（微生物学专业论文）耐高温α淀粉酶菌株的筛选、发酵条件优化及酶基因的克隆.pdf

硕士学位论文摘要 摘要 耐高温i x 淀粉酶是目前最重要的工业酶制剂之一，约占酶制剂市 场2 5 的比例。耐高温a 淀粉酶能在较高温度下能够有效快速的分 解淀粉，被广泛应用于纺织退浆、发酵、制糖等高温条件下生产工业。 枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 是国内生产耐高温a 淀粉酶的代表菌 株之一。 为了获得纺织工业中所需求的耐高温仅淀粉酶，从枯草堆、农田 积肥、下水道等处土样中分离得到一株能向胞外分泌耐高温a 淀粉酶 的菌株并对其所产酶的酶学性质进行了研究。通过生理生化及分子生 物学鉴定，鉴定该菌为枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) ，并初步命名 为b a c i l l u ss u b t i l i sc i 。b a c i l l u ss u b t i l i sc 1 在基础培养基中( p h7 ，温 度4 5 ) 培养2 4h 左右达到生长稳定期，在6 8h 时酶活达到最高， 为1 8 5 6u m l 1 。对该菌株分泌的耐高温a 淀粉酶的性质研究表明， 此a 淀粉酶最适作用p h 值为6 ，最适温度为7 0 。酶的耐热性能 较好，在7 0 下处理lh ，仍具有8 1 的酶活，适合纺织品高温退 浆的需要。 为了获得较高的酶活和产量，在实验中，利用m i n i t a b 软件中 p l a c k e t t b u r m a n 设计和响应面分析法，对耐高温q 淀粉酶产生菌 b a c i l l u ss u b t i l i sc1 的发酵培养条件进行了优化。在单次单因子法得出 的适宜条件基础之上，综合考虑了所有影响酶活的因素，并对培养条 件进行了统计分析，得到了b a c i l l u ss u b t i l i sc1 产耐高温肛淀粉酶的 最佳培养条件。结果表明：优化培养基的组成( 2 0 0m l ) 为麸皮2 1 6g ， 棉粕粉1 9 8g ，酵母粉0 4 0g ，n a c i1 0 0g ，c a c l 2o 4 0g ，淀粉o 1 0g 。 该营养条件下的酶活为2 3 2 9u m l ，约是培养基优化前酶活的1 2 6 倍，酶活有了显著的提高。 根据g e n eb a n k 中已知的洳淀粉酶基因保守序列设计出特异性 引物，通过p c r 方法从b a c i l l u ss u b t i l i sc 1 基因组d n a 中扩增出了 预期的1 5k b 左右的特异性产物。该片段与已报道的解淀粉芽孢杆菌 和枯草芽孢杆菌的a - 淀粉酶编码基因分别有1 0 0 和9 9 的同源性。 最大阅读框为1 5 4 5b p ，信号肽序列9 3b p 。重新设计引物，获得去除 信号肽的弘淀粉酶编码基因，并将其与p p i c z i x a 载体连接后，电击 转化t o p1 0f 菌株的感受态细胞，经质粒抽提、酶切鉴定，确认该 目的产物已得到成功克隆。该基因的克隆，为构建弘淀粉酶的工程菌 硕士学位论文 摘要 奠定了基础。 关键词：q 淀粉酶，耐高温，枯草芽孢杆菌，响应面分析，克隆 硕士学位论文 a bs t r a c t t h e r m o s t a b l e 0 【一a m y l s e ，c a t a l y z i n gh y d r o l y s i s o fs t a r c ha t h i g h t e m p e r a t u r e s ，i so l l eo f t h em o s ti m p o r t a n te n z y m e i ti sw i d e l ya p p l i e di n d e s i n z i n g ，s u g a ra n df e r m e n t a t i o ni n d u s t r y b a c i l l u ss u b t i l i si so n eo ft h e i n d u s t r i a ls t r a i n s w h i c hs e c r e t e st h e r m o s t a b l e 仅a m y l a s ea th i g hl e v e l i no r d e rt oo b t a i nt h et h e r m o s t a b l ed e s i z i n ge n z y m e ，w h i c hc a nb e u s e di nt e x t i l e i n d u s t r y , as t r a i nw a si s o l a t e df r o ms o i l ，a n dt h e c h a r a c t e r i s t i c so fi t sc r u d e e n z y m e w e r es t u d i e d b a s e do nt h e p h y s i o l o g i c a l a n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ，a n dt h e p h y l o g e n e t i c a n a l y s i so f16 sr d n as e q u e n c e ，t h es t r a i nc 1i si d e n t i f i e dp r e l i m i n a r i l y a sb a c i l l u ss u b t i l i s t e m p o r a r i l yn a m e db a c i l l u ss u b t f f i sc1 i nt h eb a s a l m e d i u m t h es t r a i nc1r e a c h e si t ss t a t i o n a r yp h a s ew i t h i n2 4h o u r sa tp h 7a n d4 5 a n d ，a t6 8h ，i tr e a c h e st h eh i g h e s te n z y m ea c t i v i t yo f 18 5 6 u m l t h e s t u d yo ft h e c h a r a c t e r so ft h e h i g h t e m p e r a t u r e a l p h a - a m y l a s es h o w st h a tt h eo p t i m u mp hi s 6a n dt h eo p t i m u m t e m p e r a t u r ei s 7 0 t h i se n z y m ei ss t a b l et oh i g ht e m p e r a t u r e ，a n d 81 o fe n z y m ea c t i v i t yi sr e t a i n e dw h e nd i s p o s e da t7 0 f o rlh i ti s s i g n i f i c a n tt os t u d yf u r t h e ro nt h es t r a i nf o rt h ei n d u s t r i a la p p l i c a t i o n i nt h es t u d y , t h eo p t i m u mm e d i u mf o rb a c i l l u ss u b t i l i sc1w a s s y s t e m a t i c a l l ys t u d i e dw i t h m i n i t a bs o f t w a r e o nt h eb a s i so fs i n g l ef a c t o r e x p e r i m e n t s ，t h ep r i m ef a c t o r sa f f e c t i n ge n z y m ea c t i v i t yw e r es e l e c t e db y m e a n so fp l a c k e t t b u r m a nd e s i g n a n dt h e n ，t h ef a c t o r sw e r eo p t i m i z e d b yr e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i s t h er e s u l ts h o w st h a tt h eo p t i m a lm e d i u m c o m p o s i t i o nw a s a sf o l l o w s ：w h e a tb r a n2 16g ，c o t t o ns e e dm e a l1 9 8g ， y e a s te x t r a c to 4 0g ，n a c i1 0 0g ，c a c l 20 4 0g ，s t a r c ho 10g e n z y m e a c t i v i t yu n d e rt h eo p t i m a lc u l t u r ec o n d i t i o n si s2 3 2 9u m l 1 w h i c hi s 12 6f o l do ft h a to ft h eo r i g i n a lm e d i u m ，t h i ss t u d yh a sas i g n i f i c a n t a d v a n c e m e n t t h ee x p e r i m e n t a ld a t au n d e rv a r i o u sc o n d i t i o n sh a v e v a l i d a t e dt h et h e o r e t i c a lv a l u e s a b o u t1 5l ( bs p e c i f i cf r a g m e n tw a so b t a i n e df r o mg e n o m i cd n ao f b a c i l l u ss u b t i l i sc1 b y p c r a m p l i f i c a t i o n w i t h p r i m e r sd e s i g n e d a c c o r d i n gt ot h ek n o w ns e q u e n c e so ft h ea - a m y l a s eg e n ei nt h eg e n e b a n k a n dt l l e nt h ef r a g m e n tw a sl i g a t e dw i t hp p i c z aav e c t o r ， i i i 硕士学位论文 a b s t r a c t t r a n s f o r m a t e di n t ot o p10f c o m p e t e n tc e l ls u c c e s s f u l l y c l o n i n go ft h e q - a m y l a s eg e n eo fb a c i l l u ss u b t i l i sc 1f o u n d e dt h eb a s ef o rc o n s t r u c t i o n o ft h ee n g i n e e r i n gs t r a i n 丽t hl l i g h y i e l do t a m y l a s e k e yw o r d s ： q - a m y l a s e ，t h e r m o s t a b l e ，b a c i l l u ss u b t i l i s ，r e s p o n s e s u r f a c ea n a l y s i s ，c l o n i n g i v 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名：j 虹日期：趋里皇年坚月上鱼日 l 学位论文版权使用授权书 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文， 允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 作者龆盥导师签名隆弧吼哔年月4 日 硕士学位论文第一章综述 第一章综述 1 1仅淀粉酶的种类和性质 c t 淀粉酶，系统名称为a 1 ，4 葡聚糖_ 4 葡聚糖水解酶( q 1 ， 4 - g l u c a n - - 4 - g l u c a n o h y d r o l a s e ) 。它以糖原或淀粉为底物，从分子内部切开洳l ，4 葡萄糖苷键，使底物水解成糊精和少量的葡萄糖和麦芽糖。其产物的末端葡萄糖 残基c l 碳原子光学性质呈m 型，故称a 淀粉酶。依据国际生物化学联合会酶学 委员会规定，编号为e c 3 2 1 1 。 弘淀粉酶广泛分布于动物( 唾液、胰脏等) 、植物( 大麦芽等) 及微生物。微生 物的酶几乎都是分泌性的。a 淀粉酶既作用于直链淀粉，也作用于支链淀粉，以 随机方式切断旺1 ，4 葡萄糖苷键。a 淀粉酶是金属酶，它以c a 2 + 为必需因子并 作为稳定因子保持酶分子的最适构象。在q 1 ，4 糖苷键水解的过程中，葡萄糖 单位间的c 1 o c 4 键的c l - o 键间断裂。a 淀粉酶在分解直链淀粉时最终产物为 麦芽糖、麦芽三糖及少量葡萄糖。它在分解支链淀粉时，不能水解支链淀粉的1 ， 6 葡萄糖苷键，也不能水解紧靠l ，6 分支的泓l ，4 葡萄糖苷键，产物除麦芽糖、 葡萄糖外，还生成分支部分具有c t 1 ，6 葡萄糖苷键的a 极限糊精。一般分解限 度以葡萄糖为准是3 5 5 0 ，在某些细菌的淀粉酶中，分解限度高达7 0 ，以至 最终游离出葡萄糖【l 】一1 2 。淀粉被不同来源的a 淀粉酶分解所得到的各种产物的含 量是不同的。真菌q 淀粉酶的淀粉水解终产物主要是麦芽糖和麦芽三糖，而细菌 旺淀粉酶以短链糊精为主。因此真菌a 淀粉酶实际上是一种产麦芽糖的糖化酶， 而细菌a 一淀粉酶则多是液化酶【3 l 。直链淀粉和支链淀粉均以无规则的形式被分 解，从而淀粉糊的粘度迅速下降，即起“液化”作用，纺织退浆即应用了此原理。 洳淀粉酶液化淀粉导致淀粉部分解聚，失去粘性和遇碘呈色的性质，水解物 的还原力增加，当到达消色点附近时随还原力增加而反应速度降低，逐渐达到水 解极限。但是不同来源的a 淀粉酶，不同来源的淀粉、对淀粉的预处理方式、 处理温度以及溶液p h 等因素都会影响这一水解过程，导致a 淀粉酶作用于淀 粉的水解极限不同，生成低寡糖组成存在差异和结构不同的极限糊精【4 j 1 5 。 a 淀粉酶种类繁多，按其来源不同可分为真细菌淀粉酶、古菌淀粉酶、植物 和动物淀粉酶；按其使用条件不同可分为中温型、高温型、耐酸耐碱型。耐高温 a 淀粉酶的来源主要为古菌和真细菌，最适作用温度都在6 0 以上。古菌一般 在各种极端的条件下生存，如高温、高渗、强酸强碱等，维持他们生命活动的很 多蛋白质也是适应其生存环境的，因此，古菌来源的m 淀粉酶较真细菌能够耐受 硕士学位论文第一章综述 更高的温度。虽然古菌q 淀粉酶耐热性能较好，但它们最适生长温度较高，多为 8 0 以上，生长条件较为苛刻，并不适合工业化生产的要求。因此常温菌株芽 孢杆菌属( 如b a c i l l u ss u b t i l i s ，b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ) 仍然是研究的重点。表1 1 列 出了部分耐高温q 淀粉酶的性质6 1 。 表1 1 耐高温m 淀粉酶的种类 t a b l el - 1t h et y p eo f t h e r m o s t a b l ea - a m y l s e 各种微生物所产生的a 淀粉酶有着各自不同的起源，因此它们的理化性质 既有共性又各有不同。 ( 1 ) 最适p h 真菌来源的q 淀粉酶在4 0 时的最佳p h 范围在4 8 5 4 。有些霉菌的洳 淀粉酶很耐酸，在p h2 0 时仍有分解淀粉8 0 的活性。在4 0 时它可以有效的 在4 0 6 6 这样p h 范围内水解淀粉 7 1 。细菌来源的q 淀粉酶，大部分在p h 5 5 8 0 比较稳定，最适p h 范围为6 0 7 0 ，在p h 5 0 已失活严重。而一些嗜碱性细菌 中存在着p h 在4 0 1 1 0 的洳淀粉酶【8 l ，如芽孢杆菌属的少数种在较高p h 的 碱性培养基中分泌碱性小淀粉酶。它们的最适p n 在9 2 1 0 5 之间，但酶大多数 在4 0 以上酶活力很快下降。m e d d a 等报告的两株菌地衣芽孢杆菌和凝结芽孢 杆菌在碱性p h 条件下产生耐热小淀粉酶，在9 l 能维持稳定1 小时，最适 p h 为9 5 【9 】。 ( 2 ) 最适温度 真菌的洳淀粉酶的耐热性比较低，一般最适温度为4 5 6 5 。枯草芽孢杆 菌的弘淀粉酶最适作用温度6 0 7 0 ，在7 0 9 0 之间随着温度的升高，其反 2 硕士学位论文第一章综述 应速度加快，但失活也加快，适用于最高达9 0 的液化过程。地衣芽孢杆菌产 生的甜淀粉酶作用的最适温度较高，为9 2 ，短时期反应温度能达1 1 0 。而 解淀粉芽孢菌q 淀粉酶操作的最高温度是8 5 9 0 。在3 7 最适p h 5 7 时，这 二种酶的活力大体相当，在6 0 地衣芽孢菌q 淀粉酶的话力大约提高1 5 ， 在9 5 酶活力显著提高。但是解淀粉芽孢杆菌的q 淀粉酶在此条件下极不稳定， 活力大大下降【l o 】。在7 0 使用地衣芽孢杆菌a 淀粉酶加3 4p p mc a c l 2 即能达 到完全稳定，而对解淀粉芽孢杆菌a 淀粉酶加5 4p p mc a c l 2 也极不稳定【1 l 】。纯 化的q - 淀粉酶在5 0 以上容易失活，但是有大量c a 2 + 存在下，酶的热稳定性会 有较大提高。c a 2 + 对多数a 淀粉酶的热稳定性有着较大影响，对于动物a 淀粉酶 来说，c l 也为激活剂。另外，a 淀粉酶的耐热性还受底物的影响，高浓度的淀粉 能显著地提高q 淀粉酶的稳定性【1 2 】。在高浓度的淀粉浆中，最适温度原为7 0 的枯草杆菌m 淀粉酶，以8 5 9 0 时的活性最高。在生产中应用时，淀粉的浓 度通常为3 0 4 0 。 ( 3 ) 金属离子的影响 a 淀粉酶是金属酶，很多金属离子，特别是重金属离子对其有抑制作用。金 属离子对淀粉酶活力的影响机理很复杂，一般认为，金属离子是通过改变酶蛋白 的构象来影响酶的活力的。 c a 2 + 使酶分子保持适当的构象，从而维持其最大的活性和稳定性，a 淀粉酶 中至少包含一个c a 2 + f 1 3 l 。c a 2 + 对a 淀粉酶的亲和能力比其它离子强，其结合钙的 数量在1 到1 0 之间。结晶高峰淀粉酶a ( t a a ) 包含1 0 个c a 2 + ，但只有一个结 合很牢固。通常情况下结合一个c a 就足以使洳淀粉酶很稳定。用e d t a 透析 或者用电渗析可以将c a 2 + 从淀粉酶中除去，加入ca j 2 + 可以激活钙游离酶【1 4 1 。通 常情况下，有c a 2 + 存在淀粉酶的稳定性比没有时要好，但也有报道q 淀粉酶在 c a 2 + 存在时会失活，而经e d t a 处理后却保留活性。有人解释为当c a 2 + 的数量 超过酶分子的结合能力时，过量的c a 存在于环境中对酶分子起到破坏作用【1 5 1 。 另外，有报道称c a 2 + 对q 淀粉酶没有影响【1 6 1 。 对于其他金属离子来说，除m 9 2 + 等少数对a 淀粉酶有一定的激活作用外， 其他严重抑制淀粉酶活性。如c e 3 + 、c ( 1 2 + 和p b 2 + 等不仅可能完全占据c a 2 + 与淀粉 酶的结合位点，而且还可能在c a 2 + 的结合位点以外的氨基酸残基上结合，从而导 致酶的构象改变，使淀粉酶的活力发生改变，z n 2 + 和m n 2 + 同样也具有强烈的抑 制作用【1 7 】【1 8 j 。 1 2 耐高温a 淀粉酶的工业应用 耐高温小淀粉酶是酶制剂中应用很广的产品，应用历史早，产量大，约占酶 3 硕士学位论文 第一章综述 制剂市场2 5 的比例，主要应用于纺织物退浆、啤酒和酒精生产、淀粉加工、食 品加工、发酵工业、医药行业以及石油开采工业等方面【1 9 j ，1 2 0 】。 ( 1 ) 纺织物退浆 由于棉织物在编织过程中需使用较大的张力，容易使丝线断裂，因此需加入 一些浆料对其保护。由于淀粉资源广泛，廉价易得，易退浆，因此纺织工业中多 采用淀粉浆。在织物漂白和染色之前必须经过退浆处理，因为织物纤维上的胶浆 影响到湿加工处理的一致性。常规酸、碱或氧化剂退浆容易产生大量化学品污染， 且对纤维有一定的损伤。而采用酶退浆则杜绝了这些现象。绿色纺织品加工中， 利用耐高温q 淀粉酶对纺织品进行湿加工不但产品性能得到提高，不损伤皮肤， 而且生产能耗低废液，易生物降解，符合现代人对绿色环保的要求。 织物退浆主要使用a 淀粉酶，它会使淀粉大分子发生分解，生成可溶性的水 解产物，减弱了对纤维的粘附力，因此可以通过水洗将其除去，最后从纤维上脱 除【2 1 1 。早期是用麦芽产生的一种内生酶来退浆，但作用温度低，无法适应浸轧、 汽蒸工艺。为了便于工艺控制，适应p h 范围宽、热稳定性高的酶对加工工艺的 控制有利，而连续化生物酶退浆生产则离不开耐高温耐碱性的a 淀粉酶。酶制剂 的复配虽然可以改善生物酶制剂的p h 活性域和热稳定性，但是效果有限。使 用耐高温的细菌隰l i c h e n i n f o r m i s 、丑s u b t i l i s ) 淀粉酶。它们能够耐高温，在碱性 的环境里有一定的稳定性，具有一个中性的最适p h 值( p h5 - 7 5 ) ，可用于退除淀 粉类和聚乙烯醇类胶浆，且酶的催化效率高，有利于提高生产效率。如用碱分解 淀粉退浆需要l o 1 2h ，而用0 t 淀粉酶只要2 0 3 0m i n 即可完成退浆过程。在退浆 浴中添加钙盐，可提高淀粉酶的稳定性，从而可用较高的温度或较低的酶剂量来 达到退浆的目的1 2 2 1 。 ( 2 ) 酒精生产 在玉米、淀粉为原料生产酒精中，原来普遍采用高温蒸煮方法f 2 射。通过高 温高压使原料组织、细胞壁强度削弱。吹醪时压力变化使细胞壁膨胀破裂，从而 达到淀粉糊化的目的。此种蒸煮工艺要求温度在1 3 5 1 4 6 。能源消耗较大， 高压作用对设备要求也比较高。 酒精生产的蒸煮过程中加耐高温叶淀粉酶，能够加速原料的糊化，降低蒸煮 中高温糊化所需要的能量，将糊精转化为酵母可利用的葡萄糖。在温度为9 5 ， 液化8 0m i n ，经测定，其糊化率都在8 5 以上，对原料液化彻底，分解产物为 短小糊精及少量麦芽糖，缩小了糖化酶作用的底物分子，并且在糖化发酵过程中 还保存有酶活力，使糖化更彻底。加入酶后，酒精生产的蒸煮温度能从原先的 1 3 0 以上降到1 0 0 ，蒸煮醪粘度降低，有利于泵的输送，便于蒸馏，明显 地降低能耗及动力消耗。同时耐高温c t 淀粉酶能使淀粉迅速液化，降低水料的配 4 硕士学位论文第一章综述 比，提高发酵液浓度，提高糖化和发酵设备的生产能力，达到节能节水的目的。 另外采用1 0 0 蒸煮，后熟9 0r a i n ，既可有效地杀死原料中带来的杂菌，降低 入池酸度和染菌机率，又可保护原材料中的淀粉组织不被破坏形成焦糖或其它物 质而损失，从而提高原料利用率。并且还减少了高温高压对设备的作用，用汽量 减少3 0 左右，减少了锅炉负荷，节约了煤电。且生产发酵酸度正常，原料出酒 率提高，成品质量稳定1 2 4 1 。 ( 3 ) 淀粉糖生产 利用淀粉可以生产葡萄糖，以及高果糖浆、饴糖等其它淀粉糖，一般使用精 制淀粉作为原料【2 5 1 。用a 淀粉酶处理后，使淀粉糖化、液化，再使用其它淀粉 酶进行转化处理。工业生产中，淀粉的液化是将0 【淀粉酶先混入淀粉乳中，加热， 淀粉糊化后进行液化。由于a 淀粉酶对于糊化淀粉具有很强的催化水解作用，因 此可以迅速将淀粉水解成小分子，使其粘度降低，流动性增高，以利于淀粉的糖 化。 目前广泛应用的是双酶法制糖工艺，先用耐高温旺淀粉酶进行连续喷射液 化，加入糖化酶进行间歇式糖化，经过脱色。离子交换除去杂质，最后经过浓缩、 结晶、喷雾干燥得到成品。 耐高温q 淀粉酶在喷射液化工艺过程中，可提高喷射温度至1 0 0 1 0 5 ， 不需灭酶，因此无需较多的液化罐，液化液可连续进入糖化罐冷却糖化。其液化 时间短，液化温度高，操作方便。酶具有较高的热稳定性。它的最适作用温度为 9 2 ，在1 0 0 仍保持相对较高活力，实际生产中喷射液化的瞬间温度可达 1 0 5 1 1 0 。 有报道称，将耐高温q 淀粉酶应用于玉米干磨制粉直接加工淀粉糖后，由于 液化是在密闭的管道内进行，便于连续生产，不仅节能，而且能大幅度增加玉米 粉的干物质回收率，已突破了国外文献报道的玉米干法制糖约有3 0 的淀粉未能 直接利用的界限。此外，还改进了液化液组成，有利于糖化，在二代果糖生产中 可使糖化液d e 值达9 7 9 8 ，超过了国际上报道的酶法淀粉糖化液d e 值9 5 9 6 的要求1 2 6 1 。 1 3a 淀粉酶的研究进展 从5 0 年代开始，人们就着手从高温土壤中筛选出发菌株来研究耐高温昏淀 粉酶。近年来人们对高温土壤中，特别是温泉附近土壤中，筛选到了产耐高温洳 淀粉酶的凝结芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌。可见高温菌在耐高 温a 淀粉酶研究中仍然十分重要。自1 9 7 3 年m a d 咖【1 0 1 等报道了采用常温地衣 芽孢杆菌得到了一种新的耐高温a 淀粉酶开始，人们尝试从中温菌，如枯草芽孢 5 硕士学位论文第一章综述 杆菌、地衣芽孢杆菌中获得耐高温a 淀粉酶，这给耐高温仅淀粉酶的研究开辟 了一条新途径。目前工业化应用的耐高温洳淀粉酶多是来自常温芽孢杆菌属。 枯草芽孢杆菌是当今工业酶生产应用最广泛的菌种之一。由于枯草芽孢杆菌 生境多样，可利用的营养物质种类十分丰富，这决定了其自身含有丰富的产酶系 统，具备生产多种酶的应用潜力。研究资料表明，枯草芽孢杆菌能够产生蛋白酶、 c t 淀粉酶、纤维素酶、p 葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶和木聚糖酶等十几种彰2 7 j 。 据不完全统计，枯草芽孢杆菌所产的酶占整个酶市场的5 0 。并且其产酶量高、 种类多、安全性好和环保，在现代工业生产中被广泛用作生产菌种，其发酵生产 的酶已在食品、饲料、洗涤、纺织、皮革、造纸和医药等领域均发挥着十分重要 的作用【2 引。 国内外关于枯草芽孢杆菌的研究与应用已有1 0 0 多年的历史，早期大部分工 作集中在形态观察、分类鉴定、生理机制、功能发掘及防治等方面。近年来，对 枯草芽孢杆菌的研究渐进到遗传学与分子生物学领域，研究内容体现在特定功能 基因的寻找并克隆到需要的物种中或者通过诱变、基因工程等手段对枯草芽孢杆 菌生产菌进行遗传改造等【2 9 l 1 3 0 1 。1 9 9 7 年，k u n s tf 等人首先完成了枯草芽孢杆 菌的完整基因组序列测定，并将结果发表在( n a t u r e ) ) 杂志上【3 1 1 。 枯草芽孢杆菌生产的蛋白酶、淀粉酶是工业酶中应用最为广泛的酶，仅二者 就占到了整个工业酶市场的5 0 t 3 2 l 。其中，淀粉酶的生产和应用处于整个酶制 剂的首位，其最早是在2 0 世纪初，由德国的b o i d e n 和e f f r o n t 先后从枯草芽孢 杆菌培养液中分离出的。目前，枯草芽孢杆菌酶市场营业额的9 0 以上掌握在 2 0 多家工业酶企业手中，仅n o n o z y m e s 和d a n i s c o 两家公司就占到了6 0 以上。 随着分子生物学的发展，利用基因工程技术，枯草芽孢杆菌几乎可以在短期内大 量生产任何种源的新酶，从而省略了大量的原始菌种改造、驯化、毒理学实验等 工作。同时，利用蛋白质工程技术，能够在生产新酶之前对该酶的性质进行改良 和调整，从而改善酶的活性或者赋予酶新的所需性质。这些新技术的应用使新酶 种的开发周期大大缩短，难度和成本降低，产品更加稳定有效。我国酶制剂工业 近年来取得了长足的发展，但仍无法跟上世界同行业发展的步伐，科研乏力已成 为制约中国酶工业发展的瓶颈因素。随着中国经济的持续增长和中国生物技术产 业的发展，不断增强的经济基础必然会对酶制剂的市场需求产生有力的拉动作 用，并对酶工业的技术创新创造有利条件。目前，我国的酒类产品、果汁类产品、 肉类产品、发酵类产品、饲料、纺织品等产量和消费量都位居世界前列，这些传 统产业的技术改造都涉及枯草芽孢杆菌酶的应用，同时酶的消费量与人口数量和 生活质量成正比，我国作为世界人口第一大国，枯草芽孢杆菌酶具有广阔的发展 前景。 6 硕士学位论文第一章综述 随着分子生物学的发展，目前已研究清楚了a 淀粉酶的蛋白质结构，并已经 分别从枯草芽孢杆菌【3 3 】、地衣芽孢杆菌【3 4 】等微生物中克隆到了洳淀粉酶基因。 日本的k o h j io h d a n 和t a k a s h ik u r i k i 对枯草芽孢杆菌的两种淀粉酶形式( 即完整 的淀粉酶基因和c 末端截短了1 8 6 个氨基酸的淀粉酶基因) 进行了研究，结果表 明c 末端缺失1 8 6 个氨基酸的淀粉酶基因，比完整的淀粉酶基因短了2 8 ，除 了酶的热稳定性比完整的淀粉酶基因高之外，其淀粉酶酶学特性包括催化活性、 分解淀粉的模式、转糖基能力，特定p h 下的酶活性及其稳定性、酶的最适温 度、结合淀粉的能力和其空间结构与完整的淀粉酶没有变化。其三级结构预测表 明，截短的淀粉酶基因可能包括淀粉酶基因的全部功能区【3 5 1 。 为了获得更高的产量和酶活，现阶段国内外的研究内容主要为：( 1 ) 用传统 方法筛选高产菌株；( 2 ) 对发酵培养基和工艺进行改进；( 3 ) 构建基因工程菌。 传统方法因操作简单、技术性不高，今后相当长的时间内仍将被广泛使用。 利用传统技术培育菌种的目标是使产酶活力提高，菌株性状稳定，发酵周期缩短。 直接筛选出具有生产稳定性好、菌种适应性强的出发菌株是很多研究的初始步 骤。传统的育种技术除直接筛选外，还包括诱变育种等。对a 淀粉酶合成培养基 发酵实验表明酶的合成多是在对数生长期进行的，并受分解代谢阻遏的调节【3 6 】。 对分解代谢阻遏很敏感的菌株，在可利用糖未耗尽和达到静止期前，不会大量地 形成耐高温洳淀粉酶。容易利用的碳源，如蔗糖、葡萄糖、果糖等，可以促进细 胞的呼吸和生长，但不利于产酶，代谢愈快的糖对产酶的抑制愈严重；而反之一 些能源利用性差的糖类，如糖原、乳糖、半乳糖、棉子糖和木糖等对生长不利， 却能促进产酶【3 7 】，1 3 8 1 。如果采用的菌株是突变株，有的可能消除了分解代谢阻遏， 比如地衣芽孢杆菌的无孢子突变株，由于解除了分解代谢阻遏，可以利用葡萄糖 作为碳源来生产。国外工业化上采用的多是代谢缓慢的碳源，如乳糖等。国内使 用的淀粉或淀粉原料具有诱导作用，可以避免分解代谢阻遏。采取诱变处理在一 定程度上打破了酶合成调控机制和酶分泌调节机制，通过反复多次诱变处理，筛 选抗代谢阻遏的突变株或者蛋白质分泌的突变株，在淀粉酶产生菌中逐渐积累有 效变异基因位点，以增加酶活力，从而获得了淀粉酶高产变异株三种方法尽管可 以获得酶活性较高的突变株，但其稳定性还差一些。由于菌种的诱变选育是一个 长期细致的工作，且诱变后正、负突变均同时存在，所以要获得酶活性有很大提 高的突变株，需进行大量、重复的诱变筛选工作，才有望获得理想的突变株。但 是，这些方法也有很大的盲目性，基因变异的程度也有限，特别是经过长期的诱 变处理，产量上升变得越来越缓慢，甚至无法继续提高，且在诱变育种过程中发 现了平台效应，进一步提高酶活性受到了限制。 培养环境会影响菌株的生长和耐高温舡淀粉酶的合成。生产性能优良的菌 7 硕士学位论文第一章综述 株，在合适的环境条件下，才能使其潜力充分表达出来。调控菌种的生长环境一 般从培养基的组分和生产工艺着手。选用较为粗放的培养基组分，及尽可能的选 择较为经济的培养条件，也会降低发酵成本，提高生产经济效益。所以，对生产 工艺和培养基成分的优化是必不可少的一步。 常规选育工作的繁琐、效率低，再加上常规诱变选育菌种存在一个平台效应， 现在人们更倾向于构建基因工程菌来实现菌种的改良，通过将耐高温洳淀粉酶基 因引入大肠杆菌【3 9 1 、枯草芽孢杆菌【删、酿酒酵母【4 、巴斯德毕赤酵母等来获得 酶的表达。这使得耐高温q 淀粉酶的生产菌株将不再限定于芽孢杆菌属。 大肠杆菌是使用最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基 因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操 作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物得基因表达调控机制和蛋白质翻译 后加工修饰能力，其产物往往形成没有活性的包涵体，须经过变性、复性等处理 才能应用。 为克服大肠杆菌表达系统的缺点，科研工作者发展了酵母表达系统。最先使 用的是酿酒酵母，它的优点是繁殖速度快，能高密度发酵，可进行蛋白质翻译后 加工和修饰。缺点是缺乏强有力的启动子，分泌效率差，表达菌株不够稳定，表 达质粒易于丢失等等。为克服酿酒酵母的缺陷，近年来又发展了表性优良的第二 代甲醇酵母表达系统巴斯德毕赤酵母表达系统。 巴斯德毕赤酵母表达系统是一类能以甲醇为惟一碳源和能量来源的酵母菌， 和其他真核、原核表达系统相比，它具有几个独特的优点【4 2 j ： ( 1 ) 高表达。它生长速度极快，而且能利用强有力的乙醇氧化酶( a o x l ) 基因 启动因子，严格调控外源蛋白的表达，其表达产量约为细菌表达系统产量的 1 0 1 0 0 倍。据报道，外源蛋白在毕赤酵母中表达的量每升可达到克以上水平，如 破伤毒素c 片段蛋白的产量可达1 2g l 。 ( 2 ) 高稳定。该系统的载体为整合型载体，它携带的外源目的基因随着染色 体的复制而复制，进行整合型表达，所以一般不会出现外源基因随着生长繁殖而 丢失的现象。 ( 3 ) 高分泌。它可利用多种信号引导外源基因分泌，其分泌量可达1 0g l 。 ( 4 ) 表达蛋白的后加工。毕赤酵母采用胞外分泌表达方式时，可对外源蛋白 进行翻译后加工，使表达的蛋白更接近于天然蛋白的构象与活性。 ( 5 ) 高密度发酵培养。毕赤酵母在甲醇诱导下连续发酵培养表达水平稳定， 易于放大培养，已有利用毕赤酵母大密度工业化高密度发酵工艺，且发酵罐中细 胞干重可达1 2 0g l 以上。 ( 6 ) 培养成本低。毕赤酵母营养要求低，培养基中不含蛋白，较廉价，生长 3 硕士学位论文 第一章综述 速度快，易于进行操作和培养，便于工业化生产。 ( 7 ) 产物易纯化。毕赤酵母自身分泌的蛋白非常少，十分有利于纯化。如表 达的重组水蛭素( h i r ) ，仅经过两步层析纯化，纯度就高达9 7 以上；表达的人 重组白细胞介素经过疏水层析、离子交换和凝胶过滤3 步纯化纯度即可达到 9 9 。 ( 8 ) 糖基化程度低。毕赤酵母中加到翻译蛋白上的糖链长度与酿酒酵母相比 短的多。 迄今，已用巴斯德毕赤酵母表达系统成功地表达了2 0 0 种以上的蛋白，包括 蛋白酶、受体、抗体、抗原、激素、含辅基的蛋白质以及可用于研究晶体结构的 蛋白质等。随着我国对毕赤酵母分子遗传学研究和认识的进一步深入和实践经验 的不断积累，人们会利用毕赤酵母生产出更多更好的来自人类、动物、植物和微 生物的活性蛋白，对整个生命科学和人类健康产生重大影响。同时我们也相信， 毕赤酵母表达系统必将在我国2 1 世纪基因工程真核表达产品产业化、商品化进 程中，发挥越来越大的作用。 1 5 本课题研究目的和内容 1 5 1 研究目的和意义 酶制剂工业是上世纪七十年代就己形成的一个重要产业，目前世界酶制剂总 产值达1 0 0 亿美元，我国的产值为1 0 0 亿人民币，并且随着其应用领域的不断扩 大及新酶种的不断开发，这一市场还将继续扩大。 我国酶制剂工业在经历8 0 9 0 年代的快速发展后成为世界酶制剂生产的主要 国家之一，但生产酶种较为简单，生产工艺相对落后，与国际同行业相比在酶的 产量和质量上都有着较大的差距。并且，国外研究方向多关注于分子水平上。经 过改造的转基因微生物，不但能在一天之内生产出十亿之多的相同拷贝，而且代 谢产物的品质和数量，大大地超过了传统的生化药物生产，创造了前所未有的生 产率。我们则多局限于生产工艺的改进。因此，我国酶制剂工业的发展必须依靠 新菌种的开发与生产工艺水平的提高，二者并重，才能在世界酶制剂工业中确立 自身地位。 本课题的研究目的是为了获得产耐高温q 淀粉酶的优良菌株，并通过培养条 件优化来实现工业中的扩大生产。同时希望通过分子生物学技术，实现耐高温洳 淀粉酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达，构建具有自己独立知识产权的优良的基 因工程菌，更进一步促进成果的产业化，创造良好的社会效益和经济效益。 9 硕士学位论文 第一章综述 1 5 2 研究内容 本论文以实验室所筛选的耐高温洳淀粉酶产生菌b a c i l l u ss u b t i l i sc 1 为研究 对象，主要从事以下几方面的研究。 ( 1 ) 耐高温a 淀粉酶产生菌的筛选和鉴定 ( 2 ) 耐高温a 淀粉酶的分离纯化及其酶学性质 ( 3 ) 响应面法优化b a c i l l u ss u b t i l i sc 1 培养条件 ( 4 ) 耐高温0 【淀粉酶的基因克隆 1 0 硕士学位论文第二章耐高温a 淀粉酶产生菌的筛选和鉴定 第二章耐高温0 【淀粉酶产生菌的筛选和鉴定 2 1 前言 产耐高温a 淀粉酶的菌种有许多，目前研究和应用较多的是芽孢杆菌属 ( b a c i l l u s ) 4 3 1 ，常用的是地衣芽孢杆( b a c i l l u sl i c h e n i n f o r m i s ) 、枯草芽孢杆菌 ( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 、嗜热芽孢杆菌( b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u s ) 等，国外生产高温淀 粉酶所用菌株也多数是芽孢杆菌属，但是所用菌株产酶性能并不相同，应用于造 纸、酿酒、纺织等不同行业的生产。另外，也有关于嗜热细菌和古菌的研究【删， 不过它们最适生长温度较高，多为8 0 以上，生长条件较为苛刻，并不适合工 业化生产的要求。因此常温菌株芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 仍然是研究的重点。 2 2 实验材料 2 2 1 样品来源 样品来自枯草堆、农田积肥、下水道污泥等富含淀粉的土样中。 2 2 2 培养基 基础培养基：蛋白胨1 0g t , ，可溶性淀粉1 0e t , ，酵母粉5g l ，n a c i1 0g l ， p h 7 0 。 筛选培养基：在基础培养基的基础上，加入2 的琼脂粉，0 0 1 的曲利本 蓝【4 5 1 。 其它糖或醇培养基：( n h 4 ) 2 h p 0 41g ；酵母膏o 2g ；m g s 0 4 7 h 2 00 2g ； k c l0 2g ；糖或醇1 0g ；琼脂5g ；o 4 溴甲酚紫乙醇液2 m l ：蒸馏水1 0 0 0m l ， p h6 8 7 0 。糖或醇为葡萄糖、甘露醇等。分装试管，每管装1 3 高。 甲基红( m r ) 试验和v p 试验培养基：蛋白胨5g ；葡萄糖5g ；n a c i5g ； 蒸馏水1 0 0 0n l l ；每管装l 3 高度，1 1 5 灭菌2 0r a i n 。 硝酸盐还原试验培养基：蛋白胨1 0g ；牛肉膏3g ；n a c i5 9 ；k n 0 31g ； 蒸馏水1 0 0 0m l ，p h7 2 7 4 ，分装试管，1 2 1 灭菌2 0r a i n 。 柠檬酸盐、丙酸盐利用试验培养基( s i m m o n s 氏培养基) ：柠檬酸钠或丙酸钠 2g ；n a c i5g ；m g s 0 4 7 h 2 00 2 9 ；( n h 4 ) 2 h p 0 4lg ；k 2 h p 0 4 。3 h 2 0lg ；1 溴 百里酚蓝水溶液1 0m l ；琼脂2 0g ；蒸馏水1 0 0 0m l 。除指示剂外加热溶解，调 节p i - i6 8 6 9 ，再加入指示剂培养基分装试管，1 2 1 灭菌2 0r a i n 后摆成斜面。 硕士学位论文第二章耐高温q - 淀粉酶产生菌的筛选和鉴定 明胶水解试验培养基：蛋白胨5g ；明胶1 2 0g ；蒸馏水1 0 0 0m l 。p h7 2 7 4 ， 分装试管，每管装l 3 管高。1 2 1 灭菌2 0m i n 。 耐盐性试验培养基：以牛肉膏蛋白胨培养基根据鉴定需要，加入不同浓度的 n a c i 溶液。1 2 1 灭菌2 0m i n 。培养基要求十分澄清。 2 2 3 实验试剂 蛋白胨为生化试剂，购自上海市宝典化工有限公司；酵母粉为生化试剂，购 自中科院上海昆虫科技开发有限公司康乐