（生物化学与分子生物学专业论文）shewanella+piezotolerans+wp3中异柠檬酸裂解酶icl基因的克隆表达酶学性质研究及在不同胁迫条件下的转录翻译表达.pdf

摘要 摘要 本实验研究的是s h e w a n e l l a p i e z o t o l e r a n sw p 3 的异柠檬酸裂解酶，它是乙醛 酸循环的关键酶，在w p 3 基因组里是单拷贝的。 w p 3 分离自西太平洋1 9 1 4 米的深海沉积物中，它是一株革兰氏阴性，兼性厌 氧的杆状细菌，耐冷并耐压。其生长温度范围是0 2 8 。c ，最适生长温度是2 0 ， 生长压力范围是0 5 0 m p a 。最适生长压力为2 0 m p a ，是研究极端微生物适应极端 环境的理想材料【1 1 。 基因芯片的结果表明，当w p 3 处于一些环境因子，如生长温度、压力的变化， 温度，压力的短时间刺激等，很多基因都有明显的改变。本实验从w p 3 的代谢途 径的关键酶出发，探索极端微生物适应胁迫条件时( 特别是比较明显的低温和高 压条件) 异柠檬酸裂解酶的特性和表达特征，进而为研究极端微生物的极端环境 适应性机理研究奠定基础。 i c l 的o r f 有1 5 8 1 b p ，编码5 2 6 a a ，预计分子量大小为5 8 k d a 。l c l 的序列比 对分析表明了岍3 i c l 基因相对于其他中温菌的i c l 基因和嗜冷菌的c o l w e l l i a m a r i s 的适冷酶基因i c l 更为相似。为了深入研究i c l 在各种环境下的代谢中所 起的作用，我们构建了w p 3 i c l 基因的原核表达质粒，在e c o l i 中表达后纯化重 组i c l ，制备抗i c l 的多克隆抗体，而且在转录和翻译水平上运用r e a l t i m ep c r 和w e s t e r nb l o t t i n g 研究了i c l 基因的在各水平上的表达情况。为了研究i c l 在乙 醛酸循环，甚至w p 3 整个能量与物质代谢中的地位和角色，我们更进一步构建 了w p 3 的i c l 的缺失突变体，并研究了i c l 缺失的情况下w p 3 的生长状况和它的 底物竞争酶一异柠檬酸脱氢酶的表达变化。 酶活分析表明，i c l 不仅在序列上也是在酶活性质上是一个冷适应酶，它的 最适酶活温度是2 5 。c ，但它不像c m a r i s 一样是个冷诱导酶。在各个环境变化 下的i c l 基因的转录，翻译水平都有明显的变化，在冷激、热激下，i c l 基因在转 录水平上都出现了明显的低表达，在低温下也有一定程度的下降，但是没有冷激 的反应大。而在压力刺激和高压环境下生长时，都出现了高表达。通常低温和高 压对深海耐压菌的很多基因具有相似作用方式、原理，特别是与膜流动性，渗透 性相关的基因上，而在w p 3 中i c l 对低温和高压的表达出现相反的趋势，这也 是一个未来感兴趣的研究方向。i c l 对于乙酸的代谢，和其他大多数菌株一样， 摘要 是必需的，在转录、翻译水平都有高表达。而在w p 3 的i c l 突变体中，在2 0 。c 和 4 c 的菌株生长状况和野生菌相比，没有什么变化，我们推测在w p 3 中，乙醛 酸循环只是起辅助的作用，即使菌株在相对恶劣的环境中，而t c a 循环一直都 是主要的代谢循环。而i c l 的缺失并没有导致异柠檬酸脱氢酶的表达上调，而是 出现了表达下调，说明i c l 和i d h 的关系更多的是代谢过程中中间产物上的互 助，支援互补关系，而不是底物的竞争关系。 关键词：s h e w a n e l l ap i e z o t o l e r a n sw p 3 ；异柠檬酸裂解酶；实时荧光p c r ；基因表 达；胁迫反应 a b s t r a c t i s o c i t r a t el y a s e ，t h ek e ye n z y m eo fg l y o x y l a t ec y c l eo fad e e ps e ab a c t e r i u m s h e w a n e l l ap i e z o t o l e r a n sw p 3 ，i su n i q u ei ng e n o m e i c lc o m p e t e sw i t hi s o c i t r a t e d e h y d r o g e n a s eo ft c ac y c l ef o ri t sc o r n n l o ns u b s t r a t e ，i s o c i t r a t e t h eb a c t e r i u mu s e di nt h i ss t u d yw a si s o l a t e df r o md e e p s e as e d i m e n t so fw e s t p a c i f i ca tt h ed e p t ho f1914m e t e r t h ep h y l o g e n e f i ca n a l y s i sa n dm o l e c u l a rs t u d y s h o w st h a tt h eb a c t e r i u mi sap s y c h r o p h i l i ca n dp i e z o t o l e r a n tm i c r o b ew h i c hm a yb e i d e a lt os t u d yt h ea d a p t a t i o nm e c h a n i s mo fe x t r e m o p h i l e s a n dt h er e s u l to f m i c r o a r r a yo fw p 3u n d e rv a r i o u se n v i r o n m e n tf a c t o r sd i s p l a y ss i g n i f i c a n tc h a n g e si n t h eg e n ee x p r e s s i o nr e l a t e d 埘t l lc o l da n dp r e s s u r es h o c k ，a d a p t a t i o n t h ea i mo f p r e s e n ts t u d yi st of i n dt h ea d a p t a t i o nm e c h a n i s mo fe x t r e m o p h i l e sa n dp o s s i b l er o l e o fi c lg e n ei n v o l v e di n ，u n d e rt h ee x t r e m ec o n d i t i o no ft e m p e r a t u r ea n dp r e s s u r e i n v i t r o t h ei c lg e n eo fw p 3c o n t r a i n sa l lo p e n r e a d i n gf r a m eo f15 81b p ，e n c o d i n ga 5 2 6 a ar e s i d u e sp r o t e i nw i t hm o l e c u l a rm a s so f5 8 k d a s e q u e n c ea n a l y s i so ft h i sg e n e r e v e a l v e dt h a ti ti sh i g h l yh o m o l o g o u st ot h ei c lg e n e so fs h e w a n e l l as p e c i e sa n d a l s oh a sh o m o l o g yt oi c lg e n eo fc o l da d a p t e dc o l w e l l i am a r i sc o r r e s p o n d i n gt o s o m eo t h e rm e s o p h i l i cm i c r o o r g a n i s m s w ec l o n e dt h ei c lg e n ef r o mw p 3a n d p u r i f i e dt h ee n z y m et oi n v e s t i g a t es p e c i f i c i t yo ft h ee n z y m ea n dt h em e t a b o l i c r e g u l a t i o n t h e nw es t u d i e dt h ei c lg e n ea tb o t l lt r a n s c r i p t i o n a la n dt r a n s l a t i o n a l l e v e lu s i n gr e a l t i m ep c ra n dw e s t e r nb l o t t i n g ，r e s p e c t i v e l y f u r t h e r m o r et h ei c l g e n ew a sk n o c k e do u tt oi d e n t i f yt h er o l ea n df u n c t i o no fl c l i ni s o c i t r a t em e t a b o l i s m b y w p 3 t h ei c lo fw p 3e x h i b i t s m a n y c h a r a c t e r i s t i cf e a t u r e so fc o l d a d a p t e d ， t h e r m o l a b i l ee n z y m e sr e v e a l e db ye n z y m ea c i v i t ya s s a y sa n dh a sm a x i m u me n z y m e a c t i v i t ya t2 5 。c b u ti ti sn o tac o l d i n d u c i b l ee n z y m el i k et h a to fcm a r 西i t e f f i c i e n t l yr e s p o n s e st ov a r y i n ge n v i r o n m e n tb yc h a n g i n gi t st r a n s c r i p t i o na n d t r a n s l a t i o nl e v e l a ts h a r p l yd e c r e a s e si t se x p r e s s i o nl e v e l 、i t l lc o l d ，h e a ts h o c ka n d i n c r e a s ef o r t h ep r e s s u r i n gs h o c k , a d a p t a t i o n a n di ts u g g e s t st h a ti c li si m p o r t a n tf o r h i a c e t a t em e t a b o l i s ma n di si n d u c e dt r a n s c r i p t i o n a l l ya n dt r a n s l a t i o n a l l yb ya c e t a t e s i m i l a rt ot h ei c l sf r o mo t h e ro r g a n i s m s i ni c lm u t a n tw eu n e x p e c t l yo b s e r v et h ei d h g e n ee x p r e s s i o nt h a ti d h - i in o t a b i l i t yr e d u c et h er n a l e v e le x p r e s s i o nw h i l ei d h - - i h a sn oc h a n g e ，w h i c hm e a n st h a ti d he x p r e s s i o nd o e sn o ti n c r e a s et os u p p l yt h e g l y o x y l a t ec y c l e t h eg r o w i n gc o n d i t i o n sa t2 0 。ca n d4 。cd i f f e rr e l a t i v e l yl i t t l ef r o m w i d et y p ew h i l ei c li st h ek e ye n z y m ei ng l y o x y l a t ec y c l e t h e s er e s u l t ss h o wt h a t t h ep r o p o r t i o no fg l y o x y l a t ec y c l ei nw p 3m e t a b o l i s mi s v e r yt i n ye v e na tl o w t e m p e r a t u r ea n dt c ac y c l ei sa l w a y st h em a i np a t ha tk i n d so fg r o w t hc o n d i t i o n s p r o b a b l yt h eg l y o x y l a t ec y c l ea n dt c ac y c l ei nw p 3c o o p e r a t ef o ri n t e r m e d i a p r o d u c t si n s t e a do fc o m p e t i n gf o rs u b s t r a t e k e y w o r d s ：s h e w a n e l l ap i e z o t o l e r a n sw p 3 ；i s o c i t r a t el y a s e ；r e a l - t i m ep c r ；g e n e e x p r e s s i o n ；s t r e s sr e s p o n s e i v 缩写词表 缩写词表( a b b r e via tio n s ) b p p c r d n t p d d h 2 0 d n a r n a g + c m t a e 咖 t e 瞄s d e p c 姆 陋 t e m e d s d s p a g e t 玳a s i n m p u p i ，u p 2 k b m m m l u l p g r a i n 0 r f b a s ep a i r 碱基对 p o l y m 淌ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 d e o x y r i b o n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e 脱氧核苷三磷酸 d o u b l ed i s t i l l e dw a t e 双蒸水 d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 脱氧核糖核酸 r i b o n u c l e i ca c i d 核糖核酸 g u a n i n e m y t o s i n e 鸟嘌呤+ 胞嘧啶 m a r k e r 分子量标记 t r i s a c e t a t ee l e c t r o p h o r e s i sb u f f e rt r i s 醋酸电泳缓冲液 t h e r m o sa q u a t i c u s 热聚合酶 确s e d t a 嘶s e d t a 缓冲盐溶液 t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 d i e t h y p y r o c a r b o n a t e 焦碳酸二乙脂 a m m o n i u mp e r s u l f a t e 过硫酸胺 a l k a l i n ep h o s p h a t a s e 碱性磷酸酶 n ，n ，n ，n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n en ，n ，n ，n 四甲基乙二胺 s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基硫酸钠 p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 r n a s ei n h i b t o rr n a 酶抑制剂 m a g e p a 兆帕 u n i v e r s a lp r i m e r l ，2 通用引物1 ，2 l d l o b a s e 千碱基对 m i l m o l a r 毫摩尔 m i l i l i t r e 毫升 m i c r o l i t r e 微升 m i c r o g r a m 微克 m i n u t e 分钟 o p e nr e a d i n gf r a m e 开放读码框 v 缩写词表 m r n a o d r n a s e i u 乙p c r b s a c d n a e c o l i i c l i c l i c l r i d h i d h m s 、御3 i h f r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e 转分钟 s e c o n d 秒 a m i n oa c i d 氨基酸 d i t h i o t h r e i t o l 二硫苏糖醇 e t h y l e n ed i a m i n e - t e t r a - a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 d i m e t h y ls u l f o x i d e 二甲亚砜 i s o p r o p y l t h i o - - d - g a l a c t o s i d e 异丙基- d 半乳糖苷 5 - b r o m o 一4 - c h o r o - 3 一i n d o l y l p i ) i g a l a c t o p y r a n o s i 5 - 溴一4 一氯3 吲哚p d 半乳糖吡喃 m e s s e n g e rr i b o n u c l e i ca c i d 信使核糖核酸 o p t i c a ld e n s i t y 光密度 r i b o n u c l e a s er n a 酶 r e v e r s et r a n s c r i p t i o n - p c r 反转录聚合酶链式反应 b o v i n es e r u ma l b u m i n 小牛血清白蛋白 c o m p l e m e n t a r yd n a 互补d n a e s c h e r i c h i ac o l i 大肠杆菌 i s o c i t r a t el y a s e 异柠檬酸裂解酶 i s o c i t r a t el y a s e 异柠檬酸裂解酶基因 a r e p r e s s o rp r o t e i no fa c e b a ko p e r o na c e b a k 操纵子抑制子 i s o c i t r a t ed e h y d r o g e n a s e 异柠檬酸脱氢酶 i s o c i t r a t ed e h y d r o g e n a s e 异柠檬酸脱氢酶 m a l a t es y n t h e t a s e 苹果酸合成酶 s h e w a n e l l ap i e z o t o l e r a n sw p 3 希瓦氏菌w p 3 i n t e g r a t i o nh o s tf a c t o r 整合作用宿主因子 v i 呻 僦 缸 叩 一 一 一 一 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在 文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文产生的权利 和责任。 声明人( 签名) ： 务今造 等毋- 7 “日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦 门大学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸 质版和电子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允 许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关 数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密 的学位论文在解密后适用本规定。 本学位论文属于 1 、保密() ，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密( ( 请在以上相应括号内打“ ) 作者签名： 李仑趁日期：砷年7 月7 ( 日 聊躲南j 隰1 年枷乞曰 1 前言 海洋占地球表面的7 0 以上，而深海一般指1 0 0 0 m 以下的海洋，占地球海洋 总体积的7 5 ，地球上绝大部分的深海都为10 0 0 - - 60 0 0 m 深。深海环境一般为普 通生物不能生存的高压、低温、黑暗、高盐、寡营养、高辐射的特殊极端环境 2 1 。 在微生物的进化过程中自然选择使一些微生物对极端环境有较强的适应性，这些 微生物称为极端微生物，又称嗜极菌( e x t r e m o p h i l e s ) 。生活在这种特殊环境下的 微生物具有独特的基因类型，特殊的生理机制以及特殊的代谢产物，作为地球上 的边缘生命现象，它在生命起源、系统进化等方面将给人们很多重要的启示。极 端微生物的生命现象研究有力地促进极端微生物资源在环境保护和修复、人类健 康、高效率低成本生物技术新工艺等方面的利用，乃至外空间的开发和利用。近 年来，对极端微生物的研究很多转向大多为极端微生物的古细菌。目前，从古细 菌的命名、分类到生活环境、生理结构及适应机制、应用等方面，都有了很大的 发展。这方面的研究已成为在生命科学研究的一个重要部分，极端微生物已经成 为发达国家竞相占有和发掘的重要资源。近年来我国综合国力的加强，对推动这 方面的研究工作顺利而有效开展提供良好的平台。相比较而言，国内在菌种分离 方面已有许多报道，国外研究较多的是各种极端微生物的生理结构特点和适应机 制等，还有许多未弄清楚的问题；应用方面也有一些领域有待探索。进一步深入 研究包括古细菌在内的极端微生物的适应机制及遗传基础，对于充分利用自然资 源造福人类社会，具有重要的意义。 深海是以高压和低温为主要特征的极端环境，深海细菌是生活在这一极端环 境中的主要生物类群。其基本特点是细菌细胞对环境的嗜冷或耐冷，嗜压或耐压。 由于大洋深海底部的低温性，目前分离的嗜压微生物大多也是嗜冷的【3 1 。 本文所研究的深海细菌分离自西太平洋1 9 1 4 米的深海沉积物中，菌种鉴定为 s h e w a n e l l a p i e z o t o l e r a n s 、卯3 ，它是一株革兰氏阴性，兼性厌氧的杆状细菌，耐冷并 耐压。其生长温度范围是0 2 8 。c ，最适生长温度是2 0 。c ，生长压力范围是0 5 0 m p a ， 最适生长压力为2 0 m p a ，生长盐度范围是1 - 7 ，最适生长盐度为3 州， 生长p h 为中性，是研究极端微生物适应极端环境的理想材料【l l 。 1 1 深海微生物研究进展 深海深部生物圈的发现是对“生物圈”广泛范围的进一步了解。虽然海底采集 前言 沉积柱状样已经有近八十年的历史，大规模的系统研究开始于1 9 6 8 年的深海钻探 计划。“深海钻探( d s d e1 9 6 8 1 9 8 3 ) ”，“大洋钻探( o d p ，1 9 8 5 2 0 0 3 ) ”和“综合大洋 钻探( i o d p ，2 0 0 3 ) ”，这部深海研究的三部曲，是国际地球科学历时最长、规 模最大，也是成绩最为突出的合作研究计划。大洋钻探计划o d p 以独特的视角为 我们呈现出另外一个生命世界一掩埋在洋底沉积物中和地壳中的生物圈。在数千 米深海海底存在着由微小的原核生物组成，数量极大的生物群，有人估计其生物 量相当全球地表生物总量的1 1 0 。与热液口“自养”的微生物不同，深部生物圈的 原核生物依靠地层里的有机物实行“异养”。深海大洋中生物圈的发现，让人类 认识到地球生态系统的真正基础在于原核生物。正是这些原核生物多种多样的新 陈代谢过程，产生了多种多样生物地球化学效果，在此基础上建立了地球的生态 系统。 在目前已发现的各种极端环境中深海蕴藏着的生物资源极为丰富，其中最主 要的是深海微生物，但这些微生物大部分还鲜为人知。深海环境下极端微生物的 研究不仅是目前生命科学最前沿的领域之一，也是海底深部生物圈研究和海底流 体活动研究重要的组成部分。该项研究将回答生命起源、生物进化、外太空生命 探索等生命科学的重大问题并带动包括2 1 世纪地球科学内的其它学科领域的重 大发展。 几十年来，美国、德国、英国、法国、俄罗斯、日本等国家投入大量资金用 于对大洋资源的勘查，谋求对世界海底资源再分配。新一轮合法、有序的“蓝色 圈地”运动悄然兴起。国内对深海微生物圈的研究与开发力量还比较薄弱，研究 深度也不够。在海底地质构造和矿产资源应用方面，深海微生物活性代谢产物和 新酶开发等应用方面，总体上落后1 5 2 0 年。其主要原因在较大程度上与技术方 法和仪器设备的性能、精度有着直接的关系。但随着国家综合国力的增强，对海 洋学科和生物学科的重视，特别是深海微生物研究的投入的加大，目前，在深海 微生物的分离培养、多样性调查、功能基因研究和适应性机制研究( 如深海嗜压 菌的嗜压机制) 等方面取得了一定的进展；各类极端微生物在工业用酶、工具酶、 环境修复以及生物活性物质等方面的开发应用，也有了突破，使人们看到了深海 微生物开发的巨大潜力和广阔的应用前景【4 】。 日本1 9 9 1 年开始实施了著名的深海之星( d e e p s t a r ) 计划，耗资5 0 亿日元进 2 行为期5 年深海极端微生物的研究，现在每年仍维持3 0 0 万美元的资助。从深海中 获得了1 0 0 0 多株嗜压、嗜冷、嗜热、嗜碱及耐有机溶剂的多类型的极端微生物， 最引人注目的则是有机溶剂菌，其极端因子为苯、甲苯、环已胺、煤油等，溶剂 浓度可达5 0 。这些极端微生物在新酶、新药开发及环境整治等方面的应用潜力 极大。 欧盟于9 6 年结束的一个资助期为三年的极端微生物的预研项目一 b i o t e c h n o l o g yo fe x t r e m o p h i l e s ，又于9 7 年启动一个耗资7 0 0 万欧元的计划一“极 端细胞工厂”( e x t r e m o p h i l e sa sc e l lf a c t o r y ) ，开发极端微生物及其产物的利用 价值。作为欧盟的整体策略，极端微生物项目的目的是“利用生物技术改造现在 的化学工业过程”，项目协调人a n t r i n i k a n 教授认为，极端微生物工业的时代已经 到来。 1 9 9 7 年起，美国国家科学基金会启动了关于极端微生物的研究的专项 l i f ei ne x t r e m ee n v i r o n m e n t s ( l e x e n ) 在极端微生物的基础研究方面开展了系 的工作，基本围绕三个问题：物种多样性一生命极限条件是什么? 功能多样性一 生命的行为规律是否存在? 生命进化一生命如何从前生条件进化而来? 在极端 微生物的生物技术利用方面，美国已经开始享受极端酶带来的利益。p c r 酶、e n t 酶、碱性酶及极端高温酶己在产业上产生了重要影响。极端微生物的开发利用， 有望在新材料、新药等方面开辟新的途径。 2 0 0 1 年美国国家科学基金( n s f ) 在其题为“o c e a ns c i e n c e a tt h en e w m i l l e n i u m ”的科学发展展望报告中，将海底流体活动研究列为海洋科学今后十年 最重要、最有可能取得重大突破和科学发现的前沿研究方向之一，生命科学与海 底地球物理、地球化学等在上述研究中将占据重要地位。于2 0 0 3 年1 0 月份开始的 整合大洋钻探计划( i o d p ) 将深部生物圈和洋底、海底列为该计划中三大科学课题 之一。 由中国大洋协会和国家海洋局第三海洋研究所共同建设管理的中国大洋生 物基因资源研究开发基地，除拥有较先进完备的微生物分子生物学研究设备外， 还将得到一系列特种设备支持，包括：深海悬浮物颗粒保真采样器、船载高温高 压微生物流动培养装置、实验室深海环境模拟培养装置。基地分离了6 大类极端 微生物，包括嗜酸、嗜碱、嗜盐、嗜热( 来源于西藏羊八井) 嗜冷、嗜压微生物， 前言 通过s h o t g u n 方法获得了其中一株耐冷耐压菌的具有自主知识产权的全基因组序 列；筛选出一批深海极端酶( 高温酶、低温酶) ，并进行了基因克隆、表达研究； 从极端微生物中分离出比较特别的丝状噬菌体，研究了他们与宿主关系及在宿主 适应环境中所起的作用；从深海嗜压菌细胞膜中分离纯化出各种特殊不饱和脂肪 酸，深入研究了不饱和脂肪酸合成基因簇及他们在菌株适应极端环境过程中作用 方式。中国科学院微生物研究所东秀珠研究员主持承担的国家基础研究发展计划 - 9 7 3 ”项目“极端微生物及其功能利用的基础研究”，于2 0 0 4 年1 0 月获得批准立 项【5 】。目前该项目实施已有两年时间，课题整体进展顺利，达到了预期的目标， 并取得了可喜的成绩。 深海微生物学的建立应该追溯到上世纪7 0 年代，美国s c r i p p s 海洋研究所 y a y a n o s 教授设计、改进高压培养罐并于1 9 7 9 年首先分离出深海嗜压菌，1 9 8 9 年 b a r t l e t t 首先分离出压力调控的外膜蛋l 刍( o m p h ) ，1 9 9 0 年日本三菱重工和三洋公 司开始为日本海洋科学技术中心研制深海微生物高温高压培养系统，1 9 9 4 年才 完成，耗资七亿五千万日元。该系统的建设和深潜、采样系统的建设极大地推动 了深海生物圈的研究进步。1 9 9 5 年k a t o 等分析了一个压力调控基因簇，1 9 9 9 年 n o g i 等从马里亚纳海沟分离、鉴定出极端嗜压菌m o r i t e l l ay a y a n o s i t 舛j 。2 0 0 3 年 日本、美国和意大利相继展开了深海嗜压菌s h e w a n e l l av i o l a c e a d s s l 2 和 p h o t o h a c t e r i u mg r o f u n d u ms s 9 全基因组测序【9 ，0 l ，2 0 0 5 年3 月尸p r o f u n d u ms s 9 全 基因组序列及初步分析在s c i e n c e & 发表【l l 1 2 1 。我们实验室通过深海高压模拟系 统，分离得到了两株耐压的低温菌w p 2 ，w p 3 ，1 6 s 序列分析表明它们为 s h e w a n e l l a 属，符合目前的关于耐压菌的划分范畴，在不同压力下的生长情况也 说明了它们是很好的耐压茵。我们进一步通过s h o t g u n 方法获得了其中一株菌的 具有自主知识产权的全基因组序列。本试验利用首次分离得到的低温耐压菌w p 3 开展其特有的低温酶异柠檬酸裂合酶i c l ( i s o c i t r a t el y a s e ) 的研究。 1 2 微生物极端环境及适应性机理研究进展 深海是一个特殊的生态环境，这里永久低温( 火山口除外) 、高压、黑暗。 生存在极端环境中的微生物，通常是通过代谢作用适应其所处生境而得以存活并 发挥作用，这些适应方式包括：用于能量转导和用于胞内环境及新陈代谢调节的 特殊机理；细胞膜、细胞壁结构性成分和功能性成分的稳定性；反应动力学；蛋 4 白质构象及酶系的功能。由基因决定的适应性变异不同于那些因适应环境而产生 的适应性变异。 1 2 1 深海生态环境的特征 深海一般指10 0 0 米以下的海洋。海洋的平均深度为3 ，8 0 0 米，最深的海沟为 1 1 , 0 0 0 米，而6 ，0 0 0 米以下的深海只占海洋总体积的0 1 ，因此地球上绝大部分 的深海都为1 , 0 0 0 - 6 ，0 0 0 米深。深海生态环境具有如下特征： 高压：由于地球引力的作用，每下降l o m ，压力就增加1 个大气压。因此生 长在5 0 0 0 m 深度的生物，必须能耐受5 0 0 个大气压的压力。 低温：除了海底火山口及其附近的地方，深海的温度一般始终保持在3 c i c 范围内( 少数例外，如s u l u 海的海底温度为9 8 。c ，地中海的海底温度为1 3 5 ) ， 有人称之为世界上最大的冷藏箱。在这里生存的生物必须能耐受低温。但在海底 火山口上及其附近的地方，温度高达1 0 0 - 4 0 0 。c ，在这里生活着世界上最嗜热的 微生物。 黑暗：在1 0 0 0 m 以下的深海，完全没有太阳光，这里仅有的光线是少量的生 物发光和同位素产生的射线。因此在深海没有进行光合作用的生物存在。 寡营养：由于光线只能到达水深3 0 0 m ，因此光合作用也只能在3 0 0 m 以上的 海水中进行。据估计，海洋中光合作用产生的有机物9 5 在3 0 0 m 以上被消耗。在 深度3 0 0 1 2 0 0 m 的海域内，4 的有机物被分解掉，只有1 的光合作用产物可达 1 2 0 0 m 以下的深海和海底。 盐度：深海的大部分地方的盐度同海水一样为3 左右。生活在深海的生物 均能耐受3 以下的盐度。 总之，深海环境一般为高压、低温、黑暗、高盐、寡营养。生活在深海这种 特殊环境下的微生物必然有特殊的生理代谢机制。 1 2 2 深海微生物极端酶适应性机理 极端微生物由于长期生活在极端的环境条件下，为适应环境，在其细胞内形 成了多种具有特殊功能的酶，即极端酶。极端微生物是天然极端酶的主要来源， 生活在生命边缘( 高温温泉、海底、南北极、碱湖和死海等) ，包括：嗜热菌、 嗜冷菌、嗜盐菌、嗜碱菌、嗜酸菌、嗜压菌、耐有机溶剂、耐辐射的菌类，体内 有适应于生存环境的基因、蛋白质和酶类。极端酶能在各种极端环境中起生物催 前言 化作用，它是极端微生物在极其恶劣环境中生存和繁衍的基础，根据极端酶所耐 受的环境条件不同，可分为嗜热酶、嗜冷酶、嗜盐酶、嗜碱酶、嗜酸酶、嗜压酶、 耐有机溶剂酶、抗代谢物酶及耐重金属酶等。目前日本、美国、欧洲等国都启动 了极端微生物的研究计划，主要工作包括：新物种的发现、新产物的研究与生产、 极端酶的结构与功能极其基因的克隆表达、适应机理的分子基础及遗传原理、基 因组分析【1 3 1 。下面主要介绍低温酶和嗜压酶在极端微生物中的适应机理。 1 2 2 1 低温微生物及低温酶的适应机理 低温微生物对于低温自然环境中的物质循环、能量传递以及生物地球化学循 环过程，起着十分重要的作用，从而在全球生态与环境系统中占据重要地位【1 4 1 。温 度是影响生物生存的一个限制因素，温度降低会引起细胞膜流动性、酶催化活性 的减弱，物质转运和代谢速率的降低，影响核酸二级结构的稳定性从而抑制 d n a 的复制、m r n a 的转录和翻译。若温度低于细胞质冰点，还会使细胞形成 冰晶体对细胞结构造成严重损坏1 1 5 1 ，这些问题无时无刻制约着生活在低温环境中 的低温微生物的生存，但在长期生物进化过程中，低温微生物形成了一系列适应 低温的机制，表现出极其顽强的生命力。 根据m o r i t o 的定义，其中低温菌通常又被细分为两类：一类是必须生活在低 温条件下，其最高生长温度不超过2 0 。c ，在0 。c 可生长繁殖的微生物称嗜冷菌 ( p s y c h r o p h i l i e s ) ：另一类其最高生长温度高于2 0 但上限生长温度低于4 0 。c 的 微生物，在0 5 。c 可生长繁殖的微生物称为耐冷菌( p s y c h r o t r o p h s ) 。 微生物对温度的适应，主要体现方式包括：用于能量转移与传导、胞内环境 调节及新陈代谢调节的特殊机理；细胞膜、细胞壁结构性成分与功能性成分的稳 定性；反应动力学；蛋白构象；酶功能。微生物的低温适应机制，涉及菌体 自身的生理、生化、遗传物质，以及所处生态环境与营养条件等众多因素，目前 还没有全面、系统的科学结论。其中，关于低温微生物膜功能和酶活性的研究， 是目前国际上广受关注并吸引大量研究力量的两大热点。相对膜功能的研究而 言，低温酶，包括细胞内部关系到菌体代谢、合成、调控的酶类以及作为产物分 泌到胞外的酶类，因其不但在微生物的适冷机制中具有重要的地位和作用，而且 在生物工程中也具有广阔的应用开发前景，故而在低温微生物及其相关产物的研 究开发中，占据了更大的比重【1 6 j 。目前开展的研究工作，主要集中在低温酶的合 6 前言 成与代谢、酶学性质、酶的分子适冷机制以及新型低温酶类的筛选与应用上。 目前研究得较多的低温酶大多由常年生活在极地或低温高压深海中的细菌 和鱼类所产生。在南极区海水中，低温细菌所占的比例相当高，其密度可达1 0 5 1 0 6 c e l l m 1 ，它们是低温酶的一个主要来源，另一来源是深海沉淀物。目前已在低 于3 。c 的深海沉淀物中分离出了多个种属的低温细菌，并从中成功纯化出了各类 低温酶。 由于低温酶独特的分子结构，使其具有了明显不同于中、高温酶的特征：( 1 ) 酶的最适反应温度低，( 2 ) 酶反应所需的活化自由能低，( 3 ) 酶的热稳定性低， 在高温下易失活。我们发现低温酶与相应的中、高温酶相比具有明显的结构改变， 且都是朝着蛋白质分子柔韧性增强的方向进行。其中与蛋白质结构稳定性相关的 氨基酸残基( 如精氨酸，脯氨酸，甘氨酸等) 出现了减少的趋势，分子内弱相互作 用和疏水作用也都有所减少，而酶与溶剂之间的相互作用增加，这些改变都导致 了低温酶的低温适应性加强1 7 1 。酶的热稳定性、柔韧性和活性在进化过程中紧密 相关，低温酶为适应低温环境，必然要求酶分子克服低温对疏水作用、催化作用 以及蛋白质刚性的影响，同时需要通过提高特定区域或整个蛋白结构的柔韧性， 来降低自身的活化能，才能在低温下保持高效的催化活性【1 8 1 ，但松散、柔顺的蛋 白质分子结构，会导致低温酶在常温或高温条件下更高的热不稳定性【1 9 1 。 低温酶与同类型中、高温酶相比，在低温条件下具有更低的k m 值。这反映 出酶在低温下对底物具有更强的亲和力。低温酶的催化效率( g c a t k m ) 及周转率 ( g o a t ) 更高，这可能也是低温菌细胞中包括代谢酶在内的低温酶在低温下发挥 有效催化活力的前提1 , 2 0 l 。 在低温环境中，低温微生物主要通过合成产生大量的酶类和不同类型的酶 类、合成产生具有高催化效率和高柔顺分子构象的低温酶类，从生理代谢和生化 特征两方面，在一定范围内补偿低温对细胞造成的负面影响从而适应低温环境。 因此，将造成冷适应性的多种原因进行归纳总结，即可为合理解释低温酶的 冷适应性机制提供依据。 1 2 2 2 深海嗜压菌及嗜压酶的适应机理 深海是以高压和低温为主要特征的极端环境。深海细菌是生活在这一极端环 境中的主要生物类群。其基本特点是细菌细胞对环境的嗜压或耐压以及嗜冷或耐 7 前言 冷。根据微生物在不同压力情况下生长情况的不同，可将其分为3 类，即耐压微 生物( b a r o t o l e r a n t s ) 、嗜压微生物( b a r o p h i l e s ) 和极端嗜压微生物 ( e x t r e m o b a r o p h i l e s ) 。其中耐压微生物是指在常压以及小于4 0 0a t m 的压力下最 适生长，而不能在高于5 0 0a r m 的压力下生长的微生物；嗜压微生物是指在4 0 0 a t m 最适生长，但也能在常压下缓慢生长的微生物；极端嗜压微生物是指不能在 低于4 0 0 a t m 压力下生长的微生物。 实际上，所有的生物都会对压力的变化反应。陆地自然环境中压力的变化很 小，各种生物尽管耐受压力的能力有限，但也会对压力的增长产生反应。深海细 菌耐压生长的机制是一个令人感兴趣的问题。那么，深海细菌是如何适应高压极 端环境的? 研究表明，深海细菌的转录、翻译、酶的合成，以及细胞膜的结构和 功能都对压力作出了一系列的反应。低温或高压都会导致细胞膜脂的变化，即细 胞膜脂的不饱和度的增加和一些膜蛋白的表达 3 , 2 1 】。 从深海分离的嗜压菌或极端嗜压菌的共同特征是细胞膜上不饱和脂肪酸比 例的增加。这说明通过增强膜的柔韧性嗜压微生物得以缓解环境压力，有利于细 胞膜上物质运输的正常进行，为其正常的生长代谢提供物质基础。 极端嗜压菌的d n a 中有一组能调节压力影响的基因。这些基因在高压下表 达，并通过它们减少某些蛋白质的产出率，以在压力增加的条件下，可以减少膜 的通道，从而阻止体内的糖和基他营养成分扩散到体外。近来，通过分子遗传学 方法又揭示了嗜压菌新的生理特征，发现能够在5 0 0 - 6 0 0a t m 下生长的嗜压菌在 高压下随着压力的改变其细胞壁外膜蛋白( 孔蛋白) 的组分也发生改变：一种外 膜蛋i 兰l h ( o m p h ) 在高压生长的细胞中合成，而在l a t m 压力下不能合成。 目前，k a t o 等【捌已报道了从1 10 0 0m 的m a r i a n a 海沟获取的d n a 中压力调控 操纵子序列，其中一个操纵子含两个未知生理功能的开放阅读框o r f i 和o r f 2 ， 另一个操纵子