（微生物学专业论文）黄霉素菌种工艺的优化和发酵工艺的调控分析.pdf

山东大学硕士学位论文 摘要 黄霉素属于磷酸多糖类抗生素，其产生菌为灰绿色链霉菌，是一种新型的抗 生素类药物添加剂或促生长剂。以其高效、低毒和低残留在畜牧业上有着广阔的 应用前景，是公认的绿色饲料添加剂之一。黄霉素的生产过程相对简单，所用原 料大部分为农副产品，少数是普通无机化工原料，容易得到，成本低。生产过程 对环境污染小，是一个有利于国计民生的兽用药。 本课题主要是在稳定生产的基础上，对黄霉素菌种工艺和发酵工艺进行优 化。首先运用氯化锂前处理与紫外线复合处理进行诱变，并结合自然分离，筛选 得到比出发菌株产量提高5 0 的高产菌株，同时对菌种工艺进行优化，通过试验 研究了斜面的培养周期和种子龄对发酵的影响。结果表明：孢子龄为7 2 小时， 种子龄为3 7 小时是合适的培养时间。 其次对发酵工艺进行优化。根据黄霉素的代谢特点对原料进行筛选。可以作 为碳源的有玉米淀粉、葡萄糖、豆油、可溶性淀粉等，通过优化正交试验，最后 选取4 的玉米淀粉作为发酵的主碳源，豆油作为辅助碳源，其发酵水平较高， 成本低，来源广，质量稳定，贮存方便、使用方便。 氮源可选择的范围也很广，通过试验，选择硫酸铵作为无机氮源，生物氮素 和低温黄豆饼粉为有机氮源同时使用，为产生菌提供丰富的培养成分，总的氮源 比例达3 o 以上在碳氮源优化完成后，先后对微量元素和无机盐等进行了优 化，其中磷酸氢二钾和硫酸镁等对发酵的影响较大，最后确定了发酵的优化配方 为：磷酸氢二钾0 0 2 ，硫酸镁0 0 5 ，玉米淀粉4 o ，低温黄豆饼粉2 o ，生 物氮素1 o ，硫酸铵0 3 ， 硫酸锌0 0 0 0 2 ，豆油4 o ，c a c o 。0 5 ，消 泡剂0 0 1 ，硫酸钴0 0 0 0 0 1 ，表面活性剂0 。7 ，c u s o 。5 h 2 00 0 0 0 5 ，玉米浆 0 9 ， f e s 0 4 7 h 2 0 0 0 0 0 0 4 。 其后，又对补料和补油等工艺控制进行优化。中间补料的批次，比不补料的 发酵水平要高，菌种的产素时间延长。因此，将补料纳入正常工艺范围。开始使 用补水方法时完全是根据时间即定时补水，后根据黄霉素发酵的代谢曲线，改为 根据溶氧的水平控制补水，再根据菌丝的生长情况及氨氮水平补料，完成由最初 的粗放补料工艺，到科学补料的过渡，根据代谢状态，代谢速度不同分别控制， 使菌种潜力得以发挥，同时降低生产成本。 山东大学硕士学位论文 最后，从摇瓶水平对黄霉素a 组分的提高进行了初步研究，根据初步研究的 结果，又结合实际生产，进行单因素试验，在i o l 的发酵罐上进行了验证。证明 在黄霉素发酵过程中，中间补料对黄霉素a 组分的提高有一定的负面影响。适量 的补水对黄霉素a 组分的影响甚微。 关键词：黄霉素菌种优化发酵工艺黄霉素a 组分 4 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t f l a v o m y c i n ，a san e wt y p ed i g e s t i v ee n h a n c e r ，i sak i n do fk e t o s ea n da l d o s e p h o s p h a t e sa n t i b i o t i c s ，i si n d u s t r i a l l yp r o d u c e db ys t r e p t o m y c e sb a m b e r g i e n s i ss t r a i n t h ed e v e l o p m e n to ft h ea n t i b i o t i ch a sg o o de c o n o m i ca n ds o c i a lp e r f o r m a n c ef o ri t s e f f e c t i v es a f e t y , l o wt o x i c i t ya n dl o wr u d i m e n t a l i t y , r a t h e rs i m p l ef e r m e n t a t i o n t e c h n i q u e sf o rp r o d u c t i o n ，l o wc o s tb yu s i n gm a s s i v e l y a v a i l a b l ea g r i c u l t u r a l b y p r o d u c t s a st h e m a j o rs u b s t r a t e ，a n d e n v i r o n m e n t - f r i e n d l i n e s sw i t hl o w c o n t a m i n a t i o n t h i st h e s i sf o c u s e so nt h es t r a i n i m p r o v e m e n t a n do p t i m i z m i o no ft h e f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sf o rh i g h e ra n ds t a b l ey i e l do ff l a v o m y c i n f i r s t l y , t h e h i g h y i e l ds t r a i n sw e r es c r e e n i n gb yu va n dl i c i ，a sar e s u l t ，w eo b t a i n e da h i g h - y i e l ds t r a i nw i t ht h e r ep r o d u c t i v i t yi n c r e a s e db y5 0 p e r c e n t w h i l ew eh a v e o p t i m i z e dt h ep r o c e s so ft h es t r a i n ，t h ec u l t u r ec y c l eo fs l a n ta n ds e e dt i m ee f f e c to n f e r m e n t a t i o nw a ss t u d i e db ys i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t s t h er e s u l ti n d i c t e dt h a t ：t h e s p o r et i m ei s7 2h o u r s ，t h es e e dt i m ei s3 7h o u r s ，w h i c hi ss u i t a b l et ot h ef e r m e n t a t i o n o ff l a v o m y c i n s e c o n d l y , a c c o r d i n gt ot h em e t a b o l i cr e g u l a t i o no ff l a v o m y c i n ，w ea n a l y z e dt h e f e r m e n t a t i o np r o c e s s w eh a v es c r e e n e dt h er a wm a t e r i a l so ft h ec a r b o ns o u r c e sa n d t h en i t r o g e ns o u r c e s f o rt h ec a r b o ns o u r c e s ，w em a i n l ye x p e r i m e n t e dw i t hc o r nf l o u r , g l u c o s e ，s o y b e a no i l ，s o l u b l es t a r c ha n ds oo n ，t h er e s u l ti st h a tw ec h o s ec o r nf l o u ra s t h em a i nc a r b o ns o u r c ea n ds o y b e a no i la st h es u p p l e m e n tc a r b o ns o u r c e f o rt h en i t r o g e ns o u r c e s ，t h e r ea r em a n yc h o i c e s f r o mt h er e s u l t so fo u r e x p e r i m e n t s ，w ec h o s eam i x t u r eo ft h ei n o r g a n i c ( n i - 1 4 ) 2 s 0 4a n do r g a n i cb e a nc a k e p o w d e rp l u sb i o l o g i c a ln a st h en i t r o g e ns o u r c e s t h ec o n c e n t r a t i o no ft o t a ln i t r o g e n u s e di sm o r et h a n3 0 a f t e rw e o p t i m i z e dt h en i t r o g e na n dc a r b o ns o u r c e ，w ei n v e s t i g a t e dt h eu s e so f t h et r a c ee l e m e n t sa n di n o r g a n i cs a l tf o rt h ef e r m e n t a t i o nm e d i u m d u r i n gt h e e x p e r i m e n t s ，w ef o u n dt h a tk 2 h p 0 4a n dm g s 0 4a r et h ek e yf a c t o r st h o s ea r ea b l et o s i g n i f i c a n t l ya f f e c t t h ep r o d u c t i o no ff l a v o m y c i n t h eo p t i m a lm e d i u mo ft h e 5 山东大学硕士学位论文 f e r m e n t a t i o ni s o 0 2 k 2 h p 0 4 ，0 0 5 m g s 0 4 ，4 0 c o r nf l o u r , 2 o b e a nc a k e p o w d e r ,1 0 b i o l o g i c a ln ，0 3 ( n h 4 ) 2 s 0 4 ，0 0 0 0 2 z n s 0 4 ，4 o b e a no i l ， 0 5 c a c 0 3 ，0 01 s u b d u e sb u b b l ep h a r m a c e u t i c a l ，0 0 0 0 01 c o s 0 4 ，o 7 s u r f a c t a n t ，0 0 0 0 5 c u s 0 4 5 h 2 0 ，0 9 c o ml i q u i d ，o 0 0 0 0 4 f e s 0 4 7 h 2 0 t h e r e a f t e r , t h et e c h n i q u e sf o rc o n t r o l l i n gt h ef e e d i n go ft h eo i la n do t h e r s u b s t r a t ew e r eo p t i m i z e d o u re x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tt h ey i e l do ff l a v o m y c i nc o u l d b ei n c r e a s e ds m a l lb yf e e d i n gb a t c hf e r m e n t a t i o n t h ea b i l i t yo fp r o d u c ef l a v o m y c i n c o u l db el e n g t h e n e d t h u s ，t h ef e e d i n gt e c h n i q u ei se m p l o y e di no u rf u r t h e rw o r k i n t h eb e g i n n i n g ，w a t e ra n dt h eo t h e rs u b s t r a t e sw e r ef e do n l yb a s e do nf e r m e n t a t i o n c u l t u r et i m e ，a f t e rs e r i e so fe x p e r i m e n t s ，w ec o n t r o l l e dt h ef e e d i n go fw a t e ra n dt h e o t h e rs u b s t r a t eb ya s s a y i n gt h em e t a b o l i cc u r v eo ft h ef l a v o m y c i n ，b e s i d e s ，t h e g r o w t hs t a g eo ft h em y c e l i u ma n dt h eh i g hl e v e lo fn i t r o g e ni nn h 2w e r ea l s o r e f e r r e df o rt h ef e e d i n gt i m ea n dt h ef e e d i n ga m o u n t f r o mt h er e s u l t ，w es u g g e s t e da f o r m u l af o rp r o g r a m m e df e e d i n g f o ri nd e t a i lc o n t r o l l i n gt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s s ， t h ec o n t r o l l i n gp r o g r a mw a ss e ti ns e v e r a ls t a g e s ，b a s e do nt h em e t a b o l i cs t a g e so ft h e c e lla n dm e t a b o l i cr a t e w ei n v e s t i g a t e dh o wt oi m p r o v et h ea m o u n tf l a v o m y c i naf r o mt h ef a s kl e v e l a n d10 lb i o r e a c t o r t h er e s u l t ss h o wt h a tt h em i d d l e b a t c hh a sac e r t a i nn e g a t i v ea n d f e e d i n gw a t e rd u r i n gt h ef e r m e n t a t i o nh a sl i r l ee f f e c to nt h ei m p r o v e m e n to ft h e p r o p o r t i o no ff l a v o m y c i na k e y w o r d s ：f l a v o m y c i n ，s t r a i ni m p r o v e m e n t ，f e r m e n t a t i o np r o c e s s ，f l a v o m y c i na 6 原创性声明 本人郑重声明：所星蓟拇剃妣是本 在导师的指导下，独立懒 究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论艾不包含任何其他个人 或集体已经发表或醭葡盥闭啪燃。对本文的虢作出重要茹渐人和集 体均已在文中以明确方拭粝胡。席声明的法律责任由本 承担。 名：超e t 期：鲨墨二么一矽 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东= 趔翔与关保留、使用学位沧妊| 勺规定，同意学良保留或 向国家有关部门或机 勾j 遴撇的复印件和电子版，愈毓瓮礴皮查阅和借阅： 本人魇仅山东大学可眺际栏荆立沈文的全部或音盼内容编入葡趋劂簿鞫越貊检 索，可以稠影印、缩印或剽螨蜉锻褓存论茹翩磁融醚新蓥论文。 饴罐滋汶蕴鬻密后应遵守i 归掘翘 ：弛盟撇：鲨业日期：卫翌墨= ，眵 山东大学硕士学位论文 第一章文献综述 1 1 黄霉素发展简史 黄霉素在1 9 5 5 年由灰绿色链霉素菌属培养物中发现，是一类含磷糖脂、化 学结构复杂的抗生素。至少含a 、b 1 、b 2 、c 等四种组分，以组分a 含量最高n 1 。 2 0 世纪7 0 年代初期由德国赫斯特( h o s e c h s t ) 公司推向市场，现己风行全世界。 中国称其为f l a v o m y c i n ( 黄霉素) ，美将其多称为b a m b e r m y c i n ( 斑驳霉素) ，欧 共体使用名f l a v o p h o s p h o l i p o l ( 黄磷脂素) ，学术名为m o e n o m y c i n ( 默诺霉素) 。 它们均对细菌细胞壁的合成有很强的抑制作用，其中黄霉素的产生菌为斑驳链霉 菌，加纳链霉菌，埃德尔链霉菌和喷泉链霉菌，其中优选斑驳链霉菌心1 。 黄霉素最先由德国赫斯特公司于1 9 9 1 年注册的第1 个专用于动物饲料添加 剂类抗生素，而且还是一种有效促生长剂在医学和公共卫生方面也很安全。自 7 0 年代起，对黄霉素产品进行了实用性实验，结果表明，使用低浓度剂量就可 发挥显著的促生长作用。由于黄霉素的分子量极大，在动物消化道内不吸收，不 会在体内和产品中残留，因而公认它是安全的 5 1 。该药具有很好的稳定性，甚 至在制成颗粒饲料时也很少破坏，而且可以和其他饲料添加剂配合使用。黄霉素 在土坡中能被降解，不被植物吸收，对环境无污染，也有人把黄霉素称绿色添加 剂，获得世界各国的高度评价，已在世界几十个国家获得使用许可，成为畜牧生 产企业提高经济效益的法宝h ，们。 黄霉素在我国的使用起步较晚，1 9 9 3 年开始批准荷兰英特威公司( i n t e r v e t ) 的黄霉素一4 0 和黄霉素一8 0 ( 每千克商品分别含黄霉素4 0 9 和8 0 9 ) 在我国使 用，其投放在中国的黄霉素商品名为“富乐旺”。黄霉素也是我国1 9 9 7 年发布的 允许作饲料药物添加剂的兽药品种及使用规定中无停药期且产奶期可使用的 两种抗茵药之一。黄霉素的饲料添加剂不是纯品形式，而是由斑驳链霉菌发酵后， 经喷雾干燥的产品与载体的均匀混合物，一般选轻质碳酸钙作载体。黄霉素原来 仅用作饲料添加剂，不作为治疗用药口8 r 们。 由于黄霉素杀菌力强、安全性高、无毒副作用，因此成为目前被欧盟批准使 用的四种抗生素类促生长剂之一，而国外允许在养殖业中使用的含磷糖脂类抗生 素只有黄霉素一种n 训。自从加入世界贸易组织后，我国农副产品的出口，受到了 很大程度的限制，一个重要的原因就是我国产品的药物残留严重超标，因此我国 7 山东大学硕士学位论文 农业部于2 0 0 2 年6 月发布公告，禁止生产一批高残留、毒性大的兽药( 包括饲 料添加剂) ，9 月农业部又批准黄霉素为新兽药，这说明农副产品的安全生产已 受到我国农业主管部门的高度重视。尽管欧盟已经做出在2 0 0 6 年1 月1 日开始 全面禁止使用促生长剂的决定，但这不会影响黄霉素作为一种优秀促生长剂的存 在。 今后几年内，黄霉素在国内畜牧业生产中的应用将会进入一个持续增长期。 1 2 黄霉素的理化性质 黄霉素是由斑驳链霉菌，加纳链霉菌，埃德尔链霉菌和喷泉链霉菌等产生的 含磷糖脂类抗生素。其中黄霉素a 是主要成分。 黄霉素a 的经验分子式：c 。9 h m n 。0 。p ，分子量为1 5 8 2 n 1 1 黄霉素a 组分的结构式n 1 1 2 1 黄霉素属于弱酸，由四个微生物活性物质( 它们的化学特性及抗菌活性相似 其中斑驳链霉菌的产物占5 0 以上) 组成的含糖磷脂，纯品为无色无味的非结晶 性粉末，易溶于水、甲醉、二甲基酞胺等小分子物质，不溶于苯、三氯甲烷等其 它有机溶剂。在一般条件下都较稳定，但在强酸强碱条件下则易失效。在室温和 中性条件下贮存2 年，活性不下降，即使置于1 0 0 下加热2 4 小时，其活性也 只下降2 0 。黄霉素无明显熔点，2 0 。c 开始分解。粉末和水溶液在室温和中性条 件下比较稳定，此条件下存放两年后其存活率为1 0 0 和9 4 ，但是制粒对黄霉 素的破坏可达9 0 以上口4 9 1 。 1 3 黄霉素的生物活性 1 3 1 黄霉素的作用机理 山东大学硕士学位论文 1 3 1 1 黄霉素的抑菌原理 主要抑制革兰氏阳性菌，部分革兰氏阴性菌如巴氏杆菌，布氏杆菌等也对黄 霉素敏感。黄霉素是通过干扰构成细胞壁的结构物质肽聚糖的生物合成从而 抑制这些细菌的繁殖( 肽聚糖层状结构的毁坏导致了细菌细胞的破裂) n - 3 ，劓。黄 霉素是抑制肽聚糖生物合成最活泼的物质之一，在极低剂量下即作用。通另外一 个也作用于细胞壁的抑菌促生长剂杆菌肽相比，可以清楚的显示这一点( 表一) 。 具有这种作用方式的抗生素尤其适合用作饲料添加剂，因为动物细胞上没有与细 菌相似的、易受该类抗生素破坏的细胞壁结构，这就是黄霉素非常高效而又具有 良好耐受性的原因。 表一黄霉素和杆菌肽抑制细胞壁合成的效能n 3 3 活性成分浓度( ug m 1 )抑制率( ) 杆菌肽 1 0 02 0 杆菌肽 l oo 黄霉素l1 0 0 黄霉素 o 1 1 0 0 黄霉素001 3 9 1 3 1 2 黄霉素的促生长原理 黄霉素影响肠道细菌的滋生，使肠道菌群的代谢活动有益于动物的生长，间 接改善了营养物质的吸收和利用，从而提高家禽、猪和牛的生长性能和蛋鸡的产 蛋性能。r 在饲料中添加黄霉素，能够把竞争性消耗营养物质的微生物的数量控制在一 个生理水平上，从而减少能量和蛋白的消耗，节约能量和蛋白质，并能使肠腔内 挥发性脂肪酸和氨含量降低，提高氨基酸的消化j ”1 鄹。据资料表明，黄霉素可 提高氨基酸的消化率5 左右。它还能促进反刍动物分解淀粉和纤维素的微生物 ( 如琥珀似杆菌、溶纤维丁酸弧菌、梭状芽胞杆菌等) 生长，可使其分解纤维素 的速度提高1 5 ： 同时黄霉素能使畜禽的黄霉素能使畜禽的肠道壁变薄，并能降低肠道内细菌 毒素和氨的含量，使肠壁重量和厚度降低，从而提高营养物质( 能量、蛋白质、 维生素、矿物质、色素和水分等) 的吸收k 钉。降低畜禽的饮水量和粪中的含水 9 山东大学硕士学位论文 量n 屯1 7 3 。黄霉素能保护肠道内菌群平衡和瘤胃中的p h 值稳定，从而降低动物的 发病率和死亡率及增强抗应激的能力。黄霉素能使反刍动物瘤胃中p h 值稳定在 6 - 7 的最佳范围内，有利于碳水化合物的分解和蛋白质的合成。 1 3 2 黄霉素的细菌耐药性 细菌对青霉素、土霉素、四环素、红霉素、氯霉素等抗生素一般都会产生耐 药性。这是一种染色体外耐药性。可以在细菌间传递和转移的耐药性，多数菌株 还会对这些抗生素产生多重耐药性瞳射。革兰氏阳性菌对黄霉素不产生耐药性，具 有多重耐药性的细菌也未发现对黄霉素产生交叉耐药性。革兰氏阴性菌对黄霉素 不敏感，可以看作是具有天生耐药性，但一旦革兰氏阴性菌产生了染色体外耐药 性，则对黄霉素的敏感性增强。此外黄霉素对这类革兰氏阴性菌也可抑制其生长 繁殖。另外也观察到粪中的沙门氏杆菌排出数量明显降低。 1 3 3 黄霉素的毒副作用 黄霉素属大分子物质，其分子量1 5 8 2 ，因而它在消化道中不被吸收，发挥 作用后随即以原型排出体外，在机体组织中无残留。排出体外的黄霉素又在土壤 被降解，不被植物吸收。 据报道，以临床剂量的3 5 0 倍饲喂肉鸡，其各组织中均未测出残留，其它安 全系数高达3 3 0 倍；急性毒性试验得到黄霉素纯品的急性l d 鲫为鸡8 9 0 0 m g k g 体 重，大白鼠1 4 4 0 0 m g k g 体重；在亚急性毒性试验中，观察9 0 天时间的高剂量( 1 0 0 倍于正常畜禽量) 作用，结果表明，试验动物发育正常，进行病理及组织学检查 亦无毒副作用，尿、血指标也在正常范围；在慢性毒性研究时，应用剂量为正常 剂量的1 0 倍一2 0 倍，时间为2 年，对肝脏，血液、尿指标进行检测，对主要器 官进行病理组织学检查均为发现任何毒副作用。对产蛋性能、受精率、孵化率无 任何负面影响，相反使产蛋率提高约1 0 ，可见黄霉素作为促生长剂即使在高剂 量、长时间使用也不会对动物产生有害影响口1 。说明黄霉素是一种无残留、无污 染、安全的饲料添加剂。 在致畸、致癌、致突变研究中四1 ，给怀孕母兔受孕后7 周一1 9 周内给予正常 剂量( 4 m g k g ) 的7 倍、7 0 倍、7 0 0 倍剂量的黄霉素饲料，结果表明，该饲料既 不影响母兔的健康，也不影响子宫发育和胎儿成活率，只是7 0 0 倍剂量组采食量 略有下降，但幼兔发育未见不良影响，也未观察到怀孕母兔有致畸的危险存在。 l o 山东大学硕士学位论文 1 3 4 黄霉素与硫酸抗敌素的协同作用1 用肉仔鸡做试验，喂食不同剂量组合的黄霉素和硫酸抗敌素，表明肉仔鸡饲 粮中添加黄霉素与抗敌素能够提高肉仔鸡的饲料利用率，能够提高肉仔鸡的生长 速度，改善饲料转化率，提高饲养的经济效益。 1 4 黄霉素的应用介绍 黄霉素是一种抗菌促生长剂，广泛应用于猪、鸡、牛、兔饲粮中以及一些水 产鱼类的的饲粮中，是一种理想的饲料添加剂。 1 4 1 黄霉素对禽类养殖的作用 黄霉素在禽类中应用最多的是肉鸡和蛋鸡的饲养。s a n c h e z 等添加黄霉素在 幼龄肉鸡的饲料中，0 - 2 1 天龄为4 m g k g ，2 2 4 9 天龄为l o m g k g ，等到为期4 9 天的实验结束时，不同组幼鸡粗蛋白分别增加2 1 5 和1 8 。在肉鸡日粮里添 加黄霉素5 5 p p m ，能提高增重率9 8 7 ，增加经济效益2 3 5 。在鸡球虫病发生 时，饲喂黄霉素可降低发病率和死亡率9 0 左右，而且肉色鲜艳，鸡肉的品质及 口感均有明显的改善。在蛋鸡饲养上，大连某养鸡场证明，饲料中添加了5 m g k g 的黄霉素后，可以使蛋料比降低，提高产蛋率乜引。骆先虎，张承祥等通过黄霉素 对土仔鸡生产性能的影响试验口司，得出了黄霉素对土仔鸡具有增强抗病能力，提 高鸡群的成活率，有明显的促增重和提高饲料转化率作用，为优良的抗生素促土 仔鸡生长添加剂，可在土仔鸡生产中推广使用，推荐剂量为4 - 8 p p m 。黄霉素还 能使蛋鸡的产蛋日龄提前，产蛋期延长。把黄霉素用作肉鸭、蛋鸭和鸽子的饲料 添加剂，效果也相当理想。例如陈婉如等用3 2 0 只1 日龄肉用雌番鸭进行为期 1 0 周的饲养试验，试验结果表明，饲料中加入5 m g k g 黄霉素的一组比不加的对 照组，净增重7 7 ，料肉比降低5 7 2 ，每只鸭增加收入1 2 2 元，综合经济效 益提高2 9 7 6 n 鄹。 1 4 2 黄霉素对猪养殖的作用 采用黄霉素作为猪的饲料添加剂，也有相当好的效果乜5 o 如饲养仔猪时，在 饲料里加入2 0 p p m 的黄霉素，能明显提高仔猪日增重和饲料转化率；黄霉素还能 防止仔猪腹泻，提高仔猪的成活率，从而显著增加饲养者的经济利益伫叫。黄霉素 在肥育猪的养殖上也有很好的作用，在肥育猪日粮中加入黄霉素、土霉素等抗生 素药物添加剂，结果显示使用黄霉素对肥育猪的促生长效果明显优于后两种药 山东大学硕士学位论文 物在三元杂交猪育肥时，将5 m g k g 的黄霉素加入到2 0 头试验猪的基础日粮中， 经过1 1 5 天的饲养，每头猪的平均日增重比对照组( 不喂黄霉素) 的平均日增 重提高8 5 6 ，收入平均增加1 4 5 8 元，经济效益提高了1 6 4 。 1 4 3 黄霉素对牛养殖的作用 黄霉素是一种理想的肉牛饲料添加剂，在喂养肉牛时加入黄霉素，能促进牛 瘤胃中分解纤维素和淀粉的微生物的生长，明显提高肉牛的日增重、饲料转化率 以及经济效益。在杂交一代肉牛的试验结果表明，每日添加4 5 m g 头剂量的黄霉 素，可使牛的日增重提高1 3 2 6 ，精料、粗料和饲料增重比分别下降1 5 8 、 1 5 2 6 和1 4 4 0 ，经济效益增加2 5 9 8 。在养殖奶牛方面，黄霉素可增加 牛奶产量以及牛奶中脂肪和蛋白质的含量n 6 1 。连续6 5 天给奶牛精饲料中加入 6 4 m g k g 的黄霉素，结果使每头奶牛每天多产奶0 5 k g ，乳脂肪和乳蛋白分别增 加11 8 9 和2 8 9 一头奶牛每天多收入0 8 元在饲养母牛方面，z a c h w i e j a 等在 母牛的预产期4 个星期前开始，每天在每头母牛的日粮里加入4 0 m g 黄霉素，结 果使母牛对饲料中蛋白质的利用率提高，体重增加，所产小牛也比不喂黄霉素的 对照组个体大而且健康口1 。 1 4 4 黄霉素在水产养殖中的应用 尽管黄霉素在水产养殖中的应用相对不多，但是它的价值仍值得我们重视。 在鲤鱼饲料中添加4 种浓度的黄霉素，结果显示黄霉素可使鲤鱼体重明显增加， 饲料成本下降，其中以2 m k k g 组下降幅度最大，达到了2 8 7 。张满隆等报道 在草鱼饲料中加入黄霉素，可以提高鱼的生长速度，降低饲料系数，减少其养殖 成本：黄霉素还能促进草鱼的营养平衡，使草鱼中蛋白质和粗灰分含量增加，这 说明鱼的品质已变得更好，营养价值更高“1 。 除此之外，黄霉素也开始应用于其他水产品的养殖中，例如鳗鱼、罗非鱼、 虾、鳌等，均取得了令人满意的结果和良好的经济效益。在卿鱼的配合饲料中加 入o 、2 、4 、8 m g k g 的黄霉素，结果显示后两组均出现明显的增重现象，说明黄 霉素对卿鱼有着良好的促生长作用乜7 1 。以鳜鱼为试验对象，在饲料中添加5 个水 平的黄霉素，经过3 0 d 饲养试验后，结果显示：当添加量小于2 m g k g 时，相对增 重率随添加量的增加而提高；当黄霉素添加量为2 m g k g 时，增重率达到最高值， 较a 组( 0 水平) 提高了1 9 ，饲料系数降低了0 1 5 ；添加量大于2 m g k g 时，增 1 2 山东大学硕士学位论文 重率和饲料系数无显著差异，使用黄霉素还能提高抗病能力，降低死亡率乜叭。 1 4 5 黄霉素在其它动物养殖方面的应用。 除了以上应用最多的四个方面外，近些年黄霉素也应用于其他动物的养殖 中。如兔的饲养、绵羊的养殖等。 1 5 黄霉素的提纯和检测 1 5 1 黄霉素的提纯嘲 德国h o e c h s t 公司生产的黄霉素预混合剂2 0 9 ，加入5 0 甲醇水溶液浸泡， 搅拌后，用n a o h 调至p h 8 0 ，8 5 水浴加热1 5 m i n ，凉后用盐酸调p h 7 0 。，过 滤滤液减压浓缩，浓缩液倒入小烧杯，加入适量硅胶，拌匀，自然干燥后，装 入已用异丙醇：氨水( 9 ：2 ) 预先平衡好的硅胶柱中( 1 0 0 目硅胶1 l o g ) ，以异 丙醇：二氨水( 9 ：2 8 ，2 8 ：3 ) 各9 0 m 1 分级梯度洗脱。以每份2 5 m l 进行收 集测定活性。合并有较强活性的组分，蒸去溶剂，以水溶解，冷冻干燥，获褐 色粉末。取1 5 0 m g 配成2 0 m g m l 水溶液，每次2 0 0 u l 进样，注入预先用l m l 甲醇 冲冼，l m l 蒸馏水平衡好的l m l ( 3 0 m g ) 规格的w a t e ro a s i sh l be x t r a c t i o n c a r t r i d g e 。然后用6 0 乙睛水溶液加0 0 5 三氯乙酸( t f a ) 作为洗脱剂，洗脱活 性成分，收集保留时间为2 2 - 2 3 m i n 的主成分峰，合并后蒸去溶剂，冷冻干燥， 获得纯品。 1 5 2 黄霉素的检测 黄霉素的定性检测可用薄层色谱法( t l c ) ，检测范围为0 o l m g k g 一0 1 m g k g 。 高含量样品可用紫外吸收法，低含量样品用生物自显影法，以金黄色葡萄球菌作 为试验菌株。定量检测时，含量在0 5 m g k g 1 0 0 0 m g k g 的样品用琼脂扩散法， 高于1 0 0 0 m g k g 的样品用浊度测定法心9 觚3 1 1 。 1 6 黄霉素的生产 1 6 1 黄霉素的产生菌 早在1 9 5 5 年，l i n d n e r 等人从灰绿链霉菌属的几个菌株( b a m b e r g i e n s i s , g h a n a e n s i s , e d e r e n s i s ，sg e y s i r i e n s & ) 2 1 的培养液中获得了同一种二氧磷基糖 苷类物质，即黄霉素b 钔。 1 6 2 斑驳链霉菌的微生物学特性 2 0 0 5 年福建师范大学的刘峰等口3 1 对黄霉素产生菌斑驳链霉菌的形态特征、 山东大学硕士学位论文 培养特征、生理生化特征等进行了细致的考察。 1 6 2 1 利用培养基的特点 在以淀粉作为碳源的基质中，菌丝生长较旺盛，产孢子量也多，孢子成熟快。 孢子在成熟过程中颜色由白色渐渐转为浅绿色，后颜色不断加深，呈深绿色。 在斜面培养过程中发现离试管口愈近的基质上，菌丝生长愈快，孢子色素较深， 而试管底部的孢子则颜色较浅，说明该菌的生长与空气中的氧含量有一定关系。 该菌株对蔗糖利用不良，对乳糖的利用也不太好，用葡萄糖作为碳源，菌丝生 长良好，但对产孢子不利。 1 6 2 2 生理生化特征 淀粉水解：将菌种接种在淀粉琼脂平板上，于2 8 培养1 5 天时，在菌落 周围滴加l u g o l 碘液，茵落周围有呈现明显的透明圈，表明菌种产生了淀粉酶。 纤维素水解：将菌种接种在试管中，一半浸在无碳源合成培养基内的滤纸条上， 2 8 培养1 5 天时观察，菌种能在滤纸条上生长，并分解滤纸条，表明该菌株产 生了纤维素酶。 1 7 课题的产生和研究思路 随着人们对无公害饲料添加剂的需求，黄霉素的必将广泛应用，对生产企业， 也无形中增加了竞争压力，生产水平先进，生产成本低，质量过硬，首先占领市 场，企业才能在激烈的竞争中获胜。虽然我公司的黄霉素生产水平已逐步达到了 国内先进水平，但也要加入竞争的行列，因此优化工艺，提高生产技术水平，降 低生产成本是参与竞争的上上之策，确实体现技术是第一生产力，所以黄霉素的 生产工艺优化成了公司的技术关键。 本课题的研究，是在稳定生产的基础上，以达到或超过引进生产工艺，降 低生产成本为目标，从优化菌种工艺，提高菌种的整体能力、优化发酵原材料碳 氮源配比、优化工艺技术参数、优化补料工艺等多个方面入手，使生产水平达到 一个新的高度，以实现技术先进、企业效益最大化。 1 8 主要研究内容 1 8 1 菌种工艺的优化和稳定 1 8 2 发酵工艺的调控与分析 1 8 。3 黄霉素a 组分的研究 1 4 山东大学硕士学位论文 第二章黄霉素菌种工艺的优化和稳定 2 1 实验材料 2 1 1菌种 黄霉素产生菌：斑驳链霉菌( s t r e p t o m y c e sb a m b e r g i e n s i s ) 由胜利生物工程 有限公司提供。 检定菌：金黄色葡萄球菌c m c c 2 6 0 0 3 购自北京兽药监察所。 黄霉素标准品：9 5 8 u m g 购自中国兽医药品监察所。 2 1 2 培养基组成 2 1 2 1 斜面( 平板) 培养基( g 1o o m l ) 糊精1 5 ，蔗糖0 3 ，酵母膏0 3 ，大豆蛋白胨0 5 ，牛肉浸膏0 1 ， k 2 h p 0 。3 h 2 00 0 4 ，m g s 0 4 7 h 2 00 0 4 ，f e s o 。7h z o0 0 0 1 ，n a c l0 0 5 ，琼脂1 5 ， p h7 。0 - 7 2 ，纯化水配制。 2 1 2 2 种子培养基( g l o o m l ) 玉米浆0 3 ，黄豆粉3 0 ，葡萄糖4 0 ，k 。h p o 。0 1 ，c a c 0 。0 2 5 ，p h 7 2 7 8 ( 消后6 5 6 8 ) 注：1 配制时用自来水 2 配制时，先将玉米浆和黄豆粉加水混合，在9 0 下糊化2 0 m i n ，k 。h p o 。 3 h 。0 单称，用纯化水溶解。 2 1 2 3 发酵培养基( g 1o o m l ) 玉米浆0 9 ，( n h 。) 。s o ；0 3 ，玉米淀粉3 0 ，k 2 h p o 。3 h ：0 0 0 1 ，黄豆粉3 4 ， m g s 0 4 7 h 2 00 0 5 ，豆油4 0 ，z n s 0 4 7 h 2 00 0 0 0 2 ，f e s 0 4 7 h 2 00 0 0 0 0 4 ， c os 0 4 6 h 2 00 0 0 01 ，c us 0 4 5 h 2 00 0 0 0 5 ，c a c 0 3o 5 ，表面活性剂o 5 ，有机 硅消泡剂0 0 2 ，p t t7 0 - 7 2 自来水配制 注：1 配制时，先将玉米浆和黄豆粉加水混合，在9 0 下糊化2 0 m i n ，k 。h p o 。 3 h 。0 单称，用纯化水溶解。 2 水解淀粉配制方法：按l o o g 淀粉加入5 0 0 9 水，用6 0 c 的热水溶开，加入淀 粉酶，微波炉中糊化，不断搅拌，加热到9 0 。c ，淀粉溶液先变稠，然后变为较 稀的青色溶液，最后与其它成分定容。 以上培养基均为1 2 1 灭菌3 0 m i n 。 1 5 山东大学硕士学位论文 2 1 2 4 生物检定培养基( g 1 0 0 m 1 ) 蛋白胨0 6 ，酵母膏0 6 ，牛肉浸膏0 1 5 ，葡萄糖0 1 ，琼脂2 0 ，p h 6 8 - - 7 0 注：1 纯化水配制 2 灭菌条件：1 1 8 ，2 0 m i n 2 1 3 原料与试剂 农副产品：豆油，玉米浆，黄豆饼粉，玉米淀粉，生物氮素等 化工产品：表面活性剂，有机硅消泡剂，氯化钠，硫酸镁等，其它分析纯试剂 2 1 4 实验仪器 l k b y - 5 0 摇床鲁抗装备有限公司 超净工作台哈东联空气净化设备厂 p h s 一3 dp h 计上海雷磁仪器厂 卧式蒸汽灭菌柜：山东新华医疗器械厂 电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司 2 2 实验方法 2 2 1 菌株的诱变筛选 2 2 1 1 菌悬液的制备 将出发菌株，分别接种到含氯化锂0 6 和不含氯化锂的种子培养基 ( 5 0 m l 5 0 0 m 1 ) 中，放置于旋转式摇床上，3 7 。c ，2 2 0 r m ，振荡培养2 4 t j , 时，使 菌种处于旺盛生长期，供进一步分离用。诱变处理时菌丝浓度稀释至1 06 个m l 。 2 。2 1 2 氯化锂前处理与紫外线复合处理 将制备好的含氯化锂的种子液用0 8 5 的生理盐水稀释，使菌悬液的浓度大约 为1 0 6 - 1 0 1 0 个m l ，取5 m l 稀释液于无菌空平皿中，置波长2 5 3 n m 、功率3 0 w 的紫外 灯下3 0 c m 处，磁力搅拌照射1 2 0 秒，立即进行梯度稀释，涂布于平皿上。 2 2 1 3 氯化锂后处理与紫外线复合处理 将制备好的不含氯化锂的种子液进行自然分离。同时对种子液行稀释，使菌 悬液的浓度大约为1 0 6 1 0 1 0 个m l ，取稀释液5 m l 置于波长2 5 3 n m 、功率3 0 w 的紫外 灯下3 0 c m 处，磁力搅拌照射1 2 0 秒，立即进行梯度稀释，并且涂布在含0 3 氯化 锂的平皿上。 1 6 山东大学硕士学位论文 2 2 1 4诱变菌株的筛选 出发菌株的菌悬液诱变处理后，经过初筛和复筛，选取产量最高的3 株菌进 行自然分离，不断重复，直至得到高产稳定的菌株b 钔。 2 2 2 筛选方法 初筛：菌落传代后，用接种针从斜面刮取0 5 m 2 的菌苔一对一的方式接种发 酵瓶，发酵后测定生物效价。 复筛：取初筛高产菌株接种种子瓶，发酵瓶，发酵后测定生物效价。 2 3 菌种工艺的优化 ， 2 3 1不同孢子接种龄的优化 在2 0 2 2 0 r a m 试管中装入5 0 1 斜面培养基，相同角度摆成斜面。每支试管中 接种0 1 m l 浓度为5 1 0 7 个m l 的菌悬液，在3 7 。c 的生化培养箱中分别培养2 4 h 、 3 6 h 、4 8 h 、6 0 h 、7 2 h 、8 4 h 、9 6 h 、1 0 8 h 、1 2 0 h 。测定不同培养时间斜面培养基上 的菌体数量，并在不同培养时间的试管斜面上分别刮取l c m 2 菌苔，接种于种子培 养基中，在3 7 。c ，2 2 0 r p m 的培养条件下，培养4 0 h 后，转接发酵培养基，发酵培 养1 9 2 h 后测定发酵液效价。 2 3 2 种龄的优化 2 3 2 1通过菌丝形态确定种子龄 取f l m - 0 7 - 0 7 # 生产菌种一支，吸取0 2 m 1 分别平行接入4 0 m l 5 0 0 m l 的三角 瓶中，放入3 7 c