（生物化学与分子生物学专业论文）cpaltb基因融合及其表达产物免疫原性研究.pdf

摘要 利用p c r 技术，从a 掣产气荚膜梭曲染色体和p e w d 2 9 9 中分别扩增出a 毒素基因( c p a ) 奔fl t b 基冈，通过分离，纯化、内切酶酶切、连接和转化，构建了含c p a l t b 融合基因表达 质粒重纽凶株b l 2 1 ( d e 3 ) ( p c 队l t b ) 。经酶切鉴定和核苷酸序列测定证实t 构建的重组质粒 p c p a l t b 含有c p a l t b 融合基因，l t b 基因在重组质粒中与c p a 基因的连接向信正确，位 丁二c p a 基田的f 游，并与c p a 处于同一阅读框中。 重组曲株b l 2 1 ( d e 3 ) ( p c p a l t b ) 经i p t g 诱导后，其表达产物经s d s p a g e 和 w e s t e r n - b l o t t i n g 分析，表明重组菌株可以表达c p a l t b 融合蛋白，分子量为6 7 1 0 ，与预期结 果一致。表达的融合蛋白以包涵体形式存在，可分别被抗l t 血清和a 型产气荚膜梭菌抗毒素 识剐，具有c p a 和l t b 两者的抗原性。薄层层析扫描分析，融合蛋白的表达量占菌体总蛋白 的1 2 5 。重组曲株b l 2 1 ( d e 3 x p c p a l t b ) 分别经i p t g 和乳糖诱导优化后，融合蛋白c p a l t b 的表达鼋都比优化前增加了l 倍。 用构建的工程菌的表达产物腹腔免疫小鼠，2 i 天后经静脉攻击i m l d 的a 型产气荚膜梭菌 毒素，并与用加入氢氧化铝胶作为佐剂和单独的a 型产气荚膜梭菌类毒素免疫的动物作为对照， 结果融合蛋白免疫的小鼠的存活率为1 0 0 ，而类毒索加铝胶免疫的小鼠的存活率分别为8 3 ， 单独类毒素免疫的小鼠则不能抵抗毒素的攻击。表明融合蛋白中的l t b 部分增强了c p a 的免 疫原性，起到了免疫佐剂的作用。 关键词：c p a ，l t b ，基因融合，基因表达，免授原性 a b s t r a c t a l p h a - t o x i ng e n ef r o mc h r o m o s o m a ld n ao fc l o s t r i d i u mp e r f r i n g e n st y p eaa n dh e a t l a b i l e t o x i nbu n i tg e n ef r o mp l a s m i dp e w d 2 9 9c o n t a i n i n gh e a t - l a b i l et o x i no fe s c h e r i c h i ac o l iw e r e a m p l i f i e db yp c r - p c rp r o d u c t sw e r ec l e a v e dw i t hr e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e sa n dr e c o v e r e d t h e r e c o m b i n a n tp l a s m i dp c p a l t bc o n t a i n i n gc p a l t bf u s i o ng e n ew a sc o n s t r u c t e db yr e c o m b i n a n t t e c h n i q u ea n dt h e nt r a n s f o r m e di n t oe s c h e r i c h i ac o l ib l 2 1 ( d e 3 ) t h er e c o m b i n a n te x p r e s s i o n p l a s m i dp c p a l t bw a ss t u d i e di n d e t a i lb yr e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e sa n a l y s i sa n dn u c l e o t i d e s e q u e n c i n g t h er e s u l to f n u c l e o t i d es e q u e n c i n gi n d i c a t e dt h ec p ag e n eh a sap o s i t i v er e a df r a m ea n d o r i e n t a t i o ni nt h er e c o m b i n a n tp l a s m i d b yt r a n s f o r m a t i o no f p l a s m i dp c p a - l t bi n t ot h eh o s ts l r a i n ，b l 2 1 ( d e 3 ) ，as t r a i no r e c o i l b l 2 1 ( d e 3 x p c p a - l t b ) w a so b t a i n e d b yt h ei n d u c t i o no fi p t ga n da n a l y s i so fs d s p a g ea n d w e s t e mb l o t t i n g t i tw a sd e m o n s t r a t e dt h a tt h er e c o m b i n a n ts t r a i nc o u l de x p r e s st h ec p a l t bf u s i o n p r o t e i n t h ef u s i o np r o t e i no fc p a l t bi sa b o u t6 7k da n dc o u l db e e nr e c o g n i z e db yc l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n sat y p ea n t i t o x i na n da n t i - l ts c r a mi nw e s t e r nb l o t t i n gr e s p e c t i v e l y r e c o m b i n a n tf u s i o n p r o t e i nh a dl o s tp h o s p h o l i p a s eca n dh e a m o l y t i c a la c t i v i t yo fat o x i na n dt o x i c i t yt oa n i m a l s t h e e x p r e s s i o na n a o u n to f t h ec p a l t bf u s i o np r o t e i na c c o u n t e df o r1 2 5 o f t h et o t a lp r o t e i na m o u n to f t h er e c o m b i n a n ts t r a i na f t e ri n d u c t i o nw i t hi p t gt h ef u s i o np r o t e i nc o u l db ei n c r e a s ee x p r e s s e d p r o d u c tb yo n et i m ew h e nw eo p t i m i z e dt h ee x p r e s s i o nc o n d i t i o n si n d u c e db yi p t ga n dl a c t o s e r e s p e c t i v e l y t h ep r e p a r a t i o nw a su s e dt oi m m u n l m i c ei nt w o - d o s e sw i t ho rw i t h o u ta l u m i n u mh y d r o x i d e g e l a sa d j u v a n t t h e c l o s t r i d i u m p e r f i i n g e n s a t y p e t o x o i d w a sa l s ou s e d t o i n o c u l a t e d l o a n i m a l s a s c o n t r o l s a t2 td a y sa f t e rl a s ti m m u n i z a t i o n a n i m a l sw e r ec h a l l e n g e dw i t hal e t h a id o s eo f c l o s t r i d i u mp e r f r m g e n sat y p et o x i nr e s p e c t i v e l y t h er e s u l t ss h o w e dt h a ti m m u n i z a t i o nw i t ht h e c p a l t bf u s i o np r o t e i np r e p a r a t i o nc o u l dp r o t e c ta n i m a l sf r o mt h ec h a l l e n g eo fal e t h a ld o s eo f c l o s t r i d i u m p e r f i n g e n s a t y p e t o x i n ，a n d i t s p r o t e c t i v er a t e w a s t h es a m e a s t h a t o f t h e i m m u n i z a t i o n w i t hc l o s t r i d i u mp e r f r i n g e n sat y p et o x o i dc o n t a i n i n ga l u m i n u mh y d r o x i d eg e la sa d j u v a n t b u t i m m u n i z a t i o nw i t hc l o s t r i d i u mp e r f r i n g e n sat y p et o x o i dw i t h o u ta d j u v a n tc o u l dn o ti n d u c e dt h e p r o t e c t i o no fa n i m a l sf r o mt h ec h a l l e n g eo f t h ec l o s t r i d i u mp e r f r i n g e n sat y p et o x i n t h er e s u l t s d e m o n s t r a t e dt h a tt h el t bf r a c t i o no f c p a - mc 卸s e r v e da st h ea d j u v a n ta n dp r o t e i na n t i g e nc a r r i e r a n di n c r e a s e dt h ei m m u n o g e n c i t y k e yw o r d ：c p a ，l t b ，g e a ef u s i o n ，e x p r e s s i o n ，i m m u n o g e n i c i t y 英文缩写 a m p b p b s a c f a d n a d n t p s i p t g k b k a l l l m m m l m l d o r f n g e p c r p l c r m i n s d s x - g a l u u l m n o i l 中英文缩略词表 英文全称中文名称 a m p i c i l i n 氨苄青霉素 b a s ep a i r 碱基对 b o v i n es e r u ma l b u m i n牛血清白蛋白 c l o s t r i d i u mp e r f r i n g e n st y p ea a l p h a - t o x i na 型产气荚膜梭菌a 毒素 d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 脱氧核糖核酸 d e o x y n u e l e o s i d et r i p h o s p h a t e 四磷酸脱氧核苷 i s o p r o p y l t h i o - p d - g a l a c t o s i d e 异丙基硫代- 6 一d 一半乳糖苷 k i l o b a s ep a i r s 千碱基对 k a n a m y c i n 卡那霉素 l i t e r升 m i n u t e分钟 m i u i t e r毫升 m i n i m u ml e t h a ld o s e 最小致死量 o p e nr e a d i n gf r a m e 开放读框 p o l y a e r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 聚丙烯酞胺凝胶电泳 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 p h o s p h o l i p a s ec 磷脂酶c r a l o rp e rm i n u t e转分 s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基磺酸钠 5 - b r o m e - 4 - c h l o r o - 3 一i n d o l y l p d _ g a l a c t o s i d e5 - 溴4 - 氯3 一吲哚- p d - 半乳糖苷 u n i t单位 m i c r o l i t e r微升 m i c r o m o l e l i t e r微摩尔，升 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得宁夏大学或其它教育机构的学位或证书而使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示了谢意。 研究生签名：座锄蒂 时间：_ 蚶，年，月_ 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解宁夏大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交 论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。同意宁夏大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位 论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名彦包蔼帆如年月夕日 、厶 导师签名：7 干 时阚： 讼， 年，目 第一章引言 1 1a 型产气荚膜梭菌a 毒素 产气荧膜梭曲( c l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s ) 是引起各种动物坏死性肠炎、肠毒血症以及人备创伤 性气性坏疱和人类食物中毒的主要病原菌之一，该菌产生的外毒素是其致病因子。目前发现升 被鉴定的外毒素有2 0 余种，但起主要作用的毒素只有4 种，即a ，口，和“据此该曲破分为 a ，b ，c ，d ，e5 个毒素型。各型产气荚膜梭哲均产生d 毒素( c p a ) ，它是产气荧膜梭苗最重要 的毒素之一，而且也是a 型产气荚膜梭菌最主要的毒力网子。 1 1 1a 毒素的理化性质和生物学特性 口毒素是强毒素，它具有细胞毒性、溶血活性、致死性、皮肤坏死性、血小板聚集和增加血 管渗透性等特性。a 毒素是一种由3 7 0 个氨基酸组成的单链多肽，分子量约为4 3k d ，等电点 ( p i ) 5 4 。它也是一种依赖于锌离子的多功能金属酶，具有磷脂酶c ( p h o s p h o l i p a s ec ，p l c ) 和 鞘磷脂酶( s p h i n g o m y e l i n a s e ) 两种酶活性，能同时水解磷脂酰胆碱( p h o s p h a l i d y l c h o l i n e ) 和鞘磷脂 ( s p h i n g o m y e l i n ) 。毒素依靠这两种酶活性，水解组成细胞膜的主要成分膜磷脂，从而破坏 细胞膜结构的完整性，导致细胞裂解，引起溶血、组织坏死、血管内皮细胞损伤，使血管通透性 增高，造成水肿i l j 。口毒素可被e d t a 、邻二氨杂菲可逆性抑制，还可被乙醚偶联的磷脂酰胆碱 抑制【2 l 。a 毒素的溶血活性具有冷热溶血效应( h o t - c o l dh e m o l y s i s ) ，即n 毒素在3 7 与红细 胞作用时，红细胞并不发生裂解，只有当冷至4 时，n 毒素的这种冷热溶血效应，在小鼠、 家兔、绵羊和马的红细胞上均有发现。另外，6 0 7 0 的温度可以使a 毒素的溶血活性丧失， 而在1 0 0 时，其部分活性又可以恢复”j 。此外，毒素对胰酶敏感，如2 5 的胰酶与a 毒 素于3 7 作用1 h ，即可使其完全失活。 1 1 2o r , 毒素基因的克隆和序列分析 1 9 8 9 年，国外有4 个研究小组先后报道了从a 型产气荚膜梭菌d 毒素高产菌株n c t c 8 2 3 7 中克隆到了n 毒素全基因并测定了其核苗酸序列。结果表明，a 毒素基因位于染色体上，其结 构基因大小为1 l 舛b p ，编码3 9 8 个氨基酸，分子量为4 5 4 8 0 d ，信号肽为2 8 个氨基酸，成熟 肽为3 7 0 个氨基酸，分子量为4 25 8 0 d ，与实验测得的天然的或克隆的a 毒素分子量( 4 33 0 0 d ) 相近。a 毒素编码区g + c 含鼍为3 4 ，s d 序列为c g g g g g ，1 0 区序列为t a t a a t ，3 5 区 序列为g t g a g c ，终止密码子为2 个连在一起的1 a a p i 。k t s u t s u i 等p 1 比较了5 株a 型菌株 ( n c t c8 2 3 7 ，k z 2 1 1 ，p b 6 k 1 3 和8 6 ) 、1 株b 型菌株( n c i b l 0 6 9 1 ) 、l 株c 型菌株( n c i b 1 0 6 6 2 ) 、2 株d 型曲株( l 9 和n c i b l 0 6 6 3 ) 和i 株e 型曲株( n c i b l 0 7 4 8 ) n 毒素的核苷酸 序列及编码的氮基酸序列，在1 1 9 4 b p 编码区里。不同曲株之间平均有1 3 的核苷酸序列不同， i 中爱j 、学硕l 学位论文第一帚引言 有1 2 的氨基酸序列不同。令人惊奇的是，b 犁菌株n c t b1 0 6 9 1 与a 型菌株n c t c 8 2 3 7 仅有一个核苷酸不同，导致1 个编码氨基酸不同；而同是a 型曲株的8 - 6 与n c t c 8 2 3 7 相比， 则有3 7 个核营酸不同，导致1 3 个编码氨基酸不同；另外，d 型菌株n c i b l 0 6 6 3 与e 型菌 株n c i b l 0 7 4 8 的核苷酸完全一致，但与d 型菌株l 9 比较则有1 5 个核苷酸不同，导致3 个 编码氦墓酸不同。尽管这些核苷酸的改变导致了编码氨荩酸的改变，但并不影响n 毒素本身 的活性，各犁曲株产生的n 毒素具有相同的特异性。 1 1 3a 毒素基因的表达和调控 n 毒素的启动子是最强的启动子之一，可被大肠杆菌的r n a 聚合酶所识别，因而毒素 在自身启动子下不仅可在产气共膜梭菌中被高效表达，而且也可在大肠杆菌中得剑高效表达。此 外，也可将其置于其他启动子下，转化为大肠杆菌后而获得高效表达。许崇波等【6 7 “1 在克隆a 毒素保护性抗原基因的基础上，将口毒素保护性抗原基因置于大肠杆菌表达载体p e t - 2 8 b 中的 t 7 启动子下，经s d s p a g e 和薄层凝胶扫描分析，在i p t g 诱导3 4h 后，b l 2 1 ( d e 3 x p x e t a i ) 表达的a 毒素占菌体总蛋白的3 3 2 1 。近年来，在分子水平上，一些研究人员对a 毒素基因调 控进行了研究。t t o y o n a g a 等例研究证实，在转录水平上可调控a 毒素的产量。他们将启动子 3 5 区上游富含的a + i t 序列缺失0 7k b 后，发现a 毒素的表达量增加1 0 倍，这表明该区在 基因表达时呈负调控作用。核苷酸序列分析也证明，在a 毒素基因上游一6 6 至一4 0 区间内存在3 个周期性重复的( d a ) 5 6 序列，当缺失含二个( d a ) 5 - 6 区的7 7b p 片段时，n 毒素表达量显著增 加。这些实验结果充分说明了a 毒素启动子上游的基因序列对a 毒素基因的转录呈现负调控 作用，而这种调控作用可能是由该区d n a 扭曲的潜在影响所引起的。s i k a t a y a m a 等”也讦 实，c t 毒素的表达在转录水平上会受到调控，即在相同培养条件下，a 型菌株比c 型卤株的 m r n a 含量高2 3 倍。他们还证实，菌株中含有特异的d n a 结合蛋白，如果将a 毒素基因分 成a ，b 和c 3 个片段，结果a 型和c 型菌株都含有特异结合片段a 的特异d n a 结合蛋 白，且只有a 型曲株含有特异结合片段b 的特异d n a 结合蛋白，这种特异d n a 结合蛋白 可能是a 型菌株n 毒素产量高于c 型菌株的一个因素。k t s u t s u i 等p 1 报道，n 毒素高产 曲株a 型产气荚膜梭菌n c t c8 2 3 7 和p b 6 k 的m r n a 含鼍比低产菌株b ，c ，d 型的 m r n a 含量高4 0 倍左右，即使是低产的a 型函株的m r n a 含量也比其他型的曲株含量岛。 1 1 4a 毒素的结构和功能 从毒素基因核苜酸序列推测的氨基酸序列得知，成熟a 毒素为3 7 0 个氮基酸与由2 4 5 个氨基酸组成的腊样芽孢杆菌磷脂酶c ( p c p l c ) 具有广泛的同源性，通过比较证实，产气荚膜 梭菌a 毒素基本上是由1 个完整的p c p l c 的氨基端和1 个含1 2 0 个氨基酸残基的羧基端 组成。p c p l c 结晶体结构显示该酶是由1 0 个n 螺旋连接长度可变的b 转角组成，这种结构 与a 毒素结构前常相似，只有a 毒素羧基端含有4 个螺旋，这对a 毒素具有鞘磷脂酶活 性很重要。 2 宁星人学母一卜学位论文第一帚弓l 言 r w t i t b a l l 等1 对a 毒素是否由2 个功能区组成进行了研究。他们构建了一个截短的q 毒素c p a l - 2 4 9 ，此部分毒系能编码并与p c p l c 同源，结果发现，c p a i 2 4 9 依然保留了磷脂 酶c 的活性，并能水解磷脂酰胴碱，但却人去了毒素的鞘磷脂酶活性、溶血活性和致死性。 这表明a 毒素的c 端可能具有溶血活性雨i 致，e 性，或者它能够把这些活性赋予a 毒素n 端， 而且只有此两端协同作j l j ，才只有a 毒素本身的活性。r 、矿t j l b a 】凹”义构建了n 毒索c 端 c p a 2 4 7 - 3 7 0 ，结果它不具有鞘磷脂酶活性、溶血活性雨l 致死性。然而，当心c p a l 2 4 9 和 c p a 2 4 7 3 7 0 共同作用于小鼠红细胞时，却发现两者能使小鼠红细胞发生溶血，这表明c 端能 将溶血活性赋予n 端。但也不能否认当c p a 2 4 7 3 7 0 结合c p a i 一2 4 9 前相且作用时，c p a 2 4 7 - 3 7 0 的构象发生变化，从而激c p a 2 4 7 - 3 7 0 的活性位点，使其具有了酶活性。e d w i l l i a m s o n 等1 3 i 又对c p a l - 2 4 9 和c p a 2 4 7 - 3 7 0 进行了免疫原性研究，结粟发现c p a i - 2 4 9 免瘦小鼠后所产生 的抗体能中和a 毒素的磷脂酶c 活性。但不能中和口毒素的溶血活性；而c p a 2 4 7 3 7 0 免疫 小鼠后所产生的抗体既能中和a 毒素的磷脂酶c 括性，又能中和q 毒素的溶血活性，同时能 抵抗致死量a 毒素的攻击和至少1 0l d l 0 0 剂量的a 型产气荚膜梭菌的攻击。上述这些试验结 果充分说明，a 毒素确实由2 个功能区组成，n 端具有磷脂酶c 活性，c 端具有鞘磷| j 旨酶活 性，而且只有两者协同作用才具有溶血活性和致死活性。但尚不清楚这种a 毒素是存在2 个 活性位点，还是单一活性位点。单独a 毒索n 端c p a i 2 4 9 和c 端c p a 2 4 7 - 3 7 0 的毒性很 低，但其免疫小鼠后所产生的抗血清的中和效果不同，这可能是由于c p a 2 4 7 - 3 7 0 在单独表达后， 所形成的高级结构与口毒素的完整结构相似，故能中和n 毒素的溶血活性和致死活性，表明c t 毒素的保护性抗原为c 端。如果是这样，则c 端在调控酶活性方面将具有重要作用。q 毒素 的氨基酸组成对其生物活性和毒性有着重要的影响，而其中一些氨基酸是对其生物活性具有十分 重要作用的保守氨基酸。m n a g a l l a r n a 等”4 j 利用位点突变技术，研究了组氨酸残基在毒素中的 作用。他们将第6 8 位组氨酸残基突变成甘氨酸残基后，发现突变的g t 毒素完全丧失了c t 毒素 本身具有的磷脂酶c 活性、鞘磷脂酶活性、溶血活性和致死性。如果将第1 2 6 位组氨酸残基突 变成甘氨酸残基，将第1 3 6 位组氨酸残基突变成甘氨酸残基或丙氨酸残基，结果发现突变的a 毒素活性比天然口毒素活性下降1 0 0 倍。如果将第4 6 ，2 0 7 ，2 1 2 ，2 4 1 位组氮酸残基突变 成甘氨酸残基，则突变的a 毒素活性与天然毒素活性相比没有什么变化，这表明上述4 个 位置的组氨酸残基对毒素具有生物活性不是必需的。另外，突变的毒素和天然a 毒索具 有相同的免疫原性e g u i l l o u a r d 等1 1 也做了类似研究，他们将口毒素第6 8 ，1 2 6 ，1 3 6 位 组氨酸残基突变成丝氨酸残基，结果发现突变的a 毒素丧失了a 毒素本身的磷脂酶c 活性、鞘 磷脂酶活性和溶血活性。随后他们又将c t 毒素第5 6 位天fj 冬氨酸残基突变成天j j 冬酰氩残 基，结果发现突变的n 毒素也丧失了c t 毒素本身的磷脂酶c 活性、鞘磷脂酶活性和溶血活性。 m n a g a h a m a - , 等1 1 6 1 的研究表明，当将第5 6 位的天门冬氨酸突变成丝氦酸、天门冬酰氨、谷氨酸 或谷氨酰氨之后，突变的口毒素完全丧失了a 毒素的溶血活性、磷e 酶c 活性莆j 鞘磷脂酶话性； 当第1 3 0 位的天门冬酰氨发生突变后。突变毒索与天然毒奈相比其活性降低了约1 0 0 倍：第1 5 2 位的谷氨酸突变成甘氮酸或谷氨酰氨后，a 毒素的活性完全丧失，但当川天门冬酰氨置换后则不 能完全丧失这些活性上述位点氨基酸的突变并不影响a 毒素与绵羊红细胞的结合及从溶液中 吸收游离锌离子的特性。研究还表明，第5 6 位的天门冬酰氦对毒素的酶催化作用是必需的， 而第1 3 0 位的天门冬酰氪对其结构的维持是必需的。他们还证明1 1 7 1 ，第7 4 位的酪氨酸也是一 宁砭人学而i 学位论文第一审0 f 苦 个对毒素的生物活性起重要作_ i 】的关键氨基酸残基，当其被突变置换后，它可使毒素的生物活性 降低2 5 0 倍。尽管上述不同位点的氦基酸发生突变之后，对a 毒素的生物活性有着不同稃度的 影响，甚至可使其生物活性完全丧失，但仍然保持着天然d 毒素的部分或全部抗原性。 1 2 不耐热肠毒素 人肠杆曲热不稳定性肠毒素( e s c h e r i c h i a c o l i h e a t l a b i l ee n t e r o t o x i n ，l i d 是由人肠杆菌产毒 株合成的一种毒素，与其同源家旅笮乱毒素( c h o l e r a t o x i n ，c t ) 刍! i 构和功能邗常相近，都由一个 a 哑单位( l t a 或c t a ) 和一个经5 个非共价键连接形成的5 聚体b 弧单位( l t b 或c t b ) 构成。 作为公认的强效粘膜免疫原和粘膜免疫佐剂，两种毒素及其亚单位在过去2 0 年中研究较广f i ”。 u 的作用与其a 、b 两亚单位紧密联系。l t a 特有a d p 核糖基化活性，可致肠上皮细胞持 续合成c a m p 和大量电解质及肠液的分泌，引起腹泻；同时，l t a 以独立的角色参与l t 的佐剂 效应1 。l t b 与表达于细胞表面的g m i 神经节苷脂及其受体有极高亲和力，在l t 的免疫原性 和佐剂作用中扮演极重要的角色1 2 2 4 5 1 。 1 2 1 免疫佐剂作用和免疫原性 外源蛋白经粘膜途径免疫效果常不理想，往往需要应用佐剂，【，t 和l t b 就是常用的粘膜免 疫佐剂。由于l t b 与靶细胞神经节苷脂结合的功能，常作为抗原载体，与抗原联合时以佐剂作用 加强所连结的细胞对抗原的摄取f 2 4 】，再者，通常认为b 亚单位五聚体与g m i 结合也是全l t 分 子的免疫原性所必须口6 1 。 d e h a a n 等口”用点突变的方式，将b 亚单位第3 3 位氨基酸g l y 突变为a s p ，形成的l t - g 3 3 d 缺乏与g m i 亲和力；将a 亚单位第11 2 位氮基酸突变为l y s ，形成的l t - e i1 2 k 缺乏a d p 核糖 基化活性：而经上述双突变的l t - e i1 2 k g 3 3 d 则两种功能都不具备，这些重组l t 分别联合流感 病毒a 证单位，免疫小鼠，只有l t - e 1 1 2 k 能诱导抗l t b 的特异s i g a 反麻但都能迅速诱导血 清抗流感病毒的系统免疫反应。说明l t 全毒素的佐荆作用既不依赖g m l 结合，也不依赖a d p 核糖基化作用，但l 1 和l t b 的免疫性则必需有b 孤单位的g m i 亲和力，这在其他研究中也得 到证实1 2 4 j ：当l t 和l t b 联合作为佐剂时可致更强免疫反应，刺激产生最高水平的血清特异抗体， 从而使所辅佐的幽门螺旋杆菌疫苗起到良好的抗感染保护作用。r a s k 等”以人丙种球蛋白模拟 蛋白抗原与l t b 混合或化学偶联，再与无毒u 联合时诱导的免疫反应也大大增强。 为了充分发扦l t b 的免疫佐剂作用和免疫原性，利用基因工程可构建抗原融合蛋白、纯化重 组l t b 以及与其他佐剂协同。单独l t b 或c t b 只能与神经竹苷脂亲和，而当l t b 和c t b 之间 发生系统的氨基酸交换后，两个b 亚单位相接面的顶端就存在一种识别碳水化合物( n 一乙酰乳糖 胺基糖类) 的位点。这种杂交c t b l t b 产物能识别a 型和a 犁血液决定因子员有与上皮细胞表 面的糖鞘脂的特殊结合能力2 “。在人口腔常驻菌戈登变形链球曲表面表达的l t b m 6 的融合蛋 4 - 宁要大学母，t 学位论文第一市引言 白，刺激b a lb c 小鼠高水平的局部和系统免疫反应“m 为了使抗原与l t b 易于定位化学偶联， o d o w d 等口”拄l t b 的c 端迎接p g t a g 间隔段，困p k t a g 中的半胱氮酸的傍置备异可形成一纽 l t bp k c y s 融合蛋白，随着抗原定点而化学偶联于p k m g 中的半胱氮酸残基形成l t b 抗原偶联 体动物实验证实l t b 对抗原起到了更女，的佐荆效应。将l t b 的编码基因导入载体p n u 2 1 2 后 在短轩曲中高水平表达，这种重组l t b 的氨基酸序列、分子缱、g m l 粘结能力与天然l t b 几乎 相同有良好虑_ 【 j 前景i ”j 。 含有免疫刺激性c p g 始动基元( 磷酸胞嘧啶鸟噱呤二核苷酸基元) 的脱氧寡核苜酸( c p go d n ) 自身是一种系统免疫和粘膜免疫佐剂，m c c l u s k i e 等”联合使用l 1 和c p go d n 作为h b s a g 的 佐荆免疫小鼠，从特异性系统体液免疫、粘膜体液免疫、t 细胞介导的免疫及细胞因子等多方面 进行评价，证实了c p g o d n 与l t b 的协同并推测这种协同可能与l t 固有的c a m p 合成卸a d p 核糖基化活动有关i j ”，c p go d n 联合保留部分酶促反应的l r 重组体可能取得最佳免疫放大作 用。转基因植物可食用疫苗是疫苗产业的革命，尤其是口腔疫苗的最合适来源。已证明l t b 亚单 位和某些抗原蛋白在玉米中表达激发免疫保护效用及其胃肠道稳定性。转基因玉米合成的l t b 多 肽与g m i 结合装配为低聚物结构，喂饲b a l b c 小鼠较对照组诱导了更高的粘膜及血清i g a 滴度。 而副作用腹泻减轻，并且具有天然毒素的多种特征”q 。 u 及其b 亚单位作为社膜佐剂的研究已在临床开始，据报道人体对u 的佐剂作用敏感度较 实验小鼠高，但【，t 的免疫反应作用机制、毒性与佐剂活性之间关系并不非常清楚“2 ”。野生 l t 完整分子和保留部分酶活性的突变体能选择性诱导树突状细胞表面抗原的表达，而b 亚单位 则将结合的i 类表位传递到树突状细胞系的主要组织相容性复合体，推测树突状细胞的l t 反应 对l t 的佐剂活性起着重要作用田2 ”。l t b 与g m i 受体结台后激活b 细胞，导致单核细胞的细 胞因子分泌而激发c d 8 + 细胞的凋亡，可能与抑制c a s p a s e 3 、诱导n f - c a p p ab 活性信号事件有关 p o 。l t 和l i b 的副作翊及不良影响仍是需探索的领域，有些动物实验能获得全毒素免疫放大反 应的最小l t b 削量，目前尚未发现毒性反应l 卅。h a g i w i r d 等p ”以b a l b c 小鼠为对象，进行大脑 皮层内注射免疫，研究了l i b 和c t b 对大脑的影响。根据鼠体重变化、与剂量依赖的死亡率改 变以及血清，上化参数的不同，提t t l1 0 0m g 剂量对人体安全的观点。l u r o s s 等p2 1 从关节炎小鼠模 型实验结果认为1m g 的l t b 鼻腔免疫只有保护作用，但b a n e r j e ep 3 1 将l t 作为幽门螺杆菌佐剂 免投4 2 位志愿者，发现经肠途径时剂量2 5m gl t 的副反应小、经1 3 途径时0 5m g 和0 1m g 剂 量的l t 安全有效。 1 2 2 免疫途径 与崔乱毒素( c t ) 相似，l ，t 最常用于加强枯膜免疫，对l t 佐剂效应的研究多是经粘膜途径。 针对一些攻击轴膜表面细胞的病原体如幽j 螺旋杆菌，单纯疱殄病毒，流感病毒等感染，粘膜 途径具合理性脚+ “”。因为猫膜免疫能最好诱导s l g a 产生，而s l g a 是抗粘膜璃原体感染的主 要免瘦球篮向。枯膜途杼可经口、鼻腔、阴道或直肠等局部猫膜进行免疫，免疫抗原不同。所需 最佳途径相应各异。l 1 和l i b 联合作佐荆，经口、鼻腔、直肠途径都放大了体液免疫和细胞免 宁夏大学研 学位论文 第一章l言 缦l “。r a s k 等则认为l t b 联合少晕l t 时，经口免疫优于鼻| 拧途径1 2 l j ；c p go d n 与l t 的协同 也要求口服途径l l s 驯；然而也有不少学者研究l t 佐剂仃_ 【i j 首选鼻腔途行f 2 6 2 7 3 1 , 3 q 获得理想效 果。 尽管非粘膜途行免疫的研究较少，近年来也开始认识剑l t 和l t b 经1 e 粘膜途径同样能有效 刺激抗原特异抗体、加强免疫反应，其优点是l t 毒素不与消化道上皮细胞接触因而也不引起腹 泻。l 1 、和l t b 混合佐刑经用皮f 、皮内、腹膜内及静脉内筲非粘膜途移免发，表现出的拯有效 的佐剂作用与枯膜途行类似口4 j ；肌注免疫有效促进血液循环抗体i g g 和粘膜i g o ，诱导有效保护 作h j 。g u e b r e - x a b i e r 等观察剑经皮肤局部注射( 称免疫刺激块l m m u n os t i m u l a t i n gp a t c h ) l t ( 即 l t - i s1 诱导了活化的免疫递呈细胞及其携带的抗原流感病毒从注射局部位移到相同的淋巴结，增 强血清特异抗体和粘膜l g a 反应。l t - s 途径简便有效，为佐剂应用提供了新的策略j 。 1 2 3 免疫反应类型 【，t 和u 各种重组突变单位诱导的免疫反应涉及了t h l 型和t h 2 型混和反应。l g o i 甄群具 有t h 2 型反应特征，l g g 2 a 亚群主要与t h l 型反应有关，因而l 9 0 1 i g g 2 a 比例是t 细胞各辅助 砸型介导的抗原特异性抗体程度不同的反映唧刈。经粘膜途径诱导的i g g l 和l 9 0 2 a 比值较低， 无i g e 反应；胃肠外免疫则刺激了辅助t 细胞的t h 2 亚型反应，导致较高的l g g i i g g 2 a 比值“4 j ； l t - b 辅佐变形链球菌a gi ，诱导的i g g 2 a l g g l 比值增高，而u ：i i a 作佐剂则以诱导i g g l 占 优判川；表达l t b - m 6 蛋白的重组戈登变形链球菌皮下接种时，l g o l l g g 2 a 两亚型之比为6 4 ：1 ， 而胃肠免疫时i 9 0 2 a a g o l 比为2 ：1 1 2 5 1 ；但r i c h a r d 等提出，经胃肠外途径l t 放大的保护免疫更 多与整体特异i g g 水平有关，而不是i g o 亚群1 2 4 l 。有报道认为粘膜免疫时霍乱毒素仅刺激了t h 2 型反应，而l t 刺激了t h l 和t h 2 两型反应，从这个角度来看，u 优于c t 。 综上所述，本研究在克隆c p a 和l t b 基因的基础上，将l t b 基因融合到a 毒素基因的下游， 构建了c p a l t b 融合基因，得到了表达c p a - l t b 融合蛋白的基因工程菌株，为研究免疫原性较 好的a 型产气荧膜梭菌毒素基因工程亚单位疫占奠定了基础 - 6 第二章实验部分 2 1 实验材料 2 1 1 菌株与载体 a 型产气荧膜梭菌c 5 7 - l 购白中国兽药监察所；载体p e t - 2 8 c 、质粒p e w d 2 9 9 、受体卤b l 2 1 ( d e 3 ) ，由本宝保存。 2 1 2 实验动物 i c r 小鼠，体重1 6 - 1 8 9 ，购自宁夏医学院实验动物中心。 2 1 3 酶和试剂 限制性核酸内切酶b a m h l ( 1 5l 恤) e c o r i ( 1 5l 砷l ) ，n c o i ( 1 0u l ) 、h i n d i l i ( 1 5u p l ) r r a q d n a 聚合酶( 5 u 止) 、d n a m a r k e r d l 2 0 0 0 、r n a s e a 、l o w - r a n g e p r o t e i n m a r k e r 、琼脂耱 均购自t a k a r a 公司； 氨苄青霉素、卡那霉素购自s i g a m a 公司； 1 4 d n a l i g a s e ( 3u 山) 、w i z a r d 。p c rp r e p s d n a p u r i f i c a t i o n s y s t e m 、低熔点琼脂糖、t e m e d 购自p r o m e g a 公司； 兔抗羊1 9 g h r p ( 酶标二抗) 购自北京中杉公司； 胰化蛋白胨( t r y p t o n e ) 、酵母提取物( y e a s te x t r a c t ) 为o x o i d 产品： b 巯基乙醇，溶菌酶。t r i t o n x i d 0 为北方同正生物公司产品i 丙烯酰胺( a c t ) 、甲叉丙烯酰胺( b i s ) 、过硫酸胺( a p ) 均为华美生物公司产品： 琼脂粉、n a c l 2 、氨基乙酸( g l y ) 鲁化学试荆均购自北京化学试剂公司。 2 1 4 主要仪器 p c r 反应仪为e p p e n d o f 公司产品； 微量移液器为t h e r m o 公司产品； 凝胶成像仪，垂直扳电泳槽、半于转印系统为b i o r a d 公司产品； 电泳仪、水平电泳槽、紫外分析仪为北京六一仪器厂产品： a l c 高速冷冻离心机为a l c 公司产品： 电子天平为m e r r i e r t o l e d o 公司产品： 超声波破碎仪为s a n y o 公司产品： u v - 4 8 0 2 型紫外可见分光光度计为u n i c 公刁产晶； 2 2 实验方法 2 2 1产气荚膜梭菌染色体d n a 的提取 所需培养基和溶液配制： 肝片肉汤培养墓：蛋白胨l o o g ，酵母提取物5 0g 。n a c i1 0 0g ，加蒸馏水溶至1 0 0 0m l ， 加新鲜蒸透切成碎快的动物肝脏组织适域，在1 5p s i ( 1 0 5k g c m 2 )