（生物化学与分子生物学专业论文）孑遗植物桫椤遗传多样性的issr和cpssr分析.pdf

中山大学硕士论文 孑遗植物桫椤遗传多样性的i s s r 和c p s s r 分析 专业：生物化学与分子生物学 学位申请人：李媛 指导老师：王艇( 副教授) 摘要 本论文采用i s s r 和c p s s r 二种分子标记对桫椤似厶珊妇妒加砌咖进行种群 遗传结构的研究。 桫椤属桫椤科桫椤属，被列为我国一级保护植物，现处于灭绝的边缘。为了估 计桫椤种群的遗传变异及遗传分化，对贵州紫荒沟、葫市沟和两岔河三个种群，广 西龙豆和板坪村两个种群，重庆涪陵一个种群，海南坝王岭一个种群，福建福安、 东肖、赤坑三个种群，总共l o 个种群1 6 0 个个体进行i s s r 和c p s s r 分析。主要研 究结果如下： 1 1 对桫椤的i s s r 分析中，2 0 条引物共检测到1 0 2 个位点，其中多态位点7 6 个，多态位点比率7 4 5 1 ，n e l 基因多样性为o 1 7 4 0 ，s h 柚n 多样性指数为0 2 8 5 6 ： 桫椤的c p s s r 分析中，8 对引物中有4 对引物能扩增出多态片段，在桫椤种群1 6 0 个个体中共鉴定出9 种单倍型；n e i 基因多样性为0 1 0 0 5 ，s h 锄n o n 多样性指数为 0 0 5 0 3 ，显示桫椤保留有比较丰富的遗传多样性。 2 1 对i s s r 结果进行a m o v a 分析，桫椤种群间的遗传变异占总变异的4 0 2 8 ， 基于等位基因频率的s h a n i l o n 多样性指数计算的群体问遗传多样性所占比率 * s p h p o p ) ，h s p 、基因分化系数伍，和经贝叶斯统计分析算出p 的估计值分别为 5 1 8 6 、0 4 5 8 6 、0 3 5 1 0 。对c p s s r 结果进行a m o v a 分析也得到相似结论，桫椤 种群问的遗传变异占总变异的4 9 3 4 ，根据n e i 基因多样性指数算出的基因分化系 数吼为0 a 7 3 8 。对i s s r 数据根据j 粒c a r d 相似性系数用u p g m a 法聚类分析表明， 所有桫椤种群个体明显分为三支；i s s r 谱带表型的主成分分析( p c a ) 的支持此结 中山大学硕士论文 果，表明桫椤种群间存在很大的变异，种群之间存在一定的分化。 关键n - 桫椤、i s s r 、c p s s r 、遗传多样性 中山大学硕士论文 i s s ra n dc p s s r a n a l y s i so ft h eg e n e t i cd i v e r s i t yo fa r e l i c tt r e ef e r n ，a l s o p h i l as p i n u l o s a ( c y a t h e a c e a e ) m a j o r ：b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y c a n d i d a t e ：l iy u a n s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep m w a n gt i n g a b s t r a c t t h ep o p u l a t i o ng e n e t i cs l r u c t u r eo f a l s o p h i l as p i n u l o s ai si n v e s t i g a t e du s i n gi s s r a n dc p s s rm a r k e r s a l s o p h i l as p i n u l o s a ( g e n u sa l s o p h i l a ，f a m i l yc y a t h e a c e a e ) i sc o n s i d e r e da sa c a t e g o r yip r o t e c t e ds p e c i e si nc h i n a i no r d e rt oa s s e s st h ee x t e n to fp o p u l a t i o ng e n e t i c v a r i a t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o n ，m a t e r i a l sw e r ec o l l e c t e df r o mt h en a t u r a lp o p u l a t i o n s d i s t r i b u t e di ns o n t h e 船tc h i n a t o t a l l y16 0i n d i v i d u a l sw e r es a m p l e df r o mg u i z h o u ( 6 0 ) ， g u a n g x i ( 4 0 ) ，c h o n g q i n g ( 2 0 ) ，f u j i a n ( 3 6 ) h a i n a n ( 4 ) i ng u i z h o u a n df u j i a nt h r e e p o p u l a t i o n sw e r es a m p l e de a c h ；t w op o p u l a t i o n sw e r es a n o k e di ng u a n g x i ，w h i l eo n e p o p u l a t i o ni nc h o n g q i n ga n dh a i n a ne a c h i s s ra n dc p s s rm a r k e r sw e r eu s e dt oa s s a y t h et e np o p u l a t i o n s ，a n dt h em a i nr e s u l t sa r ca sf o l l o w s ： 1 ) i ni s s ra n a l y s i s ，2 0p r i m e r sg e n e r a t e d1 0 2s i t e s ，o u to f w h i c h7 6 ( 7 4 5 1 ) w e r e p o l y r n o r p h i c n e i sg e n ed i v e r s i t yw a so 1 7 4 0 a n ds h a n n o ni n d e xw a s0 2 8 5 6 i nc p s s r a n a l y s i s ，8p r i m e r sd e t e c t e d9c h l o r o p l a s th a p l o t y p c s n e i sg e n ed i v e r s i t yw a s0 0 5 0 3 ， a n ds h a n n o ni n d e xw a so 10 0 5 ar e l a t i v e l yh i g hl e v e lo fg e n e t i cv a r i a t i o nw a s m a i n t a i n e di na l s o p h i l as p i n u l o s a 2 1a m o v aa n a l y s i sb a s e do ni s s rd a t aa n a l y s i si n d i c a t e dt h a t4 0 2 8 o ft h e v a r i a t i o nw a sp a r t i c i p a t e da m o n gp o p u l a t i o n s v a l u e so f ( h s p - h p o p ) h s p g 盯a n d04 m 中山大学硕士论文 w e r e51 8 6 ，0 4 5 8 6 ，a n do 3 51 0 a m o v af r o mc p s s rd a t ae x h i b i t e ds i m i l a rr e s u l t ： 4 9 3 4 o ft h ev a r i a t i o nw a sp a r t i c i p a t e da m o n gp o p u l a t i o n s g b a s e do nc p s s rd a t a w a s0 4 7 3 8 u p g m at r e ee s t a b l i s h e df r o mj a e e a r ds i m i l a r i t yc o e 伍c i e n t sb a s e do ni s s r d a t as h o w e dt h a t16 0a s p i n u l o s ai n d i v i d u a l sw e r ec l u s t e r e di n t ot h r e es u b g r o u p st h a t w e r ef u r t h e rl e n ts u p p o r tb yap r i n c i p l ec o m p o n e n t sa n a l y s i s ( p c a ) o fi s s rp h e n o t y p i e d a t a t h er e s u l t si n d i c a t e da h i g hl e v e lo f g e n e t i cd i f f e r e n t i a n t i o na m o n gp o p u l a t i o n s k e yw o r d s ：a l s o p h i l as p i n u l o s a ，i s s 如c p s s r ，g e n e t i cd i v e r s i t y i v 中山大学硕士论文 第1 章前言 1 1 遗传多样性和遗传结构 1 1 1 遗传多样性的概念 遗传多样性( g e n e t i cd i v e r s i t y ) 是指地球上所有生物所携带的遗传信息的总和， 亦称基因多样性，包括不同物种以及物种内的遗传变异。狭义的遗传多样性则主要 是指种内不同种群间以及种群内不同个体间的遗传变异【l j 。遗传多样性是生物多样 性的核心和重要基础。 遗传多样性的本质是生物体在遗传物质上的变异，即编码遗传信息的核酸( d n a 或r n a ) 在组成和结构上的变异。遗传多样件的研究对象主要集中在物种的可遗传变 异上。由于发育的可塑性及环境条件的作用而产生的形态学或生理学变化，不构成 遗传多样性，因为这类差异没有相应的遗传基础。这方面的例子诸如，某些生物的 不同生活史阶段的形态交型，动物出于营养和环境导致的高矮、胖瘦等【2 l 。 遗传多样性的表现形式是多层次的。在分子水平，可表现为核酸、蛋白质、多 耱等生物大分子的多样性；在细胞水平可体现在染色体结构的多样性以及细胞结构 与功能的多样性；在个体水平，可表现为生理代谢差异、形态发育差异以及行为习 性的差异 3 1 。遗传多样性通过对上述各层次的生物性状的影响，导致生物体的不同 适应性，进而影响生物的分布和演化。此外，也发现许多遗传变异并不导致任何可 观测到的表型上的差异。 遗传多样性的存在形式，主要体现在种群遗传结构的组成和变化上种群遗传 结构泛指遗传物质在种群水平上的存在格局或特征，包括基因频率、基因型频率、 交配与繁殖模式、种群遗传分化、种群问基因交流模式等阱。对大范围连续分布的 异交的植物来说，种群之间的遗传变异明显增加；对于以无性繁殖为主的植物来说， 每个无性系居群在人部分位点上是纯合的，形态变异也很小；但是不同的无性系居 中山大学硕士论文 群间有很大的差异，因为遗传变异分布于种群之间l ”。由此而见，居群遗传结构上 的差异是遗传多样性的一种重要体现，一个物种的进化潜力和抵御不良环境的能力 取决于种内遗传变异的大小，也有赖于遗传变异的种群结构f 5 - s 】。 1 1 2 研究遗传多样性的意义 研究遗传多样性具有重要的理论和实际意义： 首先，有助于进一步探讨生物进化的历史和适应潜力。遗传变异是生物进化的 内在源泉，因而，遗传多样性及其演变规律是生物多样性及进化生物学研究中的核 心问题之一。遗传结构与物种繁衍或濒危灭绝密切相关，遗传多样性在一定程度上 决定了物种的分布以及数量多样性。物种或居群的遗传多样性大小是长期进化的产 物，是适应和发展的前提。一个种群( 或物种) 遗传多样性越高或遗传变异越丰富， 对环境变化的适应能力就越强，越容易扩展其分布范围和开拓新的环境。理论和大 量实验证据表明，生物种群中遗传变异的大小与其进化速率成正比，因此对遗传多 样性的研究可以揭示物种或居群的进化历史( 起源的时间，方式1 ，也能为进一步分 析其进化潜力和未来命运提供重要的资料，尤其有助于对物种稀有或濒危原因及过 程的探讨。缺乏对生物遗传多样性的深入研究，就无法完整地认识物种的进化过程 或适应机理，以及种群地理分布格局、数量增长及物种灭绝等问题【圳。 第二，遗传多样性是保护生物学研究的核心之一。保护生物多样性最终是要保 护其遗传多样性。只有掌握物种种内遗传变异大小、时空分布及其与环境条件的关 系，我们才能制定科学有效的保护策略和措旌来保护人类赖以生存的遗传资源，才 能保护受威胁的物种，挽救濒于灭绝的物种【10 】。对珍稀濒危物种保护方针和措施的 制定，如采样策略、迁地或就地保护的选样等，都有赖于我们对物种遗传多样性的 认识】。 第三，对遗传多样性的认识是生物各分支学科重要的背景资料。古老的分类学 或系统学几百年来都在不懈地探索、描述和解释生物界的多样性，并试图建立一个 能反映自然或系统发育关系的阶层系统以及建立一个便利而实用的资料信息存取或 2 中山大学硬士论文 查询系统【1 2 】。对遗传多样性的研究无疑有助于人们更清楚的了解生物多样性的来源 和进化，尤其能加深人们对微观进化的认识，为动植物的分类、进化研究提供有益 的资料，为系统发育、分类系统的建立提供佐证，为植物育种和遗传改良奠定基础 1 1 引。 最后，遗传多样性研究也具有十分重要的实践意义。遗传多样性是生物界几十 亿年进化所产生的宝贵资源，是人类生存和社会生产发展的基础。对遗传多样性的 掌握和有效利用，是现代医学生物学，农业生物技术研究的一个前沿领域。特别表 现在诸如：动植物优良品种选育、新的药物的发现和制取、人类遗传疾病的诊断治 疗、生物活性物质的基因工程生产、生物资源的鉴别和利用、有害生物的检测和防 治等方面1 2 】。 1 1 3 遗传多样性的研究方法 检测遗传多样性的方法随生物学，尤其是遗传学和分子生物学的发展而不断提 高和完善，可从不同角度和层次来揭示物种的变异性。遗传多样性的研究方法可分 为4 种类型：形态学方法，细胞染色体方法、蛋白质生化方法和d n a 分子标记。传 统的遗传多样性实验研究方法主要依靠表型性状变异的分析，即利用表型性状遗传 标记，结合生理特性、生活习性等方面的差异来探讨遗传多样性。此外，也应用交 配繁殖实验、家系分析( p e d i g r e ea n a l y s i s ) 、染色体形态学分析等手段来分析种群的 遗传多样性。利用表型性状来研究遗传多样性的主要缺点，是可供分析的基因位点 太少，不能得到客观全面的遗传变异信息；其次，表型性状的遗传标记还会受到生 物发育阶段、环境条件等影响。 2 0 世纪5 0 年代后期出现了蛋白质电泳技术，以它为实验基础的同工酶、等位 酶分析方法开辟了种群遗传变异研究的一个额时代。从7 0 年代末至今，一系列更为 敏感的检测d n a 水平遗传变异的方法逐步发展起来，如r f l p 、d n a 指纹、a f l p 、 d n a 序列分析等，尤其是8 0 年代聚合酶链式反应( p c r ) 的发明和热稳定性d n a 聚合酶的发现，极大地促进了d n a 分析技术在群体遗传学和遗传多样性研究中的 中山大学硕士论文 应用1 3 1 。 1 1 3 1 同工酶电泳( i s o z y m ee l e c t r o p h o r e s i s ) 遗传分析中非常有用的两种类型的蛋白质是同工酶和等位酶。同工酶( i s o z y m e l 指机体内催化同一反应的酶的不同分子形式，它是由不同基因位点所编码的，具有 同一种功能但有不同分子结构的酶。等位酶( a l l o z y m e ) 指同一基因位点上不同等位基 因编码的同一种酶的不同分子型，由于酶是由基因编码且通常不会随环境的变化而 发生饰变，因此对同工酶进行分析可以间接揭示生物种群遗传结构，检测种群的遗 传多样性，也可鉴别不易从形态学上区别出来的物种或亚种。同工酶电泳具有实验 简便、成本低等优点，可以方便地检测许多个体，但是在濒危物种内，往往表现出 很少的多态性，这种情况下得到的信息量很低【1 4 】。2 0 世纪的年代，多位点同工酶的 分析主要用于人和果蝇的群体分析中，而且多态位点很少：如今人们已发现了大量 的多位点同工酶( 或等位酶) ，并被广泛应用于群体遗传多样性的研究。虽然蛋白质 多态性的分析有其一定的优点，但相对于d n a 分子标记方法而言，取材要求严格， 酶活性可能受生理和环境状态影响，信息量偏低。 态性 1 1 3 2r f l p ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 限制性片段长度多 限制性片断长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，简称r f l p ) 是2 0 世纪7 0 年代末发展起来的一种分子标记，也是最早用于群体遗传多样性分析 的d n a 分子标记技术1 1 5 1 。其原理是：限制性内切酶能识别d n a 分子中特定的核苷 酸序列，并将基因组中的d n a 分子降解成许多长短不一的酶切片段，经电泳、印 迹后再与d n a 探针杂交并放射自显影，便可检测到r f l p 的存在。如果是经过纯 化的小分子d n a 酶切电泳后可直接显色得到片段长度上的差异。该方法的优点是 r f l p 源于基因组d n a 本身的变异，检测不受环境条件和发育阶段的影响，但r f l p 分析需要比较繁琐的步骤包括多种酶切、标记、分子杂交等，加上工作量大、成本 4 中山大学硬士论文 高以及放射性的问题，使其应用受到了一定的限制“6 1 1 3 3r a p d ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i s md n a ) 随机扩增多态性d n a r a p d 技术是2 0 世纪9 0 年代初由美国杜邦公司农产品研究中心的w i l l i a m s 1 7 】和 美国加利福尼亚生物研究所的w e l s h 1 8 1 两个研究小组几乎同时建立的检测随机扩增 多态d n a 的分子生物学技术。它是以1 0 b p 左右的随机寡核苷酸单引物，对基因组 d n a 进行p c r 扩增，扩增产物通过电泳分离，从而得到扩增产物d n a 片段的多态性。 r a p d 是以盂德尔方式遗传的，故作为分子标记是有效的。个体间的多态性主要是 由于两个或其中一个引物结合位点的序列变异，表现为有或无某特定条带，或两退 火位点间的插入或缺失而引起距离变化，导致扩增产物长度变化或产物的出现和消 失f 1 9 1 。 r a p d 的优点表现在：信息量几乎是无限的：可以在对物种基因组没有任何分 子生物学研究的情况下对其进行d n a 多态性分析，合成一套引物可用于任何物种 基因组的分析，而且可用的引物种类可无限多；方法简便易行；需要样品量少；对 模板d n a 质量要求不严。r a p d 的缺陷表现在：几乎所有的r a p d 都是显性遗传， 所以无法区分显性等位基因的纯合性与杂合性；由于扩增极为灵敏，易受外源及污 染d n a 的干扰；r a p d 图谱中某些弱带重复性较差；该方法在引物长度、序列及 应用引物数目、扩增反应条件等实验技术方面未标准化，因而不同方法获得的实验 结果难以比较，重复性较差1 2 0 - 2 3 1 。 性 1 1 3 4a f l p ( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) j 扩增片段长度多态 扩增片断长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，简称a f l p ) 标 记是z a b e 硼鲫最早提出、并同v o s 陶发展起来的一种d n a 分子标记技术。其原理 是用一组限制性内切酶消化基因组d n a ，然后在限制性片段两端连接上人工接头作 为扩增的模板。设计的引物与接头和酶切位点互补，并在3 端加上2 - 3 个碱基，从 中山大学硕士论文 而使只有那些与引物3 端互补的酶切片段才能被扩增。扩增产物在变性聚丙烯酰胺 凝胶( p a g e ) - 分离后，通过一定的检测手段可显示出多态性丰富d n a 指纹式样。 a f l p 是既进行酶切位点分析，又对酶切片段进行选择性的p c r 扩增，因此它既具 备r f l p 的准确性又具备r a p d 的高效性，综合了二者的优点，采用少数几对引物 的多种组合即可获得大量遗传信息，避免r a p d 分子标记重复性差、假阳性反应过 高等不利因素的影响，同时又无需任何目的基因组d n a 的背景资料即可完成模板 d n a 多态性检测，摆脱了r f l p 繁琐的转膜、克隆、探针制各、分子杂交等一系列 繁霞且又有一定难度的工作1 2 6 - 2 8 1 。 用a f l p 分析的多态性是典型的按孟德尔方式遗传和选择中性的。它可以用于 遗传分析的各个方面。a f l p 也适于鉴定遗传多样性和物种亲缘关系的研究。迄今 为止，每个a f l p 反应能检测出的多态性片段之多、效率之高是任何一种其他的分 子标记无可比拟的。但由于采用双限制性酶酶切，所得到的片段较短，平均长度一 般不超过5 0 0 b p ，因而只能采用p a g e 电泳，用同位素等标记检测，操作较为繁琐， 片段的回收也不如琼脂糖凝胶电泳方便，而且受专利保护，对基因组的覆盖率不够 理想，a f l p 试剂盒昂贵 2 9 - 3 2 1 。 1 1 3 5s s r ( s i m p l es e q u e n c er e p e a o 简单重复序列长度多态性标记 s s r 又叫微卫星d n a ( m i c r o s a t e l l i t ed n a ) ，重复单位很短，只有1 5 b p ，重复 数可变，总长度为几十个b p ，分布于整个基因组的不同位置上。微卫星d n a 两端 的序列一般是相对保守的单拷贝序列，据此可设计特异引物进行s s r p c r ，以扩增 串联重复序列，根据串联重复数的不同，揭示微卫星d n a 的长度多态性。微卫星 标记具有以下特点：共显性；在一个居群内存在许多不同大小的等位基因，杂合水 平特别高；按孟德尔方式遗传，可用于分离和连锁分析。其主要缺点是必须事先知 道微卫星两翼序列信息才能设计引物，对于许多物种需构建文库。相对于a f l p , r f l p 和r a p d 等技术的局限性，可能很难查明位点的状态或是确定等位基因的关 系，在处理大量样品时遇到的技术困难等，s s r 具有明显的优势。s s r 标记在数据 6 中山大学硕士论文 上比前述分子标记能显示出更多的多态性，在分析具有少量位点的大量个体时显得 较为有效和经济。s s r 标记以其特有的优点，己被广泛用于植物生态学和系统与进 化研究o 蜘。 c p s s r ( c h l o r o p l a s ts i m p l es e q u e n c er e p e a t s ) ； 示记由p o w e l l 等( 1 9 9 5 ) 【3 6 1 最先提出， 并在松树中筛选出了第一批c p s s r 弓i 物。c p s s r 的原理与核基因组s s r 相同，都是以 简单重复序列作模板，根据模板两端的保守序列设计引物进行扩增，因简单序列的 重复数的不同而表现出多态性。与核基因d n a 相比，叶绿体基因组d n a ( c p d n a ) 呈 单亲遗传模式，而且具有分子质量小、多拷贝、结构简单等特点，这都有利于对叶 绿体基因组进行分析朔。叶绿体基因组相当保守，其进化速率比核基因组慢得多， 但叶绿体d n a 的保守性并非绝对，在较多植物类群中都有不同程度的c p d n a 种内变 异【弼。叶绿体s s r 是近年来发展起来的一种新型的分子标记技术，由于其具有s s r 标记的优点又兼顾到叶绿体基因组的特点，具有操作简便，多态性揭示能力强，安 全可靠等优点，所以c p s s r 耳前广泛用于植物群体遗传分析及系统发育分析研究。 已在马铃薯嗍、大麦1 4 0 、水稻i 4 1 ，4 2 】、大豆1 4 3 , 4 4 、猕猴桃1 4 5 、苜蓿1 4 6 和柑橘“7 l 等作物中有报道。在水稻中c p s s r 效率是r f l p 的3 倍l ，s s r 是迄今最具发展潜力 的叶绿体标记，但由于引物来源受限，目前的应用主要是模式植物或研究基础比较 深厚的草本植物h 明。 1 1 3 6i s s r ( i n t e r s i m p l es e q u e n c er e p e a t s ) 简单重复序列问长度多态性 i s s r 标记技术是由z i e t k i e w i c z 等提出的，是一种利用p c r 扩增进行检测的d n a 标记，所用的引物是基于简单序列重复而设计的长度一般为1 4 - 2 0 个碱基的寡核苷酸 引物，用来检测两个s s r 之间的一段短d n a 序列的差异【4 9 】。一般在引物的5 或3 端 接上l _ 4 个嘌呤或嘧啶碱基，引物的序列和和核苷酸均是任意选择合成的。使用i s s r 引物进行p c r 扩增时，引物可以锚定于微卫星上，扩增可得到相邻s s r 问区域的扩 增片段嗍，如果基因组在这些扩增区域内发生d n a 片段插入、缺失或碱基突变以及 其它结构变异，就可能导致这些区域与引物结合的数量和位置的改变，从而使p c r 7 中山大学硕士论文 扩增片段数量及长度改变，通过电泳即可检测出基因组在这些s s r 位点的多态性。 在真核生物基因组中散布有大最的双核苷酸和多核苷酸s s r 重复序y u t s t - 5 3 ，其中双 核苷酸重复序列是最丰富的，在不同的物种中具有特异的不同类型重复序列，在同 一物种不同的植物样本中也存在着数量和类型上的差异，因此，植物基因组也就可 能含有丰富的i s s r 多态信息，通过i s s r 分子标记检测，就可以从d n a 水平上分析其 遗传信息。 i s s r 技术利用基因组中有关s s r 序列信息，结合了r a p d 和s s r 技术的优点 5 0 , 5 4 , 5 5 ，具有r a p d 操作简单、结果检测方便的特点，并具有s s r 的稳定性的优点， 而且e l r a p d 具有更高的多态性【5 6 】概括起来，具有以下几个方面的特点：0 ) e h 于 s s r 在生物基因组中广泛存在，所以i s s r 可以提供较大的信息量；( 2 ) 可以在没有任 何分子生物学研究基础的情况下，进行基因组指纹图谱构建，为物种演化和分类研 究提供d n a 水平上的证据；与s s r 相比，i s s r p c r 不需要引物的序列信息，所以可 以在没有任何的测序基础上进行实验；( 3 ) 在s s r 的5 或3 端锚定1 4 个简并碱基，这 样在基因组上只有那些与锚定的核苷酸匹配的位点才能被靶定，因而避免了s s r 在 基因组中的滑动，大大的提高了p c r 扩增的专一性；( 4 ) i s s g 弓l 物序列较长，p c r 反 应的退火温度较高( 5 0 左右) ，能获得稳定的扩增，克服了r a p d 重复性差的特点； ( 5 ) i s s r 通常为显性标记，呈孟德尔式遗传，并且由于i s s r 扩增的可能是不编码的 位点，所承受的胁迫较低，因此与等位酶相比，i s s r 具有良好的稳定性和多态性。 1 1 3 7d n a 测序( d n a s e q u e n e i n g ) d n a 序列分析是在d n a 一级结构水平上检测遗传多样性的分子标记技术，即 采用某种策略测定核苷酸在基因组d n a 特定区域的排列顺序，它是最能充分揭示 d n a 多样性的方法【册。d n a 序列分析是区分个体间遗传差异最彻底准确的分析方 法，可提供基因组特异区的完全遗传信息。在解决种群学和系统学问题中都是可靠 的，它可以避免等位酶在电泳中由于相似的迁移率和相同的遗传密码而无法检测到 信息的情况。但d n a 测序仅能观察到单基因的多态性，只揭示该基因的变化情况， 中山大学硪士论文 而且分析费用高，因此对所有生物基因组d n a 都进行测序不是轻易能做到的事。 一般而言，比较保守的基因进化速度较慢，它的序列分析适用于亲缘关系较远的物 种间的遗传研究，而进化较快的基因适合于群体遗传研究。随着p c r 技术的发展， 基因组特殊区域或特异基因的序列测定正逐渐使用。目前应用最多的是用“通用” 引物扩增m t d n a ，c p d n a 或核d n a 某些基因、d n a 片段，然后对这些p c r 产物 进行测序。其中单拷贝基因测序是一个很有潜力的分子标记技术，已被用于系统发 育地理学、分子系统学、遗传学等研究领域当中嗍。 1 1 3 8 选择合适的遗传多样性研究方法 在生物多样性的保护及生物资源的开发和利用中，生物遗传多样性的检测技术 无疑起着巨大的作用。进行遗传多样性的研究，首先应选择合适的遗传标记。w e i s i n g 和n y b o m 等( 1 9 9 5 ) 指出，理想的分子标记应该符合以下标准：1 ) 具有高的多态性； 2 ) 共显性遗传，可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；3 ) 在基因组中频繁出现，甚 至贯穿分布于整个基因组；4 ) 选择中性( 即无基因多效性) ；5 ) 开发成本和使用成 本尽量低廉；6 ) 容易操作，检测手段简单、快速( 如实验程序易自动化) ；7 ) 重复性 好；8 ) 所得数据可在实验室之间交流和比较i 堋。 但是，目前发现的任何一种分子标记在理论和实际研究中都有各自的优点和缺 陷，还找不到一种能完全替代其他方法的技术【6 0 朋j 。本研究综合考虑了分子标记的 检测适用范围、检测效率、所得信息量及花费成本等各方面的因素并且与本实验室 的条件相结合，选取了i s s r 和c p s s r 二种分子标记来尽可能地客观实际地揭示桫椤 的遗传多样性水平和居群遗传结构。 1 1 4 濒危植物遗传多样性保护 濒危植物保护的研究方法主要有种群生态学的研究方法、生殖生态学研究方法 和遗传多样性研究方法。生物多样性有多种多样的表现形式，最终都是由控制形态 和发育的基因多样性所决定的。从大量研究的基础或者统计规律来看，遗传杂合度 中山大学硕士论文 ( 遗传多样性) 的高低与种群或物种的适应度相关，近交导致杂合性降低，导致物种 灭绝的概率增加【3 】。遗传多样性是其它一切多样性的基础和源泉，遗传多样性的保 护是保护生物学中的一个中心问题，也是保护生物学的核心领域之一。保护生物多 样性的一个重要任务是使种群保持足够程度的遗传多样性，进而保障种群未来的适 应能力、扩展能力以及在自然环境下重新建立新种群的能力。f r a n k l i n 提出，为了 保持与正常自然种群相当水平的遗传多样性，一般来说至少要有5 0 0 个体。这个指 标是由数量性状的可加性遗传变异度( a d d i t i v eg e n e o ev a r i a n c e ) 的突变一漂变平衡计 算出来的【1 4 1 。s o u l e 认为，圈养种群的遗传管理目标之一应是尽可能地在2 0 0 年 的时间内能够保持原( 野生) 种群中9 0 的遗传变异别【i4 1 。f a l c o n e r 提出一个种群遗 传管理的数学模型，种群经历t 代后能保持的中性遗传变异( 杂合度) 变化的期望比例 为： 矾矾= 1 1 ( 2 e ) ( 1 一一 其中，h o 为初始杂合度；p 为有效种群大小；t 为世代数；f 为近交系数【。 根据这种模型，为了最大程度地保持遗传多样性，降低遗传变异的逐代丢失，应采 取以下措施：1 ) 扩大 k ，比如可扩大种群大小，平衡家族大小，减少单雄多雌交 配及减小种群大小的波动等；2 1 减小t ，如通过发育过程或生殖调控，扩大世代间 隔；3 ) 降低f 可采用与扩大p 相似的手段，监测、控制个体问的交配关系等【6 2 1 。 根据群体遗传学和保护生物学的理论和技术，提出保护原有种和培育新品种是 植物遗传多样性保护的两个重要手段。要适应不断变化的生物环境，要求生物物种 必须贮存足够的基因多样性，需要建立种质基因库、保护园和保护区来实现保护的 目的。具体的保护措施主要有就地保护( 原位保护、原生境保护) 和迁地保护( 异位保 护、非原生境保护1 两种。长期保护遗传多样性的最佳策略就是在野外原有的生态环 境下条件保护自然群落和种群，即原生境保护( h a s i t uc o n s e r v a t i o n ) ，因为只有在原 有的生态环境条件下，物种才能在自然群落中适应变化的环境，沿着既有的进化途 径发展。但对许多珍稀物种而言，在面临日益增长的人类干扰情况下，遗传多样性 丧失严重。因此异位保护( e x s i t uc o n s e r v a t i o n ) 是目前植物遗传资源保护的主要方式。 l o 中山大学硕士论文 异位保护又分为种质库( g e n e b a n k ) 与种质圃( n u r s e r i e s ) 或植物园保存两种方式。目前 世界上已有5 0 多个国家级种质库，保存着数百万份植物种子，我国也建成了2 座国 家种质库和3 2 个国家种质圃，保存种质资源3 7 万多份。然而，目前主要是以保护 森林和野生动物为主且仅限于物种水平和生态系统水平的保护，而对能保证物种进 化的现存的遗传多样性的原生境保护研究甚少 6 3 - 6 7 1 2 桫椤的研究概况 桫椤( a l s o p h i l as p i n u l o s a ( w s l i 既h o o k ) t r y o n ) 属桫椤科( c y a t h e a c e a e ) 桫椤 属( a l s o p h i l a ) ，又名树蕨、蕨树、水桫椤、刺桫椤、大贯众、龙骨风、七叶树，为白 垩纪时期遗留下来的珍贵树种，是现今仅存的木本蕨类植物，极其珍贵。桫椤的出 现距今约三亿多年，比恐龙的出现还早一亿五千多万年。恐龙灭绝，桫椤独存，故 桫椤又有“活化石”之称。因为它稀有珍贵，被国家列为一类保护植物【醅p l 。 1 2 1 桫椤的形态学特征 桫椤孢子体的茎直立，高通常为l 6 m ，有时可达1 0 m 以上，上部有残存的叶 柄，向下密被交织的不定根，不定根不仅起吸收作用，还能加粗茎干，起支持作用。 茎基部为原生中柱，向上逐渐发育为管状中柱，再向上则为网状中柱，双韧，外围 厚壁组织，皮层无形成层。髓部薄壁细胞富含淀粉，其间有维管束穿过【删。叶片为 二回羽状复叶至三回羽状深裂，大型，纸质，长1 3 m ，宽0 4 0 8 m 左右，叶螺 旋状排列于茎的顶端，羽片1 7 2 0 对，长3 5 5 0 c m ，宽1 4 l8 e m ；小羽片呈浅状 披针形，1 8 2 0 对，长5 1 2 c m ，宽1 2 1 6 c m ，叶面绿色，背面灰绿色。 桫椤孢子呈钝三角形，黄褐色孢子囊群着生在叶片背面侧脉分叉处，靠近中 肋囊群近球，膜质。每个孢子囊产1 6 个孢子，孢子四面体形，辐射对称，三缝， 大小为3 0 7 4 6 1u m 每张叶片与孢子囊群1 0 8 6 3 0 万个，每株桫椤年产孢子约 1 0 1 9 2 亿粒【7 1 1 。 巾f n 人学硕十论文 图i - 1 桫椤的形态特征 f i g i - im o r p h o l o g yo f a l s o p h i l as p i n u l o s a a ：树干 a ：b o l e 1 2 2 生长发育特性 b ：叶柄c ：叶子 b ：l e a f s t a l kc ：l e a r d ：孢子 d ：s p o r e 桫椤腋芽从3 月上旬开始抽发，月均温1 4 5 ：5 月出现发n f 量的第一个高峰， 平均每株发叶5 4 枚，气温为2 1 2 ；九月气温达至1 2 1 7 c ，发叶量达到第二个高峰 中山大学硕士论文 从1 1 月上旬起到第二年的3 月上旬，桫椤处于休眠或半休眠状态。桫椤要l o 年以上的 植株才进人生理成熟期，1 2 m 以上的植株才开始生长孢子。在不同纬度桫椤的生殖 物候有很大的差别。张家贤观察赤水桫椤孢子囊群5 月出现，7 , 9 孢子成熟开裂。而 程治英等在西双版纳的观察发现：孢子囊群2 、3 月份开始孕育，4 月发育，5 月趋于 成熟，6 月开始成熟。在人工条件下，从孢子的萌发至丝状体，原叶体到幼孢子成熟 整个生活周期约1 0 个月阎。 1 2 3 桫椤的地理分布 据古植物资料，桫椤化石孢子发现于波兰、印度和朝鲜的侏罗纪以及苏联、捷 克的早垩纪；在我国山西大同的侏罗纪，大兴安岭，辽宁的阜新、吉林的早白垩纪 均有发现【仕嘲。现代属孢子化石，在苏联的侏罗纪、白垩纪、老第三纪均有发现。 由此可见，此类树形蕨类植物在侏罗纪已存在，且分布很广泛。随着地质历史的变 迁，分布区逐渐缩小和南迁，分布区逐渐缩小和南迁，形成了如今的泛热带分布格 局。 桫椤的生境类型较为单一，多生长在沟深谷狭，温暖潮湿的环境生境类为热 带雨林季雨林型。垂直分布一般在海拔4 0 0 9 0 0 m ，最高可达到1 5 0 0 1 6 0 0 m ，最 低1 5 0 m 。相对湿度8 0 以上，年平均气温1 5 c ，年平均降雨量1 0 0 0 m m 以上。分布 在亚洲的有斯里兰卡、尼泊尔、锡金、不丹、印度、孟加拉国、缅甸、泰国、老挝、 越南、柬埔寨、印度尼西亚、菲律宾、日本等国i 醴卿。 我国桫椤主要分布在以下省、自治区、直辖市。 贵州：赤水为集中分布区，习水、安龙、贞丰、册亨、望谟、三都、榕江等 亦有分布。 云南：麻栗坡、马关、金平、屏边、绿春、泸西、通海、广南、贡山、盈江、 瑞丽、西畴等地均有分布。 四) j h 五通桥、荣县、邻水为集中分布区，犍为、合江、叙永、筠连、珙县古 中山大学硕士论文 蔺、宜宾、屏山、雷波、雅安、峨嵋等地亦有分布。 重庆：为集中分布区，江津、大足、缙云山等地亦有分布。 西藏：分布在墨脱、察隅等地。 福建：永定为集中分布区，福清、安溪、长泰、漳南等地亦有分布。 台湾：分布在台中、南投、花莲、屏东等地。 广东：分布在仁化、乳源、连山、怀集、肇庆、德庆、信宜、高州、五华等地。 广西：分布在乐业、龙胜、永福、融水、金秀、荣县、武鸣、龙州、蒲北等地。 湖南：分布在通州、靖州，城步等地。 海南：分布于琼中、昌江、乐东、宝亭、吊罗山、尖峰岭等地。 1 2 4 桫椤的人工繁殖与引种栽培 桫椤依靠孢子进行繁殖，孢予呈钝三角形，黄褐色。同一株桫椤各叶片上生长 的孢子囊群发育不同步，即使同一叶片上的孢子囊群发育也不同步，最早出现时期 为5 月初前后，最晚期8 月。囊群盖近圆形、膜质，幼时完全包裹孢子囊群，成熟时 开裂并折向中脉。孢子囊群一般在2 3 月孕育，4 月孢子囊群发育，呈绿色；5 月为 浅褐色，孢子趋于成熟；6 月呈褐色，孢子开始成熟。桫椤的孢子体生长缓慢，生殖 周期长，孢子的萌发和配子的发育及配子的交配都需要温暖和湿润的环境，而人类 的过度开发利用使分布区生境日趋干燥，导致配子体生殖发育受到严重影响，植株 数量日渐减少，多数居群规模极小【7 6 , 7 7 。因此，对桫椤进行人工繁殖和引种栽培显 得日益紧迫。莫新寿等经过长期的桫椤人工栽培研究，提出了桫椤引种栽培的技术 措施 7 8 j 。毕世荣等用桫椤的嫩叶和孢子通过组织培养获得了桫椤小植株，首次使桫 椤的人工快速繁殖成为可能嗍。程治英等也运用组织培养技术，通过孢子繁殖、无 性无融合生殖和愈伤组织分化不定芽等方式得到桫椤孢子体幼苗，他们还发现成熟 的新鲜桫椤孢子有近1 年的休眠期，用g a 处理可以有效地打破孢子休眠。在实验室 内，通过控制培养条件可保存桫椤的丝状体、原叶体和孢子体。蒋胜军等利用海 1 4 中山大学硕士论文 南白桫椤进行孢子组织培养研究获得了配子体丛【8 l 】。桧艳等成功进行了大叶黑桫椤 孢子的无菌培养i 嘲。组织培养在桫椤资源的保护与开发利用方面显示了巨大的潜 力。此外，韩见宇等发现，桫椤的人工繁殖还可直接将孢子播种于腐质土加酸性田 土的基质上，经配子体世代产生孢子体植株，并用这种方法获得了孢子体幼苗1 8 5 0 余株【8 ”。鼎湖山保护区试用人工孢子有性繁殖，培育有2 0 0 株孢子萌发而的幼苗。 王俊浩等进行了桫椤的引种和孢子繁殖栽培，并模拟高湿、荫蔽的生境建立自然的 生态群落进行就地保护嗍。邬秉左采用盆栽的方法对桫椤进行了引种并对栽培过程 中的水分和湿度、光照、温度、施肥和防病等方面进行了观察研究嘲。曾莉莉等采 用易地保存的方法，成功地将桫椤植株从5 0 0 m 海拔( 赤水市) 引种到1 2 6 0 m ( 贵阳市六 冲关) ，并用引种成活植株产生的孢子进行繁殖，并获得了幼苗 8 6 1 。 1 2 5 桫