（生物化学与分子生物学专业论文）家蚕bmphb基因的表达及其功能初步研究.pdf

浙江理工大学硕士学位论文 浙江理工大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权浙江理工 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 学位论文作者签名：孤尝- 芳 日期：矽f 晖多月 日 保密口，在年解密后使用本版权书。 不保密口。 指导教师签名： 日期：擀弓 圆 月1 日 l 浙江理工大学硕士学位论文 本研究由张耀洲教授主持的 国家8 6 3 计划课题 ( n o 2 0 0 7 a a 0 217 0 3 ，2 0 0 7 a a l 0 0 5 0 4 ) 浙江省自然科学基金 ( n o y 3 0 8 0 1 8 3 ) 提供资助 论文 作者 指导 学科 所在 提交 浙江理工大学硕士学位论文 at h e s i ss u b m i t t e dt oz h e j i a n gs c i t e c h u n i v e r s i t yf o rd e g r e eo fm a s t e r o fs c i e n c e c a n d i d a t e sn a m e ： z h a n gx u l a g s u b m i s s i o nd a t e ： m a l2 q lq 单位代码! q 墨墨璺 研究生学号qz 2 q 2 q ! q 互垦 浙江理工大学硕士学位论文 摘要 p r o h i b i t i n ( p h b ) 是一种在进化上高度保守的蛋白质，因其具有明显的抗细胞增殖作用 而得名，广泛分布于哺乳类、植物、细菌等多种生物体中。p h b 蛋白不仅是一类新型的分 子伴侣蛋白，在维持线粒体结构和功能方面具有重要作用，而且具有转录调控作用，在细 胞增殖、凋亡等多种生命活动中发挥重要作用，但到目前为止p h b 蛋白行使其功能的具体 的分子机制尚不完全清楚。 通过筛选家蚕蛹c d n a 文库获得一条c d n a 序列，全长为11 4 5b p ，开放阅读框( o i 讧) 大小为8 2 5b p ，编码2 7 4 个氨基酸残基，预测分子量大小为3 0 0 8 ，等电点为6 7 9 。生 物信息学分析发现该基因编码的氨基酸序列与其他物种中的p r o h i b i t i n 蛋白氨基酸序列同 源性较高，并且都含有b a n d7p r o h i b i t i n 这一特征的保守结构域，故将其命名为b m p h b 基因( b o m b y xm o r i p r o h i b i t i n ，b m p h b ) ，g e n b a n k 登陆号为d q 3 11 4 3 1 。将b m p h b 基因e d n a 序列与家蚕基因组序列进行比对，结果显示该c d n a 序列具有3 个内含子，4 个外显子， 外显子内含子边界符合经典的g t a g 规则。根据b m p h b 基因o r f 设计上下游引物，p c r 扩增目的基因，经b a m hi 和x h oi 双酶切后，插入到原核表达载体p e t 2 8 a ( + ) 的相应酶切 位点上，成功构建了重组融合蛋白表达质粒p e t 2 8 a ( + ) - b m p h b ，经p c r 鉴定、双酶切鉴 定以及测序分析证实该重组质粒的正确性。将该重组质粒p e t 2 8 a ( + ) - b m p h b 转化大肠杆菌 r o s e t t a ( d e 3 ) ，筛选阳性克隆，以终浓度为1m m 的i p t g 诱导工程菌后，裂解菌体作 s d s p a g e 分析，s d s p a g e 实验结果显示在3 5k d 左右的位置有一条浓集的特异性蛋白 条带，与预期值( 融合标签3 5 6k d ，b m p h b3 0 0 8k d ) 相符。重组融合蛋白h i s b m p h b 以包涵体的形式存在，包涵体经洗涤、溶解后，用镍柱亲和层析纯化，再用f p l c 反相柱 层析进一步纯化后，经质谱分析得到该重组融合蛋白的分子量为3 3 5 3k d ，与理论值相符， 证实了该融合蛋白表达的正确性。以纯化所得蛋白h i s b m p h b 为抗原免疫雄性新西兰兔， 制备了该重组蛋白的多克隆抗体。多克隆抗体经p r o t e i na 凝胶柱纯化，e l i s a 检测抗血清 的效价可达到1 ：1 2 8 0 0 以上。以家蚕b m 5 细胞进行免疫细胞化学实验，亚细胞定位结果 表明，b m 5 细胞中b m p h b 蛋白在细胞核和细胞质中均有分布且主要存在于细胞质中。提 取家蚕各发育时期和五龄幼虫各组织总蛋白，w e s t e r nb l o t t i n g 实验结果表明，b m p h b 蛋 白在家蚕卵、幼虫、蛹三个发育时期都有表达，在五龄幼虫的生殖腺、马氏管、气管、脂 肪体、肠、头等组织中都有表达，且表达量依次降低，而在丝腺、表皮组织中以及蛾期没 有检测到该蛋白的存在。我们推测b m p h b 可能在家蚕的生长发育中发挥重要的作用。目 浙江理工大学硕士学位论文 前为止未见家蚕p r o h i b i t i n 蛋白的相关研究报道，故本研究为深入研究b m p h b 蛋 奠定了基础。 关键词家蚕；b m p h b 基因；组织分布；亚细胞定位 浙江理工大学硕士学位论文 a b s t r a c t p r o h i b i t i n ( p h a ) i sa l le v o l u t i o n a d l yc o n s e r v e dp r o t e i nw h i c hw a so r i g i n a l l yt h o u g h tt o h a v ea l li m p o r t a n tr o l ei nt h ei n h i b i t i o no fc e l lp r o l i f e r a t i o n , u b i q u i t o u s l yd i s t r i b u t e di nm a n y s p e c i e ss u c ha sm a m m a l s ，p l a n t sa n db a c t e r i a m a n yr e s e a r c h e sr e v e a lt h a tp r o h i b i t i n ( p h b ) i sa n o v e lc h a p e r o n ep r o t e i n , a n dh a si n v o l v e di nd i v e r s ec e l l u l a rp r o c e s s e ss u c ha sc e l lp r o u f e r a t i o n a n da p o p t o s i s h o w e v e r ，i t sm e c h a n i s mo fa c t i o ni su n k n o w na sy e t a c c o r d i n gt ot h el a r g e s c a l ee d n as e q u e n c i n go fs i l k w o r mp u p a e ，an o v e lc d n as e q u e n c e w a si d e n t i f i e df r o mt h ec d n al i b r a r y t h ee d n as e q u e n c ei s1 14 5b pi nl e n g t h , w h i c hh a sa l l o r fo f8 2 5b p ，e n c o d i n gap r e d i c t e d2 7 4a m i n oa c i d s ，m o l e c u l a rw e i g h t3 0 0 8k d ，i s o e l e c t r i c p o 缸6 7 9 v i ab i o i n f o r m a t i o na n a l y s e s ，t h en o v e lg e n ec o n t a i n sab a n d _ 7 _ p r o h i b i t i nd o m a i n , s o w en o m i n a t ei ta sb m p h b ( b o m b y xm o r ip r o h i b i t i n ) ，a n dt h eg e n b a n ka c c e s s i o nn u m b e ri s d q 3 114 31 a na l i g n m e n to ft h eb m p h be d n a s e q u e n c ew i t ht h es i l k w o r mg e n o m es e q u e n c e s r e v e a l st h a tt h e r ea r e3i n t r o n sa n d4e x o n si ni t ，a n da l lo ft h e mc o n f o r m e dt h ec a n o n i c a lg t - a g r u l e s a c c o r d i n gt ot h eo r f o fb m p h b ，t w op r i m e r sw e r ed e s i g n e dt oo b t a i nt h ec o d i n gr e g i o no f b m p h bg e n e t h eo r f o ft h eg e n ew a sc l o n e di n t op e t - 2 8 a ( + ) v e c t o rd i g e s t e d 晰t hb a m hia n d x h oi p c i ld o u b l ed i g e s t i o na n ds e q u e n c i n gi n d i c a t e dt h a tt h er e c o m b i n a n te x p r e s s i o np l a s m i d p e t - 2 8 a ( + ) - b m p h b w a sc o n s t r u c t e d s u c c e s s f u l l y s c r e e n i n gp o s i t i v e c l o n e sa n dt h e n t r a n s f o r m e di n t oe c o l ir o s e t t a ( d e 3 ) ，a n dt h ee x p r e s s i o no ft h eh i s - t a g g e df u s i o np r o t e i nw a s i n d u c e d 、砘也lm mi p t g t h ea n a l y s e so fs d s p a g es h o w e dt h a tt h ef u s i o np r o t e i n h i s - b m p h bw a se x p r e s s e dh i g h l yi nr o s e t t a ( d e 3 ) 、) l ，i m3 5k dt h a tw a sa c c o r d e dw i t ht h e t h e o r yv a l u e t h er e c o m b i n a n tp r o t e i nw a si n s o l u b l ei n c l u s i o nb o d ya n dp u r i f i e dw i t ha f f i n i t y a n dr e v e r s e d - p h a s ec h r o m a t o g r a p h i e s t h ee l u t e dh i s b m p h bw a st h e ni d e n t i f i e d 、j ，i t l lm a s s s p e c t r o m e t e r p o l y c l o n a la n t i b o d yw a sg e n e r a t e db yi m m u n i z a t i o no fn e wz e a l a n dr a b b i tw i 也 p u r i f i e dr e c o m b i n a n tp r o t e i nh i s - b m p h b p o l y c l o n a la n t i b o d yw a sp r e p a r e db ya f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h yu s i n gi m m o b i l i z e dp r o t e i naa n d t h ef i t e rw a sl a r g e rt h a n1 ：12 8 0 0 ，m e a s u r i n g b ye l i s a p u r i f i e da n t i - b m p h bp o l y c l o n a la n t i b o d yw a su s e dt od e t e r m i n et h es u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n i m m u n o s t a i n i n gi n d i c a t e dt h a tb m p h b c a nb ef o u n di nb o t hn u c l e u sa n dc y t o p l a s m b u ti sl o c a t e dp r i m a r i l yi nc y t o p l a s m w e s t e r nb l o t t i n ga n a l y s e si n d i c a t e dt h a t ，i nt h ef i f t hi n s t a r l a r v a , b m p h bw a se x p r e s s e dd e s c e n d i n g l yi ng o n a d ，m a l p i g h i a nt u b u l e ，t r a c h e a , f a t t yb o d y ， i n t e s t i n ea n dh e a d h o w e v e r ，n o n ew a sd e t e c t e di nl a r v a ss i l kg l a n da n de p i d e r m i s a d d i t i o n a l l y ， b m p h bw a se x p r e s s e di nt h en a s c e n te g g ，l a r v aa n dp u p a , b u tn o n ew a sd e t e c t e di nt h em o t h t h e r e f o r e ，w eh y p o t h e s i z e dt h a tb m p h bm a yp l a ya l li m p o r t a n tr o l eo ns i l k w o r md e v e l o p m e n t t od a t e ，w eh a v en o tf o u n da n yr e p o r ta b o u tt h ep r o h i b i t i np r o t e i nf r o ms i l k w o r mp u p a e ，b m o r i ， s ot h e s er e s u l t sl a yaf o u n d a t i o nt of u r t h e rr e s e a r c h e so nb m p h b p r o t e i n i i i 浙江理工大学硕士学位论文 k e y w o r d sb o m b y xm o r i ；b m p h bg e n e ；t i s s u ed i s t r i b u t i o n ；s u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o n i v 摘要 a b s t r a c t 缩略语 目 第一章p r o h i b i t i n 的研究进展 第二章实验方案设计 第三章序列分析 第四章家蚕b m p h b 基因的克隆与原核表达 v 浙江理工大学硕士学位论文 1 1 材料2l 1 2 试齐u ：1 1 1 3 试剂的配制2 2 2 方法2 4 2 1b m p h b 基因的克隆2 4 2 2 重组克隆的筛选与鉴定2 8 2 3 重组质粒的转化2 9 2 4 重组质粒p e t - 2 8 a ( + ) - b m p h b 的表达与鉴定2 9 3 结果2 9 3 1p c r 扩增目的基因2 9 3 2 重组质粒p e t - 2 8 a ( + ) - b m p h b 的鉴定3 0 3 3 重组质粒测序结果3l 3 4 重组蛋白的诱导表达3l 4 讨论3 2 第五章重组蛋白的纯化和多克隆抗体的制备 1 材料与试剂3 3 1 1 材料3 3 1 2 订购试剂3 3 1 3 主要试剂的配制3 3 2 方法3 6 2 1 重纽蛋白的纯化3 6 2 2 多克隆抗体的制备及纯化3 8 2 3 抗体的效价测定3 9 2 4w e s t e r nb l o t t i n g 检测3 9 3 结果4 0 3 1 融合蛋白表达形式的确定及蛋白纯化4 0 3 2 纯化b m p h b 的质谱鉴定4 1 3 3 多克隆抗体的纯化4 2 3 4 间接e l i s a 法测定抗体效价4 2 3 5w e s t e r nb l o t t i n g 检测抗体的特异性4 3 4 讨论4 4 第六章b m p f l b 在家蚕发育各时期及组织的分布 l 材料与试剂4 6 1 1 材料4 6 1 2 订购试剂4 6 1 3 试剂的配制4 6 2 方法4 9 2 1 家蚕4 i 同发育时期及 龄幼虫4 i 同组织总蛋白的提取4 9 2 2w e s t e r n b l o t t i n g 检测b m p h b 蛋白在家蚕巧i 同发育时期及五龄幼虫不同组织中的分布4 9 3 结果5 ( 3 1w e s t e r nb l o t t i n g 检测家蚕发育各时期b m p h b 的表达景变化5 0 3 2w e s t e r nb l o t t i n g 检测五龄幼虫各组织中b m p i - i b 表达景的变化5 0 4 讨论5l v i 浙江理工大学硕士学位论文 第七章b m p h b 在b m 5 细胞中的亚细胞定位分析 l 材料与试剂5 2 1 1 材料5 2 1 2 式剂5 2 1 3 试剂的配制5 2 2 方法5 2 3 结果5 3 4 讨论5 4 结论与创新点 参考文献 v u 5 6 5 7 浙江理工大学硕士学位论文 a c n a p b r l l p h b b s a d a p i e d t a e l i s a e s t f c a f 认 冲 d t g k a n c m n c b i o r f p c r d a p i s d s - p a g e t e m 匣d t f a a c e t o n i t r i l e 缩略语 a m m o n i u mp e r s u l f a t e b o m b y xm o r ip r o h i b i t i np r o t e i n b o v i n es e r u ma l b u m i n 2 - ( 4 - a m i d i n o p h e n y l ) - 6 - i n d o l e c a r b a m i d i n e d i h y d r o c h l o r i d e e t h y l e n ed i a m e m i n e t e t r a a c e t i ca c i d e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y e x p r e s s e ds e q u e n c et a g f r e u n d sc o m p l e t ea d j u v a n t f r e u n d si n c o m p l e t ea d j u v a n t h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e i s o p r o p y l t h i o - p - d g a l a c t o s i d e k a n a m y c i n c h l o r o m y c e t i n n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n o p e nr e a d i n gf r a n e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 4 - 6 - d i a m i d i n o - 2 - p h e n y l i n d o l e s o d i u md o d e c y ls u l f a l t ep o l y a c r y l a m i d eg e l e l e c t r o p h o r e s i s n ，n ，n ，n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e t r i 日o u r o a c e t i ca c i d 乙腈 过硫酸铵 家蚕p r o h i b i t i n 蛋白 牛血清白蛋白 4 , 6 - 联脒2 苯基吲哚 乙二胺四乙酸 酶联免疫吸附实验 表达序列标签 弗氏完全佐剂 弗氏不完全佐剂 辣根过氧化物酶 异丙基硫代一肛d 一半乳糖苷 卡那霉素 氯霉素 美国国立生物技术信息中心 开放阅读框 聚合酶链式反应 4 ，6 联咪- 2 苯基吲哚 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝 胶电泳 n ，n ，n ，n - 四甲基乙二胺 三氟乙酸 浙江理工大学硕士学位论文 引言 第一章p r o h i b i t i n 的研究进展 p r o h i b i t i n ( p l i b ) 是一种高度保守、分布广泛的多功能蛋白质，广泛分布于细菌、植物、 酵母、原虫及哺乳类等多种生物中，且具有高度的同源性。p r o h i b i t i n ( p h b ) 基因的表达产物 p r o h i b i t i n ( p 衄) 蛋白的氨基酸结构非常保守，参与了多种生命活动，目前研究认为 p r o h i b i t i n ( p h b ) 蛋白是一类新型的分子伴侣蛋白，同时具有转录调控作用，在细胞增殖、 细胞凋亡和衰老等过程中发挥着非常重要的作用。p r o h i b i t i n ( p l i b ) 蛋白在多种疾病( 如肿 瘤等) 中存在差异表达的现象，说明该蛋白可能参与了多种疾病的发生与发展过程，但到 目前为止p r o h i b i t i n ( p h b ) 蛋白发挥多种功能的具体的分子机制尚未完全阐明，在家蚕中也 未见相关报道。 1p r o h i b i t i n 的结构与定位 i i 结构和分类 p r o h i b i t i n ( p h bo r p h b l ) 和它的同源物p h b 2 同属于一个蛋白家族，这个蛋白家族的特 点是含有- - + p r o h i b i t i n 1 i k e 结构域( p h b 结构域) ，也称为b a n d7p r o h i b i t i n 结构域。通常情 况下，p h b 2 蛋白的相对分子量e k p h b i ( o p p h b ) 蛋白略大几个k d 。人：类p h b l 基因( 即p 肋基 因) 编码由2 7 5 个氨基酸残基组成的分子量为3 2k d 的p h b l 蛋t 刍( o p h b 蛋白) ，定位于染色体 1 7 q 2 1 1 1 】，包括7 个外显子；人翔厅6 2 基因编码由3 1 6 个氨基酸残基组成的分子量为3 7k d 的 p h b 2 蛋白，定位于染色体1 2 p 1 3 【2 】，包括l o 个外显子。不同种属生物的p h b 蛋白氨基酸序 列组成高度同源，如小鼠和大鼠的p h b 蛋白氨基酸序列完全相同，与人类仅相差1 个氨基酸 残基【3 】。 1 2 定位 p r o h i b i t i n ( p h b ) 在多种生物中普遍存在，且是一种多细胞器定位的蛋白质。p h b i ( 最o p h b ) 通常情况下不以单体形式在生物体内存在，而是和同一蛋白家族的p h b 2 一起形成异 源二聚体，再装配成一种高分子量的复合物或者p h b i ( 且i p h b ) 自身形成四聚体结合到细胞 骨架上发挥作用。多数研究发现p 船1 ( 即p h b ) 和p 耶2 在生物体内共定位f 4 1 。如哺乳动物的 2- 浙江理工大学硕士学位论文 p 耶l ( 即p 皿) 和p 皿2 共定位于线粒体且相互作用【1 1 ，酵母中p h b l ( 即p 衄) 和p h b 2 共表达 且定位在质膜上【5 】；在人类、嗤鼠动物细胞株中p 鹏1 ( 即p 船) 和p 船2 共定位于线粒体内膜 上【1 1 ，调节线粒体功能。由p 皿1 ( 即p 船) 和p 册2 构成的高分子量复合物已经在多种生物的 线粒体和质膜中证实存在。哺乳类动物p h b i ( 且p p h b ) 和p h b 2 的氨基酸c 端有一段较短的疏 水性序列，通过这个疏水性末端将p h b i ( i i p p h b ) 和p 耶2 固定到线粒体内膜上，而其余大 约3 0k d 的c 端则延伸到线粒体膜间隙，中部的氨基酸序列构成所谓的p h b 结构域，c 端具 有一个推测的卷曲卷曲区域( 图1 1 ) 。有研究证实c 端卷曲卷曲区域是酵母细胞内高分 子量复合物装配形成的关键区域 6 1 。p h b i ( 且p p h b ) 和p h b 2 构成异源二聚体，构成环复合体 的亚单位【7 】，构成的环直径大约2 0 - 2 5i m l ，最终装配形成高分子量的复合物铆定在线粒体 内膜上( 图1 2 ) 。 p h b l 1 】83 43 91 8 82 0 12 6 42 9 9 p h b 27 了一l ，盔幽- j 遴缸盔盔幽盔篮盔缸颦盔幽翻盔籀磁赫龋罐崩酗幽戳。黼_ 。童豳编翟幽磁翻翻磷豳誊溺 彩嬲翻渤嬲 乙豳么p h bd o m a i n 二嘲缀c o i l e d c o i ld o m a i n 觑嬲 毛幽豳叠h y d r o p h o b i cs t r e t c h 图1 1 哺乳类动物p h b l 和p h b 2 的结构域特征 f i g1 1d o m a i ns t r u c t u r e so fm a m m a l i a np h b la n dp h b 2 灰色框代表n 端疏水性序列，蓝色框代表p h b 结构域，紫色框代表卷曲卷曲结构域， 颜色上面的数字代表氨基酸残基数。 g r a yb o x e si n d i c a t eh y d r o p h o b i cs t r e t c h e s ；b l u e ，p h bd o m a i n s ；v i o l e t , c o i l e d - c o i ld o m a i n s n u m b e r si n c o r r e s p o n d i n gc o l o u r sr e f e rt ot h er e s p e c t i v ea m i n oa c i dr e s i d u e si np h b 1a n dp h b 2 浙江理工大学硕士学位论文 p h b l p h b 2 c i m s m a t r i 童己，谚魄 j v 鹫 “ 。气 图1 2 线粒体内膜上p h b l 和p h b 2 装配成的复合体 f i g 1 2c o m p l e xa s s e m b l e db yp h b la n dp h b 2i nm i t o c h o n d r i ai n n e r m e m b r a n e p h b l 和p h b 2 构成异源二聚体，直径大约2 0 2 5a m 的环复合体亚单位，再装配成p h b 高分子量复合物 铆定到线粒体内膜。i m = 内膜m s = 膜间隙 h e t e r o d i m e r so fp i - i b1a n dp h b 2a s s e m b l ei n t or i n g - l i k ep r o h i b i t i nc o m p l e x e ss u b u n i t , t h ea v e r a g ed i a m e t e r o ff i n gc o m p l e x e si s - 2 0 2 5r i m , t h e na s s e m b l ei n t op r o h i b i t i nc o m p l e x , a n c h o r e dt ot h em i t o c h o n d r i a l i n n e r m e m b r a n e i m = i n n e rm e m b r a n ei m s = i n t e r m e m b r a n es p a c e 2p r o h i b i t i n 的生物学功能 2 1 分子伴侣作用 p r o h i b i t i n ( p h b ) - - 种多功能蛋白，但目前为止对p h b 的多种功能存在争议最少的还是 它的分子伴侣作用。研究发现p 船在线粒体中主要发挥分子伴侣作用【2 】，p h b l ( p h b ) 和i p h b 2 氨基端各有一个很短的疏水性跨膜区，p 耶1 ( p h b ) 和p h b 2 装配成膜联合环复合体【8 ，9 】 4 浙江理工大学硕士学位论文 并通过n 端的疏水末端铆定于线粒体内膜上，羧基端位于线粒体膜内腔中，形成的复合体 与线粒体内新合成的多肽链相结合，稳定其空间构象，帮助其在折叠酶的作用下完成正确 的折叠而免遭降解。p h b 对多种线粒体蛋白质如细胞色素氧化酶、线粒体氧化呼吸链中的 复合体i 等的组装和降解起调节作用，还可以转运已经裂解的膜蛋白基质至线粒体外。有研 究发现【l o p h b 还可以调节膜离子通道以及钙依赖性a t p 的生成，提示p h b 可能与细胞内能 量代谢和衰老有关，通过发挥分子伴侣的作用，稳定机体的多种代谢功能。当线粒体蛋白 的合成发生紊乱时，p h b 复合物的合成也显著增爹1 1 】。 2 2 维持线粒体的结构与功能 p r o h i b i t i n ( p h b ) 蛋白对维持线粒体结构完整性和正常功能的发挥具有重要的作用。 p h b 表达量的降低会导致线粒体在细胞分裂、分化和细胞信号转导等多种生命活动过程中 形态改变【l o j 。在正常酵母细胞衰老过程中p h b 缺失会加重线粒体形态学、分布和遗传特性 的改变【l2 。，在秀丽隐杆线虫幼虫发育期细胞线粒体中p h b 的表达显著增加，表明p h b 对线 粒体正常发育是必需的。有研究证实，在酿酒酵母中，p h b 对m a a a 蛋白酶活性有负调节 作用【l3 1 。m a a a 蛋白酶是一种保守的a t p 依赖蛋白，它在线粒体的生物发生中起关键作用， 可以调控线粒体内膜蛋白成分的平衡【1 4 ，1 5 】。p h b i ( n j p h b ) 蛋白和p h b 2 蛋白形成的分子量 大约2 1 0k d 的p h b 复合物，通过与存在于线粒体内膜的m a a a 蛋白酶形成超级复合物 ( 图1 3 ) ，调节膜蛋白翻折。与p h b 蛋白不同，m - a a a 蛋白酶的催化结构域暴露在线粒体 基质侧。聊a a a 蛋白酶与p h b 环复合物的结合方式还需要进一步的证实。在缺失p h b 蛋白 的线粒体中，m a a a 蛋白酶能加速非装配内膜蛋白的水解作用，从而实现对，z a a a 蛋白酶 活性的负调节作用。 浙江理工大学硕士学位论文 a b 纛l ，飞4 瓢- ： 阳己7j 燃锄7 训 一 p h bc o m p l e x 图1 3p h b l 和p h b 2 形成p h b 复合物，与a t p 依赖的m - a a a 蛋白酶形成超级复合物 f i g1 3s u p e r c o m p l e xo fp r o h i b i t i n sw i t ht h ea t p - d e p e n d e n tm - a a ap r o t e a s e a ：超级复合物的侧面图；b ：p h b 复合物和m - a a a 蛋白酶可能的结合方式。 m s = 膜间隙；i m = 内膜。 a ：s i d ev i e wo f t h ea s s e m b l e ds u p e r c o m p l e x b ：p o t e n t i a la r r a n g e m e n to f p r o h i b i t i n sa n d 肌- aaap r o t e a s e w i t h i nt h es u p e r c o m p l e x i m s = i n t e r m e m b r a n es p a c e i m = i r m e r m e m b r a n e 6 + 蕴缪 嘲 t耐， ，一 浙江理工大学硕士学位论文 2 3 参与细胞周期调控 p r o h i b i t i n ( p h b ) 最初因其具有抗增殖作用而得名l l j ，研究表b ) j p r o h i b i t i n ( p i - m ) 主要是在 细胞周期的g 1 期s 期之间发挥限制点的作用，通过调节一些转录因子的活性，抑制细胞 增殖。将合成的p h bm r n a 显微注射到正常的成纤维细胞和h e l a 细胞中【l o 】，可以阻止细胞 进入s 期，相反地显微注射p 砌反义寡核苷酸，则可以诱导细胞进入s 期，故认为p h bm r n a 的抗增殖作用主要是通过抑制细胞d n a 合成从而抑制细胞从g 1 期进入s 期。但最近的研究 结果却指出，p h bm r n a 是通过其3 端非翻译区( 3 u t r ) 产生有功能的砌蛆来发挥抗增 殖作用1 1 6 j 。p h b 还可能通过参与调节p 5 3 信号通路进行调节，研究表明p h b 在体内、体外 能与p 5 3 相互作用，增强p 5 3 与d n a 启动子的结合能力，但是对p 5 3 的表达水平并没有影响， p h b 参与信号通路的具体机制尚未阐明。此外，p h b 在卵巢【1 6 】和睾丸【1 7 】中的表达不同。研 究发现，大鼠精原细胞或精母细胞减数分裂时，不能检测到p h b 的表达，提示p h b 与精原 细胞或精母细胞抗增殖有关，在卵巢中p 船的表达与细胞增殖核抗体( p c n a ) 表达成负相关 1 8 1 。在胸腺中观察到p 船免疫定位于非增殖淋巴细胞【1 9 1 。p h b 通过与各种细胞周期调控蛋 白 2 0 1 、细胞信号通路等相互作用发挥抗增殖作用。 2 4 抗细胞衰老 p 船1 或p h b 2 复合物与细胞骨架蛋白肌动蛋白和膜联蛋白存在相互作用，提示 p h b 可能通过细胞骨架信号通路协调细胞骨架的构建，维持细胞结构和功能的完整性【2 1 1 。 在衰老细胞中，p h b 的m r n a 表达明显降低，蛋白质表达水平仅轻度下降，二维电泳技术 观察到衰老细胞中磷酸化形式的p h b 比例显著降低。通过基因敲除技术敲w , p h b 基因可以使 细胞的寿命减少1 3 左右i z z j ，这可能与p h b 的分子伴侣作用有关。可能是由于细胞衰老时 p h b 功能减退，不能帮助新合成的线粒体蛋白j 下确折叠，降低了线粒体蛋白的稳定性，线 粒体氧化呼吸链无法正常装配，影响线粒体氧化呼吸功能，氧化损伤积累，线粒体膜电位 下降，线粒体正常的形态难以维持，同时，线粒体d n a 的稳定性亦显著降低等。因此，多 种因素共同加速了细胞的衰老。线粒体含量丰富的细胞及组织中p h b 的含量也会相应增多， 尤其是代谢旺盛的肿瘤细胞中，p h b 的表达水平明显升高。 7 浙江理工大学硕士学位论文 2 5 抗凋亡作用 p 船主要是通过与e 2 f 和p 5 3 相互作用，调控其活性，从而发挥抗凋亡作用。研究表明， p h b 可以保护细胞免受拓扑酶抑制剂喜树碱诱导的凋亡【2 3 1 ，当p r b 家