（生物化学与分子生物学专业论文）厨余物厌氧发酵产氢的研究.pdf

摘要 摘要 随着人们生活水平的提高，厨余物的产生量与日俱增，若处置不当，不仅污染环境， 更会对人们的身体健康造成重大威胁。如何对其进行及时有效地处理已经越来越受到人 们的重视。 氢气是一种完全清洁且可再生的能源，燃烧后不产生任何温室气体，是化石燃料的 完美替代品。随着世界能源危机的日益加剧，人们对制氢方法的研究也愈加重视。厌氧 发酵法制氢是目前其中最行之有效的方法之一。利用厨余物进行生物制氢，实质是产氢 产酸发酵细菌将有机物质分解为有机酸( 乙酸、丙酸、丁酸等) 和乙醇等产物，同时释放 出发酵气体h 2 和c 0 2 的过程。 本实验以厌氧颗粒污泥为菌种，考虑到颗粒污泥混合菌群内的产甲烷菌会利用酸化 阶段产生的h 2 以及旷合成c h 4 ，因此研究了厌氧颗粒污泥不同方式的预处理方法( 热 处理、微波处理和甲烷抑制剂处理) ，以达到抑制或消除其中产甲烷茵活性，提高产氢 活性的目的，实验还对不同预处理方法对脱氢酶活性的影响做了研究。随后，实验对影 响厌氧颗粒污泥产氢活性的主要条件( 反应温度、初始p h 、碳氮比、金属离子等) ，以 及它们对脱氢酶活性的影响进行了研究，对产氢体系进行了优化。最后，实验对产氢体 系中混合菌群进行分离纯化，回复投加入体系进行反应后发现了两株对产氢过程有显著 影响的微生物，并对其进行了分子生物学鉴定。 实验结果表明：1 不同的预处理方法均对厌氧颗粒污泥的产甲烷活性有明显抑制， 其中热处理( 1 2 1 处理1 5 - - 2 5 m i n 或8 0 一1 0 0 处理3 0 m i n ) 时，厌氧颗粒污泥的产 氢效率最高，氢气含量可达5 4 ，其中1 2 1 时处理2 5 m i n 时，反应体系脱氢酶活性最 高，表明：该预处理条件对厌氧颗粒污泥中的芽孢的激活作用最为显著，反应体系中微 生物的恢复速度最快。2 厌氧颗粒污泥利用厨余物厌氧发酵产氢的最佳反应温度是 3 2 _ 4 ：1 ，产氢效率达到1 1 6 7m l g t s ；最适初始p h 值范围在6 5 7 0 ，氢气含量达到 4 5 左右；最适碳氮比为2 0 ：1 ，产氢效率为1 2 0 2 7m l g t s 。体系中脱氢酶活性的变化趋 势与体系产氢效率的变化趋势并不完全一致，说明体系产氢最适条件与微生物的最适生 长条件并不完全吻合。三种金属离子的最适含量分别为：n i 2 + 为2 6 7 6i x g g t s 时，产氢 效率达到1 18 7 0r r d g t sf e 2 + 为4 9 4 9 6 0p g g t s 时，产氢效率达到7 4 4 0m l g t s ；外源 添加m 矿+ 对促进产氢效果不明显；三种金属离子对厌氧颗粒污泥产氢活性促进作用的 顺序是：n i 2 + f e 2 + m 矿+ 。对脱氢酶活性的促进作用先后顺序为：m f + f e 2 + n i ”。 3 反应体系中分离纯化得到的两株细菌经1 6 s r d n a 鉴定分别为b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s 和e s c h e r i c h i ac o l i ，前者在体系中在厌氧发家产氢过程中具有促进厌氧环境的形成，强 化反应过程中底物的水解的作用；后者对反应体系除同样具有促进厌氧环境的形成的作 用，还能提高体系内产氢菌密度，从而更高效地利用底物产氢。 关键词：氢气、厌氧发酵、厨余物 a b s t r a c t a b s t r a c t t h eh u g ei n c r e a s i n go ft h ea m o u n to ft h ek i t c h e nw a s t e ，w h i c hc o m eu pw i t ht h e i m p r o v e m e n to fl i v i n gs t a n d a r d ，h a sb e e na f f e c t i n gt h ee n v i r o n m e n tm o r ea n dm o r es e r i o u s l y , w h i c hw i l lt h r e a tp e o p l e sh e a l t h a sar e s u l t ，m o r ea n dm o r ea t t e n t i o n sa r ep a i do nh o wt o d e a lw i t ht h ek i t c h e nw a s t er a p i d l ya n de f f e c t i v e l y t h eh y d r o g e n ，o n eo ft h ec l e a n e s te n e r g ys o u r c e s ，w h i c hm a k e sn o t h i n ga f t e rb u r n i n gc a n r e p l a c et h ef o s s i lf u e lp e r f e c t l y a n dh y d r o g e np r o d u c t i o nt h r o u g ha n a e r o b i cf e r m e n t a t i o ni s t h em o s tf e a s i b l ew a y h y d r o g e np r o d u c t i o nu s i n gk i t c h e nw a s t e sw e r ed e c o m p o s e db y h y d r o g e n - p r o d u c i n gb a c t e r i ai n t oo r g a n i ca c i d s ( a c e t i ca c i d ，b u t y r i ca c i d ，e t c ) ，e t h a n o l ，c 0 2 a n d h e b e c a u s eo ft h eu s i n go ft h eh 2a n d 旷b y m e t h a n o g e n s ，w h i c ha r em a d ei nt h ea c i d i f i c a t i o n p h a s e ，s o m ep r e t r e a t m e n t ss h o u l db ed o n eo ng r a n u l a rs l u d g et oi n h a b i tt h ea c t i v i t yo fc n 4 p r o d u c t i n g ，a n dg e te n o u g hh y d r o g e n i n i t i a lp h ，f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e ，c a r b o nn i t r o g e n r a t i oa sw e l la st h em e t a li o n so nh y d r o g e nc o n t e n t ，t h ea c c u m u l a t i o ng a sp r o d u c t i o na n dt h e d e h y d r o g e n a s ea c t i v i t i e sw e r ea l s oi n v e s t i g a t e di nt h ee x p e r i m e n t t h el a s ts t e po ft h es t u d y w a sp u r i f y i n gt h eb a c t e r i ai nt h eh y d r o g e np r o d u c t i o ns y s t e r m a n dt w os t r a i n so fb a c t e r i a , w h i c hw e r ei d e n t i f i e db y16 sr d n a ，w e r ef o u n dt h a tt h e yh a v ed i f f e r e n te f f e c t so nh y d r o g e n p r o d u c t i o n t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t ：1 d i f f e r e n tp r e t r e a t m e n tm e t h o d sh a v et h es a m ee f f e c t so n i n h a b i t o no fc h 4p r o d u c i n ga c t i v i t y c o m p a r i n gw i t ho t h e rt r e a t m e n t s ，t h eh e a tt r e a t m e n t ( 1 2 0 1 5 - - 一2 5 m i no r8 0 一1 0 0 3 0 m i n ) m a d et h eg r a n u l a rs l u d g et h em o s ta c t i v eo n h y d r o g e np r o d u c t i o n ，t h a tt h ec o n t e n to f t h eh y d r o g e nw a s5 4 f u r t h e r m o r e ，t h ec o n d i t i o no f 12 0 。c2 5 m i nh e a t i n gt r e a t m e n tc a u s e dt h eh i g h e s td e h y d r o g e n a s ea c t i v i t y , w h i c hi n d i c a t e d t h a tt h es p o r ei ns l u d g ew a sa c t i v a t e ds i g n i f i c a n t l y 2 t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so fa c t i v i t yo f h y d r o g e np r o d u c t i n gw e r et = 3 2 _ q = l ，i n i t i a lp h = 6 5 7 0 ，c n = 2 0 ：1 ，c n i z + = 2 6 7 6u g g t s ， c f e 2 + = 4 9 4 9 6 0u g g t s m e t a li o n sa f f e c t i n gm e t h a n ep r o d u c t i o ni si nt h ef o l l o w i n go r d e r ： n i 2 + f e 2 + m 9 2 + a n dt h ec o m p a r i s o no fd e h y d r o g e n a s ea c t i v i t i e ss h o wt h a ti t w a sn o t c o m p l e t e l ym a t c h a b l eo nt h eo p t i m u m c o n d i t i o n sb e t w e e nt h e a c t i v i t y o fh y d r o g e n p r o d u c t i n ga n dt h ed e h y d r o g e n a s ea c t i v i t y 3 t w oo ft h e b a c t e r i at h r o u g hi s o l a t i n ga n d p u r i f y i n gf r o mt h er e a c t i o ns y s t e m ，i d e n t i f i e db y16 s r d n a ，w e r eb a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sa n d e s c h e r i c h i ac o l i t h ef i r s to n ep r o m o t e dt h ef o r m a t i o no fa n a e r o b i ce n v i r o n m e n t , a n d s t r e n g t h e nt h ee f f e c to ft h eh y d r o l y s i so fs u b s t r a t e ；t h es e c o n do n e ，w h i c ha l s op r o m o t e dt h e f o r m a t i o no fa n a e r o b i ce n v i r o n m e n t ，i n c r e a s e dt h ed e n s i t yo fh y d r o g e n - p r o d u c i n gb a c t e r i ao f t h es y s t e m 。w h i c hm a d et h eh y d r o g e np r o d u c t i o nm o r ee f f i c i e n t k e y w o r d s ：h y d r o g e n , a n a e r o b i cf e r m e n t a t i o n ，k i c h e nw a s t e s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签应牟虹日 矶警蛳 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签 名：型 上j 盏一导师签名： 日 期： 第一章前言 第一章前言 1 1 研究背景及现状 随着人们生活水平的提高，生活垃圾产生量与日俱增，随之带来的对环境的污染也 日益加剧。厨余物是生活垃圾的重要组成部分，对其进行及时有效地处理能有效地缓解 环境压力，改善人们的生活品质。厨余物具有有机物含量高，营养物质丰富全面的特点。 如果能够得到有效利用，不仅能够解决污染问题，更能变废为宝，实现废弃物资源化。 厨余物具有含水率高，脱水性能差，在高温环境下容易腐烂，从而滋生蚊蝇、病菌。 因此，直接将厨余物作为养殖用饲料极易使病菌进入食物链，最终对危害人类身体健康。 如何合理有效的处置厨余物日益引起重视。 目前，对厨余物的处置方法主要包括：高温消毒制取肥料、好氧堆肥、厌氧发酵、随 生活垃圾混合进入填埋和焚烧体系等方法。其中，填埋是最主要处理处置方式。各种方 法都存在着这样那样的问题。将厨余物进行填埋不仅会占用大量土地资源，还会导致填埋 场以及周边环境的破坏。考虑到厨余物含水率高的特点，进行焚烧处置时不可取的。而将 厨余物高温消毒制取肥料虽然具有处理过程短、处理效果较彻底的优点，但是处置过程 中能源消耗高。 厨余物中富含大量的淀粉和纤维素等有机物质，生物可降解性强，因此生物方法已 经逐渐成为处理厨余物的主要发展方向。 随着社会经济的发展，人们对能源的需求日益增加。当今世界，化石燃料占全球所 消耗能源的8 0 以上。化石能源加速枯竭，人们正面临着前所未有的能源危机。同时， 因化石燃料燃烧而造成的严重的环境污染和温室效应直接危及人类生存。与之相比，氢 是一种非常理想的能源，它以水的形式大量存在于地球上，储量巨大。氢气的燃烧只生 成水，不会产生环境污染，而且氢气的热值和热转化率很高，具有清洁、高效和可再生 的特点。因此，氢能是化石燃料的最佳替代品之一。传统的理化法制备氢气能耗过大， 成本高，对环境也有一定的污染，这些都限制了氢能的应用与推广：而生物制氢对环境 没有任何污染，利用的是可再生资源，可以循环往复。此外，生物制氢工艺还可以利用 诸如高浓度有机废水和含碳水化合物物质等一系列可再生资源来生产氢气，具有广泛的 应用前景。 氢气由于其清洁、高效、可再生性被誉为“未来燃料 。随着人们对由以石化燃料 为基础的能源生产所带来的环境问题的逐步深入的了解，越来越认识到由石化燃料造成 的大气污染不只会造成区域性的危害，由于大量排放温室气体造成的全球气候变暖更会 对人类生存造成直接影响。 生物制氢是指：利用生物将自然界中储存于有机化合物，如碳水化合物、蛋白质、 脂肪等中的能量转化为氢气的过程。生物制氢是利用某些微生物代谢过程来生产氢气的 一项生物工程技术。 江南大学硕士学位论文 1 2 生物制氢概况 1 2 1 产氢生物介绍 迄今为止，已研究报道的产氢生物类群包括了光合生物( 厌氧光合细菌、蓝细菌和 绿藻1 、研究较多的有蓝绿藻属、绿藻属、深红红螺菌、球形红假单胞菌、深红红假单 藻菌、液泡外硫红螺菌、紫色无硫菌、类球红细菌等；非光合生物( 严格厌氧细菌、兼 性厌氧细菌和好氧细菌) 和古细菌，如大肠埃希氏杆菌、产气肠杆菌、褐球固氮菌、丁 酸梭菌、产气荚膜梭菌、丙酮丁醇梭菌等。各类微生物产氢状况见下表1 1 【1 ，2 1 。 表1 - 1 产氢生物种类及其产氢效率 t a b1 一lo g a n i s ns p e c i e sa n de f f i c i e n c yo fh y d o g e np r o d u c t i o n 1 2 2 生物制氢的种类 根据所采用的产氢微生物、利用的反应底物以及反应机制的不同，生物制氢可以分 为光解水产氢、光合细菌制氢和厌氧发酵产氢等3 种类型。 ( 1 ) 光解水产氢 这种产氢类型以蓝细菌和绿藻为代表。它们在厌氧条件下，通过光合作用将水分解 成氢气和氧气，因此这一产氢类型也被称作光分解水产氢途径。其作用机理和绿色植物 光合作用机理相似。在同一个光合系统中，存在着两个相对独立又相互协作的光合作用 中心：光合系统i ( p si ) 和光合系统i i ( p si i ) 。其中p si i 吸收阳光，并利用太阳能将水 分解成氢离子、电子和氧气，而p si 则生成还原力用以固定c 0 2 。由p s 产生的电子 由以铁氧化还原蛋白为载体经两个光合中心传递给氢酶，氢离子在适当条件下经氢酶催 化生成h 2 i 川。 ( 2 ) 光合细菌产氢 光合细菌产氢同样也是以太阳能作为能源，不同的是光合细菌只有一个光合作用中 心( 相当于p si ) ，以为缺少p si i ，光合细菌无法通过分解水分子获得电子，只能以有 机物作为电子供体进行光合作用。这一光合细菌特有的只具有一个光合作用中心的结构 使得其光能转化效率很高，因而具备了十分可观的光转化效率提高潜力。 2 第章前言 ( 3 ) 厌氧发酵产氢 厌氧发酵产氢以化能异养微生物为主，厌氧菌由于缺少正常的氧化磷酸化途径，在 生长过程中电子不断积累得不到有效释放。因此，需要特殊的调控机制来调节新陈代谢 中的电子流动，通过产生氢气消耗多余的电子就是调节机制中的一种【4 】。目前对于许多 厌氧产氢细菌的生理学、还原剂产生途径、新陈代谢过程电子传递的分子生物学和生物 化学等已经基本探明【4 】，但是对于厌氧细菌的产氢量还没有详细的研究。 1 3 厌氧发酵产氢的机理及发酵类型 厌氧发酵产氢即厌氧微生物在酸性介质中代谢有机物产生氢气的过程。目前，人们 普遍将厌氧消化过程主要分为三个阶段【5 】，水解阶段、产氢产酸阶段和产甲烷阶段。在 这一过程中，各类微生物菌群及作用见表1 2 t 6 。在整个厌氧消化过程中，由于三大类菌 群的相互协同作用，最终使得复杂的有机物降解为c h 4 和h 2 。 氢气产生大都是在产甲烷阶段受到抑制的情况下的进行的，此时气体中氢含量可达 6 0 以上【。7 1 。产氢最终来源于厌氧消化的第二阶段。 表1 2 厌氧活性污泥中微生物群及作用 ! 璺! ! ：兰巴i ! 翌2 婆竺i ! 巴! 垫竺苎1 2 1 生苎垒坐! 垒! ! 坚垒罂垫垒虫! 生2 ! | 2 翌 菌群菌型作用 厌氧发酵是各种菌群协同代谢的过程。微生物不同，其产能方式也不同。在无氧条 件下，发酵细菌的产能代谢过程仅依赖于底物水平磷酸化，在有机物氧化过程中，辅酶 n a d + 或n a d p + 接受氢质子( 同时接受电子) 后，形成的n a d p 或n a d p h 不能通过 电子传递系统得以氧化。然而，在微生物体内，n a d + 或n a d p + 的量是有限的，所以若 使代谢过程不断进行下去，n a d p 或n a d p h 必须得以再生。发酵细菌可以借助于包括 丙酮酸或由丙酮酸而产生的其他有机化合物的氧化还原机制得到再生。由于细菌种类及 不同生化反应体系的生态位存在着相当幅度的变化，导致形成多种特征性的末端产物， 江南大学硕士学位论文 从微观角度上分析，末端产物组成是受能过程，n a d h n a d + 的氧化还原偶联过程及发 酵产物的酸性末端数支配，由此形成了在经典生物化学中不同的发酵类型。根据末端发 酵产物组成，常将发酵类型分为三类：丁酸型、丙酸型、乙醇型，如图1 - i 所示【8 l 。丁 酸型、丙酸型在发酵过程不同程度地存在着丙酸产率过高，而对发酵细菌有毒害作用， 乙醇型发酵以乙酸、乙醇为主，发酵气中含有大量的 r ，无论产氢和产甲烷都有优势。 图1 - i 厌氧发酵产氢途径 f 通1 1p a n h w a y f o r h p v i a 蚴e m b 沁1 1 n e m 日土i o n 1 3 1 丁酸型发酵f b n t y r i ea c i d - t y p ef e r m e n t a t i o n ) 产氢 丁酸型发酵主要是在梭状芽孢杆菌属( c l o s t r k h u m ) 的作用下进行的。如丁酸梭状 芽孢杆菌( cb u t y r i c u m ) 和酪丁酸梭状芽孢杆菌( ct y r o b u t y r i c u m ) ，如表1 - 3 。它们 在厌氧条件下将有机物分解，经过三羧酸循环形成丙酮酸，丙酮酸在丙酮酸铁氧还蛋白 氧化还原酶催化作用下脱羧，羟乙基结合到酶的t p p ( 焦磷酸硫胺素) 上，生成乙酰辅酶 a ，脱下的氢使铁氧还蛋白还原，而还原型铁氧还蛋白在氢化酶的作用下被还原的同时 释放出h 2 。 表i - 3 发酵1 0 0 m 叫萄苟糖产生的产物组成 ! 些1 2 些匹型竺g 竺垡里磐型! g 磐堕! 螋巴型型! 竺 菌种 丁i 骏m o l 乙酸m o lc o , t o o | h _ m o lc 回收率m o r 平衡 梭状芽孢杆菌属发酵葡萄糖为丁酸和乙酸是以中间产物乙酰c o a 作为分叉点( 如图 i - 2 ) 。从氧化还原反应平衡来看，以乙酸作为唯一终产物是不理想的，因为产乙酸过 程将产生大量的n a d p + h * ，生化反应式如下： 第一章前言 c 6 h 1 2 0 6 + 4 h 2 0 + 2 n a d + + 4 a d p + 4 p i + 2 c h 3 c o o 。+ 6 i - i + + 2 h 2 + 2 h c 0 3 。+ 2 n a d h + 4 a t p ( 1 ) 由于乙酸生成途径无还原力，所以当乙酸产率较高时，可导致n a d h + 旷过量；同 时，由于乙酸所形成的酸型末端过多，所以常因p h 很低而产生负反馈作用。虽然葡萄 糖的产丁酸途径中并不能氧化产乙酸过程中过剩的n a d h + w ，但是产丁酸过程可减少 n a d h + h + 的产生量，同时可减少发酵产物中的酸型末端，所以对加快葡萄糖的代谢进 程有促进作用，因此出现产乙酸过程与丁酸循环机制的偶联。 c 6 h 1 2 0 6 + 2 h 2 0 + 3 a d p + 3 p i - - * c h 3 c h 2 c h e c o o 。+ 3 h + + 2 h c o 扣+ 3 a t p ( 2 ) 从丁酸型发酵的末端产物平衡分析，丁酸与乙酸物质的量之比约为2 ：1 ，其反应式如 下： 5 c 6 h 1 2 0 6 + 1 2 h 2 0 + 2 n a d + + 1 6 a d p + 1 6 p i 4 c h 3 c h 2 c h 2 c o o + 8 h + + 2 c h 3 c 0 0 + 2 n a d h + 10 h 2 + 1 0 h c o + 16 a t p ”( 3 ) f d ：镞飘还蛋白t p p ：酸脏索然磷睃虚线表示产丁麓过理m 断后途径 图1 2 梭状芽孢杆菌丁酸型发酵途径 f i g 1 - 2b u t y r i ca c i d - t y p ef e r m e n t a t i o nb yc l o s t r i d i u mb u t y r i c u m 1 3 2 丙酸型发酵( p r o p i o n i ca c i d t y p ef e r m e n t a t i o n ) 产氢 丙酸型发酵细菌主要有丙酸杆菌属( p r o p i o n i b a c t e r i u m ) 、韦氏球菌属。丙酸的产 江南大学硕士学位论文 生不经乙酰c o a 旁路，而是以e m p 途径产生的丙酮酸作为起点，其中包括部分t c a 循 环机制( 如图1 3 【9 】) ，采用离子色谱测定证实了这一途径的存在，当丙酸为2 7m m o l l 时，中间产物苹果酸为0 2 8m m o l l ，琥珀酸为0 2 1m m o l l 。此外，由于丙酸杆菌属无 氢化酶，因而无h 2 产生。在丙酸型发酵中，产乙酸过程中所释放的过量n a d h + 一通过 与产丙酸途径偶联得以再生，偶联的反应式如下： c 6 i - 1 1 2 0 6 + h 2 0 + 3 a d p - c h 3 c o o 。+ c h 3 c h 2 c o o 。+ h c o j 。+ 3 h + + h 2 + 3 a t p ( 4 ) a g o = 2 8 6 6k j m o l 葡萄糖( p h = 7 ，t = 2 9 8 1 5 目 据d i n o p o u l o u t l o 等人对肉膏废水和b r e u r e 等人对明胶废水的研究结果表明，有机负 荷和p h 均对丙酸和乙酸摩尔比率( m p r m a c ) 有影响。降低有机负荷或提高p h ，均可 减d x m p r m a c 值。对于肉膏废水，当p h = 5 0 时，m p r m a c 约为1 3 6 ，而p h = 7 0 时， m p r m a c 为0 7 3 。 , c l - l g ) i q n 蕾萄糖 洋o图一 i 乙陵l h + 图1 3 丙酸杆菌属的丙酸型发酵途径 f i g 1 - 3p r o p i o n i ca c i d - t y p ef e r m e n t a t i o nb yp r o p i o n i b a c t e r i u m 1 3 3 乙醇型发酵( e t h a n o l - t y p ef e r m e n t a t i o n ) 产氢 乙醇型发酵制氢是最近几年发现的一种新型制氢方法。这种方法不同于经典的微生 物代谢过程中乙醇发酵。它是由任南琪教授在利用有机废水发酵产酸的过程中发现的全 新产氢途径。其末端产物主要有乙醇、乙酸、c 0 2 ，、h 2 和少量丁酸。乙醇型发酵途径主 6 第一章前言 要是葡萄糖经e m p 途径生成丙酮酸，丙酮酸经脱羧作用，形成乙醛，继而在醇脱氢酶 作用下形成乙醇。在这个过程中还原型铁氧还蛋白在氢化酶的作用下被还原的同时释放 出h 2 ，如图1 - 4 9 1 所示。由于具有发酵过程稳定及产氢效率较高的优势，乙醇型发酵仍 被认为是一种高效的厌氧发酵及产氢途径。过程中存在乙酸和乙醇在体系内和细胞内的 相互转换，乙醇型发酵理论也被称为“双碳发酵产氢学说或理论”【1 1 1 。目前，纯菌种分离 鉴定和代谢分析为这种理论找到了物质基础。 a 阿i o h 2 a t p2 p 0 4 04 肼 c h 业2 色 * i 二。 6 h ，0 02n 刖。i y2 。n a i 粥h a - t 黼t ” 丙_ t 卜圃 a 山 7 弋2k ：n 渺州4 - 带乙罨t 一i 图1 _ 4 细菌乙醇型产氢发酵途径 f i g 1 - 4e t h a n o l t y p ef e r m e n t a t i o n 1 3 4 厌氧发酵产氢的主要影响条件 ( 1 ) 温度 温度是影响微生物生长、繁殖和代谢等生命活动的重要的因素之一。微生物的一切 生命活动都是由一系列的生物化学反应来完成的，而所有生物化学反应都需要生物催化 剂“酶”的催化作用才能顺利进行，酶促反应对温度的敏感性决定了微生物的生长必 须在一定的温度范围内才能正常进行。除此之外，温度还对细胞质膜的流动性能有着重 要影响，较高的温度使得细胞质膜流动性大，有利于物质的运输；而温度较低则会降低 其流动性，从而不利于物质的运输。总之，温度变化影响营养物质的吸收和代谢产物的 分泌。 根据微生物主长的最适宜温度的不同，可将微生物分为嗜冷、兼性嗜冷、嗜温、嗜 热和超嗜热等5 种不同类型，表1 4 分别列出不同类型微生物各自的最低、最适宜和最高 生长温度范围。 7 江南大学硕士学位论文 表1 _ 4 不同微生物的生长温度范围 t a b1 - 4d i f f e r e n tt e m p e r a t u r er a n g e so fm i c r o b i a lg r o w t h 根据文献的报道：厌氧发酵产氢温度绝大部分在室温范围，最佳的产氢的温度范围 通常在3 0 4 0 c 之间，大量研究【1 3 j 表明：厌氧发酵产氢的最适温度在3 5 3 7 之间。也有 文献报道了高温厌氧发酵产氢的内容，如y u 等【1 4 】研究发现：利用混合发酵细菌产氢的 最佳温度是5 5 。 ( 2 ) p h p h 值是影响微生物生长、繁殖和代谢等生命活动的另一个重要因素。同温度对微生 物生命活动影响的原因相似，不同的酶促反应都有一个最适p h 范围。反应体系中p h 值 的变化将直接影响酶的活性中心的存在形式以及底物分子和酶分子的带电状态，进而影 响酶与底物的结合。过高或过低的p h 值直接影响酶的稳定性，使得酶得结构变化，失去 活性。 除此之外，p h 对细胞质膜结构的稳定、膜的渗透性以及对营养物质的吸收都有着重 要影响，进而影响微生物的生长代谢。不同的微生物生长和繁殖都要求有一个合适的p h 值范围，p h 过低或过高都会对微生物的生长及其繁殖代谢有着抑制作用。 文献报道【”】严格厌氧的丁酸梭菌产氢的最佳p h 值范围是6 0 6 5 左右，而产气肠杆 菌的p h 范围为4 5 6 5 之间，最佳的产氢p h 范围为5 5 6 0 之间。混合细菌产氢的p h 值研 究较为广泛，但是分歧较大。绝大部分研究表吲1 6 j ，厌氧发酵细菌最佳生长的p h 值范 围在5 0 6 0 之间，最佳产氢p h 范围在5 5 左右。少数不同的研究结果如任南琪等人报道 的乙醇型发酵最佳产氢p h 范围为4 2 4 5 之间；而l m 等报道【1 3 】的丁酸型发酵的最佳产氢 p h 范围在6 7 左右。 ( 3 ) 底物种类和浓度 底物种类和浓度是微生物厌氧发酵产氢的另一个重要影响因素。不同的微生物可的 利用的底物千差万别，在可利用的多种底物中也会对特定某些种类有优先选择性。碳水 化合物是厌氧发酵微生物最好的产氢底物，蛋白质和脂肪相对较难利用，在厌氧发酵过 程中产氢较少。碳水化合物中，葡萄糖和蔗糖是最好的产氢底物。糖蜜、果糖、乳糖、 木糖、阿拉伯糖、纤维糖和淀粉等也是产氢细菌很好的底物。相关文献报道：用于厌氧 发酵的产氢的底物绝大多数是上述的这些糖类物质，此外，含有大量碳水化合物的有机 废水如制糖废水、酒厂废水也是发酵产氢的很好的底物【1 4 l ；也有少数以有机废弃物如豆 腐渣、生活垃圾作为厌氧发酵产氢的底物【5 1 。丌。也有少量研究人员以结晶纤维素作为产 8 第一章前言 氢的底物l l 引。 从目前的研究结果来看，由于反应器内部的产氢微生物的浓度难以维持高的细菌浓 度，故进水的底物浓度一般都在5 2 0g l ，反应器的有机负荷一般都维持5 4 0gc o d l d 。 ( 4 ) 水力停留时间 水力停留时间( h r t ) 是影响连续发酵产氢的重要的因素之一，在厌氧发酵反应器 内部通常存在产甲烷细菌、硫化细菌等氢气利用菌，为了提高反应器的产氢能力，必须 抑制甲烷细菌的活性。在通常的庆氧产氢反应器内，发酵细菌的生长速度比甲烷菌快， 对p h 的适应范围也比较广。因此，通过改变p h 值和水力停留时间等工艺条件可以实现 发酵细菌和产甲烷细菌动态分离，从而提高整个反应器的产氢能力。 从目前的研究结果来看，厌氧产氢反应器的水力停留时间通常维持在2 2 4h ，并且 水力停留时间与反应器的结构有密切关系。用连续流搅拌反应器( c s t r ) t 1 9 】和上流式厌氧 反应器【l4 1 ，反应器的最佳产氢的h r t 通常在2 1 2h ，最佳停留时间是6 小时左右；对于序 批式反应器【1 2 1 ，最佳产氢的停留时间通常在4 1 2h a 间。对填充式反应器【2 0 1 ，最佳产氢 的停留时间通常在2 6h 。 ( 5 ) 其它影响因素 除了以上讨论的主要因索外，影响细菌厌氧发酵产氢的因素还有氧气、溶液的氧化 还原电位【2 、重金属离子如铜【捌、有机毒物质和氨氮的浓度等幽2 4 1 ，这些因素对发酵细 菌都有一定的抑制作用，其抑制作用的程度与该物质的浓度有密切的关系，同时与溶液 p h 值等因素也有一定的关系。特别是利用复杂的有机废水或有机废弃物为底物进行产氢 研究时，由于体系的成分比较复杂，这些因素对发酵细菌产氢共同的抑制作用比较复杂。 1 4 本论文的研究意义、研究目标和研究内容 1 4 1 研究意义 随着人民生活水平的提高，厨余物的产生量逐年增大，我国每天厨余物的产生量超 过2 0 0 0 0 t 。厨余物含水率高，脱水性能较差，高温易腐，易孳生蚊蝇、病菌。如果直接 作为饲料使用，易导致病菌进入食物链，对人体健康造成危害。因此，有关厨余物的合 理利用和处理方式的研究已日益引起重视。 目前，主要的处理处置方法包括高温消毒制取肥料、好氧堆肥、厌氧发酵、随生活 垃圾混合进入填埋和焚烧体系等，其中以填埋为主要处理处置方式。厨余物填埋不仅占 用了大量填埋场的库容，而且容易导致填埋场环境的破坏；由于厨余物本身含水率非常 高，所以不适合进入焚烧体系。高温消毒制取肥料技术的主要优点在于处理过程短、处 理效果较彻底，主要缺点是能源消耗高。厨余物以有机组分为主，含有大量的淀粉和纤维 素等，具有较高的生物可降解性，生物转化利用已逐步成为主要处理方式的发展方向。厨 余物好氧堆肥的主要优点在于处理时间比厌氧处理短，缺点是产品出路问题突出，且堆 肥过程中会产生恶臭以及温室气体的排放【i3 1 。厌氧发酵技术是目前国内外针对大规模厨 9 江南大学硕士学位论文 余物处理利用的主要发展方向。发酵制氢过程具有微生物比产氢速率高、不受光照时间 限制、可利用的有机物范围广和工艺简单等优点，具有发展潜力，是理想的制氢方法。 1 4 2 研究目标 ( 1 ) 确定厌氧颗粒污泥利用厨余物产氢气的可行性及对厌氧颗粒污泥产氢预处理的最 佳方式； ( 2 ) 确定厌氧颗粒污泥利用厨余物产氢发酵最佳条件： ( 3 ) 分离纯化厌氧发酵反应体系中的微生物，并分析它们对厌氧发酵产氢过程的作用。 1 4 3 研究内容 本研究为江苏省自然科学基金( b l q 0 0 6 0 2 3 ) 资助项目。 本文主要研究内容如下： ( 1 ) 寻找最佳的预处理方式使厌氧颗粒污泥利用厨余物发酵产氢成为可能，考察热处 理、微波处理以及甲烷抑制剂( b e s ) 等预处理方式对产氢的影响； ( 2 ) 研究厌氧颗粒污泥利用厨余物产氢的最佳发酵条件，对反应温度、初始p h 值、碳 氮比、单个金属离子进行梯度分析比较并对金属离子对产氢活性影响的主次顺序进行比 较，以获得厌氧颗粒污泥最高的产氢效率； ( 3 ) 分离纯化厌氧发酵反应体系中的微生物，并分析它们对厌氧发酵产氢过程的作用。 对在产氢过程中作用明显的菌株做1 6 s r d n a 鉴定。 1 0 第二章材料与方法 第二章材料与方法 2 1 预处理方法对颗粒污泥利用厨余物产氢及脱氢酶活性影响的对比研究 2 1 1 实验装置 整个实验过程采用了实验室自行设计的实验装置，如图2 1 所示，装置分为厌氧反 应装置和气体收集两个部分，反应物在厌氧反应装置中反应产生氢气，再由管道进入量 筒进行计量。其中厌氧反应装置置于恒温水浴锅中控制反应。 w a t e rb a t h 图2 - 1 试验装置图 f i g 2 - 1s c h e m a t i ca p p a r a t u so fh y d r o g e nb i o p r o d u c t i o n 2 1 2 实验材料 整个反应体系中，反应底物采用取自学校食堂的厨余物，总固体含量( t s ) 为4 0 8 6 ， 挥发性固体含量( v s ) 为9 9 7 8 ，接种厌氧颗粒污泥取自无锡市某柠檬酸厂正在运行的 内循环式厌氧反应器( i c ) 中的厌氧颗粒污泥。污泥的t s 为2 0 7 4 ，v s 为9 6 9 3 。 实验中按t s 污泥：t s 米饭= 5 ：1 的比例接种。反应体系中以n a h c 0 3 饱和溶液为p h 缓冲 溶液。 2 1 3 主要测定项目及方法 ( 1 ) t s 和v s 的测定 t s 和v s 的测定见参考文献【1 4 】 ( 2 ) 氢气的计量 采用排水集气法 ( 3 ) 氢气含量的测定 氢气含量测定采用气相色谱仪( g c 9 1 0 ，上海科创色谱仪器有限公司) ，色谱柱为不 锈钢填充柱，填料为5 a 分子筛，柱规格：l m d 6 m m ，柱温9 0 ；汽化温度1 0 0 * c ；检 测器温度1 0 0 。c ，载气为氩气，进样量1 0 0 i _ t l 。 江南大学硕士学位论文 图2 - 2 气相色谱氢气图谱 f i g 2 - 2h y d r o g e np r o f i l ei ng a sc h r o m a t o g r a p h y ( 4 ) 有机酸的测定 有机酸测定采用液相色谱法，柱子为z o r b a xs b a q ( 1 5 0 4 6m m ，5 1 x m ) ；流动相： 0 5 乙腈、9 9 5 o 0 2mk h 2 p 0 4 、调p h 至2 0 ( 用磷酸调节) ；流动相流速：0 5 m l m i n ； 进样量：1 0 此；柱温：3 0 ；检测器：紫外检测器( 2 1 0 n m ) ( 5 ) 脱氢酶活的测定 脱氢酶是一类氧化还原酶，能使被氧化有机物的氢离子活化并传递给特定的氢受体。 无论在废水好氧处理还是在污泥厌氧消化中，基质脱氢都是生化反应的关键。脱氢酶的 酶活是厌氧体系微生物代谢的重要指标，脱氢酶活性水平直接关系到有机物降解速度， 反映处理体系内活性微生物的量以及生物处理设施的运行效果。在生物质发酵过程中基 质脱氢是生化反应的第一步，脱氢酶活性水平直接关系到后继氢化酶的产氢过程。因此， 研究脱氢酶活性和发酵产氢之间的关系是有着极其重要的意义i l 5 。 氯化三苯基四氮唑( t t c ) 脱氢酶活性测定法l i6 ，1 7 】。氯化三苯基四氮唑( t t c ) 法是 目前运用较为广泛的测定脱氢酶活性的方法之- 。该法主要选用无色的t t c 做为人为 受氢体，受氢后生成深浅不同的红色三苯基甲膳( t f ) 。 标准曲线绘制：在8 支2 5m l 具塞比色管中，依次加入2m l 嘶卜一h c l 缓冲液、lm l 蒸馏水和1m l t t c ( 氯化三苯基四氮唑) 系列溶液，对照管不加t t c ，再各加入1 0 的 硫化钠溶液l m l ，振荡摇匀置于暗处，待溶液充分显色后，各管分别加入5m l 丙酮，3 7 振荡萃取1 0 m i n ，离心5m i n ，取上层有机溶液用7 2 3 分光光度计在波长4 9 2n n l 处，测定 吸光度值，以试剂空白作对照，绘制标准曲线。 样品脱氢酶活的测定：取污泥制备液2m l 于带塞试管中，依次加入t r i s h c l 缓冲 溶液1 5m l 、0 1m o l l 葡萄糖溶液、0 4 t t c 溶液和0 3 6 n a 2 s 0 3 溶液各0 5m l ，置 于3 7 士1 恒温水浴振荡仪中培养2h 后取出，加入0 5m l 甲醛终止反应，准确加入 5m l 丙酮，3 7 士l 振荡萃取1 0r a i n ，在3 0 0 0r m i n 的条件下离心5m i n ，4 9 2n m 处测 定吸光度。在上述条件下，lh 产生ll ig t f 的量为一个酶活力单位。( 酶活计算公式) 1 2 第二章材料与方法 2 1 4 实验方法 将经过不同预处理(