（微生物学专业论文）sphingomonas+spzute03产辅酶q10发酵提取新工艺研究.pdf

s p h i n g o m o n a ss p z u t e 0 3 产辅酶q l o 发酵提取新工艺研究 摘要 辅酶q l o ( c o e n z y m eq l o ，简写为c o q l o ) ，又称泛醌，本质上是一 种类维生素类物质，脂溶性苯的衍生物。其在自然界中分布广泛，主 要存在于酵母、植物叶子和种子及动物的心脏、肝脏和肾脏中。辅酶 q 。o 是细胞呼吸链上的一种递氢体，是细胞自身产生的天然抗氧化剂、 细胞代谢激活剂。本论文对辅酶q 。o 的同步皂化提取工艺、发酵萃取 耦合产辅酶q l o 较佳工艺条件、对羟基苯甲酸等前体物质、无机盐添 加对发酵产辅酶q 。o 的影响，以及产物的纯化进行了研究。 本文对自行筛选获得的鞘氨醇单胞菌( s p h i n g o m o n a ss p z u t e 0 3 ) 发酵产辅酶q l o 的皂化提取工艺进行了改进，设计了同步 皂化提取新工艺，进行菌体中辅酶q l o 的提取，通过正交方法确定了 辅酶q l o 高提取得率的条件为：皂化温度9 0 c ，皂化时间6 0 m i n ，提 取溶剂体积3 0 m l 。该工艺提取溶剂回收率均达到5 0 以上。并对提 取样品进行了纯化分离和定性分析。无水乙醇为洗脱液的硅胶柱层析 可以初步分离纯化提取样品，通过t l c 、h p l c 、显色反应的检验鉴 定，以及全波长扫描的佐证，可以初步确定该菌发酵合成产物为氧化 型辅酶q l o 。 探索了发酵萃取耦合工艺对s p h i n g o m o n a ss p z u t e 0 3 产辅酶 q l o 的影响。发现该工艺可以显著提高鞘氨醇单胞菌( s p h i n g o m o n a ss p z u t e 0 3 ) 的辅酶q l o 产量。单因子试验确定了该工艺的较佳工艺条 件为：2 豆油为细胞通透剂并在发酵起始时加入培养液，以3 0 m l 正 己烷为萃取溶剂并在发酵3 0 h 后加入培养液，发酵萃取8 h ，最终辅 酶q l o 的产量可达3 2 51 m g l 。 考察了对羟基苯甲酸添加对s p h i n g o m o n a ss p z u t e 0 3 菌辅酶 q ，o 合成的影响。该前体的添加对菌体中辅酶q 。o 合成有较为显著的 促进作用，并确定了其较佳添加条件为：以水为溶解体系，于发酵培 养基中摇床培养6 h 后，加入对羟基苯甲酸溶液，终浓度为1 5 m g l ， 继续发酵培养1 8 h ，进行前体转化反应，实验结果能达到最高产值 6 9 91 m g l 。 考察了添加甘油、f e 2 + 和m 9 2 + 对s p h i n g o m o n a ss p z u t e 0 3 菌产 辅酶q 。o 的影响。甘油的添加对辅酶q 。o 的合成有一定的促进作用， 其添加浓度为1 时，产量可达1 5 8 3 m g l ，相对空白对照提高了 1 4 0 ；当f e 2 + 添加的较佳浓度为2 m m o l l 时，m 9 2 + 添加的较佳浓度 为l m m o l l ，s p h i n g o m o n a ss p z u t e 0 3 菌体生长量以及辅酶q l o 的产 量都能达到较理想值。 关键字：s p h i n g o m o n a ss p z u t e 0 3 ，辅酶q 1 0 ，发酵，提取 i i s t u d yo nn o v e lt e c h n o l o g yf o rc o e n z y m e q 一1 0p r o d u c t i o nb y s p 日姗0 a 织删ss p z u t e 0 3 a bs t r a c t c o e n z y m eq l o ( c o q i o ) w a sap r e n y l a t e db e n z o q u i n o n el i p i d ，a n di t w a sa l s on a m e du b i q u i n o n e t h ec o q l ow e r ef o u n di nm i c r o o r g a n i s m s ， p l a n t s ，a n dt h eh e a r t ，k i d n e y ，l i v e ro fa n i m a l s ，w h e r et h e yf u n c t i o n e da s r e d o xc a r r i e r si nm i t o c h o n d r i ao ri na s s o c i a t i o nw i t hr e s p i r a t o r yp r o c e s s e s o fe l e c t r o nt r a n s p o r tc h a i n s i tw a sa na n t i o x i d a n tp r o d u c e dn a t u r a l l y i n t h i sp a p e r ，w es t u d i e dt h eo p t i m i z a t i o nc o n d i t i o no fc o q l 0e x t r a c t i o n ，t h e e f f e c to ft h es u p p l e m e n t a t i o no fp h b ，g l y c e r o l ，f e 2 + a n dm 9 2 + o nt h e f e r m e n t a t i o no fc o q l 0 ，a n dt h ep u r i f y i n gt e c h n o l o g yo fc o q l o an o v e li s o l a t en a m e d s p h i n g o m o n a ss p z u t e 0 3w a su t i l i z e dt o p r o d u c ec o q l o ，a n dt h es y n c h r o n o u ss a p o n i f i c a t i o n e x t r a c t i o nm e t h o d w a sa p p l i e dt oe x t r a c tc o q 1o i n f l u e n c e so fs e v e r a l f a c t o r ss u c ha s i l l s a p o n i f i c a t i o nt e m p e r a t u r ea n dt i m e ，o r g a n i cs o l v e n tv o l u m eo nc o q l o 。一 。 一 一 一 e x t r a c t i o nw e r es t u d i e d t h eo p t i m a l c o n d i t i o n s o i s y n c h r o n o u s s a p o n i f i c a t i o ne x t r a c t i o nw e r e a sf o l l o w s ：t e m p e r a t u r e9 0 c ，t i m e3 0 m i n a n do r g a n i cs o l v e n tv o l u m e3 0 m l t h i sm e t h o dh a sp r e d i g e s t e da n d o p t i m i z e dt h et r a d i t i o n a ls a p o n i f i c a t i o nm e t h o dw i t hn o n l o s s ，w h i c hh a s o p e n e dv a s tv i s t a f i n a l l y ，t h ee x t r a c t e dp r o d u c tw a sf u r t h e rp u r i f i e db y t h ec o l u m n c o n t a i n i n gs i l i c a g e l ，a n ds e p a r a t e db yt h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h ，t h e n d e t e r m i n e d b y u l t r a v i l e t s p e c t r a m e t e r ， c h r o m o g e n i cr e a c t i o n t h er e s u l t ss h o w e dt h a ti tw a so x i d a t e dc o q l o t h ec o u p l e dp r o c e s so ff e r m e n t a t i o na n de x t r a c t i o nw a se v a l u a t e di n t h ec o q l op r o d u c t i o nb ys p h i n g o m o n a ss p z u t e 0 3 t h eo p t i m a l c o n d i t i o n sw e r eo b t a i n e da sf o l l o w s ：2 s o y b e a no i la st h ec e l l m e m b r a n ep e r m e a b i l i t ya c c e l e r a n tw a sa d d e di n t ot h eo r i g i n a lc u l t u r ea n d 3 0 m lh e x a n ea st h ee x t r a c t i n gs o l v e n tw a sa d d e da f t e r3 0 hc u l t u r e a f t e r g o i n gs e q u e n t i a lc o u p l e dp r o c e s so ff e r m e n t m i o na n d e x t r a c t i o nf o ra b o u t 8 h ，t h em a x i m a ly i e l do fc o q loc o u l dr e a c ht o3 2 51m g l p h bi sa ni m p o r t a n tp r e c u r s o ri nt h eb i o s y n t h e s i so fc o q l o t h e o p t i m a lc o n d i t i o nf o rt h eb i o c o n s e r v a t i o nf r o mp h bt oc o q l 0w e r ea s f o l l o w s ：a f t e r6 hc u l t u r eo fs p h i n g o m o n a ss p z u t e 0 3i nt h eo p t i m a l m e d i u m , 15 m g lo fp h bw a sa d d e du s i n gd i s t i l l e dw a t e ra st h es o l v e n t ， a n dc o n t i n u e dt of e r m e n tf o r18 ho fb i o t r a n s f o r m a t i o n1 t h em a x i m a l y i e l d o f c o q l o c o u l d r e a c ht o6 9 91m g l t h ee f f e c t so ft h e i v s u p p l e m e n t a t i o no fg l y c e r o l ，f e 2 + a n dm 9 2 + o nt h ey i e l do fc o qlow e r e a l s os t u d i e d t h r o u g hm a n ye x p e r i m e n t s ，w h e n1 g l y c e r o l ，2 m m o l l f e 2 + ，1m m o l lm 9 2 + w a sr e s p e c t i v e l ya d d e di n t ot h eo p t i m a lm e d i u m , t h e y i e l do fc o q l 0c o u l de v i d e n t l yi n c r e a s e k e yw o r d s ：s p h i n g o m o n a ss p z j u t e 0 3 ，c o q l o ，f e r m e n t a t i o n ， e x t r a c t i o n v 浙江工业大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行 研究工作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文 不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙 江工业大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作 出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明 的法律责任。 作糍沸尸7 弓吼硼年多月岁日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密切。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名御丫叨毒日期潮年石月歹日 新签名：溯侈穆日期：沙萨6 月多日 浙江工业大学硕士论文 第一章文献综述 1 1 引言 1 9 5 7 年，美国w i s c o n s i n 州的f r e d e r i c kc r a n e 和其合作者第一次从牛心脏线粒 体中分离出一种维生素类似物i l j ，同年英国的m o r t o n 教授从维生素a 缺陷的小鼠 的肝脏中也得到了这种化合物，并测出其化学结构，将其命名为：泛醌或辅酶 q 1 0 ( c o e n z y m eq l o ，u b i q u i n o n e ) ，意思就是说这种醌无处不在【2 】o 现已知辅酶q l o 是呼吸链中n a d h 脱氢酶、琥珀酸脱氢酶和b c 复合物之间的脂溶性电子载体，是 细胞能量生成要素，在细胞线粒体内呼吸链质子转移及电子传递中起重要作用， 是细胞呼吸和细胞代谢的激活剂，也是重要的抗氧化剂和非特异性免疫增强剂。 它是人体血液中必需的物质，是生物体内广泛存在的脂溶性醌类化合物，是细胞 自身产生的天然抗氧化剂，与网状内皮组织系统有关，具有促进氧化磷酸化反应、 保护生物膜结构完整性和提高机体免疫力的功能。正因为它具有多方面的生理活 性，因此，辅酶q 1 0 是一种良好的生化药物，亦可作为一种天然抗氧化剂，应用 于保健美容等方面【3 1 。在我国，辅酶q 1 0 胶囊的用量在逐年增加，但原料基本依 赖进口，这要求国内能自行生产大量廉价辅酶q 。o 原料和制剂。 1 2 辅酶q l o 的结构与性质 辅酶q l o ( c o e n z y m eq l o ，c o q l o ) 的化学名称是2 ( 3 ，7 ，1 1 ，1 5 ，1 9 ，2 3 ，2 7 ，3 l ，3 5 ，3 9 一 癸甲基2 ，6 ，1 0 ，1 4 ，1 8 ，2 2 ，2 6 ，3 0 ，3 4 ，3 8 一四十癸烯基) 5 ，6 二甲氧基3 一甲基p 苯醌。其 分子式为c 5 9 h 9 0 0 4 ，相对分子质量为8 6 3 3 6 ，是黄色或橙黄色结晶性粉末，无臭 无味，脂溶性，易溶于氯仿、苯、四氯化碳；溶于丙酮、乙醚、石油醚；微溶于 乙醇，不溶于水和甲醇【4 1 。它遇光易分解成微红色物质，对温度和湿度较稳赳1 ，5 1 。 熔点4 8 c 5 2 c 【刀。其化学结构，如图1 1 1 6 1 所示： 浙江工业大学硕士论文 u 图1 - 1 辅酶q 1 0 的结构图 f i g 1 1s t r u c t u r eo f c o e n z y m eq l o 从化学结构上可以看出辅酶q l o 是以2 ，3 一二甲氧基一5 一苯醌为核心，连上 一个类异戊二烯侧链的醌类化合物。它的功能作用主要来自于醌基的氧化还原化 学特性和侧链的物理特性。x 射线分析证明，辅酶q l o 的醌环具有典型的烯烃和 碳基化合物的反应性能，细胞中的辅酶q o 有三种不同氧化还原状态，即氧化型 醌( q ) ，还原型醌( q h 2 ) 和自由基半醌( q h ) 【7 】，它的氧化还原电势量为o 5 4 2 v ，氧 化型较还原型稳赳8 1 。 1 3 辅酶q l o 生理功能及应用 1 3 1 辅酶q 1 0 生理功能 9 - 1 3 】 辅酶q 1 0 主要存在于人体细胞线粒体内，作为与能量转换有关的若干酶系统 的辅助因子，是人体维持生命的必需物质。长期以来，大量的科研结果表明，辅 酶q l o 具有以下几种主要的生理功能： 1 - 3 1 1 抗氧化功能 辅酶q 1 0 具有与维生素e 相类似的抗氧化功能。在用辅酶q l o 防治大鼠内毒素 休克及防治离体大鼠心肌细胞缺氧试验中，发现辅酶q 1 0 能显著提高动物或细胞 存活率，显著减少组织细胞的脂质过氧化物含量。 1 3 1 2 自由基清除功能 辅酶q l o 可明显降低线粒体耗氧，降低细胞对a t p 的消耗。据文献报道，超 微结构检查证实辅酶q l o 能维持细胞线粒体结构的完整性，防止细胞水肿、细胞 膜破裂、线粒体溶解和肌原纤维的排列紊乱。 2 浙江工业大学硕士论文 1 3 1 3 稳定生物膜功能 辅酶q 1 0 可防止因过量维生素a 所致的红细胞膜及溶酶体膜的不稳定性，对 维持细胞膜通道的完整性具有重要作用。 1 3 1 4 对穿透膜功能的影响， 作为细胞膜氧化系统的主要组成部分，辅酶q l o 在膜上具有独特的功能。这 些功能包括离子或代谢物的运输；运输过程中的信号、保护以及膜运动功能。按 照辅酶q l o 在线粒体中的功能类推，质子传递有可能是细胞膜中能量传递的基础。 在膜或蛋白质的结合位点上，当酶处于疏水环境时，质子运动到结合位点的这一 过程可能是氧化还原速率的限制因素。提供一个亲脂性的质子运输载体可以增加 质子运输到膜中的速率。此时，加入解偶联剂或脂肪，会产生很显著的效果。然 而在不需要辅酶q l o 的n a d h 细胞色素c 还原酶活性上没有解偶联效果。由此 我们可以推论，辅酶q 1 0 在此过程中发挥了很大的作用。因为还原酶位于膜的细 胞质侧( n a d h 细胞色素b 5 还原酶) ，而对苯二酚氧化酶在膜的外侧，所以最合 理的质子运动是从细胞内到外。我们现在还不清楚辅酶q l o 在膜内的位置，所以， 对定向功能的分析需要更多的数据支持。 1 3 2 辅酶q l o 的应用 1 3 2 1 心肌保护 1 4 - 1 5 】 辅酶q 1 0 能防止心肌缺血和再灌注所致的结构和功能异常。用辅酶q 0 处理的 动物心脏可在定程度上保持细胞氧化磷酸化及a t p 生成能力，减少细胞和线粒 体的负荷。 1 3 2 2 治疗呼吸肌疲劳【1 6 】 辅酶q l o 可增强呼吸肌收缩力。据报道，以辅酶q 1 0 l o m g 救治8 例呼吸困难为 主的呼吸系统疾患，用药3 个月后，最大吸气量显著升高，呼吸困难明显改善。 1 3 2 3 治疗冠心病 研究者在临床治疗心肌梗塞过程中发现，梗塞区心肌的辅酶q 1 0 含量比非梗 塞区少，辅酶q 。o 可防止在急性缺血时的心肌收缩力减弱，使异丙肾上腺素导致 的心肌缺氧减轻，防止磷酸与a t p 含量减少，保持缺血心肌细胞中线粒体的形态 结构，缩小- t 1 , 8 1 梗塞范围【1 7 】，并且有研究发现，在辅酶q l o 治疗前后，患者血浆 浙江工业大学硕士论文 中超氧化物歧化酶活性升高，而丙二醛含量下降，进而增强清除体内自由基的能 力【1 8 】。因此辅酶q l o 在缓解冠心病病情、心力衰竭等心肌、治疗心绞痛、心血管 方面的疾病具有较好的疗效。 1 3 2 4 治疗高血压【1 9 】 口服以补偿体内所缺辅酶q 1 0 。可以增加复合物i i 酶活性，虽然在其治疗高 血压的机理上还没有统一的认识，但研究显示辅酶q l o 。在治疗原发性高血压上 有很好的疗效。 1 3 2 5 治疗乙型脑炎 2 0 l 乙型脑炎是由乙脑病毒引起的一种虫媒病毒性脑炎，流行于夏秋季节，多 见于学龄前儿童。研究发现辅酶q i o 可清除脑组织中的自由基，改善脑细胞的新 陈代谢，修复损伤的脑组织，从而避免或减少大量甾体激素而可能发生的副作用。 1 3 2 6 治疗慢性肝判2 1 】 辅酶q 1 0 的免疫调整功能可以增加体内抗体的产生，增强吞噬细胞的吞噬能 力，从而用于慢性肝炎的治疗。北京医学院附属第一医院传染病教研室通过对5 0 例慢性病毒性肝炎的治疗研究发现，血清谷丙转氨酶平均下降1 9 7 ，而对照组 却上升3 2 8 ，治疗组的显效率( 3 2 ) 显著高于对照组( 1 0 ) 。 1 3 2 7 治疗乳腺癌 2 2 - 2 5 】 在日本的一次试验中，研究人员挑选了3 2 名患有严重乳腺癌的病人，每天服 用9 0 m g 辅酶q l o 。其中6 名病人肿块明显减小。将其中一名病人口服剂量大幅增 加，达至u 3 9 0 m g 天，一个月后，肿块触摸不到，两个月后，肿块消失。在丹麦的 一个研究中，乳腺癌病人每天服用3 9 0 m g 的辅酶q l o 。作为营养补充，乳腺癌患 者的肿瘤缓和、减小并使其转移得到了抑制。 1 3 2 8 免疫力增强【2 6 之7 】 补充辅酶q l o 能增强人体的免疫应答，从而对艾滋病有一定的疗效。艾滋病 病人血液中辅酶q 1 0 的含量比常人要低，让其连续三年以上口服辅酶q l o ，得到了 较好的临床疗效，且无毒副作用。 1 3 2 9 其他应用 最新的临床试验表明，辅酶q 1 0 的应用范围越来越广泛：片剂已有效地用于 肺气肿的治疗；每天注射3 m l 针剂可改善先天再生障碍性贫血，明显增加红细胞 4 浙江工业大学硕士论文 数量：对于支气管哮喘和听觉障碍的治疗也有一定的作用。辅酶q 1 0 除用于医疗 外，还常用于化妆品【2 引、营养保健品及食品添加剂。在化妆品中辅酶q 1 0 能抑制 分解胶原蛋白的产生、维持肌肤丰润、弹性，而且它还能增加保湿成分透明质酸 的含量，提高肌肤的保湿效果。 1 4 辅酶q l o 合成工艺 目前，辅酶q 1 0 的生产方法主要有动植物组织提取法、动植物组织培养法、 化学合成法和微生物发酵法。 1 4 1 生物组织提取法 生物组织提取法主要是指工业上利用线粒体中富含有辅酶q l o 的动物器官， 如牛心、肝、肾脏、猪肝脏等提取生物辅酶q 1 0 。动物组织中辅酶q l o 含量相对较 高，而其结构类似物q 8 、q 9 、q l l 相对含量少，分离纯化简单【2 9 1 。但提取法生产 辅酶q 1 0 限于其原料来源困难，生产成本较耐3 0 1 。 1 4 2 动植物组织培养法 利用烟草细胞培养技术制备辅酶q i o 是植物细胞培养技术发展的产物之一。 国内从事辅酶q l o 植物细胞培养的单位只有少数几家，也都处于初步研究阶段， 还没有进入中试和工业化生产。鉴于植物细胞培养生产次生代谢物的独特优势， 利用烟草细胞培养生产辅酶q l o 值得深入研究和开发。 利用植物生物工程生产辅酶q l o 国内外报道甚少。自国内1 9 9 9 年康起亮 3 1 , 3 2 】 等人发表了关于从烟草悬浮细胞制备辅酶q l o 的研究论文之后，此项研究在国内 掀起了新热潮。孙君社等【3 3 】人在黄花草烟草细胞株培养过程中，对生物量、总 糖、辅酶q 。o 的含量进行检测，并建立起了在烟草细胞悬浮培养过程中细胞生长、 蔗糖消耗、辅酶q 1 0 生成动力学方程模型，相关系数均达到了9 9 以上。 1 4 3 化学合成法 化学合成法因其路线较为复杂，从辅酶q l o 的发现至今，化学工作者们对它 的化学合成路线一直进行着不懈的探讨与研究。化学合成法主要有五种方式：1 ) 浙江工业大学硕士论文 在被保护或未被保护的氢醌或醌的母体上直接引入癸异戊烯基3 4 , 3 5 , 3 6 , 3 7 】；2 ) 先 在母核化合物上引入一异戊烯型3 8 , 3 9 , 4 0 ，然后再引入所期望的长链；3 ) 以香叶 醇为原料将具有双官能团的单体逐步进行耦联的合成路线 4 1 , 4 2 1 ；4 ) 利用重排法 将癸异戊烯基引入母核化合物的酚羟基上，然后重排【4 3 】；5 ) 通过逆d i e l - - a l d e e r 反应制得【4 引。 辅酶q l o 的化学合成需要3 个关键步骤【4 5 】：首先是合成2 ，3 一二甲氧基一5 一甲基一l ，4 一苯醌或氢醌( 除方法5 ) ；其次需合成出具有立体选择性的多戊 烯醇或其卤化物；最后是进行两者高产率的缩合。方法1 到4 ，在侧链引入时都 以被保护或未被保护的氢醌作为合成的起始物或中间反应物，在得到这一氢醌时 所经历的步骤都繁多；这是造成产率低下的重要原因。方法5 是先在亚甲基萘醌 上引入侧链，然后利用周环反应的机理进行逆狄一阿反应，获得所需物质。这一 方法较之前4 种方法而言，比较独特，且关键的缩合步骤使用的中间体不是氢醌， 但要获得亚甲基萘醌所经路线很长，总产率不高。 1 4 4 微生物发酵法 随着产辅酶q l o 微生物的发现和利用，发酵法逐渐成为一种新的生产方式。 发酵法产辅酶q 1 0 最早由日本人在上世纪8 0 年代实现工业化生产，目前研究较多 的辅酶q 1 0 生产菌株【2 9 ，删有酵母属( 如假丝酵母、尚德尔酒香酵母、隐球酵母等) 、 细菌如假单胞菌属、土壤杆菌属、硫杆菌等，在根瘤菌属里也有发现产辅酶q l o 的菌株。该法具有原料廉价丰富，产物分离过程相对简单，发酵产物为天然品， 不存在手性问题，生物活性好，易被人体吸收等优点【4 刀，且可以通过发酵罐实 现工业化生产，现已成为最具有发展潜力的辅酶q 1 0 生产方法。但因其含量有限， 效率较低，生产成本高而使工业化受到一定限制。如能选择合适菌株进行遗传改 造，定向选育性能优良的菌种，使菌体中辅酶q l o 的含量提高，生产成本就会大 幅度下降。 6 浙江工业大学硕士论文 1 5 微生物发酵法产辅酶q l o 的研究 1 5 1 菌种选育 辅酶q 1 0 在各种微生物体内分布是不均匀的，在不需氧呼吸的细胞中无辅酶 q - 0 ，如革兰氏阳性菌，而对革兰氏阴性菌则具有较高浓度的辅酶q l o 。目前，国 内用于研究的菌种有放射型根瘤菌、光合细菌、豌豆根瘤菌、粟酒裂殖酵母等， 其研究内容主要是菌种的遗传改造及发酵条件的优化。己报导的辅酶q 1 0 的生产 菌株见表1 1 。 表1 1 辅酶q l o 产生菌及其胞内含量【鸫1 t a b l e1 - 1c o e n z y m eq 1 0p r o d u c i n gs t r a i n sa n di t sc o n t e n ti nc e l l s 辅酶q l o 产生菌含量( m g g 干细胞) 荚膜红假单胞菌( r h o d o p s e u d o m o n a sc a p s u l a t u s ) 胶状红假单胞菌( r h o d o p s e u d o m o n a sg e l a t i n o s a ) 假白布勒弹孢酵母u ll e r a p s e d o a l b a ) 热带假丝酵母( c a n d i d a tr o p i c a l i s ) 脱氮假单胞菌( p s e u d o m o n a sd e n i t r i f i c a n s ) 斯谷假单胞菌( p s e u d o m o n a su m o m s ) 脱氮副球菌( p a r a c o c c u sd e n i t r i f i c a n s ) k y 3 9 4 0 ( a t c c l 9 3 6 7 ) 鱼精蛋白杆菌属( p r o t a m i n o b a c t e r ) 烟曲霉( a s p e r g i l l u s f u m i g a t u s ) 放射型根瘤菌( r h i z o b u sr a d i o b a c t e r i u mw s h 2 6 0 1 ) 豌豆根瘤菌( r h i z o b i u ml e g u m i n o s a r u m ) 土壤杆菌属( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ) k y 2 3 0 8 5 ( a t c c a 4 5 2 ) 类球红细菌( r h o d o b a c t e rs p h a e r o i d e s ) k y 4 113 ( f e r m 2 p 4 6 7 5 ) 通常，工业发酵若想获得较高目的产物产量，必须突破( 或解除) 微生物细胞 自我调节控制机制，最常用且有效的方法就是从遗传的角度解除微生物正常代谢 控制机制的突变株。辅酶q l o 发酵生产的代谢调控育种基本途径有：结合辅酶q 1 0 7 粕煳 诎 k ， 池 削 无有 h 株株 啪 鲰 一一啷 一m 一一 一躺 忽 傩 所 懿 舵 m 狮 1 l 5 、 2 3 ， 浙江工业大学硕士论文 的代谢调控机制，应用营养缺陷型菌株、选育抗反馈调节突变株、利用营养缺陷 型回复突变株或条件突变株的方法，解除终产物对关键酶的调节；或切断或减弱 不必要的代谢支路包括芳香环和异戊二烯基侧链部分，尽量使胞内代谢流向合成 辅酶q l o 的方向进彳亍【6 1 。采用传统的物理或化学方法进行诱变育种，是目前提高 辅酶q 1 0 产量的主要手段。y o s h i d a l 4 9 】通过对类球红细菌进行诱变处理，并结合理性 化筛选得到突变株a u 2 5 5 。江南大学潘春梅等【5 0 】采用传统的诱变育种与高效的推 理选育方法相结合的方式，对细胞进行全面的非特异性诱变和针对合成途径的特 异性诱变处理，显著提高了辅酶q 1 0 的产量，提高幅度达3 7 ，并根据微生物的 生理需要和辅酶q 1 0 的合成途径和代谢调控机制，设计了如图1 2 所示的诱变筛选 模型，即以抗放射线菌素( a c t d ) 为指标，将抗性与辅酶q l o 合成量相联系，筛选 经紫外线和亚硝基胍复合诱变后的辅酶q , o 产生菌放射型根瘤菌( r h i z o b i u m r a d i o b a c t e ) ，得至l j 7 0 株抗a c t d 突变株，经摇瓶初筛得n 7 株辅酶q l o 产量提高l o 以上的突变株，再经复筛后得到一株辅酶q 1 0 产量提高1 6 1 堑j 突变株，其辅酶q l o 产量达n 1 1 0 2 m g l 。对该菌株连续传种5 代后辅酶q , o 产量仍稳定在1 0 8 m g l 以上。a c t d 是一种具有很强的细胞毒性致畸剂和致癌剂，对菌体细胞产生胁迫 毒害作用、并可选择性地抑制转录和蛋白质合成，培养基中加入的a c t d 对菌体 细胞具有较强的胁迫毒害作用。而辅酶q 1 0 是一种能提高机体免疫力的生理活性 物质，其胞内含量的提高也许能增强细胞对a c t d 的抗性。 8 浙江工业大学硕士论文 蛩1 - 2 辅酶q l o 高产菌筛选模型 f i g 1 - 2s c r e e n i n gm o d e lo f c o q j oh i g h l yp r o d u c i n gs t r a i n s 此外维生素k 3 ( v k 3 ) 是辅酶q l o 的结构类似物，对v k 3 的耐受浓度提高的突 变株有可能部分解除辅酶q 1 0 生物合成的反馈抑制，使辅酶q l o 合成量提高；潘春 梅【5 l 】等研究发现葡萄糖浓度过高会抑制辅酶q l o 生产菌的生长，故筛选葡萄糖反 馈阻遏减弱、解除突变株也许能提高葡萄糖代谢通量，促进菌体生长，提高辅酶 q l o 产量。利用x g a l 平板可筛选这种突变株，因为，若菌体发生了减轻糖分解代 谢阻遏的突变，则会提高菌体对x g a l ( 5 溴4 氯3 吲哚半乳糖苷) 利用能力。 1 5 2 构建基因工程菌 辅酶q 1 0 的合成途径在微生物体内可分为醌环的合成、聚十异戊二烯基焦磷 酸的合成和醌环的修饰三部分【5 2 1 。因此，通过分析这三个途径中起作用的前体、 酶及它们的编码基因，将辅酶q 1 0 生产菌株的关键酶基因，通过重组d n a 技术 引入生产菌株( 如酵母菌等) ，结合微生物的代谢调节机制，可找到辅酶q l o 高 产菌株的定向突变途径，从而达到大幅提高辅酶q l o 发酵产量的目的。 在与辅酶q 。o 的生物合成途径相关的若干种酶中，聚异戊烯焦磷酸转移酶和 十聚异戊二烯焦磷酸合成酶是两个关键酶，这两种酶在各物种之间具有较高的同 9 浙江工业大学硕士论文 源性。与这两个关键酶对应的基因是u b i a 基因和d d s a 基因。 ( 1 ) 聚异二戊烯焦磷酸转移酶( u b i a ) 在辅酶q x 的生物合成中，m e l z e r 掣5 3 】发现长链聚异戊二烯在聚异二戊烯 焦磷酸转移酶的催化下转移到对羟基苯甲酸上，该步骤被认为是合成途径中的限 速步骤。在大肠杆菌中，u b i a 催化对羟基苯甲酸( p f i b ) 和聚异戊二烯焦磷酸( p p p ) 的缩合，其编码基因为u b i a 基因。对其研究还表明，该酶对类异戊二烯焦磷酸 的专一性不强，可接受不同数目的侧链。 ( 2 ) 十聚异二戊烯焦磷酸合成酶( d d s a ) 十聚异二戊烯焦磷酸合成酶是辅酶q 1 0 侧链合成的一个关键酶，s u z u l d 等通 过构建裂殖酵母d d s 缺陷突变株证实了这一剧5 4 1 。辅酶q 系列的命名是根据其 侧链长度决定的。目前，有研究表明其侧链长度是由聚异戊二烯焦磷酸合成酶所 催化的反应决定的。通过对不同微生物的聚异戊二烯焦磷酸合成酶的氨基酸序列 比较、分析可知，它们之间存在较高的同源性，在序列中有七个高度保守的区域， 其中i i 区( l x x d d x x d x x x x r r g ) 和v i 区( g x x f q x x d d x x d x x x d ) 是两个天 冬氨酸富集区，是聚异戊二烯焦磷酸合成酶的典型序列，推测这两个区域是类异 戊二烯焦磷酸( 皿p ) 的二磷酸基团和丙烯基底物的结合位点5 5 5 6 1 。 对于不同菌种，辅酶q 1 0 合成的关键酶编码基因是不一样的。大肠杆菌中聚 异戊二烯焦磷酸合成酶由卸b 基因( 八聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因) 编码，弱氧 化葡糖杆菌( g l u c o n o b a c t e rs u b o x y d a n s ) 中则由d d s a 基因( 十聚异戊二烯焦磷酸合 成酶基因) 编码，酿酒酵母( s a c c a r o m y c e s c e r e v i s i a e ) 贝0a h c o q i 基因( 六聚异戊二烯 焦磷酸合成酶基因) 编码。虽然侧链长度是辅酶q 系列分类的重要标准，但是在微 生物体内侧链长度并不是电子转移的关键因素s 7 , s s 。因此可以通过扩增d d s a 基 因，通过质粒转入大肠杆菌，使其能产辅酶q 1 0 0 通过基因工程技术构建合成辅 酶q 1 0 大肠杆菌的基本策略如图1 3 。 1 0 浙江工业大学硕士论文 图1 - 3 运用基因工程技术构建合成辅酶q l o 大肠杆菌的策略 f i g 1 3s t r a t e g yo f c o q t op r o d u c i n ge c o i lr e c o m b i n a n tb yg e n ee n g i n e e r i n gt e c h n i q u e 利用分子生物学技术找到辅酶q 1 0 生产菌株的关键酶基因2 ，3 二甲氧基5 甲 基6 癸异戊烯基苯醌合成酶基因，通过重组d n a 技术筛选带有目标基因的细胞， 将目的基因引入生产菌株( 如酵母菌等) ，增强合成目的产物的能力，这是构建辅 酶q 。o 发酵重组菌株的基础，通过克隆上述关键酶基因，使其高效表达，并增强其 代谢流。通过将带有目的基因的质粒转化至经过诱变的突变茵( 如双重突变株) ， 随着细胞中合成酶基因拷贝数的增加，可积累较大量的产物【6 】。 随着生物体内辅酶q l o 合成途径的进一步阐明及酶工程、基因工程技术的应 用，近年来也有采用经过基因改造的菌株合成辅酶q 。o 的研究报道【5 9 鲫。在从弱 氧化葡糖杆菌g l u c o n o b a c t e rs u b o x y d a d p 分离关键酶基因方面的研究进行得比较 深入。p a r k 掣6 1 】从g l u c o n o b a c t e rs u b o x y d a n r 扣分离得到目的基因在e c o l i b l 2 1 中表 达，通过分批补料的方法发酵得到的产量为2 5 5 m g l 发酵液，但同直接从辅酶 q l o 的高产菌中提取得到的产量还是有差距的，目前还只是处于实验室研究阶段， 未能扩大生产。而c h e o n g 6 2 】等则是将聚十异戊二烯焦磷酸( d p s ) 基因和1 脱氧d 木酮糖一5 磷酸合成酶( d x s ) 基因一起插入载体p g p r x l l 中，通过质粒转化入 a g r o b a c t e r i u m t u m e fa c i e n sb n q - p g p r x li ( k c c m 一1 0 5 5 4 ) 中表达，得到辅酶q l o 的高产菌，通过发酵工艺优化后得到生物量为8 8 2 9 l ，辅酶q l o 的产量为 6 4 2 1 m g l 产率达到6 6 9 m g ( g h ) ， s a k a t o 6 3 】等通过多次诱变筛选得到高产突变 株产量( 7 7 0 m g l ) 相近，工业化生产前景较好。 浙江工业大学硕士论文 1 5 3 辅酶q 1 0 发酵与提取条件优化 提高辅酶q 1 0 的发酵产量，除了应用代谢控制理论选育高产突变株或构建基 因重组菌株外，对生产菌的发酵条件进行优化也是提高发酵产量的一条重要而有 效的途径，主要包括对培养基、培养条件、培养模式以及发酵提取、分离纯化条 件的优化。 1 5 3 1 辅酶q l o 发酵生产条件优化 ( 1 ) 培养基优化 菌种生长的优劣，培养基的成分极其重要，不同菌种，培养基的成分也不同。 在辅酶q l o 发酵过程中可通过选择不同来源成分的碳源、氮源、生长因子、无机 盐等进行发酵优化实验，以确定培养基的组成。有研究表明，金属离子，尤其是 m 9 2 + 、f e 2 + 、m n 2 + 对r s p h a e r o i d e s 发酵生产辅酶q 1 0 有促进作用6 4 1 。袁静【6 5 】 对光合细菌r c a p s u l a t u s 产辅酶q l o 培养基及培养条件进行了优化，得出酵母膏质 量浓度为3 1 3 9 l ，硫酸铵0 8 9 l ，m g + 0 6 4 9 l ，f e ”4 5 2 m g l ，m n 2 + 18m g l ， c d + 1 6 m g l ，初始p h 值7 o ，温度3 0 0 。培养4 d 后，菌体中辅酶q l o 质量浓度由 1 5 2 1 m g l 提高至2 0 3 7 m g l ，产量提高约3 3 8 7 。 另外，在培养基中添加一定量的其他物质( 前体物质及促进剂) ，也能明显提高 辅酶q 1 0 的产量。据日本m g c 公司【6 6 】报道，在脱氮副球菌的基本培养基中加入 胆碱和甜菜碱可提高辅酶q 1 0 的合成量达约3 0 ；若同时加入l 半胱氨酸则可提 高5 0 。张延静等【6 7 1 研究发现，豆油、豆粉、胡萝卜汁、西红柿汁、烟叶、p 胡萝卜素、桔子皮汁等自然物的添加亦能大幅度提高酵母菌中辅酶q l o 的含量， 其中烟叶和p 胡萝卜素阻断了合成p 胡萝卜素的途经从而起到提高辅酶q l o 合成 的作用；胡萝卜汁的作用可能两者兼而有之，进而认为微生物中辅酶q l o 的合成 与p 胡萝卜素的合成密切相关。t a n a k a 掣6 8 】用摇瓶培养菌种c 1 t 1 p k - 2 3 ，以1 0 - - - 1 3 个碳原子长的链烃为碳源3 0 培养4 5 h ，从培养液和细胞中分别得到4 6 6 和 1 3 1 m g l 的辅酶q l o ；若在培养基中加入前体物质对羟基苯甲酸，产量分别为1 0 6 8 和2 7 7 m g l 。刘萍等【6 9 】用粟酒裂殖酵母( 鼬扬伽口c 砌舢，移忙劣夕阳聊6 ) 研究了添加 侧链供给前体茄尼醇及醌环供给前体对羟基苯甲酸和c o q o 对辅酶q l o 产量的影 响。结果显示，单独添加茄尼醇能达到最大产量3 3 1 m g l ，比对照提高了9 1 ； 对羟基苯甲酸也能提高辅酶q l o 产量