（生物化学与分子生物学专业论文）可去除选择标记的植物抗逆转基因研究.pdf

四川农业太学硕士学位论文 a b s t r a c t a b i o t i cs t r e s s e ss u c ha sd r o u g h t ，s a l t i n g ，a n dl o wt e m p e t a t u r ec a u s ea d v e r s ee f f e c t so nt h e g r o w t ho fp l a n t sa n dt h ey i e l do fc r o p s t oi m p r o v es t r e s s t o l e r a n c eo fc r o p s ，t h ee m p l o y m e n t o fg e n ee n g i n e e r i n gt e c h n i q u eh a sb e e na ni m p o r t a n tt r e n di np l a n ts t r e s s t o l e r a n c eb r e e d i n g i n2 1s tc e n t u r y t h eu s eo fs e l e c t a b l em a r k e rg e n e se n c o d i n ga n t i b i o t i co rh e r b i c i d er e s i s t a n c ef o r t r a n s g e n i cc r o p sh a sp o t e n t i a ln e g a t i v ee f f e c t s i tm a i l yc a u s e ss a f e t yo fe n v i r o n m e n ta n d h u m a nh e a l t h ，w h i c hb r i n g si n c r e a s i n gp u b l i cc o n c e r na n dt h e i ra c c e p t a n ct ot r a n s g e n i c p r o d u c t s ，p r e c l u d e st h eu s eo ft h es a m em a r k e rg e n ef o rt h es e l e c t i o no fm u l t i t r a n s f o r m e d p l a n t s ，d e l a y st h em a r k e tp r o c e s so ft r a n s g e n i cc r o p s p r e s e n t l ym a n yp l a n tt r a n s f o r m a t i o n s y s t e m sh a v e b e e nd e v e l o p e di no r d e rt or e m o v es e l e c t a b l em a r k e rg e n e ss u c ha s c o t r a n s f o r m a t i o n s y s t e m ，s i t e s p e c i f i cr e c o m b i n a t i o ns y s t e m ，t r a n s p o s a b l ee l e m e n ts y s t e m a n dm a tv e c t o rs y s t e me t c d o u b l et - d n av e c t o rs y s t e mo fc o t r a n s f o r m a t i o ns y s t e mw a sa s i m p l ea n de f f i c i e n ts t r a t e g yt oo b l i t e r a t em a r k e rg e n e s ， t h et w od o u b l et - d n a p l a n te x p r e s s i o nv e c t o r s ，p c d m a r p w d t - h y ga n dp c d m a r - u s o d h y gi n c l u d i n gt a r g e tg e n ed r e ba n ds o dr e s p e c t i v e l y ，w e r ec o n s t r u c t e di no u r r e s e a r c h t h e yc o n t a i n e dp l a n ts e l e c t a b l em a r k e rh y g r o m y c i np h o s p h o t r a n s f e r a s eg e n e ( 幼订 a n dt a r g e tg e n ei nt w oi n d e p e n d e n tt - d n a r e g i o n t h ef l a n k i n go fd r e ba n ds o dg e n ei s m a rs e q u e n c ef r o mp e aw h i c hc o u l di n c r e a s eg e n ee x p r e s s i o nl e v e l as t r e s s i n d u c e d p r o m o t e rw a su s e dt od r i v et h ee x p r e s s i o no fd r e bg e n e t h e s et w ov e c t o r sw e r ei n t r o d u c e d i n t om a i z e ( z e am a p sl ) a n dr i c eb ya g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dt r a n s f o m l a t i o n ，t h e nt r a n s g e n i c m a i z ea n dr i c ep l a n t sw e r eo b t a i n e dt h r o u g ha b o u tt w om o n t h so fs e l e c t i o no nn 6m e d i u m c o n t a i n i n gh y g b ，am o n t ho fd i f f e r e n t i a t i o nm a dh a l fam o n t ho fr o o t a g e t h et r a n s g e n i c m a i z er e s u l to fp c r a s s a ys h o w e dt h a tf r e q u e n c yo fc o t r a n s f o r m a t i o nw i t hh 雕g e n ea n d d r e bg e n ew a s2 3 8 i nt r a n s g e n i cd r e bm a i z ep l a n t s b ys e x u a lp r o p a g a t i o nt h et w o g e n e sw i l lb es e p a r a t e di nt r a n s g e n i cp l a n td e s c e n d a n t s a n dw ew i l lo b t a i nm a r k e r - f l e e t r a n s g e n i cp l a n t s l o wt r a n s f o r m a t i o ne f f i c i e n c yi ss t i l lac r i t i c a lf a c t o rv , h i c ha f f e c t s p l a n tg e n e e n g i n e e r i n gd e v e l o p m e n t i no r d e rt oo p t i m i z et h et r a n s f o r m a t i o ns y s t e ma n di m p r o v e t r a n s f o r m a t i o ne f f i c i e n c y , w ea n a l y z e dc e r t a i n i n f l u e n c i n gf a c t o r so fm a i z eb y a g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o nb yg u sg e n et r a n s i e n te x p r e s s i o nw es t u d i e dt h e 里型垒些查量堡主兰垡堡圭 i n f l u e n c i n gf a c t o r so fg e n et r a n s f o r m a t i o ne f f i c i e n c yb ys e t t i n gh i 曲o s m o t i ct r e a t m e n t st o c a l l i ，d i f f e r e n tp hi n f e c t i o u ss u s p e n s i o na n dd i c o t y l e d o ns e n s i t i v et i s s u ei nc a l l i a c e o r d i n gt o s t a t i s t i c sa n a l y s i s ，l o wp hi n f e c t i o u ss u s p e n s i o nh a dt h em o s te v i d e n te f f e c to nt r a n s i e n t e x p r e s s i o ne f f i c i e n c yo f g u s ，a n dt h ei n f e c t i o u ss u s p e n s i o no f p h 5 2r e p r e s e n t e dt h eh i g h e s t t r a n s i e n te x p r e s s i o ne f f i c i e n c yo fg u s ；t h et r e a t m e n to fd i c o t y l e d o ns e n s i t i v et i s s u ei nc a l l i h a d h i g h e rt r a n s i e n te x p r e s s i o ne f f i c i e n c yo f g u s ，b e s i d e s ，h i 曲一o s m o t i ct r e a t m e n tw i t hl o g l m a n n i t o lt oc a l l ii nc o c u l t u r em e d i u mh a da l s oa ne f f e c to ni m p r o v i n gg e n et r a n s f o r m a t i o n e f f i c i e n c y k e yw o r d s ：s t r e s s t o l e r a n c eg e n ee n g i n e e r i n g ；a g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dt r a n s f o r r n a t i o n ； d o u b l et - d n a ；c o t r a n s f o r m a t i o n ；s e l e c t a b l em a r k e r - f r e e 四川农业大学硕士学位论支 一、文献综述 1 植物基因工程的发展 1 1 植物基因工程发展概况 转基因植物的研究始于2 0 世纪7 0 年代末、8 0 年代初，当时仅在少数植物种上由 野生型的m 和t i 质粒转化的细胞再生出植株。1 9 8 3 年z a m b r y s k i 等，1 9 8 4 年d eb l o c k 等分别报道用切去瘤基因的根瘤农杆菌( a t ) 及发根农杆菌( m ) 进行基因转移，获得 形态正常的转基因植株。1 9 8 5 年h o r s c h 等人首创了叶盘法，用a t 感染烟草外植体， 获得转基因烟草。迄今为止，全世界已分离目的基因数百个，获得转基因植物近2 0 0 种， 3 0 0 0 多例转基因植物被批准进入田间试验，至1 9 9 8 年l 【= 已批准3 0 种植物投放市场。 植物基因工程对农业发展的重要性举世瞩目( 王景雪，2 0 0 1 ) 。 从目前情况看，抗虫、抗除草剂基因工程产品开发较快，抗病基因工程的研究开发 需要进一步深入，抗逆、品质改良、生长发育等基因工程还有待基础研究的新突破。总 体来说，我国植物基因工程技术体系已初步建立，并取得了可喜的令人瞩目的进展。 1 2 植物基因转化受体系统的建立 建立良好的受体系统是植物基因工程的一个关键环节。良好的基因受体系统应满足 下面一些条件( 王关林，2 0 0 2 ) ：( 1 ) 高效稳定的再生能力；( 2 ) 受体材料要有较好的遗传 稳定性，尽量不发生体细胞变异；( 3 ) 具有稳定的外植体来源；( 4 ) 对选择性抗生素敏 感；( 5 ) 对农杆菌侵染有敏感性但无过敏反应。 由于多数的禾本科植物不是农杆菌的天然寄主，因此早期对禾本科的转化工作主要 是针对原生质体进行的。所采用的转化方法一般有p e g 法、电击法等。但是，原生质体 培养技术复杂、培养周期长、遗传稳定性差，且基因依赖性强，无法在有生产价值的品 种上应用，因而极大地限制了该转化体系的推广( 徐子勤，2 0 0 1 ) 。 玉米幼胚具有强烈的生活能力，是转化外源基因较好的受体。柯遐义等( 1 9 9 5 ) 选 用具有较强再生能力的甜玉米幼胚做转化受体，将新霉素磷酸转移酶( n e o m y c i n p h o s p h o r t r a n s f e r a s e ，n p t - i i ) 基 n ( n p t i i ) 平f l f l - 葡糖醛酸酶( 屉一g l u c u r o n i d a s e ，g u s ) 基 n ( u i d a ) 导入受体细胞并成功得到转基因植株。董云洲等( 1 9 9 9 ) 将g u s 基因导入玉米花粉中， 经人工授粉获得种子。 如何提高玉米转化细胞的再生能力是受体系统建立的瓶颈因素。外植体的类型、生 理状态、基因型、培养条件等因素都对再生频率有较大的影向。现有的主要转化受体一 股都要经过产生愈伤组织再生完整植株的过程。愈伤组织容易获得，再生能力比较强， 获得转化体的周期比较短。在玉米上已经获得了稳定的转化体。玉米胚性愈伤组织分三 四川农业大学硕士学位论支 一、文献综述 1 植物基因工程的发展 1 1 植物基因工程发展概况 转基因植物的研究始于2 0 世纪7 0 年代末、8 0 年代初，当时仅在少数植物种上由 野生型的m 和t i 质粒转化的细胞再生出植株。1 9 8 3 年z a m b r y s k i 等，1 9 8 4 年d eb l o c k 等分别报道用切去瘤基因的根瘤农杆菌( a t ) 及发根农杆菌( m ) 进行基因转移，获得 形态正常的转基因植株。1 9 8 5 年h o r s c h 等人首创了叶盘法，用a t 感染烟草外植体， 获得转基因烟草。迄今为止，全世界已分离目的基因数百个，获得转基因植物近2 0 0 种， 3 0 0 0 多例转基因植物被批准进入田间试验，至1 9 9 8 年l 【= 已批准3 0 种植物投放市场。 植物基因工程对农业发展的重要性举世瞩目( 王景雪，2 0 0 1 ) 。 从目前情况看，抗虫、抗除草剂基因工程产品开发较快，抗病基因工程的研究开发 需要进一步深入，抗逆、品质改良、生长发育等基因工程还有待基础研究的新突破。总 体来说，我国植物基因工程技术体系已初步建立，并取得了可喜的令人瞩目的进展。 1 2 植物基因转化受体系统的建立 建立良好的受体系统是植物基因工程的一个关键环节。良好的基因受体系统应满足 下面一些条件( 王关林，2 0 0 2 ) ：( 1 ) 高效稳定的再生能力；( 2 ) 受体材料要有较好的遗传 稳定性，尽量不发生体细胞变异；( 3 ) 具有稳定的外植体来源；( 4 ) 对选择性抗生素敏 感；( 5 ) 对农杆菌侵染有敏感性但无过敏反应。 由于多数的禾本科植物不是农杆菌的天然寄主，因此早期对禾本科的转化工作主要 是针对原生质体进行的。所采用的转化方法一般有p e g 法、电击法等。但是，原生质体 培养技术复杂、培养周期长、遗传稳定性差，且基因依赖性强，无法在有生产价值的品 种上应用，因而极大地限制了该转化体系的推广( 徐子勤，2 0 0 1 ) 。 玉米幼胚具有强烈的生活能力，是转化外源基因较好的受体。柯遐义等( 1 9 9 5 ) 选 用具有较强再生能力的甜玉米幼胚做转化受体，将新霉素磷酸转移酶( n e o m y c i n p h o s p h o r t r a n s f e r a s e ，n p t - i i ) 基 n ( n p t i i ) 平f l f l - 葡糖醛酸酶( 屉一g l u c u r o n i d a s e ，g u s ) 基 n ( u i d a ) 导入受体细胞并成功得到转基因植株。董云洲等( 1 9 9 9 ) 将g u s 基因导入玉米花粉中， 经人工授粉获得种子。 如何提高玉米转化细胞的再生能力是受体系统建立的瓶颈因素。外植体的类型、生 理状态、基因型、培养条件等因素都对再生频率有较大的影向。现有的主要转化受体一 股都要经过产生愈伤组织再生完整植株的过程。愈伤组织容易获得，再生能力比较强， 获得转化体的周期比较短。在玉米上已经获得了稳定的转化体。玉米胚性愈伤组织分三 四川农业大学硕士学位论文 种类型：i 型、i i 型、i i i 型。i 型愈伤呈乳白色或绿色，结构致密，生长缓慢，不易长 时间保持胚性：型愈伤呈黄色或淡黄色，结构松散，呈颗粒状；生长较快，能长时间 保持胚性；i i l 型呈白色或灰色透明水渍状，松软无结构，继代易褐化死亡。这三种愈伤 可相互转化( 杜娟，2 0 0 0 ) 。如果用愈伤组织为转化受体，选择i i 型愈伤组织要比i 型愈 伤组织更有利于获得转化体。本实验用的是i i 型胚性愈伤作受体。相对于i 型愈伤，】i 型愈伤对基因型的依赖性更强。 王景雪等( 2 0 0 4 ) 以玉米自交系幼胚为外植体，就不同基因型、不同激素对其愈伤 组织诱导和植株再生的影响进行了研究，建立了玉米自交系高频率再生系统。据其实验 结果，建立的优化的玉米高效组织培养体系是：诱导愈伤组织形成的培养基为n 6 + 2 m g l 2 , 4 一d + 1 0m g l a g n 0 3 + 3 0 0m g l 脯氨酸+ 5 0 0 m g l 水解酪蛋白+ 2 0 9 l 蔗糖+ 1 0g l 甘露 醇：诱导再生植株分化的培养基为m s + l m g l 6 - b a + 0 1m g l i a a + 5 0 0 m g l 水解酪蛋白 + 3 0 9 l 蔗糖；继代培养基为n 6 + l 一2 m g l 2 , 4 一d + 1 0 r n g l a g n 0 3 + 3 0 0 r n g l 脯氨酸+ 3 0 l 蔗 糖。 1 3 植物转基因的主要方法及原理 在植物基因工程中，转基因植物的获得与否与转化频率的高低有着密切的联系，而 转化频率的高低又与基因转移技术的成熟程度休戚相关，因此基因转移技术在植物基因 工程中占有特殊的地位。随着转基因植物研究的不断深入发展，基因转移的技术也相应 不断地自我完善、推陈出新。迄今为止，植物基因工程中的基因转移方法主要有以下几 种( s a w a h e l ，1 9 9 2 ；王关林，2 0 0 2 ) ： 1 3 1 聚乙二醇法( p e g ) p e g 法是借助p e g 和磷酸高钙在高p h 条件下，诱导原生质体摄取外源d n a 分子的一 种转基因方法。其主要原理是：使磷酸钙和外源d n a 形成d n a 一磷酸钙复合物，并通过 p e g 的作用，使细胞膜表面的电荷紊乱，干扰细胞间的识别而利于细胞膜间的融合和外 源d n a 分子的进入，运用这一方法已经得到了很多的转基因植株，但是由于这种方法需 要以原生质体作为受体，而胚性悬浮细胞系难于建立，且保持、再生困难，所以在转基 因操作中存在一定的难度。 1 3 2 电击法 电击法( e l e c t r o p o r t i o n ) 指借助高压脉冲电场击破转化受体的细胞膜或细胞壁，造 成瞬时可逆通道，3 b i 原d n a 因渗透压的作用而进入受体细胞并整合到受体细胞核基因组 中，从而实现外源基因的遗传转化。1 9 9 3 年s u k h a p i n d a 等用电击法转化，从玉米花药愈 伤组织分离的原生质体获得单倍体带有g u s 、n p t i i 基因的转化植株。该方法优点在于： 四川农业大学硕士学位论文 种类型：i 型、i i 型、i i i 型。i 型愈伤呈乳白色或绿色，结构致密，生长缓慢，不易长 时间保持胚性：型愈伤呈黄色或淡黄色，结构松散，呈颗粒状；生长较快，能长时间 保持胚性；i i l 型呈白色或灰色透明水渍状，松软无结构，继代易褐化死亡。这三种愈伤 可相互转化( 杜娟，2 0 0 0 ) 。如果用愈伤组织为转化受体，选择i i 型愈伤组织要比i 型愈 伤组织更有利于获得转化体。本实验用的是i i 型胚性愈伤作受体。相对于i 型愈伤，】i 型愈伤对基因型的依赖性更强。 王景雪等( 2 0 0 4 ) 以玉米自交系幼胚为外植体，就不同基因型、不同激素对其愈伤 组织诱导和植株再生的影响进行了研究，建立了玉米自交系高频率再生系统。据其实验 结果，建立的优化的玉米高效组织培养体系是：诱导愈伤组织形成的培养基为n 6 + 2 m g l 2 , 4 一d + 1 0m g l a g n 0 3 + 3 0 0m g l 脯氨酸+ 5 0 0 m g l 水解酪蛋白+ 2 0 9 l 蔗糖+ 1 0g l 甘露 醇：诱导再生植株分化的培养基为m s + l m g l 6 - b a + 0 1m g l i a a + 5 0 0 m g l 水解酪蛋白 + 3 0 9 l 蔗糖；继代培养基为n 6 + l 一2 m g l 2 , 4 一d + 1 0 r n g l a g n 0 3 + 3 0 0 r n g l 脯氨酸+ 3 0 l 蔗 糖。 1 3 植物转基因的主要方法及原理 在植物基因工程中，转基因植物的获得与否与转化频率的高低有着密切的联系，而 转化频率的高低又与基因转移技术的成熟程度休戚相关，因此基因转移技术在植物基因 工程中占有特殊的地位。随着转基因植物研究的不断深入发展，基因转移的技术也相应 不断地自我完善、推陈出新。迄今为止，植物基因工程中的基因转移方法主要有以下几 种( s a w a h e l ，1 9 9 2 ；王关林，2 0 0 2 ) ： 1 3 1 聚乙二醇法( p e g ) p e g 法是借助p e g 和磷酸高钙在高p h 条件下，诱导原生质体摄取外源d n a 分子的一 种转基因方法。其主要原理是：使磷酸钙和外源d n a 形成d n a 一磷酸钙复合物，并通过 p e g 的作用，使细胞膜表面的电荷紊乱，干扰细胞间的识别而利于细胞膜间的融合和外 源d n a 分子的进入，运用这一方法已经得到了很多的转基因植株，但是由于这种方法需 要以原生质体作为受体，而胚性悬浮细胞系难于建立，且保持、再生困难，所以在转基 因操作中存在一定的难度。 1 3 2 电击法 电击法( e l e c t r o p o r t i o n ) 指借助高压脉冲电场击破转化受体的细胞膜或细胞壁，造 成瞬时可逆通道，3 b i 原d n a 因渗透压的作用而进入受体细胞并整合到受体细胞核基因组 中，从而实现外源基因的遗传转化。1 9 9 3 年s u k h a p i n d a 等用电击法转化，从玉米花药愈 伤组织分离的原生质体获得单倍体带有g u s 、n p t i i 基因的转化植株。该方法优点在于： 四川农业大学硕士学位论文 简单，快速，费用较低，无需精制设备，转化率较高。但是电击容易对细胞造成损伤， 而且这种方法也主要以原生质体作为受体，所以在应用中也受到一定限制。 1 3 3 花粉介导法 利用花粉作为外源基因的载体进行遗传转化，在玉米、小麦、水稻等作物上已获得 成功( 王景雪，2 0 0 1 ：王罡，2 0 0 2 ；侯文胜，2 0 0 3 ；赵凌，2 0 0 3 ) 。其原理是授粉后使 外源d n a 沿花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子 胚或早期胚胎细胞。 1 3 4 子房注射法 是指使用微玻针把外源基因注入子房，由于子房或胚囊产生高压以及卵细胞的吸 收，使外源基因进入受精的卵细胞中，实现基因的转化。丁群星等在国内外首次报道了 用此法将毒蛋白基因导入玉米自交系的全过程，重复试验也获得了成功( 谭振波，2 0 0 0 ) 。 种质转化以子房和花粉为受体，避开了组织培养过程，利用植物本身的有性繁殖过 程进行繁殖，避免了转化体早期天亡、不孕和不育等，比较容易得到种子，但转化后代 群体大，需要有简便可靠的筛选方法( 白云凤，2 0 0 3 ) 。 1 3 5 脉冲电泳法( p f g e ) 介导外源基因转移 脉冲电泳法( p u l s e df i e l dg e le l e c t r o p h o r e s i s ，p f g e ) 作为一种新型的转基因技术越 来越受到人们的重视。它最初用于分离大片段d n a 分子，其原理是在凝胶上外加正交电 场，使大片段d n a 分子能够在交替变化的电场中通过重新定向在狭小蓝折的凝胶中不断 向前运动而分离。利用脉冲电泳分离大片段d n a 分子的原理为带壁植物细胞进行外源 d n a 分子导人提供了新的思路。利用我国白行研制的d y 一4 a 型交变脉冲电泳仪，在交变 脉冲电泳槽中灌制1 5 的a g a r o s e ，将剥去种皮的种子包埋于电泳胶中，质粒d n a 由点 样孔加入，然后进行脉冲电泳至d n a 样品扫过种子包埋区( 董琼珠，2 0 0 3 ) 1 3 6 基因枪法 基因枪法( p a r t i c l eb o m b a r d m e n ，p a r t i c l eg u n ，g e n e g u n ，m i c r o p r o j e c t i l e ，b i o l i s t i c s 或 b i o l o g i c a lb a l l i s t i c s ) 又称生物弹法、微弹轰击法，1 9 8 7 年由美困康奈尔大学s a n f o r d , t i k l e i n 提出，是目前应用最广的两种方法之一。其基本原理是借高速运动的金属粒将附着 于其表面的核酸分子引入受体细胞，然后通过组织培养再生出完整植株。 3 7 农杆菌介导法 农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，普遍存在于双子叶植物中。目前研究较多的是 根癌农杆菌( a g r o b a c t e r i u mt l l m 咖c i e n s ，a t ) 和发根农杆菌( a g r o b a c t e r i u mr h i z o g e n e s ， a r ) ，它们都可以侵染植物细胞，但引起不同的病症。根癌农午t 菌常引起植物近地面的 四川农业大学硕士学位论文 根茎交界处形成帽状的肿瘤。科学家们经过长期的研究发现，根癌农杆菌中存在一种环 状的、大小约1 5 0 k b 一2 0 0 k b 的质粒( t m n o r i n d u c i n g p l a s m i d ，简称为t i 质粒) ，植物肿瘤即 是由t i 质粒上的一段d n a 引起的，它通过特定的机制复制、切割、转移、整合到植物基 因组中并表达，从而引起肿瘤的发生，这段d n a 称为t - d n a ( t r a n s f e r e dd n a ) ，是一种 天然存在的遗传转化体系。人们利用这种遗传转化体系将外源基因导入植物细胞，并利 用植物细胞的全能性，通过组织培养，出一个细胞或一块组织再生成完整的转基因植株， 此即农杆菌介导的遗传转化( a g r o b a c t e r i u mm e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n ) 。 t i 质粒转基因系统中，位于t i 质粒上的转移区( t d n a 区) 和毒力区( v i r n ) 对于转移 是必需的。t d n a 是从根癌农杆菌转移到植物细胞中的d n a 片断，一旦整合到植物基因 组上就很稳定。v i r 区位于t d n a 左侧，有v i r a 、b 、c 、d 、e 、g 、h7 个操纵子共2 4 个基因。这些基因产物通过反式作用直接参与t d n a 的加工和转移过程。由于只有在感 受态植物细胞出现的时候，v i r 区基因才能表达。因此v i r 区的活化是根癌农杆菌介导基因 转化的开关。农杆菌t i 质粒的t d n a 中带有o n c 基因( 致癌基因) ，它在植物细胞内编码 植物生长素和细胞分裂素，使受侵染的植物细胞不受限制地增殖而致瘤。此外t d n a 还 编码o p i n e 类化合物，作为农杆菌代谢的氮源和碳源。t i 上的t d n a 是由两端两个不完 整的2 5 个碱基对的顺向重复序列所界定，由于t - d n a 不含编码促使自身转移物质的基 因，故可将其上的o n c 基因及其它不必要的序列去掉，而插入要转化的目的基因序列， 从而达到既不致使植物致瘤而又能改良植物的目的。 1 3 8 基因枪法和农杆菌介导法的比较 与直接基因转移相比，农杆菌介导法有着明显的优势：可转移较大片断的外源d n a ： 不需原生质体培养技术；转基因多是单拷贝或低拷贝数插入，并且优先插入转录活性区 域；转化效率高，在双子叶檀物中可高达8 0 9 0 ，在单子叶植物中也可达2 0 3 0 ； 转入的外源基因通常呈预期的孟德尔遗传，再生植株可育率高：而且方法简单、有效、 价格低廉，是一种“天然”的转化法，可能有助于避免基因沉默现象。因此，农杆菌介 导的转化愈来愈成为各种植物( 主要是单子叶类的禾谷类作物) 转基因的主要方法。从 1 9 9 3 年以来，农杆菌介导的基因转化在一些重要的禾谷类，如水稻、玉米、大麦上相继 获得成功，但是利用农秆茵介导转化系统，一般需要经过严格的组织培养过程以再生植 株，因而转化周期较长，此外，由于t d n a 可以在植物染色体的任何区域内插入，有可 能导致有益基因的插入失活( 叶健明，1 9 9 9 ) 。 基因枪法的优点是不用进行原生质体再生培养，扩大了转化受体的范吲，受体材料、 靶细胞可以有广泛的来源，如包括细胞悬浮培养物、愈伤组织、分生组织、来成熟胚等 四川农业太学硕士学位论文 等；不受宿主基因型的限制。自c h r i s t o u 等利用此项技术成功地得到转基因植株以来， 相继获得了水稻( c h r i s t o u ，1 9 9 1 ，1 9 9 2 ) 、大豆( m c c a b e ，1 9 8 8 ) 等多种农作物的转 基因植株。用这种方法转化成功的包括几乎所有的主要禾谷类作物，如小麦、玉米、水 稻、大麦、高梁等等。还可用来进行细胞器的转化( b o y n t o n ，1 9 8 8 ；d a n i e l l ，1 9 9 1 ；h o u ， 2 0 0 1 ) 、花粉的转化、植物基因表达调控研究( m a l c u i t ，1 9 9 9 ) 等。 基因枪法的主要缺点是外源d n a 整合机理不清楚，常发生多拷贝多位点整合而影响 其表达，与基因的失活及沉默有着非常密切的关系：轰击大质粒时易发生断裂；转入基 因的分离有时呈非孟德尔遗传；转化效率低，绝大多数在0 1 一1 的范围内，增加了选 择的难度：价格昂贵等。 1 4 二十一世纪植物基因工程的研究热点 1 4 1 植物基因工程从单基因生物抗性向持久性抗性转化 分子标记辅助选择育种可以实现多种基因的累加，培育出多抗或广谱的种质或品 种。国际水稻所已通过分子标记辅助选择将4 种不同的抗稻瘟病基因累加到同一水稻品 种中，获得了广谱抗稻瘟病材料。另外，基因工程育种也可以采取多基因策略来培育持 久性抗性的新品种。以抗虫基因工程为例，转基因植物在推广应用的过程中，害虫容易 对单杀虫基因产生抗性。针对这一问题，除了采用所谓的“高剂量避难所”( h i g h d o s e r e f u g e ) 策略来降低害虫抗性发生的风险之外，将具有不同杀虫机理的基因组合进同 一植物以延缓害虫的抗性发展也是一种行之有效的策略。因此，就需要不断寻找杀虫活 性更强的新基因。国际上对于从各种生物资源特别是微生物资源中发现有价值的新基因 一直予以极大重视。最近一个非常鼓舞人心的发现是美国w i s c o n c i n 大学的科学家从寄 生在异小杆线虫消化道内的一种发光秆菌( p h o t o r h a b d u sl u m i n e s c e n s ) 的细菌中找到一 个蛋白复合物，它由a 、b 、c 、d 四种成分组成，这种蛋白复合物除了对鳞翅目具有 杀虫活性外，对鞘翅目和双翅目也都有很强的毒杀活性，是一种广谱杀虫基因；这种新 基困对于农作物持久性抗虫育种具有很大的应用潜力。 在植物中同时表达多个目的蛋白如今已成为可能。将所要表达的目的蛋白基因陶 建在一个丌放阅读框架内，目的蛋白基因之间连接有l o 一2 0 个氨基酸的序列，翻译后 形成的所谓“多蛋白”可由目的蛋自之间的短肽介导切割成为各自完整的功能性蛋白， 这样一种表达系统为向植物中导入多基因或引入某一完整的代谢途径提供了一个更为 有效的途径， 1 4 2 生物性抗逆转向非生物性抗逆 农作物所处的非生物逆境包括予旱、盐渍、冷冻、高温、营养贫瘠、重金属胁迫、 四川农业太学硕士学位论文 等；不受宿主基因型的限制。自c h r i s t o u 等利用此项技术成功地得到转基因植株以来， 相继获得了水稻( c h r i s t o u ，1 9 9 1 ，1 9 9 2 ) 、大豆( m c c a b e ，1 9 8 8 ) 等多种农作物的转 基因植株。用这种方法转化成功的包括几乎所有的主要禾谷类作物，如小麦、玉米、水 稻、大麦、高梁等等。还可用来进行细胞器的转化( b o y n t o n ，1 9 8 8 ；d a n i e l l ，1 9 9 1 ；h o u ， 2 0 0 1 ) 、花粉的转化、植物基因表达调控研究( m a l c u i t ，1 9 9 9 ) 等。 基因枪法的主要缺点是外源d n a 整合机理不清楚，常发生多拷贝多位点整合而影响 其表达，与基因的失活及沉默有着非常密切的关系：轰击大质粒时易发生断裂；转入基 因的分离有时呈非孟德尔遗传；转化效率低，绝大多数在0 1 一1 的范围内，增加了选 择的难度：价格昂贵等。 1 4 二十一世纪植物基因工程的研究热点 1 4 1 植物基因工程从单基因生物抗性向持久性抗性转化 分子标记辅助选择育种可以实现多种基因的累加，培育出多抗或广谱的种质或品 种。国际水稻所已通过分子标记辅助选择将4 种不同的抗稻瘟病基因累加到同一水稻品 种中，获得了广谱抗稻瘟病材料。另外，基因工程育种也可以采取多基因策略来培育持 久性抗性的新品种。以抗虫基因工程为例，转基因植物在推广应用的过程中，害虫容易 对单杀虫基因产生抗性。针对这一问题，除了采用所谓的“高剂量避难所”( h i g h d o s e r e f u g e ) 策略来降低害虫抗性发生的风险之外，将具有不同杀虫机理的基因组合进同 一植物以延缓害虫的抗性发展也是一种行之有效的策略。因此，就需要不断寻找杀虫活 性更强的新基因。国际上对于从各种生物资源特别是微生物资源中发现有价值的新基因 一直予以极大重视。最近一个非常鼓舞人心的发现是美国w i s c o n c i n 大学的科学家从寄 生在异小杆线虫消化道内的一种发光秆菌( p h o t o r h a b d u sl u m i n e s c e n s ) 的细菌中找到一 个蛋白复合物，它由a 、b 、c 、d 四种成分组成，这种蛋白复合物除了对鳞翅目具有 杀虫活性外，对鞘翅目和双翅目也都有很强的毒杀活性，是一种广谱杀虫基因；这种新 基困对于农作物持久性抗虫育种具有很大的应用潜力。 在植物中同时表达多个目的蛋白如今已成为可能。将所要表达的目的蛋白基因陶 建在一个丌放阅读框架内，目的蛋白基因之间连接有l o 一2 0 个氨基酸的序列，翻译后 形成的所谓“多蛋白”可由目的蛋自之间的短肽介导切割成为各自完整的功能性蛋白， 这样一种表达系统为向植物中导入多基因或引入某一完整的代谢途径提供了一个更为 有效的途径， 1 4 2 生物性抗逆转向非生物性抗逆 农作物所处的非生物逆境包括予旱、盐渍、冷冻、高温、营养贫瘠、重金属胁迫、 四川农业太学硕士学位论文 水灾、紫外线等。农作物基因工程已经在抗生物逆境( 如抗虫、抗病) 方面取得了相当 的成就。随着人们对非生物逆境的作用机制和植物对非生物逆境信号反应的分子机制的 了解，克隆与非生物逆境信号传导( s i g n a lt r a n s d u c t i o n ) 相关的基因转入植物，将可能 使转基因植物获得对非生物逆境的抗性( 如抗寒、抗旱、抗盐、抗土壤营养缺乏、抗重 金属毒害等) 。 植物抗土壤营养逆境基因工程研究已经取得一定成果，某些转基因农作物将在2 1 世纪初进入商品化生产。例如，转谷氨酸脱氢酶基因玉米可以大大提高对氮肥的利用率， 其生长量提高了1 0 ，植物根表氮肥残留物降低5 0 ，这种转基因玉米将在未来的3 - 4 年内上市。土壤中缺乏一些植物生长必要的无机盐也是一种逆境，通过基因工程手段可 以使植物获得抵抗这种逆境的能力。例如，山梨醇合成能力强的转基因烟草对于硼缺乏 具有一定的抗性。 近年来，环境问题己引起人们越来越多的关注。重金属是一类严重的污染源，散布 在土壤和水分中，会给人类和动植物造成很大伤害。重金属又不同于有机污染物，不能 用化学方法或生物方法降解除去。转基因植物在清除重金属污染物方面已经表现出一定 的作用。例如，高表达谷胱甘肽合成酶的油菜可以在体内积累镉，高表达锌转运蛋白的 拟南芥菜可以大量积累锌，因而这些转基因植物将有望用于抵抗诸如镉、锌等重金属离 子的毒害，并有效清除环境中的重金属污染物。 1 4 3 目标性状的研究重点将从目前的“抗性”向“品质”转移 品质改良内容包括：水果蔬菜的延熟保鲜；有益于健康的植物油( 如不饱和脂肪酸) ： 增加营养价值( 如维生素、蛋白质等) ；富含抗癌蛋白质的作物品种；高营养的饲料( 如 高赖氨酸、表达植酸酶的玉米) 等等方面。 在对农作物品质的生理代谢过程进行充分了解的基础上，对植物的代谢过程进行改 造从而改善农作物的营养品质是一个引人注目的发展方向。例如，a - - v i t a m i ne 是一种 脂溶性抗氧化剂，对人体健康很重要，可以降低心血管病和癌症的发病机率，增强免疫 功能。植物油是a - - v i t a m i ne 的主要来源，但是植物油中a - - v i t a m i ne 含量艰低，且 主要以其前体 ，一t a m i ne 存在。利用基因组学方法( g e n o m i c s - - b a s e da p p r o a c h ) 从 拟南芥中克隆了 _ 维生素甲基转移酶( 7 - t o c o p h e r o lm e t h y l t r a n s f e r a s e ) ，该酶是1 一 v i t a m i ne 合成代溅中最后的关键酶。通过在拟南芥的种子中表达这种酶，使油脂的成 分发生了改变，9 5 以上的1 一v i t a m i ne 被转化成a - v i t a m i ne 。在油料农作物( 大豆、 油菜、棉籽，包括玉米在内) 中表达这种酶，同样也可以将种子中大量的下维生素前体 转化成维生素，提高维生素的水平，从而改善油料作物的营养价直。 四川农业大学硕士学位论文 1 4 4 由质量性状向数量性状转移 植物基因工程除了在单基因转移方面已经取锝的成就外，在未来的一段时间内某些 基因工程研究也许会对农作物潜在产量的提高做出贡献。产量属数量性状，由多基因控 制。目前，科学家们正在通过分子标记等技术寻找与产量相关的数量性状的基因位点 ( q u a n t i t yt r a i tl o c u s ，q t l s ) ，最终有可能通过育种程序将这些q t l s 集中起来加以利用。 与此同时，科学家们也正在试图通过分子生物学策略对与产量相关的某些生理生化过程 进行修饰改造，从而达到农作物增产的目的。其一，通过控制植物叶片表面的气孔的开 闭使植物更加有效地利用氧、二氧化碳和水分。有两个因素影响气孔关闭：脱落酸( a b a ) 引起关闭及称为法呢化( f a m e s y l a t i o n ) 的酶催过程抑制脱落酸的形成而使气孔开放。 因此，从理论上讲，通过改变法呢化就可调解植物对a b a 的敏感性，最终调节气孔的 关闭。其二，提高光合作用的效率。日本科学家最近发现，一种红藻中的r u b i s c o 的 活性比一般植物中的r u b i s c o 高3 倍，他们正利用叶绿体转化技术将该基因导入植物， 以