（药理学专业论文）大鼠hrh1基因新发现的csnp位点及相关研究.pdf

大鼠h r h l 基因新发现的c s n p 位点 及相关研究 中文摘要 中文摘要 组胺( 2 一【4 一i m o d a z o l e 一e t h y l a m i n e ) 是组胺酸在组胺酸脱羧酶( h i s t i d i n e d e c a r b o x y l a s e ，h d c ) 作用下形成的体内作用最广泛的单胺类物质之一，是 i 型超敏反应中的主要效应分子，组胺通过与其相结合的h r h l ( h i s t a m i n e r e c e p t o rh 1 ) 参与机体内多种生理功能的调节。h r h l 是研究神经一内分泌一 免疫一效应器轴的重要中介。 h r h l 作为单拷贝基因，在大鼠基因组中定位于4 号染色体，4 q 4 2 区。 直至最近的研究才发现，人类的h r h l 基因属于无内含子的结构基因。截至 2 0 0 9 年4 月，n c b i 中报道的人类基因组无内含子基因约为1 8 0 个，数量远 远少于有内含子基因，但是，真核生物的无内含子基因在比较物种进化与 基因组的遗传变异中起着重要的作用，近年来已逐渐引起人们的兴趣。大 鼠h r h l 基因也是无内含基因，全长均为外显子。 目前，针对h r h l 基因多态性与碱基突变的研究尚不多，国内未见有关 大鼠h r h l 基因突变的报道。大鼠h r h l 基因与人基因组h r h l 基因具有较 高的同源性，其蛋白结构相近，具有两段7 个跨膜0 【螺旋结构域，氨基酸 序列比对同源性约8 0 ，因此我们选择大鼠h r h l 基因研究其基因组与转 录产物m r n a 的碱基突变，核苷酸多态性，为今后研究人类基因组h r h l 杨天燕：大鼠h r h l 基因新发现的e s i i p 位点及相关研究4 中文摘要 基因多态性，相关突变及与h r h l 表达产物( 组胺h 1 受体) 的遗传药理学 与药物基因组奠定前期实验基础。 针对我们的研究目的，本课题实验主要分为四个部分。 第一部分实验，我们研究了大鼠h r h l 基因在大鼠全血基因组、大鼠脑 组织转录产物m r n a 以及大鼠肝组织转录产物m r n a 中序列的碱基差异。 主要实验操作方法为：从雄性s d 大鼠中用碘化钾法提取全血基因组 d n a ，t r i z o l e 法提取大鼠脑组织与肝组织的总r n a 。紫外分光光度法与琼 脂糖凝胶电泳鉴定提取的核酸纯度与浓度合格后，以脑组织和肝组织的总 r n a 为模板，r e v e r t a i d t mf i r s ts t r a n dc d n as y n t h e s i sk i t s 逆转录合成 c d n a 第一链。根据n c b i 公布的大鼠h r h l 基因组d n a ( g i ：6 2 7 5 0 8 0 4 ) 及m r n a 序列( 酉：2 2 0 7 7 0 ) ，应用v e c t o rn t is u i t e1 0 0 软件，针对h r h l 的蛋白编码区序列设计克隆编码区全长的引物，为便于今后研究h r h l 基因 的表达，在上下游引物的5 引入不同的限制性酶酶切位点。使用保真度极 高的p r i m e s t a r t mh sd n ap o l y m e r a s e ，以所提取的大鼠全血基因组d n a 、 脑组织c d n a 以及肝组织c d n a 为模板，使用聚合酶链反应( p c r ) 方法 克隆大鼠h r h l 编码区全长。p c r 产物纯化回收试剂盒对p c r 反应的产物 进行纯化。用限制性内切酶双酶切法对基因组d n a 、脑c d n a 、肝c d n a p c r 纯化产物与克隆载体p u c l 9 进行双酶切。小量胶回收试剂盒进行酶切产物 的纯化回收。t 4d n a l i g a s e 分别将基因d n a ，脑c d n a ，肝c d n a 酶切 产物与p u c l 9 载体进行粘性末端的连接，构建p u c l 9 h r h l 重组载体。 用i n o u e 法制备大肠杆菌d h 5 a 的超级感受态。将构建好的p u c l 9 h r h l 杨天燕：大鼠h r h l 基因新发现的c s n p 位点及相关研究 5 中文摘要 通过热激转化至d h 5 a 的感受态细胞中，用i p t g ，x g a l 对转化的感受态 进行蓝白筛选，用菌落p c r 法快速筛选含有p u c l 9 h r h l 的阳性菌落。对 筛选好的阳性菌落进行过夜培养，用小量质粒快速抽提纯化试剂盒进行质 粒提取。 提取的质粒首先进行凝胶电泳，根据质粒条带初步确定质粒的大小。 以质粒为模板，进行p c r 扩增，根据是否有特异性条带判定重组载体中是 否含有目的基因。为保证筛选出的重组载体不含有目的片段的双克隆，以 限制性内切酶对提取的质粒进行双酶切鉴定。从筛选合格的重组子中，我 们选择了3 个血基因的重组克隆子、3 个脑c d n a 的重组克隆子以及5 个肝 c d n a 的重组克隆子送北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序。 根据测序结果进行比对，我们发现血基因组3 个克隆子与脑c d n a 的3 个克隆子、肝c d n a 的1 个克隆子与n c b i 中公布的大鼠h r h l 基因组d n a ( g i ：6 2 7 5 0 8 0 4 ) 序列1 0 0 一致，但与m r n a ( g i ：2 2 0 7 7 0 ) 序列的一致性 为9 9 7 ，存在4 个碱基差异。而肝c d n a 组的另4 个克隆存在5 个位点 的碱基突变，分别是2 3 7 位、9 2 8 位、1 0 4 1 位、1 2 1 0 位以及1 3 4 2 位。通过 分析氨基酸的三联体密码，我们发现9 2 8 位与1 3 4 2 位突变可导致编码的氨 基酸发生改变。9 2 8 位为蛋氨酸( m e t ) 一缬氨酸( v a l ) ，即v a l 代替了m e t ； 1 3 4 2 位为v a l m e t 。根据n c b i 公布的大鼠h r h l 的c s n p 位点，仅2 3 7 位( r s 8 1 5 5 5 4 9 ) 的c t 多态与我们的测序结果相符，其余的4 个突变位点， 未见有相关的报道。因此，我们推测：大鼠h r h l 基因中，存在有新的 c s n p 位点。h r h l 在大鼠体内不同组织中转录时( 如脑组织与肝组织) ， 杨天燕：大鼠h r h l 基因新发现的e s n p 位点及相关研究 6 中文摘要 有可能存在r n a 水平上的突变，即r n a 编辑。 在第二部分实验中我们主要研究不同抗凝剂对全血基因组d n a 提取 的纯度和得率，尤其是下游的基因扩增的影响。在第一部分实验中，我们 发现当使用肝素钠抗凝时，紫外分光光度法与琼脂糖凝胶电泳检测基因组 d n a 得率与纯度都令人满意，但p c r 扩增时，结果并不稳定，效果亦不理 想。在排除多种因素并查阅了相关资料后，推测有可能是抗凝血中抗凝剂 的使用对基因组d n a 的扩增效率产生影响。考虑到e d t a 对p c r 反应的 催化剂m 9 2 + 的螯合作用，我们没有选择e d t a 作为抗凝剂，而是选用枸橼 酸钠与肝素作为抗凝剂，分别对大鼠动脉血与静脉血抗凝后，进行实验比 较。 设计了3 对引物，引物1 扩增p - a c t i n ( 跨内含子设计，1 1 0 4b p ) ；引物 2 扩增h r h l 基因的部分片段，4 6 8 b p ；引物3 扩增h r h l 全长，1 4 7 7 b p 。由 实验结果可知，当使用肝素钠作为抗凝剂从全血中提取核酸进行基因扩增 实验，扩增效率会受到明显的抑制，尤其扩增的目的片段较长( 1 0 0 0b p ) 时。扩增小片段时，肝素钠对p c r 的扩增效率影响较小。而动脉血与静脉 血的d n a 扩增结果没有差异。根据这部分的实验结果，我们在提取血基因 d n a 时，选择使用枸橼酸钠作为抗凝剂，保证下游实验结果的稳定性。 为了确定大鼠h r h l 基因的c s n p 位点，证实在第一部分实验中的推测， 我们进行了第三部分实验。这部分实验选择健康雄性s p fs d 级大鼠7 只， 健康雌性s d 大鼠6 只，颈静脉取血，碘化钾法提取全血基因组d n a 。紫 外分光光法与琼脂糖电泳鉴定d n a 的浓度与纯度。p r i m e s t a r t mh sd n a 杨天燕：大鼠h r h l 基因新发现的c s n p 位点及相关研究 7 中文摘要 p o l y m e r a s e 高保真扩增大鼠h r h l 编码区全长，琼脂糖电泳鉴定p c r 产物， 小量胶回收试剂盒进行剩余p c r 产物的纯化回收。纯化产物送北京诺赛基 因组研究中心有限公司进行测序。 通过分析1 3 只大鼠的基因组h r h l 序列测序峰图，我们发现在大鼠h r h l c d s 全长1 4 6 1b p 中，共有4 个c s n p 位点，分别为：2 3 7 位c t 多态；9 2 8 位g 多态；1 0 4 1 位c t 多态；1 3 4 2 位g a 多态。并对1 3 例样本4 个c s n p 位点用s p s s1 5 0 进行了频率统计。 截至2 0 0 9 年4 月，n c b i 中对大鼠h r h l 编码区报道的c s n p 位点共为 3 个，分别为r s 8 1 5 3 5 4 0 ( 1 0 2 位c 多态) 、r s 8 1 5 5 5 4 9 ( 2 3 7 位c 厂r 多态) 以及r s 8 1 5 3 5 4 1 ( 1 4 0 4 位c g 多态) 。 本课题研究发现的4 个c s n p 位点仅2 3 7 位叩多态性c s n p 与n c b i 所报道r s 8 1 5 5 5 4 9 相符，其余3 个c s n p 位点( 9 2 8 位、1 0 4 1 位、1 3 4 2 位) n c b i 均未见报道，而n c b i 报道的r s 8 1 5 3 5 4 0 、r s 8 1 5 3 5 4 1 本研究中未发现 多态性。 我们发现的大鼠h r h l 基因编码区内4 个c s n p 位点中，2 3 7 位与1 0 4 1 位c t 多态引起三联体密码子的改变不会影响编码氨基酸的改变。但9 2 8 位g 多态与1 3 4 2 位g a 多态能造成三联密码子编码的氨基酸发生改变， 是错义突变。 我们根据n c b i 中公布的人类基因组h r h l 基因d n a 序列、m r n a 序 列；大鼠h r h l 基因d n a 序列、m r n a 序列；小鼠h r h l 基因d n a 序列、 m r n a 序列，应用v e c t o rn t is u i t e1 0 0 与l a s e r g e n e7 0 进行分析比对，发 杨天燕：大鼠h r h l 基因新发现的e s n p 位点及相关研究 8 中文摘要 现大鼠h r h lc s n p 位点与人类基因组h r h lc s n p 位点，小鼠h r h lc s n p 有 着相似的发生区域。使用n c b i 的p r o t e i nb l a s t 功能进行了h r h l 基因所编 码的蛋白结构预测，可知人类、大鼠、小鼠的h r h l 蛋白结构极为相似，都 存在有2 段7 个跨膜a 螺旋结构域，区间均为4 5 - - 2 2 5 a a 和3 9 0 - - 一4 7 0 a a 。 用l a s e r g e n e7 0 进行h r h l 编码蛋白多肽链的二级结构预测表明9 2 8 位 和1 3 4 2 位c s n p 可导致编码蛋白多肽链3 1 0 与4 4 8 位氨基酸的改变。从预 测分析可发现，氨基酸改变后会导致0 【区域与亲水性的改变。结果提示我 们，突变引起编码多肽链一级结构的改变，最终导致翻译的蛋白质活性的 改变，从而影响受体蛋白的特性和功能。 为今后进行h r h lc s n p 相关的遗传药理学与药物基因组学等实验确定 相应的检测c s n p 的方法，在第四部分实验中，我们探索了等位基因特异性 扩增法( a l l e l e ss p e c i f i ca m p l i f i c a t i o n ，a s a ) 检测9 2 8 与1 3 4 2 位c s n p 。选 择第三部分实验中通过测序确定序列的1 号( 9 2 8a g1 3 4 2g a ) 、2 号( 9 2 8 g g1 3 4 2 a a ) 、8 号( 9 2 8 ，a ，1 3 4 2g g ) 大鼠做为测定样本。 a s a p c r 引物的设计至关重要。针对9 2 8 位( a g ) 和1 3 4 2 位( g a ) c s n p 位点，应用v e c t o rn t is u i t e1 0 0 软件设计引物。2 个位点的引物都是 在下游引物3 端设计相应的碱基探针，与探针相邻的碱基设计成错配。 提取全血基因组d n a ，高保真扩增h r h l 全长，p c r 产物纯化回收， 稀释后作为a s ap c r 的反应模板。选择第一部分实验中通过测序确定的重 组质粒b l o o d1 ( 9 2 8 a ，1 3 4 2g ) 和l i v e r1 ( 9 2 8g1 3 4 2 a ) 做为阳性对照。 实验结果表明，p c r 结果与预期结果一致，证明所设计a s a 探针引物 杨天燕：大鼠h r h l 基因新发现的e s n p 位点及相关研究 9 中文摘要 完全可行，建立a s a p c r 反应体系可靠，为今后对大鼠的h r h l 基因进行 分型，进行相应的h r h l 不同基因表型、遗传药理学与药物基因组学等相关 实验奠定了前期的基础。 关键词：组胺h 1 受体，基因克隆，编码区，编码区单核苷酸多态性，结 构预测，等位基因特异性扩增 杨天燕：大鼠h r h l 基因新发现的c s n p 位点及相关研究 1 0 n e wc s n pl o c ii nr a t t u sh r h lg e n e a n di t sr e l e v a n ts t u d y a bs t r a c t h i s t a m i n ei sd e r i v e df r o mt h ed e c a r b o x y la t i o no ft h ea m i n oa c i dh i s t i d i n e ， ar e a c t i o n c a t a l y z e db yt h ee n z y m el h i s t i d i n ed e c a r b o x y l a s e i ti s o n eo f m o n a m i n e sw h i c hh a v et h em o s te x t e n s i v e l yi n f l u e n c e so nt h ef u n c t i o n so ft h e b o d y h i s t a m i n ei st h em a j o rr e s p o n s ef a c t o ri nh y p e r s e n s i t i v i t yt y p ei m e d i a t e d b yh r h l ( h i s t a m i n er e c e p t o rh 1 ) ，h i s t a m i n er e g u l a t e sc o m p r e h e n s i v e p h y s i o l o g i c a lf u n c t i o ni ne u c a r y o t i co r g a n i s m t h e r e f o r e ，h r h li sa ni m p o r t a n t a g e n c yt os t u d yt h en e r v e - i n c r e t i o n i m m u n i t y e f f e c t o ra x i s a sam o n o c o p yg e n e ，h r hli sl o c a l i z e da tr a t t u sn o r v e g i c u sc h r o m o s o m e4 ， 4 q 4 2r e g i o n h o m os a p i e n sh r h lg e n ew a st h o u g h tt o b ei n t r o n l e s su n t i l r e c e n t l y u pt oa p r i l2 0 0 9 ，t h en u m b e r so fh u m a n si n t r o n l e s sg e n er e p o r t e da t n c b is i t ew e r ea b o u t1 8 0 ，f a rl e s st h a nt h en u m b e ro f h u m a n si n t r o ng e n e b u t e u k a r y o t i ci n t r o n l e s sg e n e sa r ei m p o r t a n td a t a s e t sf o rc o m p a r a t i v eg e n o m i c sa n d 杨天燕：大鼠h r h l 基因新发现的c s n p 位点及相关研究 1 1 a b s t r a c t e v o l u t i o n a r ys t u d i e s ，a n dh a v ee v o k e di n t e r e s t i n go fr e s e a r c h e r s r a t t u sh r h li s a l s oi n t r o n l e s sg e n ea n di t sf u l ll e n g t hi se n t i r ee x o n t h e r ea r ef e ws t u d i e sa b o u tt h eh r h l g e n ep o l y m o r p h i s ma n db a s e m u t a t i o ns of a r , a n dt h e r ei sn or e p o r ta b o u tt h em u t a t i o no fr a t t u sh r h lg e n ei n d o m e s t i cr e s e a r c h r a t t u sh r hlg e n ei sh i g h l yc o n s e n s u sw i t hh u m a ng e n o m i c h r hl g e n e t h e i rp r o t e i n s t r u c t u r e sa r e v e r y s i m i l a r ：b o t hh a v et w o 7 - t r a n s m e m b r a n e0 【h e l i xr e g i o n s ，i nw h i c hh o m o l o g o u sa m i n oa c i ds e q u e n c ei s a b o u t8 0 a c c o r d i n gt ot h i sf a c t ，w ec h o s er a t t u sh r h lg e n et os t u d yi t sb a s e m u t a t i o na n dn u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s mi ng e n o m i cd n aa n dd n a t r a n s c r i p t ( m r n a ) ，t ol a yt h ee x p e r i m e n t a lf o u n d a t i o no fp o l y m o r p h i s m ，r e l e v a n t m u t a t i o n ，p h a r m a c o g e n e t i c s ，a n dp h a r m a c o g e n o m i c sa b o u th u m a nh r h l g e n e a n di t se x p r e s sp r o d u c t ( h i s t a m i n e h 1r e c e p t o r ) i nt h ef u t u r e t h e s u b j e c ts t u d y i s m a i n l y i nf o u rp a n sf o r t h e p u r p o s eo f o u r i n v e s t i g a t i o n i ne x p e r i m e n tp a r ti ，w es t u d i e dt h es e q u e n c ev a r i a t i o no fr a t t u sh r hlg e n e f r o md i f f e r e n to r i g i n sr e s p e c t i v e l y , i e g e n o m i cd n ae x t r a c t e df r o mr a tw h o l e b l o o d ，t r a n s c r i p tm r n a i nr a tb r a i nt i s s u ea n dt r a n s c r i p tm r n ai nr a th e p a t i c t i s s u e w ee x t r a c t e dam a l es dr a tg e n o m i cd n af r o mw h o l eb l o o du s i n gk i m e t h o da n de x t r a c t e dt o t a lr n af r o mr a tb r a i nt i s s u ea n dh e p a t i ct i s s u ew i t h t r i z o l e u l t r a v i o l e ts p e c t r o p h o t o m e t r ya n da g a r o s eg e l e l e c t r o p h o r e s i sw e r e 杨天燕：大鼠h r h l 基因新发现的e s n p 位点及相关研究1 2 a b s t r a c t u s e dt od e t e c tp u r i t ya n dc o n c e n t r a t i o no fo b t a i n e dn u c l e i ca c i d r e v e r t a i d t m f i r s ts t r a n dc d n as y n t h e s i sk i t sw a su s e dt os y n t h e s i z ef i r s ts t r a n dc d n a c h a i nw i t hb r a i nt o t a lr n aa n dh e p a t i ct o t a lr n aa sr e a c t i o nt e m p l a t e w e a p p l yv e c t o rn t is u i t e 1 0 0t od e s i g nt h ep r i m e r si nc o m p l i a n c ew i t hc o d i n g s e q u e n c eo fr a t t u sg e n o m i ch r h ld n as e q u e n c e s ( g i ：6 2 7 5 0 8 0 4 ) a n dm r n a s e q u e n c e ( g i ：2 2 0 7 7 0 ) r e p o r t e da tn c b is i t e a c c o r d i n gt o t h er e s t r i c t i o n e n z y m e sd i g e s ts i t e a t5 t e r m i n u si ns e n s ea n da n t i s e n s ep r i m e r , w ec a n c o n v e n i e n t l y c o n s t r u c tt h er e c o m b i n a n t e x p r e s s v e c t o ri nt h ef u t u r e p r i m e s t a r t mh sd n ap o l y m e r a s eh a sv e r yh i g hf i d e l i t y , s ow eu s e di tt o c l o n et h er a th r h lg e n ee n t i r ec o d i n gs e q u e n c eb yp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n w i t hr a tg e n o m i cd n a , b r a i nc d n a , a n dh e p a t i cc d n aa st e m p l a t e p c r p u r i f i c a t i o nk i tw a su s e dt op u r i f ya n dr e c o v e rt h ep r o d u c to fp c r d o u b l e e n z y m er e s t r i c t i o nw a su s e dt od i g e s tp c rp r o d u c to fg e n o m i cd n a ，b r a i n c d n a ，a n dh e p a t i cc d n a , a n dc l o n i n gv e c t o rp u c l 9g e le x t r a c t i o nk i tw a s u s e dt op u r i f ya n dr e c o v e rt h ep r o d u c to fd o u b l ed i g e s t i o n t 4d n al i g a s e j o i n t e dt h ed i g e s t i o np r o d u c to fg e n o m i cd n a ，b r a i nc d n a , h e p a t i cc d n a a n d v e c t o rp u c l 9r e s p e c t i v e l yw i t ht h e i rc o h e s i v et e r m i n i b yt h i s ，w ec o n s t r u c t p u c l 9 h r h lr e c o m b i n a n t v e c t o r t h ei n o u em e t h o dw a su s e dt op r e p a r es u p e rc o m p e t e n to fe c o l id h 5 a p u c l 9 一h r h lr e c o m b i n a n tv e c t o rw a st r a n s f o r m e di n t od h 5 as u p e rc o m p e t e n t b yh e a ts h o c k ，a n di p t gx g a lw a su s e dt od oab l u e w h i t es c r e e n c o l o n yp c r 杨天燕：大鼠h r h l 基因新发现的c s n p 位点及相关研究 1 3 w a su s e dt oq u i c k l yi d e n t i f yt h e p o s i t i v ec o l o n yw i t hp u c l 9 一h r h1 t h e s e l e c t i v ep o s i t i v ec o l o n yw a sc u l t u r e do v e r n i g h t p l a s m i dw a se x t r a c t e df r o m t h eo v e r n i g h tc u l t u r ew i t hp l a s m i dd n ae x t r a c t i o nk i t a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i sw a su s e dt oi d e n t i f yt h es i z eo fp l a s m i d a c c o r d i n g t h e i rb a n d c o m p a r e d w i t ht h em a r k e r a p p r o x i m a t e l y p c r a m p l i f i c a t i o nw i t hp l a s m i da st e m p l a t ew a su s e dt od e t e r m i n et h et a r g e tg e n ei n s e l e c t i v er e c o m b i n a n t d o u b l ed i g e s t i o nw a su s e dt oi d e n t i f yt h e p l a s m i dt o p r e v e n ts e l e c t i v ep l a s m i df r o md o u b l ec l o n i n gw i t ht a r g e tg e n e w es e l e c t e d3 r e c o m b i n a n t so fg e n o m i cd n a ，3r e c o m b i n a n t so fb r a i n c d n a , a n d5 r e c o m b i n a n t so f h e p a t i cc d n a ，a n dc o m m i t t e d t h e s er e c o m b i n a n t st o s i n o g e n o m a xc o ，l t d f o rs e q u e n c i n g b yt h ec o n s e q u e n c eo fs e q u e n c i n g ，w ef o u n di tw a s1 0 0 c o n s e n s u so f3 r e c o m b i n a n t so fg e n o m i cd n a , 3r e c o m b i n a n t so fb r a i nc d n aa n d1 r e c o m b i n a n to fh e p a t i cc d n aw i t hr a t t u sh r h lg e n o m i c d n a ( g i ：6 2 7 5 0 8 0 4 ) ， b u to n l y9 9 7 c o n s e n s u sw i t hm r n a ( g i ：2 2 0 7 7 0 ) ，w i t h4b a s e sd i f f e r e n c e t oo u rs u r p r i s e ，t h e r ew e r e5b a s em u t a t i o n sw i t h i n4r e c o m b i n a n t so fh e p a t i c c d n 八a t2 3 7 ，9 2 8 ，1 0 4 1 ，1 2 1 0 ，a n d1 3 4 2l o c u s a f t e rt h et r i p l e tc o d eo fa m i n o a c i dw a sa n a l y z e d ，w ef o u n dt h em u t a t i o n sa t9 2 8a n d1 3 4 2l o c u sc a nl e a dt ot h e c h a n g eo ft r a n s l a t i o na m i n oa c i dw i t ht h a tv a l i n er e p l a c e sm e t h i o n i n ea t9 2 8 l o c u sa n dm e t h i o n i n er e p l a c e sv a l i n ea t1 3 4 2l o c u s a c c o r d i n gt ot h er e p o r to f c s n po f r a t t u sh r h l g e n e a tn c b i s i t e ，o n l y t h ec t p o l y m o r p h i s m 杨天燕：大鼠h r h l 基因新发现的e s n p 位点及相关研究1 4 a b 5 - t r a c t ( r s 8 1 5 5 5 4 9 ) a tl o c u sn u m b e r2 3 7c o i n c i d e sw i t ho u rr e s u l t t h e r ew a sn o r e l e v a n tr e p o r ta b o u tt h er e s t4l o c im u t a t i o n s i ti ss u g g e s t e dt h a t ( 1 ) t h e r ea r e n e wc s n p si nr a t t u sh r h lg e n e ；a n d ( 2 ) t h e r em a yb em u t a t ea tr n a l e v e l ， w h e nh r h lg e n et r a n s c r i p t si nd i f f e r e n to r g a n s ( e g b r a i no rl i v e r ) o ft h er a t ， t h a ti sa l s oc a l l e dr n a e d i t i n g i ne x p e r i m e n tp a r ti i ，w em a i n l yr e s e a r c h e dt h ei n f l u e n c e so fd i f f e r e n t a n t i c o a g u l a n t t ot h ep u r i t ya n dy i e l do fd n ae x t r a c t e df r o mw h o l eb l o o d g e n o m e ，e s p e c i a l l ys u b s e q u e n tp c ra m p l i f i c a t i o n b e c a u s e ，i ne x p e r i m e n tp a r ti ， w ee x t r a c t e dg e n o m i cd n af r o mb l o o da n t i c o a g u l a t e dw i t hh e p a r i ns o d i u m ， y i e l da n dp u r i f yo fg e n o m i cd n a ，d e t e c t e db yu l r a v i o l e ts p e c t r o p h o t o m e t r ya n d a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s ，h a dn op r o b l e m b u tt h er e s u l to fp c ra m p l i f i c a t i o n w a sn o ts t a b l ea n ds a t i s f i e d r e f e r r i n gt oi n v o l v e di n f o r m a t i o na n da f t e r e x c l u d i n gm a n yf a c t o r s ，w es p e c u l a t e dt h a ta n t i c o a g u l a n ti nb l o o dm a yi m p a c t p c ra m p l i f i c a t i o ne f f i c i e n c y c o n s i d e r i n ge d t aa sc h e l a n tc a ni n h i b i tt h em 9 2 + t oc a t a l y z ep c r ，w ed i d n tc h o o s ei ti nt h i se x p e r i m e n t ，b u tu s es o d i u mc i t r a t e a n dh e p a r i ns o d i u ma sa n t i c o a g u l a n t ，t oa n t i c o a g u l a t ea r t e r i a lb l o o da n dv e n o u s b l o o do fr a tr e s p e c t i v e l y , a n dt h e np e r f o r mt h ec o m p a r i s o n w ed e s i g n e d3p a i r so fp r i m e r s ：p r i m e r sia m p l i f i e s1 3 - a c t i n ( s p a na c r o s s i n t r o n ，1 1 0 4b p ) ；p r i m e r si ia m p l i f i e sp a r to fh r h lg e n e ，4 6 8 b p ；a n dp r i m e r si i i a m p l i f i e sf u l ll e n g t ho fh r h lg e n e ，1 4 7 7b p f r o mt h er e s u l to fe x p e r i m e n t s ，w e c a nm a k et h ec o n c l u s i o nt h a tw h e ng e n o m i cd n af r o mb l o o dc o n t a i n i n g 杨天燕：大鼠h r h l 基因新发现的c s n p 位点及相关研究 1 5 a n t i c o a g u l a n th e p a r i ns o d i u mi se x t r a c t e d ，t h ea n t i c o a g u l a n tw i l li n h i b i tp c r a m p l i f i c a t i o ne f f i c i e n c y , e s p e c i a l l y t oa m p l i f yl a r g es i z ef r a g m e n t h e p a r i n s o d i u mi n h i b i t e da m p l i f i c a t i o ne f f i c i e n c ys l i g h t l yw h i l es m a l ls i z ef r a g m e n tw a s a m p l i f i e d a c c o r d i n gt ot h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t s ，w ee x t r a c t e dg e n o m i cd n a f r o mb l o o dw i t hs o d i u mc i t r a t ea sa n t i c o a g u l a n t ，i no r d e rt og u a r a n t e et h es t a b i l i t y o fs e q u e n te x p e r i m e n t p a r ti i io ft h ee x p e r i m e n t sw a sc s n pd e t e c t i o ni nr a t t u sh r h l ，t oc o n f i r m o u rc o n c l u s i o ni ne x p e r i m e n tp a r ti w es e l e c t e d1 3h e a l t h ys p fs dr a t s ，7 m a l e sa n d6f e m a l e s ，a n dp h l e b o t o m i z e dt h er a t sf r o mj u g u l a rv e i n g e n o m i c d n aw a se x t r a c t e df r o mw h