（微生物学专业论文）抗真菌蛋白和几丁质酶基因克隆与表达研究.pdf

山东大学硕士学位论文 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明 的法律责任由本人承担。 论文作者签名：姓日 期：丛丝：丘么 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使学位论文的规定，同意学校保留或向国家 有芙部l j 或机构送交论文的复印作和电子版，允许论文技查阅和借阅；本人授权山尔人 学可以将本学位论文的全部域部分内容编入有关数据库进行检索，可以采_ l j 影印、缩印 或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：显啦导师签名：f 竣生尘日期：翌二兰。 山东大学硕士学位论文 抗真菌蛋白和几丁质酶基因克隆与表达研究 摘要 随着大棚蔬菜的日益普及，防治真菌病害的化学农药带来的残余危害日益突 出。在众多的生防菌中，木霉以其强大的拮抗和寄生植物病原菌而具有巨大的经 济价值。在食品饲料和生物农药领域内木霉有着巨大的应用前景，对天然生防木 霉的基因工程改造以提高抗植物病源真菌的效果有着巨大的理论和实际价值。 本文从大棚蔬菜病害土壤中采取土样，设计了特定的木霉分离培养基，分离 得到了具有较强生防性能的木霉菌株w 5 1 2 。通过形态学观察和1 8 sr d n a 序列 的测定，鉴定为绿色木霉( t r i c h o d e r m a v i r i d e ) 。对w 5 1 2 的1 8 sr d n a 序列进行 了系统发育树分析，克隆了该菌株的几丁质酶基因e c h 。利用酶标仪和9 6 孔板 测定了植物病原真菌和生防木霉在液体培养基中的生长曲线。从产黄青霉中克隆 了抗真菌蛋白基因组基因和c d n a 基因。将融合型和非融合型抗真菌蛋白基因 转入大肠杆菌b l 2 1 表达，s d s - - p a g e 检测到重组大肠杆菌产生相应分子量的 蛋白条带，但未检测到抗真菌活性构建了含有c b h l 启动子和终止子的真菌诱 导型表达载体p c b h ，将抗真菌蛋白基因插, h p c b h 得到重组表达质粒p c b h 中吃 用p c b h - p a f 和p 3 s r 2 共转化w 5 1 2 ，在乙酰胺平板上初筛得到6 株转化子。对 阳性转化子进行了p c r 和点杂交验证。抗真菌活力测定表明抗真菌蛋白基因在 转化子l 2 中得到了成功表达。构建了含有g , p d 启动子和终止子的真菌组成型表 达载体p g 。采用重组p c r 将抗真菌蛋白基因( p a d 和几丁质酶基因( e c h ) 以 及c b h l 的底物结合区和连接区( 1 i n k e r + c b d ) 连接构建了融合基因p a f - e c h c b d 。 将几丁质酶基因和p a f - e c h c b d 融合基因分别插入载体p g ，得到相应的重组质粒 p g e c h 和p g r 。用p g e c h 和p 3 s r 2 共转化w 5 1 2 ，经p c r 验证得到一株阳性 转化子。p g r 对w 5 1 2 的转化工作正在进行中。 本文克隆得到的产黄青霉抗真菌蛋白基因和绿色木霉几丁质酶基因为迸一 步研究两种酶的作用机理和酶的定向进化奠定了基础。实验结果为探讨优化抗真 菌活力测定方法提供了较好的思路和试验数据，对生防木霉的遗传改造进行了初 步的探索，对抗真菌蛋白和几丁质酶融合蛋白在绿色木霉中的表达作了有益的尝 试。研究结果对生物防治木霉菌株的遗传改造有一定的借鉴和推动作用。 关键词：绿色木霉；产黄青霉；抗真菌蛋白；几丁质酶；生物防治 融合表达 一 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t c l o n i n g a n de x p r e s s i o no f a n t i f u n g a lp r o t e i na n dc h i t i n a s eg e n e w i t ht h ep o p u l a r i z a t i o no fg r e e n h o u s ev e g e t a b l e s ，t h eh a r mw h i c hp a t h o g e n yf u n g i c a u s ei sb e c o m i n gs e r i o u s t h ee m p l o y m e n to ft h et r a d i t o n a lc h e m i s t r yp e s t i c i d e i n e v i t a b l yb r i n gt h er e m a i n i n gd a n g e r i ti sk n o w nt oa l lt h a tm a n ym i c r o b ec o u l db ee f f e c t i v et or e s t r a i nt h ep a t h o g e n y f u n g is i n c et h e1 9 6 0 s a m o n gt h eb i o c o n t r o lm i c r o b et r i c h o d e r m ai sv e r yc o m m o n a n dh a se c o n o m i c a ls i g n i f i c a n c e t r i c h o d e r m ah a ss e r i o u sa n t a g o n i s ma n dp a r a s i t e a c t i o nw h e nc o m f f o n t i n gt h ep a t h o g e n ) , f u n g if r o mp l a n t t h e r ei s w i d e s p r e a d i l g ei nt h ef e e da n df o o da n dt h eb i o l o g i c a l p e s t i c i d e i n d u s t r y t h es t u d yo ft r i c h o d e r m ah a st h e o r ys i g n i f i c a n c ea n dp r a c t i c a la p p l i c a t i o n v a l u e t h i sw o r kf o c u s e do ng e n e t i c a l l yi m p r o v i n gt h et r i c h o d e r m aw 5 1 2w h i c hw a s s e p a r a t e df o r ms o i lt og a i nb e t t e ra n t i f u n g a lp e r f o r m a n c e w ea d o p t e dt h es o i ls a m p l ef r o mt h eg r e e n h o u s ea r o u n dj i n a n ，d e s i g n e ds p e c i f l c a l t f i c h o d e r m as c r e e n i n gm e d i a , s e p a r a t e dat r i c h o d e r m ah a v i n gp r e f e r a b l yb i o c o n t r o l a b i l i t y ，i d e n t i f i e da p p r o x i m a t e l yt h ef u n g ia st r i c h o d e r m ab yt h em o r p h o l o g i co b s e r v a t i o n ，m a d ep h y l o g e n e t i er e l a t i o n s h i pa n a l y s i so n18 sr d n as e q u e n c et oi d e n t i f i e di t a st r i c h o d e r m av i r i d e ，c l o n e dt h ec h i t i n a s eg e n e ( e c h ) f r o mw 5 1 2 i nt h i sw o r km i c r o p l a t er e a d e ra n d9 6 w e l lf l a t t e d b o u o mp l a t ew e r eu s e dt o m e a s u r et h ec u r v eo ft h ef i l a m e n t o u sf u n g ig r o w t h ，a l s ow e r eu s e dt od e t e r m i n et h e a n t i f u n g a le f f i c e n c yo f t h es a m p l e w ea l s oc l o n e dt h ea n t i f u n a lp r o t e i ng e n e ( p 奶a n d e d n a g e n e i n t h ee s c h e r i c h i ac o l ib l 21w e e x p r e s s e d t h ep a f p r o t e i n ( g s t p a f ，g s t - p r o p a f ，g s t - m a t u r e p a f ，m a t u r e p a f )b y v i r t u eo f e x p r e s s i o nv e c t o rp b v 2 2 0a n df u s i o ne x p r e s s i o nv e c t o rp g e x 4 t - 1 b u tn oa n t i f u n g a l a c t i v i t yw a sd e t e r m i n e d w ec o n s t r u c t e dt h ei n d u c e df u n g a le x p r e s s i o nv e c t o r ( p c b h ) b yv i r t u eo ft h e t e r m i n a t o ra n dp r o m o t e ro ft h ec b h l f r o mt r i c h o d e r m ar e e s e i w ee o t r a n s f o r m e dt h e w 5 1 2u s i n gt h ep l a s m i da n dp 3 s 婵a tp r e s e n tw ei s o l a t e ds i xt r a n s f o r m a n t s 2 遵 山东大学硕士学位论文 c o r r e s p o n d i n gt op c b h - p a fb yv i r t u eo fp c ra n dd o t - b l o t t i n g t h ea n t i f u n g a l e f f i c e n c yo ft r a n s f o r m a n tl 2w a sd e t e r m i n e df a i n t l yb ya n t i f u n g a lt e s t i ts h o w e d a p p r o x i m a t e l yt h a t p a f g e n eh a sb e e ne x p r e s s e ds u c c e s s f u l l yi nt h et r a n s f o r m a t a n tl 2 t h ec o n s t i t u t ef u n g a le x p r e s s i o nv e c t o ro g ) w a sc o n s t r u c t e db yv i r t u eo ft h e t e r m i n a t o ra n dp r o m o t e ro f g p d g e n ef r o ma n i d u l a n s b yv i r t u eo f r e c o m b i n a n tp c r , w ec o n s t r u c t e dt h er e c o m b i n a n tg e n eo f p a f a n de c ha n dc b dd o m a i nf r o mc b h io t t r i c h o d e r m ar e e s e i a f t e rw es u b c l o n e de c ha n dr e c o m b i n a n tg e n ei n t op qw eg o t b i o c o n t r o lp l a s m i d0 g - e c h ，p g r ) a c c o r d i n g l y t h et r a n s f o r m a t i o nw o r ki ss t i l lo n t h i sa r t i c l e l a i dg o o df o u n d a t i o nf o rc a r r yo u ts t u d yo na c t i o np r i n c i p l ea n d d i r e c t i o n a le v o l u t i o no fa n t i f u n g a lp r o t e i ng e n ea n dc h i t i n a s eg e n e ，p r o v i d e dag o o d r e f e r e n c ef o rt h eo p t i m i z a t i o no ft h em e t h o do fm e a s u r i n ga n t i f u n g a la c t i v i t y , m a d e b a s i cr e s e a r c ho nr e c o n s t r u c t i o no fb i o c o n t r o lt r i c h o d e r m a t h i sw o r ka l s om a d ea b e n e f i c i a la t t e m p tt oe x p r e s st h ef u s i o np r o t e i ni nt r i c h o d e r m av i r i d e t h eo u t p u to f f e r s o m em e a n i n g f u le x p e r i e n c eo i lb i o c o n t r o lt r i c h o d e r m ag e n e t i c a l l yi m p r o v m e n t i o n k e y w o r d ：t r i c h o d e r m av i r i d e ；p e n i c i l l i u mc h r y s o g e n u m ；a n t i f u n g a lp r o t e i n ；c h i t i n a s e ； b i o c o n t r o l ；f u s i o ne x p r e s s i o n 3 蕾 山东大学硕士学位论文 第一章绪论 活体微生物农药是拮抗有害生物的微生物活体。例如，自僵菌是一类真菌杀 虫剂本身是真菌，具有杀虫活性；苏云杆菌( 8 0 是一类细菌杀虫剂。从目前的市场 需求和科技发展来看，活体微生物农药相比传统的化学农药有更多的优势和更广 阔的前景。目前来说木霉生物防治已经在很多方面取得了实际的应用效果。比如 可危害蔬菜、果树及花卉等多种植物的葡萄孢菌( b o t r y t i s ) 灰霉病的生物防治。 1 植作物真菌病害概述 植作物真菌性病害主要可表现为： ( 1 ) 在病害发生部位，出现病斑，天气湿度大( 如早晨) 时，病斑上有病症如 粉、霉层、黑色颗粒等) 出现。如黄瓜霜霉病，发病部位主要在叶片上，形成多 角形病斑。潮湿时，在病斑处长出紫黑色霉( 病菌的孢囊梗和孢子囊) 病症。 ( 2 ) 病株枯萎、黄萎枯萎病的病株表现为全株凋萎，根系腐烂，病株基部茎上 有粉红色霉层，剖开茎基部，维管束呈褐色。如瓜类作物的枯萎病、黄菱病的病 株，病叶由黄变褐，并自下而上逐渐凋萎、脱落，剖开病株的根和主茎，维管束 变褐，如茄子黄萎病 蔬菜上真菌类病害有1 0 0 0 种左右，常见病害2 0 0 种左右。 a 、杓激毛菌弧门与植物病害有关的只有根肘，菌纲和卵菌纲。 ( i ) 根肿菌纲( 变形菌纲) 危害栽培植物的主要有2 个属。根肿菌属；粉痂 菌属，如马铃薯粉痂病。 ( 2 ) 卵菌纲稻绵腐病，幼苗猝倒病、根腐病、马铃薯和番茄晚疫病，水稻、 小麦及玉米霜霉病。 b 、接合菌亚门 陆生型腐生菌，少数弱寄生菌，侵染果实、块根、块茎，使农产品在贮臧期 发病腐烂。如甘薯软腐病。 c 、子囊菌亚门 ( 1 ) 半子囊菌纲，如桃缩叶病。 ( 2 ) 核菌纲，如小麦赤霉病。 ( 3 ) 腔菌纲 4 山东大学硕士学位论文 ( 4 ) 盘菌纲，如油菜菌核病。 d 、担子菌亚门 ， 黑粉菌目引起禾本科黑粉病。锈菌目是担子菌中重要类群。所有锈菌都产生 外生型冬孢子、典型锈菌有性孢子、锈孢子、夏孢子、冬孢子和担孢子五种孢子 类型。 e 、半知菌亚门 ( 1 ) 丝孢纲如引起多种植物的立枯病。 ( 2 ) 腔孢纲柑桔疮痂病、烟炭疽病、辣椒炭疽病、芭蕉炭疽病。 2 木霉研究进展 2 1 木霉的分类 木霉( t r i c h o d e r m as p p ) 属于半知菌亚门丝孢纲丝孢目，是一类分布广泛的土 壤习居菌，常见于植物残体及动物粪便上。除个别为弱病原菌外，大多数对植物 病菌具有拮抗作用。由于木霉广泛适应性、产生拮抗物的多样性和寄生的广谱性， 作为植物病害生物防治的拮抗菌被广泛研究。有些种类已经登记注册为生物杀菌 剂f 1 埘。 由于木霉菌株的形态特征复杂，又缺乏稳定性。木霉菌的种类鉴定长期处于混 乱状态【3 l 。1 9 6 9 年前，木霉菌的种类鉴定或是依据g i l m a n l 4 1 的工作，或是各行其是， 没有统一的标准。许多真菌学家检查了大量木霉菌分离物，没有发现稳定的鉴别 特征可用，因此主张木霉菌是一个单种属( m o n o t y p i c g e n u s ) ，此后相当长一段时问 内，凡是产生绿色孢予的木霉菌都定为绿色木霉( t v i r i d e ) 。然而木霉属是一个单种 属的概念并未被g i l m a n 接受，在1 9 5 7 年出版的( m a n u a lo f s o i lf u n g i 一书中，他 仍把木霉属划分为4 个种f 4 】o1 9 6 6 年，r i f a i 和w e b s t e r 旧发现h y p o c r e a 的不同种 产生相似的木霉菌类无性型，不是单种属，因此1 9 6 9 年他们依据对h y p o c r e a 属的 分生孢子阶段的研究，对木霉属的种类进行了修订，确定了9 个集合种( s p e c i e s a g g r e g a t e s ) 1 5 1 。他将集合种定义为“形态上非常相似而且难以彼此区分的集合”。 从1 9 8 4 年到1 9 9 1 年卫i s s e t t 在上述研究工作的基础上也对木霉属的分类进行了 修订，除了r i f a i l 5 1 确定的种以外，又追加了许多种，并将木霉属分为5 个组帕叫。 b i s s e t t 等人把木霉菌属( t r i c h o d e r m a ) 分为5 个组，共3 1 个种。h y p o c r e a n u m 组 包括一个种t 1 a c t e a ；l o n g i b r a c h i a t u m 组包括4 个种，即 山东大学硕士学位论文 t 1 0 n g i b r a c h i a t u m ，t c i t r o v i r i d e ，t p s e u d o k o i n g i i 和t p a r c e r a m o s u m ；s a t u r n i s p o r u m 组 包括2 个种，t s a t u r n i s p o r u m _ 和jt g h a n e u s e ；p a c h y b a s i u m 包括2 0 个种，即t c r a s s u m ， t c r o c e u m ，t f a s c i c u l a t u m ，t f e r t i l e ，r 1 l a v o f u s c u m ，t r i c h o d e r m aa n a m o r p h o f h y p o c r e aa t i n o s a ，h y p o c r e aa t i n o s a , t , h a m a t u m ，z h a r z i a n u m ，z l o n g f p g i s ， t m i n u t i s p o r u m ，t o b l o n g i s p o r u m ，t p o l y s p o r u m ，t p u b e s c e n s , t r i c h o d e r m a a n a m o r p ho fh y p o c r e as e m i o r b i s , t s p i r a l e ，t , s t r i c t i p i l s 。t s t r i g o s u m 。t t o m e n t o s u m 和t v i r e n s ；t r i c h o d e r m a 组包括4 个种，即z v i r i d e ，t a u r e o v i r i d e ，t k o n i n g i i 和 z a t r o v i r i d e 。以上是木霉菌属目前最完整的分类体系 目前用于生物防治研究的木霉菌有7 种，部哈茨木霉( zh a r z i n u m ) 、钩状木霉 ( zh a m a t u m ) 、长枝木霉( zl o n g i b r a c h i a t u m ) 、康氏木霉( t k o n i n g i i ) 、绿色木霉 ( t v i r i d e ) 、多抱木霉( r p o l y s p o r u m ) ，t a s p e r e l l u m 。 2 2 真菌的分子生物学鉴定手段 分子生物学手段已经用于木霉菌的分类研究1 0 l ，在实际工作中，形态鉴定仍 然是最为方便、最为常用的方法。因此将来木霉菌的分类结果还要通过形态学方 法来表述，而分子生物学方法则能使木霉菌的分类更加合理，更加接近“自然”的分 类系统。 目前国外发展的主要分子生物学手段是一般为先设计特定的引物通过p c r 方法对真菌d n a 的一些保守序列进行扩增，实践取得成功的保守序列如下：热休 克蛋i 刍( h s p 9 0 ) 基因，5 s r r n a 和邻近的非转录区( n t s ) ，肌动蛋l ! t ( a c t i n ) 基因， 1 8 s r r n a 基因保守序列，内部转录间隔区( i t s ) ，小亚单位r n a 的基因序列，天 冬氨酸蛋白酶基因，细胞色素p 4 5 0 羊毛甾醇a 去甲基化酶基因。 其他的分子生物学方法包括： a 真菌g + c m 0 1 分类鉴定法两菌株g + c 含量差别在2 之内是无意义的：g + c 含量差别在4 - - 5 之间，可认为是同一个种内的不同菌株；若差别在1 0 0 一1 5 之 内，可认为是同属内的不同种真菌；若差别在2 0 - - 3 0 ，则认为是不同属，甚至是不 同科内的真菌。 b 核酸杂交鉴定真菌核酸分子杂交可大致分成两类：种特异性探针杂交和多态性 探针杂交，种特异性探针的主要作用是鉴定真菌种；多态性探针在2 0 世纪9 0 年 代发展迅速，从来源上分，真菌多态性探针有基因组d n a 多态性探针，线粒体 6 山东大学硕士学位论文 d n a 多态性探针，r r n a 多态性探针，微( 小) 卫星重复序列d n a 探针等 c 核酸序列分析 真菌线粒体d n a ( m t d n a ) 序列的分析m t d n a 是真核生物核外d n a 的一 种，由于其容易抽提，且为单拷贝，不含基因间隔区和内含子，也无不等交换基因重 组与倒位，易位等畸变，因此在分子进化研究中很受青睐。 真菌小亚基：( s s u ) r d n a 序列测定r d n a 编码基因序列由于其在进化过程中 保守性强，而且其序列中又不乏有可变区和高变区，既可以用于设计真菌通用引物， 也可用于进行真菌种间的鉴别。s s u r r n a 的编码保守性强，一般适合于种以上分 类水平的研究。 d 核酸指纹分析技术 真菌随机扩增多态性d n a 分析( r a p d ) ，真菌限制性片段长度多态性( r f l p ) 分析，真菌核型的脉冲电泳分析( p f g e ) ，多位点酶电泳( m u l t i l o c u se n z y m e e l e c t r o p h o r e s i s ) ，可溶性全细胞蛋白单向s d s p a g e 图谱薄层扫描分析。 2 3 木霉的生防机理和作用因子 木霉菌对植物病原菌的生防作用包括竞争作用、重寄生作用和抗生作用等。 a 胞外酶抑菌作用 e l m ! l 等认为木霉菌的重寄生作用是其拮抗病原真菌的主要机制。它包含了 对病原菌的侵袭、识别、接触、缠绕、穿透和寄生等一系列连续步骤的复杂过程。 在木霉菌与病原菌互作的过程中，寄主菌丝能分泌出一些物质使木霉菌趋向寄 主生长，一旦寄主被木霉菌寄生物所识别，就会建立寄生关系。b a r a k 、e l a d 等1 1 2 l 证明寄主真菌细胞表面的特定外源凝集素( 1 e c t n j 在识别中起一定作用，并决定 木霉菌与寄主真菌之问的专化关系。e l a d 等【”】研究表明，木霉菌和寄主真菌识别 后，木霉菌丝沿寄主菌丝平行生长和螺旋状缠绕生长，并产生附着胞状分技吸附 在寄主菌丝上，通过分泌胞外酶溶解细胞壁，穿透寄主菌丝，吸取营养。当移去 寄生菌丝后，发现病原菌菌丝上有溶解位点和穿透孔的存在。多数学者认为拮抗 木霉菌在寄生过程中产生了一系列降解病原菌细胞壁的水解酶，如几丁质酶 i 。c h i t i n a s e ) 、纤维素酶1 c c e l l u l a s e ) 、木聚糖酶( x y l a n a e ) 、葡聚糖酶( g l u c a n a s e ) 和蛋 白酶( p r o t e i n a s e ) 等。研究表明。与拮抗木霉菌的生防作用有关的胞外酶主要是几 丁质酶和p l ，3 一葡聚糖酶。几丁质酶包括内切酶和外切酶两类，其中外切酶为 山东大学硕士学位论文 n - 乙酰心氨基葡萄糖苷酶( n a e e t y l g l u e o s a r n i n i d a s e ) 和几丁二糖酶 ( c h i t o b i o s i d a s e ) 这两类酶对植物病原真菌的细胞壁具有强烈的水解作用，从而 抑制病原菌孢子萌发并引起菌丝以及孢子的消解，而且这两类酶之间具有协同 作用，同时也具有与杀菌剂及细菌等生防因子协同作用的功效【1 4 1 。 p - l ，3 - 葡聚糖是真菌细胞壁的重要成分p 1 ，3 葡聚糖酶( 包括外切酶和内切 酶) 直接参与哈茨木霉菌与其寄主真菌之间的重寄生作用1 甜。 几丁质酶和d 1 ，3 - 葡聚搪酶对病原真菌细胞壁具有强烈的水解作用，它们不 仅能降解病原真菌成熟菌丝的顶端，同时也能降解具有几丁质葡聚糖复合结构 的老熟细胞壁以及菌核。当两种酶共同存在时，抗菌活性急剧升高。l o r i t o 等 f 阍、s e l a b u u r l a g e 等1 7 1 所做的体外试验以及v a m d e i l e i z c n 等1 8 1 的转基因 植物都证明了这一点 b 抗菌素类物质抑菌作用 多种木霉菌能产生挥发性或不挥发性的抗菌素类物质。据报道这些抗菌物 质为木霉菌素( t r i c h o d e r m i n ) 、胶霉毒素( g l i o t o x i a ) 、绿木霉索( v i r i d i n ) 、 抗菌肽( a n t i b i o t i cp e p t i d e ) 等 1 9 2 0 。木霉菌能产生抗真菌代谢产物。一个菌株可 产生多种抗生素，如哈茨木霉菌可产生1 2 种，康氏木霉菌可产生9 种，绿 色木霉菌可产生l o 种。这些抗生素的化学性质各不相同，包括戊酮、辛酮、 萜类、多肽和氨基酸衍生物等。 b i s s e t t l 2 1 】和b e n f t e z 等【2 2 1 从长枝木霉菌( t 1 0 n g i b r a c h i a t u m ) 及绿色木霉 菌( t v i r i d e )中分离提纯出一组特殊的抗菌肽，命名为t r i c h o b r a c h i n 和 t r i c h o v i r i n ，并测定了其氨基酸序列。 c 水解酶启动植物的防御反应 木霉菌产生几丁质酶和d ，l ，3 葡聚糖酶被认为抗植物病原真菌中发挥重要作 用2 3 1 。有人认为寄主感染时，这两类酶活性一起增高。d 1 ，3 葡聚糖酶使真菌细 胞壁释放出3 - 1 ，3 葡聚糖来源的诱导物，启动植物的防御反应，导致植物产生和 积累与抗病性有关的酚类化合物和木质素等。 g e r e m i a 等从哈茨木霉菌株中分离鉴定了其中一种碱性蛋白酶，并成功 克隆了相应的基因尸，6 ，。蛋白酶能使消解植物细胞壁的病原菌降解，直接抑制病 原菌萌发，使病原菌的酶钝化，阻止病原菌侵入植物细胞。 山东大学硕士学位论文 d 保护酶增强植物抗病性 过氧化物酶( p e r o x i d a s e ，p o d ) 、超氧化物歧化酶( s u r p e r o x i d ed i s m u t a s e ， s o d ) 与过氧化氢酶( c a t a l a s e ，c a t ) 等都是膜脂过氧化过程中的重要保护酶。它 使0 2 、h 2 0 2 等转变为活性较低的物质，降低或消除它们对膜脂的攻击能力， 使膜脂不被氧化而得到保护。哈茨木霉菌不仅能够提高p p o 和p o d 酶的活 力，而且还能诱导产生新的同工酶谱带。 e 协同拮抗作用 木霉菌的拮抗作用被认为是2 种或3 种机制同时或顺序作用的综合。 f 毒性蛋白作用 从一个绿色木霉菌株中分离到一种蛋白质t r i c h o l i n ，是核糖体钝化蛋 白，能抑制r h i z o c t o n i as o l a n i 生长与繁殖。 3 真菌的细胞壁 3 i 真菌的细胞壁结构 丝状真菌细胞壁的结构如图1 1 所示 、， - h ，_ 图l - l 丝状真菌类的细胞肇结构 细胞壁代谢与真菌的生长和分裂密切相关，其作用是控制细胞内膨胀压力于 保持菌体的完整性，其细胞壁的破坏必然导致菌体的溶解。大多数真菌细胞壁的 成分包括几丁质，p 或a 葡糖和各种甘露蛋白，其中几丁质和绳样葡聚糖纤维 9 山东大学硕士学位论文 ( r o p e 1 i k eg l u c a nf i b i l s ) 在维持细胞形态和张力上起重要作用1 2 5 1 因而细胞壁 的相关结构也成为了重要的抗真菌靶点。 几丁质在细胞膜表面合成并于微纤维的形式分泌胞外，在胞外通过强烈的氢 键作用反向平行排列形成a - 几丁质。葡聚糖链是葡萄糖以b - 1 ，3 键相连接，间 或b - 1 ，6 键相连，3 条葡聚糖链平行分布形成一个螺旋构成疏水的纤维网状 结构。用热碱除去其他的细胞壁成分后，电镜下的葡聚糖网状结构仍然保持完整 细胞时的结构。甚至在几丁质含量丰富的真菌中1 3 1 ，3 一葡聚糖仍是保持细胞 壁完整的必要成分。当然也有例外在8 一l ，6 一葡聚糖为主链的cn e o f o r 腑n s 中 b 一1 ，3 一葡聚搪单元并不承担维系细胞壁结构完整的主要作用。细胞壁生长主 要发生在菌丝顶端或是酵母芽殖点面上。正如合成的几丁质一样，b - - 1 ，3 一葡 聚糖主要聚集在这些位置上。就普遍而言，b l ，3 一葡聚糖合成酶最少包括两 大部分。部分是受底物u i ) p g l c 的保护而能抵抗热变性的催化结构域，另一部 分是g t p 结合区并起到激活催化结构域的作用，这部分能够通过盐析和表面活性 剂的作用分离得到。在体外试验中可以发现u d p g l c 是唯一的能够被酶用来形成 水不溶性碱溶性的b 一1 ，3 一葡聚糖的核酸一盐复合物，一部分葡聚糖单元能在 细胞壁成熟的时候共价连接到几丁质上使得1 3 一l ，3 一葡聚糖转变为碱不溶性。 酵母细胞壁的外层甘露糖基化蛋白看起来应该共价连接在d l ，3 葡聚糖链 上以起到稳定的作用。p l ，6 一葡聚糖为主要结构时其上很少连接有与p 一1 ，3 葡聚糖经常连接的蛋白，现在可以肯定的是b l ，6 葡聚糖链为次级代谢产物。 3 2 真菌细胞壁结构分子信号通路 为了抵御胞内的高压作用，真菌细胞壁进化得相当得坚厚。当在胞壁降解酶 的作用下，细胞壁渐渐破裂，细胞膨胀直至破裂。长期进化使得外界生物就能够 分泌这些酶来抵御真菌。另外细胞壁不得不调整自己的结构和组成来完成生长分 支细胞融合和其他各种形态学事件，这个时候就有破壁的风险了为了适应这种 需要，真菌就需要在信号通路的作用下维持胞壁的完整性。在酿酒酵母中这个通 途叫做s l t 2 p m p k i p 。最近的研究表明至少有2 0 个细胞壁完整性方面的基因在这 个通路中并受着同一个转录因子r l m l p 的调控。 酿酒酵母和白假丝酵母细胞壁含有的四类大分子：细胞壁蛋白，p 1 ，6 葡聚 糖，1 3 - 1 ，3 葡聚糖和几丁质，他们彼此之间以共价键相连。这些组分互相补充， 0 山东大学硕士学位论文 当某一成分量减少时，另外的成分束弥补其造成的胞壁力度损失。几丁质更多而 言是沉积在胞壁侧部。细胞壁完整性通路在酵母和丝状真菌中是保守的，当缺失 p c k 2 p 时会导致细胞壁的受损，p c k 2 p 通过激活其下游的m a p 激酶盒( m k h l p e k l s k h l ，p m k l s p m l ) ，促进m a p k 激酶的活力表达。在这种激酶活力 较低的情况下，细胞壁交易受到葡聚糖酶的攻击，相应的例子可以在白假丝酵母 中看到。 许多细胞壁维持基因是在多项信号通路的控制下。转录学研究表明细胞壁蛋 白的表达是受细胞周期和营养氧份的调控，y j 夕i , 有趣的是在提高温度的情况下促 活了m p k l p ，意味着多信号调控是相对应于热压力的，因为同时可以发现在细 胞壁维持基因的启动子中游压力响应元件的存在。 3 3 丝状真菌的细胞菌丝顶端生长和核酸的流动 幽卜2 丝状真菌的细胞菌丝顶端生长和核酸的流动 顶端生长是丝状真菌的主要生长方式( 见图1 - 2 ) 。孢子在营养条件下，孢子 首先等倍生长，在这个过程中细胞壁的材料被相应的组装到位，细胞相应变大， 细胞中的核酸等倍或2 信稀释分成2 或4 个核酸。接着胞壁管开始极化。但是细 胞如何决定从等倍生长到极化生长和在何处极化还不是十分清楚。当然现在一般 认为酵母发芽的位置取决于上轮酵母芽殖周期形成的痕迹处。 其实在顶端生长过程中核酸的平衡流动分布是一个关键的事件。顶端生长伴 随着钙梯度和p h 梯度，同时胞内的高压也是顶端生长的关键因素。在菌丝顶端 通过细胞学实验可以发现一些囊泡，其中富含有各种肌动蛋白，当然还有其他一 些罩白参与极化生长，在n c r a s s a 中包括依赖c a m p 的蛋白激酶。 山东大学硕士学位论文 在核酸移动中靠近顶端的移动距离大，实验证明细胞质微管动力蛋白和肌动 蛋白是核酸移动的引擎。细胞质微管动力蛋白是一个依赖a t p a s e 复合体，包括 a t p 结合重链，中间链，轻链。激光膜片钳实验证明了星型微管和附近的核酸之 间依赖动力蛋白的相互作用对核酸的分离和移动起重要作用。 一旦顶端形成，她就会沿着直线生长并分支，相应的卷曲或分支过多的菌丝 生长缓慢可能是因为核酸流动分布的困难和相应顶端生长所需结构物质的供应 困难，顶端起物质供应中心作用并依赖微管的囊泡显然控制了分支前进的方向。 动力蛋白、微管和肌动蛋白相互作用形成了古怪的细胞壁并导致了婉蜒曲折的菌 丝的生成。 4 抗真菌蛋白研究进展 4 1 抗菌肽 抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，分子量在 2 0 0 0 7 0 0 0 左右，由2 0 6 0 个氨基酸残基组成。这类活性多肽多数具有强碱性、 热稳定性以及广谱抗菌等特点世界上第一个被发现的抗菌肽是1 9 8 0 年由瑞典 科学家g b o m a n 等人经注射阴沟通杆菌及大肠杆菌诱导惜古比天蚕蛹产生的具 有抗菌活性的多肽，定名为c e c r o p i n s 。此后数年间，人们相继从细菌、真菌、 两栖类、昆虫、高等植物、哺乳动物乃至人类中发现并分离获得具有抗菌活性的 多肽。由于最初人们发现这类活性多肽对细菌具有广谱高效杀菌活性，因而命名 为“a n t i b a c t e t i a lp e p i i d e s ，a b p ”，中文译为抗菌肽，其原意为抗细菌肽。随着人 们研究工作的深入开展，发现某些抗细菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等 均具有强有力的杀伤作用，因而对这类活性多肽的命名许多学者倾向于称之 为”p e p t i d ea n t i b i o t i c s ”一多肽抗生素。 天然抗菌肽通常是由3 0 多个氨基酸残基组成的碱性小分子多肽，水溶性好， 分子量大约为4 0 0 0 道尔顿左右。大部分抗菌肽具有热稳定性，在1 0 0 c 下加热 1 0 1 5 m i n 仍能保持其活性。多数抗菌肽的等电点大于7 ，表现出较强的阳离子 特征。抗菌肽对较大的离子强度和较高或较低的p h 值均具有较强的抗性。此外 部分抗菌肽尚具备抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的能力。 抗菌肽功能从目前的研究结果来看，抗菌肽杀菌机理主要是作用于细菌的细 胞膜，破坏其完整性并产生穿孑l 现象，造成细胞内容物溢出胞外而死亡。首先由 山东大学硕士学位论文 静电吸引而附于细菌膜表面，疏水性的c 端插入膜内疏水区并改变膜的构象， 多个抗菌肽在膜上形成离子通道而导致某些离子的逸出而死亡。亦有学者认为抗 菌肽作用于膜蛋白引起凝聚、失活及离子通道，引起膜渗透性改变而导致死亡。 不同类别的抗菌肽的作用机理可能不一样。 4 2 抗真菌肽 抗真菌肽存在广泛，在哺乳动物，微生物中都能找到。他们的结构随抗真菌 的性质变化而变化。在过去的l o 到1 5 年中，有至少1 0 0 种抗真菌肽已被研究。 他们来源各异，结构上来说线性或是环状分子，倾向于疏水或是两性。抗真菌活 性的机理有可能是：1 多肽吸附在外膜上以消化或作用于上；2 穿过膜并和膜内 特定的靶点相互作用：3 使膜形成离子极化，使胞内物质流失。 目前为止发现的来源于子囊菌的有：a f p ( 来源于巨大曲霉) ；p a f ( 来源于产 黄青霉) ，类似的还有n a f ( 来源于p e n i c i l l i u mn a l g i o v e n s e ) ；a n a f p ( 来源于 黑曲霉) 。他们都是富含二硫键强碱性的小分子蛋白。p a f 的氨基酸组成和a f p 具有4 2 的相似性，和a n a f p 具有3 7 ，和n a f l 0 0 。他们能够对广泛的真 菌起作用。但是敏感菌并不相同，也反映了这三类抗菌肽的作用机理的不同 1 5 几定质酶研究进展 1 5 1 几定质的结构 m u c o r a l e s , d e u t e r o m y c e l e s 和a s c o m y c e r e s ( a s p e r g i l l u s ，t r i c h o d e r m a ， v e r t i c i l l i u m ，t h i e l a v i a ，p e n i c i l l i u m 和h u m i c o l a ) ，这些真菌具有特征性的诱导几 丁质酶分解系统。几丁质又称甲壳质或甲壳素。是一种生物多聚物。自然界中每年 生成的几丁质总量仅次于纤维素总量，几丁质是多数真菌细胞壁的主要成分，同时 也大量存在予昆虫和动物的甲壳中，几丁质可以通过几丁质酶的作用进行生物降 解。几丁质英文缩写为( g i c n a c ) n ，几丁质脱乙酰基后即为几丁糖( c h i t o s a n ) 。 图1 - 3 几定质和几定糖 山东大学硕士学位论文 几丁质在地球上的含量非常丰富，仅次于纤维素，而它又具有比纤维素更加丰 富的功能性质它作为结构内容物存在于许多物种的外壳中，比如真菌的细胞壁 1 2 6 1 、寄生线虫的微纤维鞘口7 1 、节肢动物的外骨架以及许多昆虫的肠道内壁1 2 8 1 ，但 值得提出的是至今尚未在包括人在内的哺乳动物中发现几丁质的存在。