DNA克隆技术.ppt

DNA克隆技术许丽辉,目录,一、概述（一）基本概念1克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。2动物克隆3杂交,克隆羊：个体水平细胞克隆：细胞水平DNA克隆：分子水平,4重组：不同的DNA分子间发生共价连接形成重组DNA分子。,5DNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。,生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等,目的分离获得某一感兴趣的基因或DNA获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）,6基因工程(geneticengineering)实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。,人体生长激素释放激素(SS),抑制和调节多种激素的作用,（二）重组DNA技术的发展史,年G.J.Mendel的豌豆杂交试验1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉,1972年,P.Berg:构建第一个DNA重组分子,1997年,动物克隆:克隆羊多莉,1977年，基因工程产品的出现H.W.Boyer,第一个基因工程产品(SS),1973年,S.S.Cohen:第一个基因克隆实验,2001年，人类基因组计划,重组DNA医药产品,目录,（三）重组DNA技术技术路线,二、重组DNA技术中常用的工具酶,（一）限制性核酸内切酶,1核酸酶的分类2限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。,+,BamH,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。,3命名,Hind,Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶,共性（1）只作用于双链DNA（2）活性有赖于Mg2+（3）碱基识别特异性（4）切口形式6使用原则及注意事项,4分类、（基因工程技术中常用型）,类酶识别序列特点回文结构(palindrome),切口：平端切口、粘端切口,BamH,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,（二）大肠杆菌DNA聚合酶（三）T4噬菌体DNA聚合酶（四）TaqDNA聚合酶（五）反转录酶（六）连接酶（七）末端（脱氧核苷酸）转移酶（八）碱性磷酸酶,三目的基因及载体的分离,（一）目的基因的获取直接从染色体DNA中分离人工合成1.60元/碱基基因文库反转录PCRmRNAcDNAPCR直接索取,分,分,分,（二）基因载体,定义能携带目的基因进入宿主细胞并且在宿主细胞中进行扩增和表达的一类DNA分子。,1载体的种类质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA,（1）质粒(plasmid),特点能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。,噬菌体DNA改造系统gt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）,（2）噬菌体(phage),M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列,（3）病毒载体（4）粘性质粒,2载体的条件,有扩增所需的复制起始点，即能自主复制；有多克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；表达型载体必须具有指导基因表达的调控元件。,多克隆位点,ori,复制起始点,遗传标记,Amp,polylinker,基因载体,目录,抗Amp,宿主细菌,含Amp培养基,标志补救（-半乳糖苷酶法）,（LacZ基因N端序列）,插入片段,（LacZ基因失活）,LacZ基因C端序列,LacZ酶,克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。,酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）,其他载体,四限制性内切酶剪切目的基因与载体,切,酶切,BamH切割反应,T4DNA连接酶15C,同一限制酶切位点连接,目录,不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接,EcoR切割位点,Bgl切割位点,配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。,目录,磷酸二酯键的形成,DNA连接酶,DNA连接酶,DNA连接酶,五、目的基因与载体的连接,接,T4-DNA连接酶：T4-噬菌体连接温度：不高于粘性末端熔点温度（Tm）15：15/6h；12/8h；8/12h；,连接方式相同粘性末端的连接平头末端的连接不同粘性末端的连接人工粘性末端的连接,粘端连接,CCGGCCGG,GGCCGGCC,CGGC,CGGC,CGGC,CGGC,CCGG,GGCC,Hap,T4-DNA连接酶,平端连接,AGCT,TCGA,Alu,DNA连接酶,AGCTAGCT,TCGATCGA,目录,六、重组体的转化,受体细胞,转,转化方法,CaCl2诱导转化电穿孔PEG介导转化人工体外包装,特殊处理,受体细胞,细胞膜特性改变,CaCl2处理,受体细菌,50-100mmol/L,CaCl2,感受态细菌,重组体转入细菌,JM109感受态,含氨苄平板,Am,重组质粒,感受态,转化后的克隆群体：,七、重组体克隆的筛选与鉴定,筛,宿主细胞,（一）初筛：遗传检测法,1）抗药性标志的选择,pBR322,Amp,Tet,插入片段,Amp平板,Tet平板,2）标志补救（-半乳糖苷酶法）,互补的检测,目录,（LacZ基因N端序列）,插入片段,（LacZ基因失活）,LacZ基因C端序列,LacZ酶,（二）酶切鉴定,凝胶电泳检测,加样孔,DNAMarker,空质粒,重组质粒,重组质粒酶切,重组质粒的PCR扩增片段,（三）DNA序列检测,原位杂交,（四）菌落杂交筛选法,（五）免疫化学检测法,放射性抗体检测法,滤膜（固定抗体）,+,目的基因,基因载体,重组体,分,切,接,转,筛,表,总体技术路线,外源基因在宿主细胞中的表达,重组子,目的基因的mRNA,表达蛋白质,大肠杆菌（E.coli）受体细胞,表,1E.coli表达体系优势：一种成熟的基因克隆表达的受体细胞繁殖迅速，培养代谢易于控制易于进行遗传操作和高效表达,不足之处：1）缺乏适当的转录后和翻译后加工机制。2）缺乏表达蛋白质复性系统，表达蛋白无特异性空间结构。3）表达产物不稳定，易被细菌蛋白酶降解。,2目的基因在E.coli中的高效表达,三个因素：强化蛋白质的生物合成抑制蛋白质的降解恢复蛋白质的空间构象,3目的基因表达产物的检测,1）蛋白质的PAGE,对照样品Marker,2）表达蛋白生物学功能检测,淀粉酶基因表达,3目的蛋白的分离纯化,分子筛亲和柱离子交换抗原抗体,目的蛋白,DNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。,重组DN