（动物学专业论文）斜带石斑鱼胚后消化系统和淋巴器官生长发育的研究.pdf

斜带石斑鱼膦后消化系统和淋巴器官生长发肖的研究 摘要 瓣带蠢斑垒( 勋翩妒& # 是醛c o i o i d e s ) 燕我国嘉方久工养篷蕊重蘩海承缀济鱼类。本 研究以斜带石斑鱼为材料，围绕其胚后消化系统的发育结构、主要消化酶的活性以 及淋巴嚣官的个体发育和生长等方面避行了研究。根据实验结莱，综合分析，主要 研究结果如下： 1 利用形态学和遗续组织切片技术，系统地对出麒后1 6 0 d 的斜带石斑鱼各期 仔鱼、壤鱼和幼鱼豹瀵他系统鼹发育进行了组织学蕊察，撼述了其消化器宫发育过 程和组织学结构特征。研究表明：在实验水温为2 2 o 2 7 8 ，孵化后第4 d ，上下颁 形成，郛黄囊被嗷浚，瀵纯系绞骥显分化藏食i 薮、霉、强、壹麟默及黪照、疆囊帮 胰脏等，鱼体由内源性营养转向外源性摄食营养，表明其消化系统的形态变化与食 性的变化裙适或。诧磊隧着鱼体静生长发育，葵涪纯系统胰功熊帮结构上逐步完善 成熟。胰脏在出膜后第4 d 出现，是和肝脏相互分开的一个独立的器官，但是发肖到 第3 5 6 0 d ，位于肠遭屠部的胰脏组织内出现许多大空泡；发育剐成鱼时，胰脏难以 分辨。 2 采用酶学的方法，研究了斜带石斑鱼出膜后1 6 0 d 仔稚幼鱼不同发育阶段的 鬟自酶稳淀粉酶活2 睦戆蹩纯。磷究结果菠明：攀期 子象已具褰一定数豢囊酶鞠淀粉 酶活性，仔鱼、稚鱼和幼鱼期鬣白酶均形成一个峰值，即在整个仔鱼阶段蛋白酶活 性爱予鞍低承平，饔仔焦浇赣瞳，蛋鑫游活毪黎鼷舞麓，稚垒期蛋叁瓣活淫不叛罐 强，2 7 豳龄达峰值，幼鱼期4 5 翻龄时达峰值：淀粉酶活性在仔鱼期处谯相对较低水 平，割了仔鱼晚期和幼鱼赣急蒯增加，雨在稚建期保持稽对稳定的承平；说明蛋备 媾和淀粉酶活性在仔鱼、稚鱼、幼鱼发育关键时期，即变态初期和变态末期时变化 较大；骚白酶和淀粉酶活性变化的总趋势是随着消化系统的逐步发育而逐渐增强， 毽楚巷不围消化组织器寓豹分化，蛋自黪和淀粉酶活性艴变化水平又鸯各自的特点， 表明其仔鱼、稚鱼和幼鱼消化酶活性的变化与消化系统形态结构的分化以及食性密 秘相关。 3 研究斜带石斑敛幼鱼消化系统备部位主要消化酶的活性。结果表明斜带石斑 ! 些查鲎竖主兰垡熊苎墨是茎 鱼幼鱼消化系统各部位主要蛋白酶和淀粉酶的活性强度不嗣，其蛋白酶活性大小为 胃 前肠 中肠 肝胰脏 后肠；而淀粉酶的活性大小则为前肠 中肠 肝胰脏 后肠 置。兹肠的蛋自酶溪力仅次予胃，藤于中肠、翳胰脏翻后强；肠邀淀粉酶熬活力则 显著地高于其它消化器官( p f o r e g u t m i d g u t h a p a t o p a n c r e a s h i n d g u t t h ea m y l a s ea c t i v i t ys e q u e n c ei nd i f f e r e n to r g a n si sf o r e g u t m i d g u t h a p a t o p a n c r e a s h i n d g u t s t o m a c h i tw a si n v e s t i g a t e dt h a t t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ea n dp ho f p r o t e a s ea n da m y l a s ea c t i v i t yi ne c o i o i d e s t h er e s u l t so f p r o t e a s ea c t i v i t i e ss h o w e d t h a tt h eo p t i m u m t e m p e r a t u r e si ns t o m a c h ，i n t e s t i n ea n dh a p a t o p a n c r e a sf o rp r o t e a s ew e r e3 7 c ，5 0 ca n d3 t c ，a n d t h e o p t i m u mp h s w e r e2 2 ，1 0 0a n d2 2 ，r e s p e c t i v e l y t h eg a s t r i ca m y l a s es h o w e dam a x i m u ma c t i v i t ya t 3 7 c t h eh a p a t o p a n c r e a sa t3 7 r e s p e c t i v e l y b u tt h ei n t e s t i n a la m y l a s ea c t i v i t yi n c r e a s e dw i t ht h e t e m p e r a t u r ei n c r e a s i n g t h eo p t i m u mp h sf o ra m y l a s ea c t i v i t i e sw e r ea l l 7 0i nt h es t o m a c h ，t h e h a p a t o p a n c r e a sa n d t h ei n t e s t i n e t h ep r o t e a s ea c t i v i t yi nt h ef o r e g u tw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a ni ni t s m i d g u t h e p a t o p a n c r e a sa n dh i n di n t e s t i n e ，b u tal i t t l e l o w e rt h a nt h es t o m a c h ( p 草食性鱼类【1 7 】。而吴婷婷等【4 0 峙旨 出鳜鱼、青鱼、草鱼、鲤、鲫、鲢肝脏蛋白酶活性低于肠蛋白酶。鲢、鳙的肝胰脏 蛋白酶活性明显大于其它组织器官i 。蛋白酶以没有活性的酶原颗粒形式储存在胰 脏细胞内【4 2 】。倪寿文等【3 8 】认为不同的鱼类分泌蛋白酶的部位和形式不同：有些鱼的 肠道内主要分泌肠致活酶，以激活肝胰脏分泌蛋白酶原，蛋白酶原经肠致活酶激活 后，酶活性明显提高，且高于肠道中蛋白酶的活性。 2 3 肠道蛋白酶 肠粘膜可以分泌有活性的蛋白酶和肠致活酶，肠致活酶的作用就是激活胰蛋白 酶原。另外，肠道内还有来源于肝胰脏、幽门垂等器官分泌的胰蛋白酶【2 引，这样使 肠蛋白酶的研究较为复杂。黄耀桐等 蚓认为，有胃鱼类和无胃鱼类肠蛋白酶最适p h 是不同的，不同食性的鱼类最适p h 也有一定的差异。淡水鱼类肠蛋白酶最适p h 大都 在6 5 9 5 之间“1 ，多为微碱性。海水鱼类如尖吻平鲇、金头鲷、大菱鲆的肠蛋 白酶最适p h 在9 5 1 0 0 之间，呈碱性【删。倪寿文等 3 8 】认为不同食性的鱼类( 肉食 性、杂食性、草食性等) 以及有胃鱼类( 鲑鳟和罗非鱼) 和无胃鱼类( 草鱼等鲤科 鱼类) 的肠蛋白酶最适p h 值差异不大，即大鳞大麻哈鱼、虹鳟、鲑鱼和莫桑比克罗 非鱼等4 种有胃鱼类的肠蛋白酶最适p h 值为7 0 9 5 ，草鱼、鲤等1 0 种无胃鱼类的 肠蛋白酶最适p h 值为6 5 9 0 ，但有胃鱼类中鲑鳟等冷水性鱼的最适p h 值偏高( 9 0 9 5 ) ，热带鱼类莫桑比克罗非鱼的则偏低( 7 0 ) 。肠道蛋白酶的活性还受到鱼类饱食 情况和饲料蛋白质水平的影响，例如黄耀桐等1 39 j 指出，草鱼( c t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l u s ) 肠道蛋白酶在蛋白质为3 2 4 0 范围内，随蛋白质的增加活性增强。黄峰等m 】手旨 出，饲料性质不同，肠蛋白酶的活性也有差异。投喂煮熟的和活饵料，蛋白酶活性 中山大学博_ l 学位论文吴余英 增强；连日投饵，酶的生成量常常保持相当高的水平。m u n i l l a - m o r a n 等f 2 8 j 研究结果 表明，大菱鲆高的蛋白酶活性水平是由于活饵料刺激其肠道产生的。h i d a l g o 等h 5 1 比较研究了六种鱼：大麻哈鱼( o n c o ，砂h c h u sm y m s # 、金头鲷、欧洲鳗鲡似n g u i l l a a n g u i l l a ) 、鲤鱼、鲫( c a r a s s i u sa u r a t u s ) 、丁觞( t i n c at i n c a ) 的肝脏、胆汁和消化道的蛋 白水解酶。 总而言之，鱼类肠道蛋白酶活性受多种因素的影响，而蛋白酶活性又直接影响 鱼类营养物质吸收利用的程度，从而影响鱼类的生长发育。 3 鱼类淀粉酶 鱼类消化道中，发现各种碳水化合物分解酶，主要是淀粉酶。在胃内、肝胰脏 和肠道内存在淀粉酶。获野珍吉【3 4 1 认为在幽门垂和肠道内的活性较高。 有关鱼类胃内淀粉酶的研究报道较少，但是胃内肯定存在淀粉酶4 4 ，4 6 ，4 7 , 4 8 ，4 9 1 。 硬骨鱼类的胃内淀粉酶最适p h 在5 0 7 0 之间，为弱酸性或中性。一般胃淀粉酶的 活性较低，低于其它消化器官，如肠道、肝胰脏等器官的淀粉酶活性；此外胃内p h 较低，为较强的酸性范围，所以一般认为淀粉酶在胃内的消化作用微乎其微。 鱼类肝胰脏和肠道存在着淀粉酶，相关的研究报道较多，如红大麻哈鱼 ( o n c o r h y n c h “s h p r k a ) 【4 6 1 、草鱼h o ，4 2 - 5 0 1 、 鳜鱼( s i n i p e r c a c h u a 船i ) 、青鱼 ( m y l o p h a r y n g o d o n p i c e u s ) 、鲤鱼、鲫、鲢鱼( 毋p 印 胁砌f c 矗f 炉m o l i t r i x ) h 仉5 叭、鳙鱼 似r 括t i c h t h y s n o b i l 括) 、南方大口鲇( s i l u r u sm e r i d i o n a l i s ) 、长吻锍( l e i o c a s s i s l o n g i r o s t r i s ) 【4 9 - 5 0 】等；海水鲷科鱼类：赤鲷( p a g r u sp a g r u s ) ，绯小鲷( p a g e l l u s e r y t r h i n u s l ，黑斑小鲷pb o g a r a v e o ，牛眼鲷( b o o p sb o o p s ) 丰t l 尾斑重牙鲷( d i p l o d u s 册厅“l a r i s ) s q 等。他们认为：淀粉酶主要是由肝胰脏分泌的，肝胰脏是淀粉酶生成的 中心器官，它分泌机能的强弱直接影响鱼类对食物中淀粉的消化能力。但不同的鱼 类分泌器官亦有差别，有的鱼类是由肝胰脏一种器官分泌的，有的鱼类肠道也是分 泌淀粉酶的重要器官【5 ( ) l 。以上研究结果表明：淀粉酶最适p h 在5 0 8 o 之间，从弱 酸性到弱碱性，平均值近中性，但大多在中性范围内，不同食性以及有胃鱼类和无 胃鱼类淀粉酶最适p h 差异不大；对热不稳定，其活性要比哺乳动物低得多，最适温 斜带石斑鱼胚后消化系统和淋巴器官生长发育的研究 度在2 0 4 0 。 k u z m i n a i s 2 研究了年龄对几种淡水鱼类消化酶的影响，包括白斑狗鱼( e s o x l u c i u s ) ，鲈鱼，欧鳊臼b r a m i sb r a m a ) ，拟鲤，指出随着鱼体年龄的增长，糖酶的活 性比蛋白酶和碱性磷酸酶的活性变化大，这种变化受鱼类食性改变的影响。h i d a l g o 等4 5 1 比较研究了六种鱼：大麻哈鱼、会头鲷、欧洲鳗鲡、鲤鱼、鲫鱼、丁麟的肝脏、 胆汁和消化道的消化酶，再次证明：有胃的肉食性鱼具有较低的淀粉酶活性，无胃 的杂食性鱼具有较高的淀粉酶活性：淀粉酶活性依赖于鱼种的天然食性，草食性和 杂食性鱼类比肉食性鱼类具有较高的淀粉酶活性。 总之，鱼类各种消化器官均存在淀粉酶，淀粉酶活性的强弱，因鱼的种类、消 化器官、食性以及年龄的不同而有所不同1 5 2 5 3 1 o 4 消化酶在鱼类肠道中的分布以及食性的关系 动物的食性因种类不同而异，即使是同一种类，在不同的环境条件和不同的发 育阶段也不尽相同，但动物的食性总是和其本身的消化酶组成状况密切相关”。鱼 类的食性与消化器官组织结构和消化机能是相适应的，消化器官组织结构不同，所 承担的消化机能不同，因而消化酶的活性也呈明显的差异。黄耀桐等【39 】研究草鱼肠 道和肝胰脏蛋白酶活性与饵料的关系，指出饲料蛋白质在3 2 4 0 范围内，肝胰 脏和肠道蛋白酶活性均随饵料蛋白质等量的增高而升高，肠道蛋白酶活性以后肠较 高，前中肠次之。吴婷婷等m 1 研究，鳜鱼、青鱼、鲤鱼、鲫、草鱼和鲢鱼等消化酶 后指出，蛋白酶活性与食性有关，即肉食性的蛋白酶活性明显高于杂食性。鳜鱼、 青鱼、草鱼、鲤、鲫、鲢肝脏蛋白酶活性低于肠蛋白酶，鳜鱼、鲢的肠蛋白酶活性 由前肠向后肠递减，而青鱼、鲤、草鱼的肠蛋白酶活性则由前肠向后肠递增，但田 丽霞掣5 4 1 和倪寿文等4 6 1 认为草鱼的肠蛋白酶活性由前向后递减。南方大口鲶蛋白酶 活性也是由前向后递减h8 1 。k a w a i 等雌5 5 1 的研究也证明胡鲇( c l a r i a sb a t r a c h u s ) 和鲤 鱼蛋白酶活性也随饲料蛋白质的增加而升高。关于肠道蛋白酶的分布，不同的研究 有不同的结果，但是可以肯定的是：不论是有胃鱼类还是无胃鱼类以及鱼类的食性 如何，其前肠是消化蛋白质的主要场所。一般认为，肉食性鱼类含有较高的脂肪酶 中山大学博士学位论文吴金英 和蛋白酶，而草食性鱼类则含有较高的淀粉酶，这与食物本身的组成成分相对应。 鱼类淀粉酶的活性分布也明显与食性有关。倪寿文等5 0 1 研究草鱼、鲤、鲢、鳙、 尼罗罗非鱼( t i l a p i a n i l o t i c a ) 淀粉酶活性，认为草食性鱼类具有较强的淀粉酶活性，而 肉食性鱼类最弱。但是，鱼类的消化酶对饵料的成分组成也有适应一t , 生t 3 4 1 。用碳水化 合物多的饵料饲养罗非鱼后，淀粉酶的活性增加，如用含蛋白质高的饲料来饲养， 则胰蛋白酶的活性提高。有学者调查了改变饵料组成后，鲤鱼、虹鳟、真鲷和五条 鲕饲养过程中的消化酶活性变化，发现杂食性的鲤鱼对于饵料中所含的碳水化合物 的量和质的适应性高于其他鱼类。由此可见，这种潜在的适应性因鱼种而异【3 4 1 。 另外，关于肠道淀粉酶的分布，不同的研究有不同的结果。鲤、黄颡鱼 f p e l t e o b a g r “5 t l u v i d r a c o ) 【4 3 1 4 7 1 、草鱼州等的淀粉酶，后肠活性最强而前肠最弱。南方 大口鲶、长吻婉淀粉酶活性由前向后递减1 4 0 1 。倪寿文等【4 8 j 与吴婷婷等 4 0 1 发现草鱼肝 胰脏淀粉酶活性高于肠的，最适p h 为6 4 。同时倪寿文等【50 j 研究草鱼、鲤、鲢、鳙、 尼罗非鲫淀粉酶活性分布情况指出，淀粉酶活性在肠道分布有2 种类型，草鱼、鲤 鱼分布后肠活性最强而前肠最弱，其它3 种鱼中肠较高。从现有的研究资料看，淀 粉酶在肠道分布因鱼而异，与鱼类的摄食情况有关。通过这些研究可以清楚地了解 鱼类肠道是何部位消化吸收何种食物营养成分，同时也为研究消化酶的分泌、贮存 机制提供了依据。 总而言之，有什么样的食性，就有什么样的消化酶分布和组成，而且消化酶活 力大小变化程度与食物组成的变化也有一定的相关性。 5 影响鱼类消化酶酶促反应的主要因素 酶是催化生物化学反应的一类特殊的蛋白质，具有催化一定化学反应的能力，生 物体中的化学反应很少是在没有催化剂的情况下进行的。酶的突出特征是高度催化 能力和专一性，它的活性可以被调节。酶在生物体内起着非常独特和关键的作用。在 生物体系中，酶的含量很少，即使经过初步提纯的酶制剂，其中也含有不少杂质， 因此，不能用一般化学分析法定量，而只能根据酶活力的多少来判断酶的量1 5 “。消 化酶是酶的一种，主要指由消化腺和消化系统分泌的起营养消化作用的酶类，具有酶 1 0 斜带石斑鱼胚后消化系统和淋巴器官生艮荧育的研究 所有的特征。酶的活性受到许多因素的影响，其中温度和p h 对酶活性的影响较大， 而且酶的蛋白质本性决定了温度和p h 值是酶促反应的两个重要影响因素，酶的最适 温度和最适p h 值是酶的重要理化性质1 3 9 1 。酶的最适温度有的高于鱼的致死温度上 限，因此，在池塘温度范围内，许多鱼在较高温度下具有较高酶的分泌量与活性f ”i 。 在一般情况下，鱼类的各种消化酶活性不可能达到最高状态，这也是鱼类对食物消 化速度较慢的原因之一。大多数鱼的消化酶活性有温度补偿作用。处于同一温度下， 驯化于较低温度的鱼，酶分泌量较多于驯化于较高温度的鱼。同时也发现，冷水性 鱼类的鲑鳟鱼类的消化酶在较低温度时比暖水性鱼类的鲫、日本鳗鲡和香鱼等在同 样的低温下，酶的活性较高【1 7 1 。 朗：多学者对鱼类消化酶的最适p h 和最适温度进行了研究，如u y s 等 5 8 】研究了 鲇鱼( s i l u r u sa s o t u s ) 不同组织器官内消化酶的最适p h 值和最适温度；b i t t e r l i c h l 5 7 | 研 究了鳙鱼和鲢鱼消化酶的酶促反应的最适p h 值；m u n i l l a - m o r a n 等对尖吻平鼬、金 头鲷、大菱鲆消化酶的最适p h 值和最适温度进行研究川1 ；倪寿文等m4 2 1 研究鲤、 草、鲢、鳙、尼罗罗非鱼( t i l a p i a n h o 盯c a ) 的肠和肝胰脏的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活 性及其最适p h 值。桂远明等【6 0 j 比较研究了温度对草、鲤、鲢、鳙主要消化酶活性的 影响。方之平等研究了温度对彭泽鲫( c a r a s s i u sa u r a t u s p e n g z e ) 蛋白酶、淀粉酶活 性的影响，指出在一定温度范围内，酶的活力随温度的升高而加快。综合以上消化 酶最适温度和p h 值的研究可归纳为：不同生物种类，不同的组织器官以及不同的酶 类具有不同的最适p h 和最适温度，同时最适p h 和最适温度随不同的反应条件而有 所不同。最适p h 值和最适温度与生物本身消化道p h 值及生活温度常常不一致，甚 至有极大的差别，消化酶起作用时的最适p h 值不仅取决于酶活性的性质，且与底物 和介质等有关。反应底物和介质会对不同的消化器官有不同的影响，如n a c i 的浓度 对胃蛋白酶的活性有抑止作用，而对肠道的蛋白酶没有影响【3 7j 。消化速度受消化酶 的浓度、底物、温度和作用时间的影响【吲。通常生物消化道内的p h 值条件能足够地 满足其不同种类消化酶活力的表现。最适温度的测定一般是在实验规定的反应时间 条件下进行的，实际上，酶在生物体内所起的作用时间会很长，所以最适温度只是 在一定条件下才有意义，但是也能在一定程度上反映了消化酶的耐热性，并可用来 比较不同种酶活力的大小p “。 中山大学博十学位论义吴金英 第二节鱼类免疫淋巴器官的发育及其生长的研究 同高等脊椎动物一样，鱼类也是通过免疫系统来抵御外来病原生物的侵害，通 过非特异性和特异性的免疫防御机制来维持机体的正常功能及自身内环境的稳定。 但是，近年来鱼类病害发生频繁，其中某些疾病给水产养殖业造成灾难性的危害， 这就使得免疫防治技术在鱼病防治中呈现出日趋广阔的应用前景。因此，对鱼类特 别是重要的经济鱼类免疫系统的研究受到国内外学者的广泛关注，如免疫淋巴器官、 组织和细胞的基础生物学已引起免疫学家们的高度重视。 1 鱼类免疫组织和细胞的研究 鱼类的免疫功能还没有象人和高等哺乳动物那样发达，但鱼类已经具备了一个 相对完善的免疫系统，同高等脊椎动物一样，在抵抗不良环境的影响、保护鱼体健 康的过程中发挥着重要的作用。鱼类的免疫系统是鱼体执行免疫功能的机构，是机 体识别和消除“异物”的一个防卫系统，是产生免疫应答的物质基础。它的重要功 能是防御、自身稳定与免疫鉴别三大方面。 鱼类的免疫系统由免疫组织和器官，免疫细胞，体液免疫因子三部分组成。在 高等脊椎动物中，淋巴免疫组织器官和细胞是发生特异性防御机能的重要组织学基 础。同样，免疫组织器官和细胞也是鱼类防御系统的基础，为鱼体防止病原侵入提 供了最初的防线，体液免疫因子作为免疫应答的效应分子对病原具有直接的防御作 用【6 3 1 。 1 1 免疫组织和器官 免疫应答是在鱼体器官及其细胞组织之间一种协调功能。这些器官的功能实验 证明适于生成特异性抗体，然后最终破坏和排除入侵物质，免疫组织是免疫细胞发 生、分化、成熟、定居和增殖以及产生免疫应答的场所【6 3 1 。大多数的抗体已查明是 由集中于特定器官中或游离于循环系统中的淋巴细胞产生的，抗体的激发及其释出 1 2 斜带石斑鱼胚后消化系统和淋巴器官生长发育的研究 涉及许多器官。 人体中和抗体产生与激发有关的器官，包括胸腺、淋巴结和骨髓等，硬骨鱼类 与哺乳动物在免疫器官组成上的主要区别在于鱼类没有骨髓和淋巴结。硬骨鱼类的 免疫组织和器官包括胸腺、肾脏、脾脏和粘膜淋巴组织( m u c o s a a s s o c i a t e dl y m p h o i d t i s s u e ，m a l t ) 5 l 。胸腺、肾脏和脾脏是鱼类最主要的免疫器官。粘膜淋巴组织同样 也是其免疫系统的重要组成部分 6 。通俗而言，免疫器官也称为淋巴器官。 1 1 1 胸腺( t h y m u s ) 从比较生物学的研究观察到，没有胸腺的无脊椎动物，都不具备免疫反应能力。 具有原始胸腺的八目鳗，开始具有特异的免疫反应。进化到鱼类，从真骨鱼类丌始 才有胸腺的形成，鳃区才出现了胸腺，在受到抗原刺激后，有特异的淋巴细胞增殖， 并出现再次免疫应答反应。再次免疫应答现象只能在具有胸腺的动物才能看到。无 脊椎动物体内虽有吞噬包裹细菌的能力，但无再次应答能力，因此，这类动物不能 称为具有免疫反应能力【6 7 1 。从系统发生看，到了低等鱼类( 七鳃鳗科) 才出现淋巴细 胞、淋巴组织和原始的上皮性胸腺旧6 8 1o 以上事实表明，动物随着进化，出现了胸 腺以后，才获得了真正的免疫反应能力 6 7 i 。胸腺的功能，一般认为和淋巴细胞的激 发作用和特异性抗体的产生有关，是鱼类的中枢免疫器官。 鱼类胸腺起源于胚胎发育的咽囊，在免疫组织的发生过程中最先获得成熟淋巴 细胞，胸腺一般成对位于鳃腔背后方，一个不十分隐蔽的位置，胸腺基底是致密结 缔组织，表面仅靠一层上皮细胞膜与咽腔相隔，可有效地防止了抗原性或非抗原性 物质通过咽腔进入胸腺实质阻6 9 ，7 0 , 7 ”，且这一层上皮细胞膜上有一些直径大约2 0 微 米的小洞，其作用尚不清楚，可能是抗原进入胸腺的一个通道 6 9 7 孙。上皮深入实质 形成网络，将胸腺分为内区和外区，其中内区和外区在组织结构上分别类似于高等 脊椎动物胸腺的髓质和皮质。鱼类胸腺是由淋巴细胞、淋巴母细胞、浆母细胞、分 泌样细胞以及其它游离问充质细胞( 巨噬细胞、肌样细胞和肥大细胞等) 组成，它们 分布于由网状上皮细胞形成的基质网孔中。外区内一般细胞密度大，有大量的胸腺 细胞( 淋巴细胞) 、巨噬细胞、浆细胞等，以及少量的上皮细胞；内区的细胞密度较 中山大学博上学位论文吴金英 低，主要为支持网眼的上皮细胞，如类肌细胞和囊细胞等，以及少量的胸腺细胞( 淋 巴细胞) 构成。胸腺内区和外区为胸腺细胞的发育、分化和成熟提供微环境 7 2 1 。 有研究者认为：上皮细胞在胸腺的成熟和特异性免疫功能的获得方面有某些作 用1 7 驯；内区内血管发育良好可能预示存在“血胸腺屏障”。血管是胸腺与其他器 官相连的唯一通道。另外，鱼类胸腺随着性成熟和年龄的增长，或者在环境胁迫和 激素等外部刺激作用下可发生退化n ”1 ，在一年内各月份间胸腺细胞的数量、胸腺 大小及其各区间的比例也呈现出规律性的变化m 7 5 1 ，细胞存在编程性死亡过程7 6 1 。 而有关胸腺细胞与上皮细胞之间关系的研究还有待于深入。 与哺乳动物免疫学知识相比，人们对鱼类胸腺细胞功能的研究还很肤浅，与其 他有颌脊椎动物一样，聃腺是鱼类t 细胞分化、增生、成熟的重要场所，在鱼类的 细胞免疫和体液免疫方面发挥着重要作用l ：7 3 7 7 , 7 8 1 。胸腺功能的研究主要是切除胸腺 实验。早期切除胸腺在技术上有一定的难度，即使在成鱼，不同种类的情况也不同， 如切除虹鳟鱼的胸腺就要比切除鲤鱼的胸腺要容易得多，且切除实验一般要在几个 月之后才能检验。此外，如果切除不彻底，常常造成实验结果的不雕”j 。许多实验 可以证明胸腺是鱼类的中枢免疫器官。如切除虹鳟鱼胸腺后，可以引起脾脏淋巴细 胞数量的减少7 9 1 。利用放射性同位素标记虹鳟鱼的胸腺，可以在脾脏内发现大量的 胸腺细胞，在肾脏内有少量的胸腺细胞瞄。 在鱼类的早期发育阶段，胸腺在免疫器官个体发生过程中具有特别重要的意义， 是第一个淋巴化的免疫器官。 1 1 2 肾脏( k i d n e y l 鱼类l 肾脏位于体腔背面，紧贴在脊柱下面，一般为紫红色。硬骨鱼类的肾脏是 一个多功能的器官。肾脏不仅有泌尿和调节渗透压的结构，而且还有大量的造血和 吞噬细胞。一般认为，鱼类肾脏分为头肾( p r o n e p h r o s o r h e a d - k i d n e y ) ：f f i 体肾 f b o d y - k i d n e y ) 两部分。头肾位于围心腹腔隔膜的前背方，以围心腹腔隔膜为界限，围 心腹腔隔膜前为头肾，围心腹腔隔膜后为肾脏，即头肾位于肾脏的前部，主要由淋 巴造血组织组成，其形态因鱼类种类不同而不同障”。鱼类头肾在免疫组织器官个体 斜带辅斑鱼胚磁消化系统和l 琳巴器官生睦发育的研究 发育过程中，一般在淡水鱼类中鼹继胸腺之后第二个发商的免疫器官，在海水鱼类 怒第一个发育的兔疫器官，比脾脏早发育。在肾脏的发育早期，整个肾脏都参与免 疫绷飕和早期的免疫反鹰，廷着惫类的生长，头蟹逐濒失去接泄功能，主要为造血 组织器官，执行兔疫功能，成为次级淋嘴( s e e o n d a r yl y m p h o i d o r g a n ) 1 8 甜。体肾( 中 鸳鞫磊鹭) 在头弩貔螽部，有丈量戆努警秘瞧警珠，是盛渡过滤与泌稼熬鬟要缝戏裁 分，作为排泄器官，其管间区组织在造m 和免疫方面也具有一定的作用【6 3 头脊实质爱国膂基屡稻漭毫逡矗缮织稔成。鬻基震怒指阚菰内皮系统箨& 豁，醐， 包括内皮细胞、纤维细胞、成纤维细胞和具吞噬功能的网状细胞，它们都是非淋巴 细胞。肾麓质除具有支持造血组缓、提供免疫反应微环境的功能外，在清除坏歹e 缩 腿方面也起着重要作用1 8 列；头肾淋巴造血组织内包括不网发育阶段的血细胞，即红 细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、颗粒细胞和血稔细胞等，参与特异性与非 特异性免疫爱瘟8 7 】。越羚，头蟹还存在黑色素题噬缨骢，蠹含有黑色素、盘铁黄 蛋白和脂褐素等组分1 8 踟。黑色素巨嗽细胞常常聚集成黑色素巨噬细胞中心 ( m e t a n o m a c r o p h a g ec e n t e r , v i m c ) ，英功现在溺不努清楚删。国予黑彀素匿噬绸 胞可以捕获抗体和维持抗体相当长的一段时间，可能具有免疫记忆的功能 9 0 1 。 头臀楚不依赖抗原嗣激可鞋产生红缅艟和b 辩誊罄细溅等缩稔，是重簧的造蠢器 官f 6 3 9 0 1 ，同时也怒免疫细胞的发源地，特刖是8 一淋巴细胞的增殖分化的中心，相当 予哺乳动物的骨髓；另一方面，头肾受抗原刺激盾，头衙和体肾的细胞鄹会岛现增 生，利用溶血空斑葶丑免疫憋标技术，迁实头肾和体肾中郝存在着抗体产生细胞，是 谰骨龟类抗体产生的主要场所6 3 ，8 孙，在特异性免疫方面越着重要作用，相当于哺乳 动糖豹游毯结。瓣此可以滋，硬嚣鱼类头弩其寿炎议睫戮动烧中攮免疫辫富及努淄 兔疫器官的双重功能盼8 9 , 9 烈。 1 1 3 脾脏( s p l e e n ) 有领邀类才滋现真正的脾脏，一般认为脾脏怒红细飚、中校自细胞鞠粒性自缁 胞产生、贮存和成熟的主要器官 6 4 1 。脾脏在腹腔肠系膜上，一般为暗红德，有被膜 包被，是髓类免疫系统中最后发生的器官 8 2 】。 中山火学博士学位论文吴金英 软骨鱼类的脾脏较大，内含椭圆体，主要是一个造血器官，脾脏实质由脾小梁 分成内侧的红髓和外周的白髓。硬骨鱼类脾脏没有分化为明显的红髓和白髓，但同 时具有造血和免疫功能。与头肾相比，脾脏在体液免疫反应中处于相对次要的地位， 而且受抗原刺激后其增殖反应以弥散的方式发生在整个器官上【7 7 ，7 9 1 。红髓由网状细 胞等网络着血窦内的各种免疫细胞，如巨噬细胞和淋巴细胞；白髓中则分散着大量 浆细胞。大多数硬骨鱼类脾内均有明显的椭圆体，椭圆体是静脉终端7 0 ，9 3 1 ，具有滤 过、捕集血液内各种颗粒性和非颗粒性物质的功能 6 6 , 9 4 。硬骨鱼类受到免疫接种后， 其脾、肾和肝等器官中的黑色素巨噬细胞增多，并与淋巴细胞和抗体生成细胞聚集 在一起形成黑色素巨噬细胞中一心，主要功能是吞噬细胞碎片，捕获不同颗粒和非颗 粒物质叫l 。鱼类脾脏与高等脊椎动物脾脏在组织与功能上相似 1 。象肾脏一样，脾 脏在造血和免疫反应方面起着重要的作用瞄“。 1 1 4 粘膜淋巴组织( m u e o s a - a s s o c i a t e dl y m p h o i dt i s s u e ，m a l t ) 鱼类具有分散的粘膜样淋巴组织( m a l t ) 。粘膜淋巴组织( m a l t ) 在鱼类体液和细 胞免疫中的作用，目前己引起免疫学家的重视【6 3 j 。粘膜样淋巴组织包括皮肤、鳃和 消化道等，这些分散的淋巴组织还不具备完整的淋巴结构【8 2 】，是预防病原菌入侵鱼 类的第一道防线和门户，在其上皮组织中存在着白细胞，包括淋巴细胞、巨噬细胞、 各种粒细胞和浆细胞等郾1 ，参与局部免疫反应( 1 0 c a l si m m u n er e s p o n s e s ) 【。当鱼体 受到抗原刺激时，巨噬细胞可以对抗原进行处理和呈递，抗体分泌细胞( a n t i b o d y s e c r e t i n gc e l l ，a s c ) 会分泌特异性抗体，与粘液中溶菌酶和补体等非特异性的保护物 质一道组成抵御病原微生物感染的有效防线6 3 ，6 6 1 。鱼类肠道的白细胞存在于固有膜 致密结缔组织层网腔，也见于粘膜层上皮9 饥。皮肤和鳃中也存在白细胞和浆细胞， 而且上皮也具有吸收抗体的功能阮9 9 ，旧叭。虽然有关抗体在皮肤、鳃内的变化过程还 不清楚，但白细胞的存在和抗原物质可以被上皮吸收是肯定的，1 0 2 1 o 所以，粘膜淋 巴组织( m a l t ) 在鱼类免疫摄取和免疫保护方面发挥着重要的作用【8 2 1 ，是鱼类抵抗环 境病原体侵袭的最初屏障。 鱼类粘膜免疫系统( m u c o s a li m m u n es y s t e m ) 相对于系统免疫系统( s y s t e m i c 斜带4 j 斑鱼胚后消化系统和淋巴器官牛k 发育的研究 i m m u n e s y s t e m ) 具有一定的自主性，不同的免疫接种方法可诱导不同的免疫器官和组 织产生不同的免疫应答反应9 8 ，i o o , 1 0 3 , 1 0 4 1 。但是，也有学者认为这两个系统没有本 质的差异。实验证实鲑鱼对皮肤粘液免疫球蛋白与血清免疫球蛋白的理化性质一致 i 0 5 1 。因此，认为鱼类存在独立的粘液免疫系统的证据不充分。 1 1 5 血液 鱼类的血液也是鱼类免疫系统的重要组成成分之一。鱼类的血液是以输送氧的 红细胞为主，红细胞体积较哺乳动物大，椭圆形，具细胞核，这是鱼类血细胞与哺 乳动物最大的不同。鱼类血液中的白细胞，包括数量较多的淋巴细胞以及少量的颗 粒细胞、血栓细胞和单核细胞四大类。鱼类外周血液白细胞同高等脊椎动物血液中 的白细胞一样，是机体细胞和体液免疫的重要成分【7 8 ，但是，不同的鱼类有不同的 白细胞类群，有着不同的形态和功能。鱼类血液中的淋巴细胞和哺乳动物的淋巴细 胞有相同之处，不同之处在于哺乳动物淋巴细胞极少见粗面内质网，而鱼类淋巴细 胞巾一般有粗面内质网和较多的核糖体颗粒。线粒体的多少、大小依不同鱼类有所 不同f 1 0 6 1 。s u z u k i 7 1 认为淋巴细胞没有吞噬作用，这与哺乳动物淋巴细胞无吞噬作用 是一致的m 6 1 。鱼类血细胞也有类似于哺乳动物血t f l , 板功能的血栓细胞，具有吞噬作 用。酸性粒细胞在鱼类血液中含量不多【1 0 6 1 。同单核细胞一样，中性粒细胞存在于所 有硬骨鱼血液中，但很少有分叶核，一般只有两分叶，与哺乳动物中性粒细胞功能 相似，具有吞噬作用。鱼类单核细胞存在于所有硬骨鱼血液中，并具有吞噬作用【8 6 i 8 7 ， 1 0 8 , 1 0 9 l 。徐豪等0 1 观察到正常鱼和病鱼血液中单核细胞数量不同，特别是感染寄生 虫、环境污染及其它疾病都能引起鱼类血液中单核细胞增多。血细胞是动物体对自 身生理状态变化和对外界环境因子刺激非常敏感的细胞，所以分析鱼类血液的形态 变化、生理生化特性等血液病理学知识，也是鱼类免疫学中的重要组成部分，是研 究免疫功能的基础。 目前对哺乳动物血细胞的研究己深入到分子水平，但是关于鱼类血细胞的研究 还不够深入，尚有许多问题未能解决，例如鱼类外周血液中有无嗜碱性粒细胞和浆 细胞，以及白细胞内的颗粒类型等问题，是吸引众多学者关注的研究内容。而且许 多研究集中于淡水鱼类，例如丽鱼( c i c i l i i d a e ，o r e o c h r o m i sm o s s a m b i c 淞) 【 、金鱼2 1 、 鲫3 1 、草鱼 1 0 7 ，1 4 ，1 1 ”、鲤鱼 1 6 1 、鳙鱼、鲢鱼 1 17 1 、银鲫 1 0 6 1 、罗非鱼【1 0 7 1 、同本白鲫 i a l 8 l 鳜鱼9 1 、欧洲鳗鲡1 2 0 1 等。在海水鱼类血细胞的研究方面，目前国内外相关的 研究及报道不多【8 6 - 1 0 8 , 1 2 ”。 1 2 免疫细胞 凡参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞均称为免疫细胞。免疫细胞分为两大 类：一类是淋巴细胞，主要参与特异性免疫反应，在免疫应答中起核心作用，另一 类是吞噬细胞。鱼类免疫细胞主要存在于免疫器官和组织以及血液和淋巴液中。白 细胞和单核一巨噬细胞系统细胞具有强大的吞噬能力，是参与机体非特异性免疫的 重要部分，并能参与机体的特异性免疫一细胞免疫和体液免疫。巨噬细胞 f m a c r o p h a g e ) 是具有多种功能的重要免疫细胞，可通过处理抗原和释放可溶性因子对 免疫功能起重要的调节作用。 1 2 1 淋巴细胞( 1 y m p h o c y t e ) 在哺乳动物中参与特异性免疫应答的淋巴细胞主要有两类：即t 淋巴细胞和b 淋巴细胞。这两类细胞在形态学上不易区分，在功能上有所不同，是两种重要的淋 巴细胞，在体内细胞免疫和体液免疫过程中分别担负着重要作用。t 细胞主要介导细 胞免疫并在免疫应答中起调节作用，其发育和成熟与胸腺有关；而b 细胞在体液免 疫中与抗体的合成有关，其发育和成熟与胸腺无关。t 细胞和b 细胞具有不同的膜表 面标志( 包括表面受体和表面抗原) 。这是鉴别两类淋巴细胞的结构基础。即b 细胞 能表达膜表面免疫球蛋i 刍( s u r f a c em e m b r a n ei m m u n o g l o b u l i n ，s m l g ) 作为抗原受体和 表面抗原，而t 细胞则不能产生免疫球蛋白。t 、b 细胞的有丝分裂原受体也不同。 植物血凝素( p h a ) 和刀豆蛋白a ( c o n a ) 可刺激t 细胞，而脂多糖( l p s ) 等只能 刺激b 细胞，使之转化为淋巴母细胞【6 3 j 。 鱼类淋巴细胞是否也r qn 甫孚l 动物一样具有异质性，是否也具有两类淋巴细胞? 斜带石斑鱼胚后消化系统和淋巴器官生长发育的研究 科学研究者一直关注这个问题，有关的研究工作不断展开。由于实验手段的不够成 熟，在t 一淋巴细胞中混有少量的b 一淋巴细胞，使得该项的有关研究受到阻碍m 2 ，1 2 3 。 现在应用单克隆抗体技术、分子生物学技术和流式细胞术等新技术，进行区分这两 种类型的淋巴细胞，为研究淋巴细胞提供了更加有效的技术保证，从而证实了鱼类 同样存在相当于哺乳动物t 、b 细胞的两类淋巴细膨1 2 叭。 1 2 2 吞噬细胞( p h a g o c y t e ) 鱼类吞噬细胞除作为辅佐细胞具有特异性免疫功能外，也是组成非特异性防御 系统的关键成分，在抵御微生物感染的各个阶段发挥重要作用：粘膜吞噬细胞构成 抗感染的第一道屏障；单核细胞和粒细胞等血细胞作为第二道防线，可以破坏出现 在循环系统中的病原生物：最后，器官和组织中具有吞噬活性的细胞能够摄取和降 解微生物及其产物【6 3 1 。当机体受到微生物侵扰时，机体炎症反应的核心细胞是巨噬 细胞和粒细胞，它们能够被微生物的有害产物激活并产生更多有效的抗微生物因子 f 6 7 1 。鱼类的吞噬细胞主要有单核细胞、臣噬细胞和各种粒细胞，具有吞噬功能。 1 2 2 1 单核细胞( m o n o c y t e ) 单核细胞存在于所有脊椎动物中，环境污染或疾病感染都能引起鱼类血液中单 核细胞数目显著增加”。与哺乳动物的相似，鱼类单核细胞也有较多的胞质突起， 细胞内含有较多的液泡和吞噬物，可进行活跃的变形运动，具有较强的粘附和吞噬 能力，能够在血流中对异物和衰老的细胞进行吞噬消化【岫7 i l l , 1 2 5 。单核细胞是在造 血组织中产生并进入血液的分化不完全的终末细胞，它还可以随血流进入各组织并 在适宜的条件下发育成不同的组织巨噬细胞怕。 1 2 2 2 巨噬细胞( m a e r o p h a g e ) 巨噬细胞在不同组织中有多种类型，在同一组织也有不同亚型6 3 1 。在免疫应答 过程中，当病原微生物表面覆盖有免疫球蛋白和补体成分时，巨噬细胞可以通过这 些因子的特异性受体识别并杀伤微生物。巨噬细胞膜表面的碳水化合物受体同样有 助丁：对入侵微生物的识别和吞噬。另外，巨噬细胞可以通过对其表面组织相容性复 合体分子中抗原的呈递、对淋巴细胞功能的调节、对自身及其它细胞生长复制的控 制等途径来操纵机体的免疫应答6 3 1 。值得注意的是，对鱼类巨噬细胞凝集 ( m a c r o p h a g ea g g r e g a t e s ，m a s ) 或黑色素巨噬细胞中心的检测，可望作为衡量鱼体健 康水平及环境污染状况的生物标志 8 9 , 9 4 1 。 1 2 2 3 粒细胞 粒细胞在鱼类中，根据其来源、形态及功能，以及依据颗粒的染色特征可分为 三类，即嗜中性、嗜酸性和嗜碱性粒细胞，这些细胞被认为在免疫应答中起了重要 作用，尤其是防御微生物病原体的作用。 软骨鱼类粒细胞生成的主要部位是脾脏和其他淋巴髓样组织，如薄壁囊器 ( e p i g o n a lo r g a n ) 和莱狄希器( o r g a no f l e y d i g ) ；脾和肾是硬骨鱼类粒细胞生成的主要 场所m “。 但是，并不是所有的鱼类都具有嗜中性、嗜酸性和嗜碱性这三种粒细胞。其超 微结构在各种鱼类间大不相同，主要表现在其胞质颗粒的形态结构上。多数硬骨鱼 类嗜中性粒细胞颗粒内具有晶体样或纤维状的内涵物，而有些硬骨鱼类相应细胞颗 粒内却并不存在这样的亚结构。鱼类嗜中性粒细胞具有活跃的吞噬和杀伤功能，但 是其吞噬能力一般比单核细胞的弱f 堙刚。目前，鱼类嗜中性粒细胞内的颗粒分类依据 尚不统一。根掘不同的分类依据，会得出不同的分类结果【1 2 们。 鱼类是否同时具有嗜酸性和嗜碱性粒细胞，争议较大。有些鱼类这两种细胞均 未见到：而大多数鱼类仅有前者，只有少数鱼类才有嗜碱性粒细胞【6 3 】。徐豪等“o 】 认为嗜碱性颗粒在制片过程中极易解体，因此很难观察到嗜碱性粒细胞。所以鱼类 嗜碱性粒细胞的功能目前尚难定论。周玉等1 2 0 1 认为嗜中性粒细胞存在于所有硬骨鱼 类q j ，是硬骨鱼类中最常见的粒细胞，而嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的存在因鱼 的种类而异。嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞无论在那种鱼类中存在，其数量都相对 较少，即鱼类外周血中嗜酸性粒细胞很少，嗜碱性粒细胞仅在少数鱼类中发现【9 ，他们。 鱼类外周血中颗粒白细胞的种类、数量及其形态结构存在明显的种间差异“9 1 。从脊 斜带石斑鱼胚后消化系统和淋巴器官生长发育的研究 椎动物血细胞的演化来看，嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞分化较晚 1 20 1 。 嗜酸性粒细胞的前体产生于造血淋巴器官，随着血液循环进入刁i 同器官如鳃和 肠道，然后分化成为粒细胞，但仍然具有有丝分裂的能力，1 28 1 。电镜下，鱼类嗜酸 性粒细胞颗粒内的晶状结构及核心是其形态鉴定的可信依据6 3 1 。 2 鱼类免疫机制 鱼类虽然是低等脊椎动物，但已经具备了一个相对完善的免疫系统，具备了免 疫的基本特征。免疫是机体为维护体内和体外环境的相对平衡和稳定而识别抗原物 质所发生的一系列反应，其目的是通过各种生理机能的调节，以消除体内的“菲己 异物”。与哺乳动物一样，鱼类也具有2 种免疫，即包括非特异性免疫和特异性免疫。 非特异性免疫或先天性免疫是机体在长期的生物进化过程中形成的，由遗传而获得 的，不依赖于以往接触过任何特殊的病原体，受性别、年龄等的影响较小。特异性 免疫或获得性免疫是对特定“非己”抗原的反应，是个体出生以后由于自然感染或 预防接种而获得的，呵以由人工方法得以加强，是在病原体征服或战胜先天的非特 异性免疫机制之后而产生的。 鱼类的生存依赖于水环境，而水环境的