（海洋生物学专业论文）青岛近海岸特征环境中海洋异养细菌的鉴定及其分布特征的研究.pdf

， 青畸近海岸特征环境中异养卸f 菌的鉴定及其分布特征的研究 青岛近海岸特征环境中海洋异养细菌的鉴定及其分布特征的研究 中文摘要 青岛近海洁净海区、养殖密集区、工业区分离了4 2 8 株菌，通过b i o l o g 方法对其进行了鉴定，对结果进行比较分析发现洁净海水特有的种群为聚 簇3 7 。养殖密集区来源于海水中的特有种群为：聚簇7 、聚簇4 9 ；来源于 底泥中特有种群为：聚簇l l 、聚簇14 ；海水、底泥中都特有的种群为：聚 簇18 、聚簇4 7 。工业区来源于底泥且为该区所特有的种群为聚簇36 ：海水、 底泥中均有分布的特有种群为聚簇16 、聚簇2 2 。 a r d r a 方法分析青岛近海岸特征环境中的异养细菌，采用r s a f 和协d 1 分别进行 酶切，结果显示：胎a ，酶切后产生9 种带型，肌“酶切后产生1 1 种带型。且与b i o l 0 2 结果大体一致。 经1 6 s r d n a 分析和生理生化鉴定得出：d 1 2 3 3 与d 4 0 5 8 为塔氏弧菌( v i b r f o t a s m a n i e n s i s ) ；d 4 0 5 l 和d 1 2 3 4 为灿烂弧菌( b r i os p l e n d i d u s ) ：d 5 0 5 0 为v b r i o a l g i n o l y t i c u s 。d 2 1 13 、d 6 0 8 4 、d 3 0 3 8 、d 2 0 9 6 为o c e a n i m o n a s d o u d o r o f f i 。d 1 1 0 3 、d 1 1 3 4 为a c i n e l o b a c t e rj o h n s o n # 。d 3 0 4 4 、d 3 0 4 3 为e r y t h r o b a c t e ra q t d m a r i s 。d 4 0 4 2 为 r h o d o v f ，苫“a q u i m w i n a 。d 3 0 5 2 、d 3 0 5 5 、d 3 0 5 7 、d 3 0 4 7 、d 4 0 1 2 、d 4 0 4 1 、d 3 0 4 8 、d 3 0 5 4 为噬纤维菌属，并且为同一种。d 7 0 3 8 可确定为橙色假交替单胞菌( n p “如a 打g 阳m 伽口5 c i t r e a ) 。d 5 0 4 4 为假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 。其中d 1 2 3 3 、d 1 2 3 4 来自聚簇3 7 ；d 7 0 3 8 来自聚簇7 ，d 5 0 5 0 来自聚簇4 9 ，d 3 0 4 3 、d 3 0 4 4 来自聚簇1 1 ，d 5 0 4 4 来自聚簇1 4 ，d 2 0 9 6 、 d 2 1 1 3 、d 3 0 3 8 、d 6 0 8 4 来自聚簇4 7 ；d 3 0 4 7 、d 3 0 4 8 、d 3 0 5 2 、d 4 0 4 1 、d 4 0 4 2 、d 4 0 1 2 、 d 3 0 4 7 、d 4 0 1 2 、d 3 0 5 4 来自聚簇4 5 。d 4 0 5 l 、d 4 0 5 8 来自聚簇3 6 ；d 1 1 0 3 、d 1 1 3 4 来自 聚簇1 6 ；d 2 0 0 1 、d 2 0 4 2 来自聚簇2 2 。 通过以上多利，方法的运用，最后得出青岛近海岸的异氧细菌的分布特征：其中洁净 区的特征类群为属于儿b r i o ，工业区的特征类群属于v j b r j 。和爿g j ，7 er o b a c p ， 养殖密集区的特征类群属于v i b r i o 、p s e u d o a h e r o m o n d s 、r h o d o v f 阳d 、p s e u d o d ”订s 、 o c e a n i m o n a s 、e r y t h r o b a c t e r 和c e l l u l o p h a g a 。 关键词：海洋异养细菌；b i o l o g 鉴定；a r d r a ；1 6 s r d l 蛆鉴定；生理生化鉴 i i 青岛近海岸特征环境中异养细菌的鉴定及其分布特征的研究 英文摘要 i d e n t i f i c a t i o na n dd i s t r i b u t i o no fm a r i n eh e t e r o t r o p h i cb a c t e r i a i ns p e c i f i ca r e ao fq i n g d a oc o a s t a b s t r a c t f o u rh u n d r e da n dt w e n t ye i g h ts t r a i n so fh e t e r o t r o p h i cb a c t e r i aw e r ei s o l a t e d f r o mm a r i n es e d i m e n t ，s e a w a t e r ，s e a w e e d ，f i s h ，a n ds h e l l i s h ，t a k e nf r o ml o c a t i o n si n q i n g d a os a m p l i n gl o c a t i o n sw e r ec o m p r i s e do fi n d u s t r i a l l ya n da q u a c u l t u r a l l y a f f e c t e ds i t e sa n d c l e a n ，c o n t r o ls i t e s b i o l o g t e c h n i q u e w a sa d o p t e df o r i d e n t i f i c a t i o na n d c l u s t e r i n g o ft h e s ei s o l a t e s a f t e r a n a l y s i s o ft h e b i o l o g i d e n t i f i c a t i o nr e s u l t s ，w ec o n c l u d e ：c l u s t e r3 7i st h es p e c i f i cs p e c i e si ns e a w a t e ro f c l e a ns i t e c l u s t e r 7 、c l u s t e r 4 9 、c l u s t e r l l 、c l u s t e r l 4 、c l u s t e r l8a n dc l u s t e r 4 7w e r e i s o l a t e df r o ma q u a c u l t u r a l l ya f f e c t e d s i t e s c l u s t e r 7a n dc l u s t e r 4 9a r et h es p e c i f i c s p e c i e si ns e a w a t e ro ft h i ss i t e c l u s t e r l1a n dc l u s t e r l 4a r et h es p e c i f i cs p e c i e si n s e d i m e n to ft h i ss i t ec l u s t e r l8a n dc l u s t e r 4 7a r et h es p e c i f i cs p e c i e si ns e a w a t e ra n d s e d i m e n t c l u s t e r 3 6 、c l u s t e r l6a n dc l u s t e r2 2a r ec l o l l e c t e df r o m i n d u s t r i a l l y s i t ec l u s t e r 3 6i st h es p e c i f i cs p e c i e si ns e d i m e n to ft h i ss i t e c l u s t e r1 6a n dc l u s t e r 2 2a r et h es p e c i f i cs p e c i e si ns e aa n ds e d i m e n to ft h i ss i t e a r d r aa r eu s e df o rt h ea n a l y s i so fd i v e r s i t yo fm a r i n eh e t e r o t r o p h i cb a c t e r i af r o m q i n g d a oc o a s t t h ep r o d u c t i o no fp c ra r ed i g e s t e db yr s a ia n dh h a ir e s p e c t i v e l y t h e 4 d i g e s t i o n so f r s a ih a v en i n eb a n d i n gt y p e s t h ed i g e s t i o n so f h h a ih a v ee l e v e nb a n d i n gt y p e s t h er e s u l t so f a r d r aa r en e a r l yi na c c o r dw i t hb i o l o g b yp h y s i o l o g i c a l a n db i o c h e m i c a li d e n t i f i c a t i o na n d a n a l y s i s o f 16 s r d n a s e q u e n c i n g ，w ec o n c l u d e ：d 1 2 3 3h a v ec l o s e rr e l a t i o n s h i o pw i t hd 4 0 5 8 ，t h e ya r ei d e n t i f i e da s v i b r i ot a s m a n i e n s i sd 4 0 5 1a n dd 1 2 3 4a r ei d e n t i f i e da sv i b r i o s p l e n d i d u s d 5 0 5 0a r e i d e n t i f i e da sv i b r i oa l g i n o l y t i c u s d 5 0 4 4i si d e n t i f i e da sp s e u d o m o n a s d 7 0 3 8i si d e n t i f i e da s 1 l i 曼! 鬯j ! ! ! 塑! ! ! 堕主墨茎塑堕塑鳖塞墨苎坌塑堑笙塑翌壅 p s e u d o a l t e r o m o n a sc i t r e a d 6 0 8 4i si d e n t i f i e d a so c e a n i m o n a sd o u d o r o j f i d 1 1 0 3 i s i d e n t i f i e da sa c i n e t o b a c t e rj o h n s o n i i d 3 0 4 4a n dd 3 0 4 3a r ei d e n t i f i e d a se n r y t h r o b n c t e r d 4 0 4 2i si d e n t i f i e da sr h o d o v i r g aa q u i m a r i n a t h ed i s t r i b u t i o no fb a c t e r i af r o mt h e s et h r e es i t e s i sw i t hr e g u l a r i t y t h er e s u i t sa r ea s f o l l o w s ：t h ep e c u l i a r c o m m u n i t yi nc l e a ns i t ei sh b r i o t h ep e c u l i a rc o i i l r n u l l i t i e si n i n d u s t r i a l l ys i t e sa r ev i b r i oa n da c i n e t o b a c f p r t h ep e c u l i a rc o m m u n i t i e si na q u a c u l t u r a l l y a f f e c t e ds i t e sa r eh b r i o 、p s e u d o a l t e r o m o n a s ，r h o d o v i r g a ，p s e u d o l p l o n 盘s 0 c e 。嚏 m 。啊能s 、 e r y t h r o b a c t e ra n dc e l l u l o p h a g a k e yw o r d s ：m a r i n eb a c t e r i a ，b i o l o gi d e n t i f i c a t i o n ，a r d r a ，a n a l y s i so f 16 s r d n a s e q u e n c i n g ，p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a li d e n t i f i c a t i o n 青岛近海岸特征环境中异氧细菌的鉴定及其分布特征的研究 刖舌 海洋约占地球表面积的7 1 ，其区域环境复杂多变，高盐、高压、低温、低营养和 无光照等特殊区域生态环境使海洋微生物在物种、基因组成和生态功能上具有多样性。 2 0 世纪8 0 年代中期，由于海洋技术迅速发展，世界各国和组织对海洋微生物资源的开 发、利用越来越重视，并投入大量的财力物力，分子生物学技术的迅速发展和计算机的广 泛应用在客观上加速了海洋微生物多样性的研究，使其进入一个崭新的阶段 1 。 1 海洋微生物多样性的概念 海洋微生物种类繁多，据统计有1 0 0 万至2 亿种，而且相对于陆地微生物而言，它们 能够耐受海洋特有的高盐、高压、低营养、低光照等极端条件，因而在物种、基因组成 和生态功能上具有多样性，是整个生物多样性的重要组成部分。通常情况下，生物多样性 可以理解为生物物种的多样化及其变异的程度和广度，是物种多样性、遗传多样性和生 态系统多样性3 个层次上的综合表述 ”。海洋微生物多样性是所有海洋微生物种类、种 内遗传变异及其生存环境的总称，包括生活环境的多样性、生长繁殖速度的多样性、营 养和代谢类型的多样性、生活方式的多样性、基因的多样性和微生物资源开发利用的多 样性等o ，1 。海洋微生物多样性自身的特点和当前研究的手段，决定了目前海洋微生物多 样性的研究通常集中于以下几个水平，即分类多样性、功能多样性、遗传多样性和系统 发育多样性吐 海洋微生物种类繁多，包括海洋细菌、海洋真菌和海洋放线菌，其种类约是陆生微 生物的2 0 倍以上，目前已发现的海洋微生物类群如下后币示【5 】= 非细胞类生物：病毒v i r u s e s 古菌a r c h a e a 化能自养菌：产甲烷细菌m e t h a n g e n s ；嗜热酸细菌t h e r m o a c i d o p h i l e s a 化能异养菌：嗜盐细菌h a l o p h i l e s 细菌b a c t e r i a 重量燮堑笙堑苎主墨墨塑堕塑鉴塞墨苎坌塑壁笙塑堡塞 光能自养菌 厌氧光合菌：紫色光合细菌和绿色光合细菌( 红菌螺目r h o d o 印i r l l a l p 5 ) 有氧光合菌：兰细菌c y a n o b a c t e r i a ( 兰细菌目c y a n b 日c f e r i d 7 p n 原绿植物菌p r o c h l o r o p h y t e s ( 原绿菌目p r o c h l o r a l 8 j ) 化能自养菌：硝化细菌( 硝化杆菌科n i t r o b a c t e r a c e a p ) ；无色氧化硫细菌；甲 烷氧化菌( 甲烷球菌科m e t h y l o c o c c a c e a e ) 化能异养菌 革兰氏阳性菌：产内孢棒状菌和球状菌；不产孢棒状菌；不产孢球状菌f 微 球菌科埘c m c o c c 8 口e ) ；放线菌( 放线菌目a c t i n o m y c e t a l p 曲 及其相关菌 革兰氏阴性菌：棒状菌和球状菌；好氧菌( 假单孢菌科n p “如m d n d d a c e a e ) ： 兼性菌( 弧菌科所6 r f o d c e 口e ) ；厌氧菌( 还原硫细菌) ；( 粘细 菌目m y x o b a c t e r i a l e s ) ； 真核生物e u c a r y o t e 光合自养菌： 化能异养菌： 低等真菌：壶菌门c h y t r i d i o m y c o t a ；结合菌门z y g o m y c o t a 2 海洋微生物多样性研究发展状况 2 0 世纪4 0 年代以来，人们一直采用分离培养的方法来研究海洋微生物的多样性，即 将海洋微生物从环境中分离纯化，然后通过一般的生物化学性状或者特定的表现型来分 析其多样性。但是海洋中微生物往往集结在一起，一些微生物处于活的非可培养状态 ( v i a b l eb u tn o n c u l t u r a b l es t a t e ，v b n c ) ，而且由于培养基的选择作用以及微生物与其他 生物共生等原因导致应用常规的分离培养方法无法全面的反映海洋微生物资源状态以 及生态功能，从而使大量的有极大应用价值的海洋微生物资源被埋没。a m a n n 等【6 增艮据 微生物原位的、不依赖于培养的微生物系统发育学的研究结果认为：通过实验室人工培 青岛近海岸特征环境中异氧细菌的鉴定及其分布特征的研究 养方法已经分离和描述的海洋微生物物种数量仅占估计数量的1 5 ，而其余9 5 一 9 9 的微生物类群仍然未被分离和认识。 自1 9 8 5 年，p a c e 等利用核酸序列的测序来研究微生物的进化问题以来，对微生物 多样性的研究进入了一个崭新的阶段1 7 】。采用p c r 和1 6 s r r n a 与1 6 s r d n a 序列同源性 比较在海洋微生物多样性研究中取得了较大的进展。w o e s e 等( 1 9 8 9 ) 认为微生物的r r n a 序列在亚种、种、属、群和界的水平上有不同的信号序列。t a k a m i 从l 万米的海底淤泥 中分离出嗜碱、嗜酸、嗜冷细菌等各种极端环境细菌，还有放线菌、真菌等。p o l z 等 8 1 从线虫的体表分离出的海洋微生物大致分为嗜细胞类细菌、硫酸盐还原细菌和柄细菌 等。r a v e n s c h l a g 等 9 j 从永冻的海底沉积物中分离得到了3 5 3 株微生物，通过1 6 s r d n a 斑点杂交发现它们大部分是与硫循环有关的细菌( 主要是d e s u 帕t a l e as p ) 。日本学者 i i z u l c a 等1 9 9 8 年首次报道了从海洋生境中分离到的最适盐浓度为2 一3 的革兰氏阴性 细菌，根据1 6 s r d n a 分析认为是粘细菌。k i t a t s u k a m o t o 等f 1 9 9 3 ) 通过1 6 s r n a 分析表 明海洋假单胞菌p s e u d o m o n a n a u t i c a 与陆地假单胞菌具有明显的不同源性。p a c e 等和 l i e s a c k f l 9 9 3 ) 就直接对r d n a 进行扩增和分析来推断环境中微生物的多样性进行了论 述。目前发现的海洋微生物主要包括：病毒、古菌、细菌、微藻、真菌，还有一些粘细菌 我国对海洋细菌的研究开始于2 0 世纪5 0 年代，5 0 年代后期报道了中国黄海近岸海 水和沉积物中的两个属t h i o b a c i l l u s 和m i c r o c o c c u s ，1 9 6 1 一1 9 7 3 年间对东海进行了海洋细 菌的调查，在2 3 个站位分离了1 3 0 0 多株异养菌报道了1 1 个属，- - p s u d o m o n a s 、p t b r i o 、 a e r m o n a s 、a l c a l i g e n s ，c a u l o b a c t e r ，f l a v o b a c t e r i u m 、m i c r o c o c c u s ，b a c i l l u s ，b r e v i b a c t e r i u m ， a r t h r o b a c t e r 和c o y n e b a c t e r i u m 。 在我国，运用分子生物学手段研究细菌多样性，正成为研究热点。张伟周等【l0 j 从内 蒙古海拉尔地区碱湖样品分离纯化了一批嗜碱菌，并通过生理生化特征、1 6 s r r n a 基因 q 扩增后酶切分析以及系统发育分析，揭示碱湖中嗜碱细菌的多样性；戴欣等1 人通过构 建1 6 s r d n a 基因文库对中国南海南沙海区沉积物中细菌多样性进行了分析，并将获得 的1 6 s r d n a 基因序列与国际基因数据库g e n b a n k 进行相似性比较及聚类分析，研究发 现来自海洋沉积物的尚不能培养的微生物( u n c u l t u r e dm i c r o o r g a n i s m s ) 往往组成一簇， 与现已获得培养物( c u l t u r e d m i c r o o r g a n i s m s ) 并已经鉴定的微生物自然分开。曾润颖等 ”驯应用1 6 s r r n a 作为分子标记，对从东太平洋海底分离到的一批嗜冷细菌进行了分子 青岛近海岸特征环境中异氧细菌的鉴定及其分布特征的研究 分类鉴定，并对其系统发育情况进行了分析。 近年来，对海洋微生物的研究更多的面向海水、沉积物、水产养殖病原、水产养殖 环境、水产品检验、海洋天然产物和环境的生物修复等方面。 3 海洋微生物多样性资源的开发利用 海洋中微生物资源丰富，由于海洋环境的特性，物种间密切的生态关系，因此，海 洋微生物中普遍存在着某些有特殊作用的生物活性物质，而且其活性一般大大超过陆栖 微生物。海洋微生物为人类提供种类繁多、分子结构新颖、化学组成复杂和生理活性特 异的海洋天然产品，是海洋药物、保健食品和生物材料的巨大宝库，而且在海洋生态环 境保护、地球物质循环和能量转换等方面具有非常显著的作用，因而开发利用海洋微生 物资源具有非常大的意义，也是海洋生物技术开发的重要内容。 3 1 研究开发有经济价值的海洋生物活性物质 海洋微生物是研究开发海洋生物活性物质的重要资源，并且可以持续利用而不会导 致海洋物种和海洋生态环境失衡。海洋微生物本身具有生长周期短、代谢易于调控、菌 种易选育和可通过大规模发酵实现工业化等特点，这样更加速了海洋生物活性物质研究 开发的产业化步伐。 目前，海洋微生物天然活性物质的开发应用已取得了很多成果。且主要体现在海洋 药物的开发应用方面，例如已经从海洋细菌、放线菌、真菌等微生物体内分离到多种具 有较强生物活性的物质，包括毒素、抗生素、不饱和脂肪酸、类胡萝h 素等，并着手于这 些物质的工业化生产。自b u r k h o l d e r ( 1 9 6 6 ) 从海洋假单胞菌分离到新抗生素硝毗咯菌素 n 之后，向海洋索取药物才成为开发利用海洋微生物多样性的重要方面。世界各国都在积 极开发海洋抗癌、抗心血管疾病、抗衰老的特效药。c u s t a f s o n ( 1 9 8 9 ) 从海洋细菌中分离 出具有抗病毒和抗细菌活性的大环内酷类化合物。s t i e r l e 等( 1 9 8 8 ) 报道，原来从海绵中 分离出的几种二酮毗嗦化合物均是由与其共生的一种微球菌属细菌产生的。o k a m i ( 1 9 7 6 ) 从海泥中分离到一株链霉菌，可以产生一种有抑制疟原虫和抗球虫活性的物质， 命名为除虐霉素( a p l a s m o m y c i n ) 。o l c a m i ( 1 9 8 6 ) 从黄杆菌属细菌中分离得到一种能显著 抑制小鼠s - 1 8 0 实体瘤病毒作用的多糖物质，命名为m a r i n a c t a n ；从海洋放线菌中得到一 青岛近海岸特征环境中异氧细菌的鉴定及其分布特征的研究 种氨基糖苷类抗生素，命名为天神霉素( i s t a m y c i n ) 。 3 2 海洋生物材料的研究开发 海洋生物材料是指由海洋生物产生的具有支持细胞结构和机体形态的一类功能性 生物大分子，由于其分子结构独特，用途广泛，许多国家在这方面开展了相当深入的研究， 并广泛应用于工、农、医和环保等领域。 生物塑料是目前的热门话题之一，2 0 世纪8 0 年代初，英国i c i i 公司通过大批量培 养，发现一些海洋细菌能够合成的一种塑料多聚物p h b v ，具有防水、无毒、易降解及 生物相容性等优点，在环保、医药等方面具有广泛的应用前景，也从根本上解决了塑料 污染的问题。此外，在研究中发现，嗜盐细菌产生的细菌视紫红质能把光信号转为电信号， 可用于制作新型计算机的生物芯片及生物传感器等；海洋磁细菌能产生超高密度的磁性 记录材料，日本的t d k 公司已经把这一研究发现转化为生产力。 3 3 海洋微生物极端酶资源 极端酶( e x t r e m o z y m e ) 是指那些在非常规条件下仍然发挥作用的酶，它主要来源于极 端生物，是极端生物在极其恶劣环境中生存和繁衍的基础。根据其生理特性的不同，极 端酶大致可分为嗜热酶、嗜冷酶、嗜酸酶、嗜碱酶、嗜压酶、嗜盐酶、耐有机溶酶、耐 抗代谢物酶及耐重金属酶等。作为长期自然进化的结果，极端酶在些普通生物无法生存 的环境中仍然可以保持活力和稳定，因而具有十分诱人的应用前景。此外，研究极端酶还 可以为生物起源和进化、微生物的分类和酶催化机制等基础研究提供新的依据。 目前，已从嗜冷菌中提取了多种嗜冷酶有a 淀粉酶、磷酸丙糖异构酶、蛋白酶、 脂肪酶、胶原酶，嗜冷碱性酶在工业洗涤剂、保持食品营养和风味中起着重要作用。从 嗜热微生物中已筛选到多种热稳定性的酶，如淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖苷酶、木糖聚酶、 磷酸烯醇丙酮酸激酶及d n a 聚合酶，这些酶在7 5 一1 0 0 之间具有良好的热稳定性。 6 ，0 0 0 m 以上深海嗜压微生物是嗜压酶的重要来源，高压增加了酶的活性和热稳定性， 且使酶具有良好的立体专一性，在高温和高压下，底物溶解度增加，溶剂黏度减少，提 高了物质的传输速率和反应速率，决定了嗜热嗜压酶在化学工业上有着良好应用前景。 嗜酸酶和嗜碱酶，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶，许多碱性酶已应用于医药等方面。嗜盐 青岛近海岸特征环境中异氧细菌的鉴定及其分布特征的研究 微生物内有在高盐浓度下保持稳定性的海藻嗜盐氧化酶。具有耐有机溶媒的嗜盐酶在化 学工业的化合物合成、石油工业的原油精炼及污水处理等方面的应用翻开了新的一页。 3 4 海洋污染环境的生物修复 海洋微生物是海洋生态系统的重要成员，参与海洋中物质循环，在消除海洋污染物 质，海洋自净起着重要作用，称为“海洋清洁工”。已发现2 0 0 多种能氧化一种或多种 水体污染物的微生物，某些霉菌和放线菌去除无机氰化物效率可达到9 0 以上，分解酚 类化合物的能力一般都在9 5 以上。海洋光合细菌还能应用于鱼虾等水产养殖的赤潮毒 女 由。 目前，应用微生物降解原理治理海洋污染环境已取得了很大的成功，并得到了广泛 的认可。随着研究水平的不断提高和范围不断扩大，一些更加有效和适应性更强的工程 微生物将会诞生，并将产生更大的经济和社会效益。 4 细菌分类与鉴定的发展概况 以前，细菌分类是通过多种生理生化试验把细菌分成属和种的。这种方法需要分离 单菌落，并对单菌落进行试验室培养。这种分类方法为传统分类法，运用这种分类方法 鉴定了很多可培养的海洋细菌。然而不到l 的海洋细菌可在实验室条件下培养。据估 计世界上的微生物种类接近三百万【1 3 】，而已被鉴定的种类仅有三、四千种 1 4 】。自二十世 纪七十年代以来，c a r lr w o e s e 和他的同事通过1 6 s r r n a 的序列来研究原核生物的进 化，对原核生物进化的认识大大提高。通过1 6 s r r n a 的序列分析法，他们认为生命是 由细菌域、古菌域、和真核生物域所构成 1 “。随着分子生物学的飞速发展，越来越多的 方法被用于细菌鉴定。些新的种类被发现，并且也发现些以前分类不合适的地方。 总之，细菌分类系统不断的完善。 4 1 传统的分类方法 利用传统方法进行细菌分类鉴定，需要做大量的形态以及生理生化等方面的实验， 然后再把这些特征综合起来对照细菌分类手册进行鉴定。常见的实验特征有：形态特征 ( 革兰氏染色、鞭毛染色、运动性、芽孢染色、荚膜染色、细胞壁、异染粒、色素、伴 青岛近海岸特征环境中异氧细菌的鉴定及其分布特征的研究 孢晶体等) 、菌落形态、生理特征( 生长温度、酬盐性、需氧性、碳源利用、氮源利用、 抗生素敏感性等) 、生化特征( 发酵类型、氧化酶、接触酶、脂酶、吲哚、甲基红、磷 酸酶、硫化氢等) 、营养分类( 光能营养、化能无机营养、化能有机营养) 、致病性、共 生关系等。 传统分类鉴定测定项目众多，比较费力、费时，有时所得结果也不很准确。但是， 传统的鉴定实验结果是描述种属特征所必不可少的。 4 2 数值鉴定和自动化鉴定等 由于传统的鉴定方法比较繁琐，不能适应快速鉴定的要求。因此，在传统鉴定的基 础上出现了多种类型成套系统及编码鉴定方法。根据鉴定对象采用一定数目试验( 试验 卡) ，所得结果( 包括属、种的名称，有的鉴定系统还可以给予分类位置) 。目前，以应 用的快速简便的商品化鉴定系统很多，例法国生物一默里埃( b i o m e r i e u x ) 公司的 a p l ( a n a l y t i cp r o d u c t si n c 简称) 、m i c r o i d 系统、e n t e r t u b e 系统、m i n i t e c k 系统、d s 系 统以及s p e c t r u m l 0 系统等，国内也有不少的编码鉴定以及商品化的微型鉴定系列。此 外，美国安普技术中心推出了的b i o l o g 细菌自动鉴定系统。b i o l o g 细菌自动鉴定系统主 要是根据细菌9 5 种碳源的利用情况，即主要是根据细菌的代谢途径而不是代谢产物区 分细菌，且结果由计算机处理，所以用其鉴定细菌有独到的优点。 4 3 分子生物学分类鉴定 随着分子遗传学和分子生物学技术的迅速发展，细菌分类学进入了分子生物学时 代，许多技术和方法在细菌分类学中得到了广泛的应用。目前，r r n a 分子已成为一个 分子指标。广泛地用于各种微生物的遗传特征和分子差异的研究，加上大量已知微生物 的d n a 都被测定并输入国际基因数据库，成为对微生物鉴定分类非常有用耵参照系统， 从而可以通过对未知微生物d n a 序列的测定和比较分析，达到对其进行快速、有效的 鉴定分类的目的。 原核生物中的核糖体r n a 有2 3 s 、1 6 s 、5 s 三种类型，它们分别含有的核营酸约2 9 0 0 、 1 5 4 0 和2 0 个。r r n a 在大多数原核生物中都具有多个拷贝【1 6 j 5 s 、1 6 s 和2 3 sr r n a 的拷 贝数相同i l ”。5 s r r a n a 易分析，但是核苷酸少，没有足够的遗传信息用于分类研究。 2 3 s r r n a 含有的核苷酸几乎是1 6 sr r n a 的两倍，分析比较困难。1 6 s r r n a 的相对分子 青岛近海岸特征环境中异氧细菌的鉴定及其分布特征的研究 量适中，可以作为比较理想的研究对象。在相当长的进化中，r r n a 分子的功能几乎保 持恒定，而且其分子排列顺序有些部位变化非常缓慢，以致保留了古老祖先的些序列。 也就是说，从这种排列序列可以检测出种系发生上的深远关系。r r n a 结构既具有保守 性，又有高变性。保守性能够反映生物物种的亲缘关系，为系统发育重建提供线索；高 变性则能揭示出生物物种的特征核酸序列，是属种鉴定的分子基础。r r n a 在细胞中含 量大，可以获得足够的量供比较研究之用。细菌的1 6 s r r n a 的可变区位点结构如下： 5 v lv 2v 3v 4v 5 v 6v 7 v 8v 9v 1 03 5 4 0 b p9 7 0 b p l5 4 0 b p 可变区( v a r i a b l er e g i o n ，v 1 1 0 )v i ：6 1 1 0 6 b pv 2 ：1 2 1 - 2 4 0 b p v 3 ：4 3 6 - - 5 0 0 b pv 4 ：5 8 8 - - 6 7 1 b p v 5 ：7 3 4 7 5 4 b pv 6 ：8 2 9 - 8 5 7 b p v 7 ：9 9 0 1 0 4 5 b pv 8 ：1 1 1 8 - 1 1 6 0 b p v 1 2 4 0 1 2 9 8 b p v 1 0 ：1 4 1 0 - 1 4 9 2 b 二 i - - g 定_ e ( c o n s t a n tr e g i o n ) 附表1 目前比较通用的几种1 6 sr r n a p c r 扩增引物 引物缩写：t 正向r ：反向d 远端p 近端。带f 的包含e c o r i 和s a l i 的位点；r 包含h i n d l i i 和b a m h i 和x m a l 青岛近海岸特征环境中异氧细菌的鉴定及其分布特征的研究 i 识别序列：反向引物产生r r n a 的互补序列：r p l 、r p 2 、r p 3 除从3 端开始的第17 个碱基不同外全部相同。2 所 有引物序列方向都从5 - 3 ，连接序列包含d n 字母写的克隆用酶切位点； 可变区序列因不同细菌而异，恒定区序列基本保守，所以可以利用恒定区序列设计引 物将1 6 sr r n a 片断扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行 分类鉴定。目前比较通用几种1 6 sr r n a p c r 扩增引物见附表( 1 ) 1 8 1 。 1 6 s r r n a 的序列分析技术原理是：从微生物样本中钓取1 6 s r r n a 的基因片断，通过 克隆、测序或酶切、探针杂交，获得1 6 s r r n a 序列信息，再与1 6 s r r n a 数据库中的序 列数据或其它数据进行比较，确定其在进化树中的位置，从而鉴定样品中可能存在的微 生物种类。其技术步骤主要包括以下3 步： 第一步基因组d n a 的获得 首先从微生物样品中直接提取总d n a ，对易于培养的微生物可通过培养富集后再 进行提取。另一种选择是提取微生物细胞中的核糖体r n a 。r r n a 在细胞中的含量很高， 易于获得较多的模板，但是r n a 易于降解，r n a 的提取技术相对于d n a 的提取较为 复杂，一般研究多采用提取细胞总d n a ，但也可以根据情况选择提取r r n a 。由于r r n a 在死亡的细胞中很快降解，提取r r n a 通过反转录钓取1 6 sr d n a 序列的方法能够区分 被检测的细胞是否为活体细胞【“1 。 第二步1 6 s r r n a 基因片段的获得 现在一般采用1 6 s r r n a 引物扩增总d n a 中的r d n a 序列，或通过反转录p c r 获 得c r d n a 序列后再进行分析，采用p c r 技术的优点在于不仅一次性从混合d n a 或r n a 样品中扩增出1 6 s r r n a 序列，而且方便了后面的克隆和测序。但也同样会出现p c r 所 固有的缺点，尤其是采用1 6 s r r n a 保守序列的通用引物对多种微生物混合样品进行扩 增，可能出现嵌合产物( c h i m e r i cp r o d u c t ) 和扩增嗜性现象，影响结果分析。 第三步通过1 6 s r f 扑 , r a 基因片段分析对微生物进行分类鉴定 1 6 s r f u , ! a 基因片段的分析方法主要包括以下3 种：一是将p c r 产物克隆到质粒载 体上进行测序，与1 6 s r r n a 数据库中的序列进行比较，确定其在进化树中的位置，从 而鉴定样品本中可能存在的微生物种类，该方法获得的信息最全面，但在样品成分复杂 的情况下需要大量的测序工作。二是通过1 6 s r r n a 种属特异性的探针与p c r 产物杂交 一伙的微生物组成信息。此外探针也可以直接与样品进行原位杂交，通过原位杂交不仅 青岛近海岸特征环境中异氧细菌的鉴定及其分布特征的研究 可以测定微生物的形态特征和丰度，而且能够分析他们的空间分布。该方法简单快速， 主要应用于快速诊断，但可能出现假阳性或假阴性结果。第三是对p c r 产物进行限制 性片断长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g e m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m s ，r f l p ) 分析，通过观察酶 切电泳图谱、数值分析，确定为生物基因的核糖体型( r i b o t y p e ) ，再同核糖体库中的数 据进行比较分析样品中微生物组成或不同微生物的种属关系。 现在比较通用的核酸序列数据库有g e n b a n k ( n a t i o n a li n s t i t u t e so fh e a l t h ) 、 e m b l ( e u r o p e a n m o l e c u l a rb i o l o g yl a b o r a t o r y ) 、d d b j ( d n ad a t ab a n ko f j a p a n ) 。 除了1 6 s r r n a 方法外，还有d n a 的g + c 含量测定、d n a d n a ( 杂交) 同源性测定、 扩增片断长度多态性分析、限制性片断长度多态性分析、随机扩增d n a 多态性分析等。 5 细菌多态性分析 5 1 变性梯度凝焦电泳( d g g e ) 或温度梯度凝胶电泳( t g g e ) 在含有连续变性梯度或温度梯度的凝胶中加入双链p c r 产物，p c r 产物中不同g + c 含量的d n a 在凝胶中的移动速度是不同的，低g + c 含量的d n a 组分在凝胶中变性比 较快，迁移速度慢；高g + c 含量的d n a 组分在凝胶中变性比较慢，迁移速度快，因此 形成不同的条带，反映d n a 的多态性，同时可以通过对不同条带的定量分折来比较不 同微生物群落中的优势种属。理论上说，有一个碱基对不同的d n a 都可用d g g e 分开 2 2 1 。除了t g g e 的梯度是温度梯度而不是变性梯度外，t g g e 和d g g e 具有相同的原 理。 d g g e t g g e 具有可信性，重复性，且快速，价格并不昂贵。多种样品可以同时分 析，这样可以研究微生物种群的变化 2 3 1 。d g g e t g g e 的不足有p c r 倾向性 2 5 1 、繁琐 的样品处理过程，这样就会影响到微生物群落 2 3 , 2 4 ，和可变d n a 提取率【2 。 现在，利用d g g e 来分析1 6 s r r n a 基因片断己被用于反映微生物群落组成【2 ，并 且可以得到群落成员间的系统发育关系口7 2 ”。 5 2 随机扩增d n a 多态性分析( r a p d ) 随机扩增d n a 多态性分析，又称为随意引物p c r ，是一种d n a 指纹多态性分析 青岛近海岸特征环境中异氧细菌的鉴定段其分布特征的研究 技术，其理论依据是不同的基因组中与随意引物匹配的碱基序列的位点和数目可能不 同，因而用一组人为设计的核苷酸作为引物，通过p c r 随机扩增可产生物种特异性的 d n a 带谱。因此r a p d 技术可用于细菌种间、亚种间乃至株间的亲缘关系分析，未知 菌株的快速鉴定和流行病学调查等。此外，r a p d 的p c r 产物还可作为探针，与s o u t h e r n 杂交技术结合，用于基因组或菌落杂交，可以填补基因组的遗传图谱和物理图谱间的空 缺。 r a p d 的优点有：( 1 ) 有极大的丰富性，能反应整个基因组的变化。( 2 ) 极大的探测 性，无需合成特定序列的引物。( 3 ) 高效性与灵活性，可在短期内获得大量的多态性 d n a 片断，只要遗传特异性发生变化，即使亲缘关系非常近的个体也能识别。( 4 ) 简 便、快速、费用低、分子识别率高、对环境污染小等。 不足：( 1 ) 稳定性差：由于单链引物随机结合在众多反向重复序列上，因而每次试验 得到的结果不可能一致，解决办法是对单链引物进行筛选，优化p c r 条件。( 2 ) 高度 的变异性，即使亲缘关系非常近的物种间结果也有很大的差异。( 3 ) t m 低的随机引物， 易受到外界条件影响。如反应体系，m 9 2 + 浓度。( 4 ) 反应使用不同引物导致产物信号 差异太大，无法进行分析。 与r a p d 相似的分子标记技术有：a p p c r ( a b i t r a r i l y p r i n e dp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ， 用2 0 - 3 0 n t 做引物) 、d n f ( d n aa m p l i d i c a t i o nf i