（有机化学专业论文）几种活性有机小分子的化学合成工艺研究.pdf

中山大学硕士毕业论文摘耍 题目：几种活性有机小分子的化学合成工艺研究 专业：有机化学 硕士生：于志文 指导老师：卜宪章副教授 摘要 本论文分两部分：第一部分是关于莱克多巴胺的化学合成工艺的研究；第 二部分是关于谷胱甘肽的化学合成工艺的研究。 第一部分主要研究了从覆盆子酮和对羟基苯乙酮出发，经四步反应得到菜 克多巴胺的反应工艺。先由覆盆子酮经l e u c k a r t 反应得到中间体1 一甲基3 ( 4 羟基苯基) 一丙胺，再与对羟基苯乙酮的溴代产物连接，得到1 - f 4 羟基苯 基) 一2 - 3 - ( 4 一羟基苯基) - l - 甲基丙胺】一乙酮，最后用硼氢化钠还原得到莱克多巴胺。 本部分工作探讨了不同的l e u c k a r t 反应试剂、同一试剂不同温度下对覆盆 子酮的还原胺化的影响，得出以甲酸铵和甲酸为反应试剂，先1 7 0 反应2 小时， 再1 9 0 。c 反应2 小时为优化条件，产率为8 2 。用硼氢化钠还原1 ( 4 羟基苯 基) 一2 _ 3 一( 4 - 羟基苯基) 一1 一甲基丙胺 - 乙酮能顺利地得到最终产物莱克多巴胺，产率 为8 l 。 第二部分主要研究了以谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸为原料经过一系列的保 护、缩合和脱保护反应得到谷胱e r 肽的化学工艺。先将谷氨酸、半胱氨酸用特殊 的保护试剂保护，再缩合，得到中间体二肽。中间体二肽与保护的甘氨酸反应得 到中间体三肽。在特定的条件下，中间体三肽脱去保护得到谷胱甘肽。 本部分工作探讨了谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸多种保护方法；各种缩合剂 的缩合方法以及中间体三肽不同的脱保护条件，最终得出一条优化的谷胱甘肽合 成路线。 关键词：莱克多巴胺l e u c k a r t 反应谷胱甘肽 i i 中山大学硕士毕业论文a b s t r a c t t i t l e ：c h e m i c a ls y n t h e s i so fs e v e r a la c t i v eo r g a n i cm o l e c u l e s m a j o r ：o r g a n i cc h e m i c a ls c i e n c e n a m e ：z h i w e ny u s u p e r v i s o r ：x i a n z h a n gb u ( a s s o c i a t ep r o f e s s o r ) a b s t r a c t t h ec h e m i c a l s y n t h e s i so fr a c t o p a m i n e ( r a c ) a n dg l u t a t h i o n e ( g s h ) a r e o p t i m i z e di nc u r r e n tw o r k 。 i nt h ec a s eo f r a c ，4 - ( 4 一h y d r o x y p h e n y l ) b u t a n 一2 一o n e a n dp - h y d r o x y - a c e t o p h e n o n ea r eu s e da sr a wm a t e r i a l s f i r s t ，4 - ( 4 一h y d r o x y p h e n y l ) 一b u t a n - 2 一o n ei s d i r e c t l yt r a n s f e r e dt o1 - m e t h y l 一3 一f 4 一h y d r o x y - p h e n y l ) p r o p y l a m i n eb a s e do nt h e l e u c k a gr e a c t i o n ，a n da no p t i m i z e dc o n d i t i o ni se x p l o r e da n df o u n di n t h i ss t e p s e c o n d ，c o u p l i n go ft h ea b o v ep r o d u c tw i t h 一b r o m o p h y d r o x y a c e t o p h e n o n el e a d s t o 1 - ( 4 一h y d r o x y - p h e n y l ) - 2 一【3 - ( 4 一h y d r o x y p h e n y l ) 一1 m e t h y l p r o p y l a m i n o - e t h a n o n e ，m i l c hj sf i n a l l yr e d u c e dt or a cb ys o d i u mb o r o h y d r i d ew i t hh i g ho v e r a l l y i e l d g l u t a t h i o n ei ss y n t h e s i z e db yu s i n gg l u t a m i ca c i d ，c y s t e i n ea n dg l y c i na sr o w m a t e r i a l s a f t e rt h ep r o t e c t i o no fe a c ha m i n oa c i d s ，t h ep r o t e c t e dg l u t a m i ca c i da n d c y s t e i n ci sf i r s t l yc o u p l e dt of o r mad i p e p t i d e t h ed i p e p t i d er e a c t sw i t hg l y c i n e g i v i n gf u l l yp r o t e c t e dt r i p e p t i d e ，t h el a t e ri sd e p r o t e c t e du n d e rd i f f e r e n tc o n d i t i o n s a f f o r d i n gg s h i nt h i sp a r t ，t h ep r o t e c t i o ns t r a t e g i e s ，c o u p l i n gm e t h o d sa n dt h e d e p r o t e c t i o nc o n d i t i o na r es y s t e m a t i c a l l yi n v e r s t i g a t e d k e y w o r d s ：r a c t o p a m i n e l e u c k a r tr e a c t i o n g l u t a d f i o n e i i i ! ! l l 查兰翌= ! 三望兰竺堡苎 圭蔓些宣望笙塑兰垡兰 h h 主要化合物结构与代号 r a o h h r a c 1 r a c 3 谷胱甘肽合成路线中间体的结构式略 h c l 鹋 中山大学硕士毕业论文第一章前言 第一章前言 活性有机小分子是指能与生物大分子( 如蛋白质、多糖、核菅酸和酶等) 相 互作用并发挥某种生理作用的生物活性物质。目前有机小分子药物在临床应用中 使用非常广泛，它们通过与体内的酶、核酸等大分子相互作用，调控该生物大分 子的生理活性，发挥药效。研发高效的活性有机小分子的合成制各工艺，以廉价、 有效的合成工艺降低原料药的制各成本，对最终药物的使用成本控制及相关药物 的推广使用至关重要，具有重要的社会、经济意义。本论文工作主要针对具有广 泛应用价值的两个有机小分子莱克多巴胺和谷胱甘肽的化学合成工艺进行研究， 优化其合成制各路线，以期精简反应步骤、提高产率并最终达到降低成本，利于 工业化生产的目的。 1 1 莱克多巴胺概述 莱克多巴胺( r a c t o p a m i n e ，商品名p a y l e a n ) 化学名是：1 一( 4 羟基苯基) 2 - l 一 甲基- 3 一( 4 - 羟基苯基) 一丙氨基1 _ 乙醇。它是一种结构及功能都类似于肾上腺素和 去甲肾上腺素的苯酚胺类1 32 肾上腺素激动剂，能选择性激动支气管平滑肌的b ： 受体，临床上普遍用于支气管哮喘治疗。2 0 世纪8 0 年代的一系列动物试验表明， 当用药量为治疗剂量的5 l o 倍时，牛、猪、羊和家禽等多种动物体内的营养成 分由脂肪向肌肉转移，表现为营养“再分配效应( r e p a r t i t i o n i n ge f f e c t s ) ”，具有 调控动物体营养代谢路径，增强脂肪分解代谢，促进蛋白质合成，显著增加胴体 瘦肉率，提高饲料转化率的作用。并被美国f d a 于2 0 0 0 年7 月份批准作为饲料 添加剂应用于畜牧_ k ，也是迄今唯一被f d a 批准应用于食品动物提高瘦肉率的 药物。市场销售的莱克多巴胺为其盐酸盐，以4 种异构体混合物形式存在，分别 为r s 、s r 、r r 、s s 昴构体。下面就其药理作用、药动学、毒理学及安全性、 检测方法和合成方法等方面的研究作一简要介绍。 中山大学硕士毕业论文第一章 前言 1 1 1 莱克多巴胺的药理作用 作为1 32 一激动剂，莱克多巴胺对蛋白质代谢的影响是使动物胴体的肌肉( 主要 是骨骼肌) 比例增加，脂肪含量降低。b2 - 激动剂通过增加a 肌动蛋i 刍m r n a 及 肌球蛋白重链m r n a 生成量来提高蛋白质合成量，通过调节蛋白质降解酶一蛋白 质降解酶抑制剂体系的相应活性来减少蛋白质降解量，最终实现蛋白质沉积增 多。有研究表明“，使用后，背最长肌中的r n a 浓度，r n a d n a ( 代表d n a 转 录活性1 比值显著上升，表明可能在转录或翻译水平促进了蛋白质的合成。莱克 多巴胺使猪背最长肌中c a m p ( 环状3 7 5 一磷酸腺苷) 浓度显著上升，证明c a m p 能促进基因转录和翻译过程。另外，莱克多巴胺能增强猪股二头肌中n a 十、 k + - a t p a s e 活性，提高细胞内外n a + 、k + 离子梯度，促进氨基酸转运进入细胞内， 为蛋白质合成提供更多底物，c a m p 浓度的增加还降低了肌肉和肝脏细胞内c 矿 浓度，减缓肌肉蛋白的降解。 莱克多巴胺也能影响脂肪的代谢过程。脂肪可分为胴体脂肪和非胴体部分， b2 激动剂对它们的沉积均有抑制作用。动物脂肪的基本成分是甘油三酷，沉积 于球形的脂肪细胞内。脂肪分解过程中，甘油三酯分子被分解为游离脂肪酸，导 致脂肪细胞内的脂肪减少，随之脂肪细胞变小，整体脂肪存积量下降。b2 - 激动 剂与脂肪细胞表面膜上的b2 受体作用，激活腺苷酸环化酶。腺苷酸环化酶的活 化引起三磷酸腺昔( a t p ) 转化为环状3 5 一磷酸腺苷( c a m p ) 。c a m p 再激活蛋 白激酶，经过一序列的扩大传递反应，最终提高激素敏感酯酶和甘油三酯分解酶 的活性，促进了脂肪的分解：再加上b2 一激动剂可降低脂肪细胞膜上的胰岛素受 体数量而提高脂肪细胞对胰岛素的抗性，即葡萄糖进入脂肪细胞的数量减少，减 少脂肪合成，最终降低脂肪沉积。所以b2 一激动剂降低脂肪沉积的机制是由于抑 制了脂肪生成和促进了脂肪的分解。 1 1 2 莱克多巴胺对猪生长的影响 陈洪亮等人”1 研究了不同饲料蛋白水平下莱克多巴胺对肥育猜生长的影响， 结果表明，在1 8 粗蛋白水平下，饲粮中添加2 0 m g k g 莱克多巴胺可使育肥猪平 均日增重增加9 0 3 ( p 00 5 ) ，料重比下降1 4 4 8 ，a 采食量减少6 5 8 ；同 中山大学硕士毕业论文 第一章 前言 时莱克多巴胺还显著改变了猪的胴体组成，肥育猪胴体瘦肉率提高了6 ，3 4 ，脂 肪率降低了2 2 7 5 ( p 0 0 1 ) ，眼肌面积增加了9 1 8 ( p o 叭) ，背膘厚降了 2 3 3 9 ( p 0 0 1 ) ，如表一： 表一莱克多巴胺对猪生k 的影响 项目皮肤比例骨骼比例瘦肉率( )脂肪率( )背膘率( )眼肌面积( ) ( )( ) ( h 吨 59 5 06 694 9 _ - 4 - 07 56 6 0 5 20 31 8 6 l 28 419 2 8 03 8 33 85 4 41 2 2 0 m g k g 5 5 6 0 2 590 6 0 9 67 0 2 3 17 51 4 4 2 16 81 4 7 7 02 2 34 20 8 22 2 莱克多巴胺对不同骨骼肌也有不同的作用效果。在1 8 粗蛋白水平下，莱 克多巴胺使背最长肌重量增加1 0 7 9 ( p 0 0 1 ) ，股二头肌重量增加1 2 0 8 ( p 0 0 5 ) ，半腱肌重量增加1 4 2 1 ( p 0 0 5 ) ，腹侧锯肌重量增加1 0 9 6 ( p 0 0 5 ) 。如表二： 表二莱克多巴胺对不同骨骼肌的作用效果 项目背最长肌股二头肌股四头肌臀巾肌半腱肌 腹侧锯肌 0 m g k g 25 6 6 02 2 61 2 4 l 00 9 51 0 6 6 00 9 90 8 5 6 01 0 904 8 5 00 6 306 9 3 0 0 4 9 2 0 m g k g 2 8 4 3 00 8 8l3 9 l 01 0 51 0 8 7 00 4 90 9 2 7 0 0 6 30 5 5 4 00 7 507 6 9 00 6 5 此外，莱克多巴胺对肌肉色泽、系水力、p h 等指标均无影响。 进一步研究表明”1 ，上市前的生猪对莱克多巴胺的反应并不是恒定的，而是 先升高，后达到一个平台，然后再下降。最大的反应是在添加2 0 p p m 莱克多巴胺 的1 9 2 4 天。与许多胴体改良剂一样，莱克多巴胺对无脂瘦肉生长的有利影响需 要一定的氨基酸水平。日粮赖氨酸水平和每天赖氨酸摄入量都要有相应的提高。 目前已经证实莱克多巴胺对猪肉品质无影响，饲喂莱克多巴胺的猪肉与对照组猪 肉的多汁性、风味和嫩度均无区别。 1 1 3 莱克多巴胺的药动学及安全性评价 用”c 标记的莱克多巴胺在几种动物体内的研究表明，口服给药吸收迅速。 大鼠在给药后o 5 2h ，血浆及全血中药物达峰浓度。雄性及雌性大鼠体内的消 除半衰期均约为7h 。但雄性大鼠以2 0 m g k g n 量给药时消除半衰期延长为1 5h 。 犬胃管给药，达峰度时间为4 8h ，血浆及全血中药物消除半衰期约为6h 。莱克 多巴胺一单葡萄糖苷酸轭合物是猪、牛、狗、鼠、火鸡等尿液中的主要代谢产物， 但是在鼠的胆汁中还发现以下3 种残留代谢物：莱克多巴胺一硫酸酯、莱克多巴 中j 火学硕卜毕业论文第一章 前言 胺，硫酸、葡萄糖苷酸非共轭化合物”1 。 莱克多巴胺在体内代谢较快，停药后在一段时间内很快被代谢。样品中母体 的浓度一般很低，大体为n g m l 水平。其安全性方面报道如下： 1 、对猪的毒副作用的研究“1 ：人们在试验中发现，饲喂b2 一激动剂的猪瘸行 及蹄壳破损率增加。研究表明，饲料中添加2 0 x1 0 6 莱克多巴胺，就能使肥育 猪血清中钙含量升高2 0 6 0 ( p 0 0 5 ) ，碱性磷酸酶活性下降1 3 0 2 ( p 0 0 5 ) ， 甲状旁腺激素水平升高5 0 8 1 ( p 0 0 1 ) 。甲状旁腺激素( p t h ) 是调节体内钙磷 代谢的主要内分泌激素，它作用于软骨及骨骼，使间叶细胞转化为破骨细胞，p t h 还加强破骨细胞的活动：从而促进骨盐的溶解，使血液钙水平升高：p t h 还抑制骨 中胶原的合成。因而莱克多巴胺可能是通过刺激甲状旁腺细胞c a d p 的产生，激活 蛋白激酶a ，从而促进p t h 分泌，p t h 通过激活破骨细胞，使软骨及骨骼组织溶解， 导致软骨和骨骼损伤，进而使动物产生腿脚疾病。 2 、对鼠的毒副作用的研究”1 ：莱克多巴胺急性毒性按寇氏法测得l d 5 0 分别 为大鼠：1 8 5 4 8 1 ( 1 6 0 2 7 7 2 1 4 7 8 3 ) m g k g ，小鼠l d 5 0 为：1 8 2 9 7 8 ( 1 6 1 6 2 0 7 1 0 9 ) m g k g 。根据化学物质的急性毒性分级标准，属低毒级。采用剂量定期递增法给 药测得蓄积系数k 值大于5 3 ，根据蓄积系数评价标准为轻度蓄积。大鼠9 0 天亚 慢性试验，从精神状况、体重、采食、血液学指标和组织切片光镜检查上看，在 饲料中添加2 0 、2 0 0 、2 0 0 0 m g k g 莱克多巴胺均无明显毒性反应。 1 1 4 莱克多巴胺的检测方法 尽管美国f d a 己批准莱克多巴胺的应用，但在中国仍属于违禁药物，其监 控检测方法主要有色谱法和酶联免疫吸附法( e l i s a ) 。 色谱法是经典的检测方法，常用于确证分析。酶联免疫吸附法由于抗体中对 莱克多巴胺及其代谢物以及其它的9z 一激动剂都有反应性，检测值常比色谱法 高，因而用作筛选方法。此法是目前检测该类药物撮普遍的方法，具有高效、灵 敏、方法简单、便于推广等优点。 l 、色谱法”1 ：称取一定量的试样0 0 0 9 ；l g 合饲料或5 0 9 浓缩锭料或1 0 9 添加 剂预混合饲料) 置于2 5 0 m l 玻璃具塞三角瓶中，加入1 0 0 m l 酸性甲醇水提取液， 震荡3 0 分钟，静止2 0 分钟，取上清液1 m l 于离心管中。4 5 氮气吹干，加入4 m l 4 中山大学硕l 毕业论文第一章前言 2 冰乙酸溶液溶解，涡动3 0 6 0 秒，加入2 m l 二氯甲烷萃取，涡动3 0 秒，3 0 0 0 r m i n 离心1 0 分钟，取上层乙酸相于另一离心管中，加入2 m l 正已烷，涡动3 0 秒， 1 0 0 0 r m i n 离心5 分钟，弃去上层，用0 4 5ul 微孔有机滤膜过滤作为样品制备液， 供高效液相色谱一荧光检测法分析，激发波长2 2 6 n m ，发射波长3 0 5 n m 。 2 、酶联免疫吸附法( e l i s a ) “。：饲料称取1 9 于试管中，加入2 m l8 0 甲 醇，充分混合5 分钟，2 0 0 0 r m i n 离心5 分钟，取1 0 0 1 tl 上清液用9 0 0ul p b s 缓 冲液稀释。注意所有试剂在使用前要恢复室温。测量步骤：( 1 ) 定好每一标准和 样品在酶标板上的相应位置，每个样品做1 次重复，在相应酶标板孔内加入5 0 ul 标准液和准备好的样品液；( 2 ) 在每一酶标板孔中再加入1 0 0ul 的抗莱克多 巴胺抗体，酶标板用振荡仪震荡混合3 0 秒后，加膜封盖后将酶标板放入3 7 培 养箱孵育3 0 分钟或在1 9 2 5 孵育1 小时；( 3 ) 倒掉板中液体，吸取2 5 0ul 洗液到每孔中，倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍干，共洗涤3 次： ( 4 ) 在每个小孔内移入1 5 01 1l 稀释的酶标记莱克多巴胺，加膜封盖后放入3 7 培养箱或在1 9 2 5 孵育3 0 分钟；( 5 ) 洗涤同步骤3 ：( 6 ) 每孔加1 0 0 ul 反 应底物，置1 9 2 5 。c 暗处反应5 1 0 分钟；( 7 ) 在每个微孔中加入5 0 ul 反应 终止液，轻轻摇动微孔板，用酶标测定仪在4 5 0 n m 处测定，根据标准曲线计算样 品中莱克多巴胺的含量。上海市的地方标准，猪尿用此方法检测限为5 0 l ag l ， 当尿样中莱克多巴胺的含量大于5 0 ug l ，时判定为阳性。 1 1 5 莱克多巴胺的化学合成方法研究 当前检索到的莱克多巴胺的合成方法主要有美匡 e l il i l l y & c o m p a n y f 拘专利 。1 、中科院成都有机化学所陈代谟的专利“、清远市华辰实业有限公司”“1 的专利 香港理工大学陈新滋院士等人“1 的专利。 e l il i l l y & c o m p a n y 的方法之一是利用对羟基苯乙醇酸和复盆子酮为原料合 成莱克多巴胺。反应过程如1 - 1 所示： 巾山大学硕士毕业论文第一章前言 ，、扎q a 。一c 。h s c h 2 0 c - , 6 h s c h 2 c l h 矿墅竺 “吣。一一q 急 。、c e 邺h 2 0 _ 、，n “z + c6hd：h4)：举：。：。 c 6 h s c h 2 0 奇 一 n h ， 1 - h y d r o x y b o n z o t d a z o l e d c cd m f ! 竺竺竺! ! ：! 型坠二竺l t h f 6 0 p $ 1 。h h o 。 此法从对羟基苯乙醇酸和覆盆子酮出发，经过长达近十步的反应得到终产 物，步骤复杂，反应过程中须使用昂贵试剂以及要用到高压反应设备。工业生产 的莱克多巴胺的成本很高。e l i l i l l y & c o m p a n y 提出的方法之二足用对羟基苯乙 醇胺和复盆子酮为原料。反应过程如1 - 2 所示： h 2 n 、q= 一。电文。+ 吣。一詈旦一。电 。h 囝。：! 茎毯蛆旦 一也je t o a c j n a 2 c 0 3 ”u r 目, m o h h c i 型型。u r 。( u j h h c i 6 1 乩“ 图卜5 陈新滋院士等人台成莱克多巴胺的方案 此法步骤简练、操作简单、产率高。不足之处是需要用氢气及高压下反应 工业对安全生产不利。 。9罗。叫卅 _ f 。西。 毛 中山大学硕士毕业论文第一章前言 1 2 谷胱甘肽的概述 谷胱甘肽( g s h ) 是体内自然产生的一种三肽，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氢 酸通过肽键缩合而成。分子量为3 0 7 3 3 ，熔点为1 8 9 1 9 3 。c ，晶体呈无色透明 细长拉状，等电点为5 9 3 。它于1 8 8 8 年在面包酵母菌的提取液中发现，最初命 名为“p h i l o t h i o n ”，1 9 2 1 年确定化学结构，并由英国生物化学家h o p l i n s 改名为 谷胱甘肽( g l u t a t h i o n e ) 。广泛存在于动物组织，如肝脏，肌肉，血液等；植物如 蔬菜，豆类，薯类，菇类，谷物等，在微生物体内大量存在，哺乳动物细胞内的 浓度为1 1 0 m m 。是含巯基量最丰富的细胞内非蛋白分子，具有多种生理活性。 1 2 1 谷胱甘肽的生物化学反应 在正常状态下，细胞内的谷胱甘肽主要以还原态g s h 形成存在，浓度为o 5 1 0 r a m ，氧化态g s s g 的含量很低，浓度在5 5 0pm 的水平。从还原态氧化到氧 化态，有多种途径( 如图1 6 ) ，可以是g s h 直接和自由基反应生产g s s g ，但更 多的时候是g s h 作为抗氧化酶的一个辅助因子，把氧化性的分子还原，自身变为 氧化性。如在g s h 过氧化酶还原h 2 0 2 中( s e 依赖型或非s e 依赖型都是) 、磷酯过 氧化物、二硫化物和核苷酸中。但在n a d p h 的作用下“，谷胱甘肽还原酶可以 有效的把氧化态的谷胱甘肽还原成还原态，始终保持g s s g 在低含量水平，阻维 持细胞内的还原性环境( g s s g g s h 的比例是评价细胞内氧化还原环境的一个重 要参数) 。 另外，g s h 的巯基还可以以形成二硫键的形式，直接连接到蛋白或者非蛋白 的巯基上“，如在一种e h r l i c h 腹水肿瘤细胞中，近3 5 的g s h 是以二硫键的形 式连接在蛋白上。g s h 还可以以硫醇的形式存在，在人的肝脏中，发现有至少三 种g s h 的硫醇化酶，g s h 转移酶也可以水解g s h 的硫酯。 g s h 提供电荷与其他化学物质结合后，或在细胞内被代谢，或靶向性的被 谷胱甘肽硫耦联( g s x ) 的质子泵家族识别，然后被排除到细胞外代谢。此种 代谢物在多种器官和细胞中发现，如血红球细胞、肝细胞、肺细胞和心脏细胞。 它也是发现g s x 泵的关键因素。 】9 6 9 年，s r i v a s t a v a # l l b e u t l e r “”最先报道了人的血红球细胞中，g s s g 跨膜 中山大学硕士毕业论文第一章前言 转移是单向的且为能量依赖性的。它可以逆浓度转移，但旦细胞内的a t p 消耗 完，转导立即停止。1 9 8 0 年证实“，此转移过程中的能量是直接i 扫a t p 提供的。 稍后，此过程被b o a r d 等人“演示出来。 1 9 8 4 年，t o s h i h i s a l s h i k a w a 等人“”报道了，在体外的灌注心脏中，有g s h 耦 联物排除，由于心脏是人体中高度接触从肺中流入的氧化性血液的器官，心脏病 就是心脏被含氧量过多的血液或者某种治疗癌症的药物( p h n 霉素) 氧化所引起 的，所以g s h 对心脏的保护具有非常重要的作用。 在肝脏中，g s s g 和g s h 耦联物主要是排泄到胆汁中，a k e r b o o m 等人报道“， 胆汁中的g s s g 转运系统会被g s h 耦联物所阻断，说明在胆汁中，g s s g 和g s h 耦联物共用一个转运系统。 1 2 2 谷胱甘肽的生物合成路线 在研究体外肝细胞中g s h 的生物合成时，人们发现g s h 是经两步a t p 依赖性 的反应所合成“。首先，二肽l 一谷氨酸半胱氨酸( y g c ) 是由y 谷氨酸半胱氨 酸合成酶( 也称为谷氨酸半胱氨酸连接酶，g s hi ) 以l 半胱氨酸和y 一谷氨酸为 原料合成的。然后，由谷胱甘肽合成酶( g s h i i ) 催化，将甘氨酸连接到y g c ， 得到谷胱甘肽。g s i ti 和g s h i i 的活性都会g s h 所抑制。如图1 - 6 所示： 图卜6 ：微生物中g s h 合成路线和相关的反庸。g f f d h ：葡萄糖一6 一磷酸还原酶， g p x ：谷胱甘肽氧化酶，g r ：谷胱甘肽还原酶，g r x ：谷胱甘肽化酶，g t p ：y 一谷氨酸转移酶 中l | 大学硕士毕业论文 第章前言 1 2 3 谷胱甘肽的生理作用 由于谷胱甘肽的化学性质非常活泼，在细胞内的浓度又非常的高，所咀它的 生物功能十分广泛。主要有：( 1 ) 清除自由基、过氧化物、重金属及黄曲霉素 等毒性物质：( 2 ) 参与氨基酸( 谷氨酰氨、半胱氨酸及其他中性氨基酸) 的转运； ( 3 ) 利于铁、硒和钙的吸收，谷胱甘肽还可以使饲料中的过氧化脂肪酸在吸收 时或吸收后恢复为正常的脂肪酸；( 4 ) 保护胃肠黏膜上皮，防止囚炎症、局部缺 血、氧化物质等对肠黏膜的损伤；( 5 ) 储存并提供其组成氨基酸( 尤其是半胱氨 酸) ；( 6 ) 参与蛋白质和d n a 的合成：( 7 ) 作为还原性物质，利于维生素e 、维 生素c 的还原，维持巯基酶的活性，并可以作为甘油醛磷酸脱氢酶的辅基，乙二 醛酶及磷酸丙糖脱氢酶的辅酶，参与体内三羧循环及糖代谢，使人体获得高能量； ( 8 ) 谷胱甘肽对淋巴细胞增殖及正常功能的发挥起着重要作用；( 9 ) 参与胰岛 素的代谢，降低雌激素、前列腺、白细胞三烯的活性；( 1 0 ) 作为抗癌、抗肿瘤 及治疗艾滋病的辅助药物。 1 2 4 工业上合成谷胱甘肽的方法 虽然g s h 广泛的生理作用被发现，g s h 的生产随之被研究。最先，人们用 溶剂提取法，从生物体中提取出g s h ，但这种方法产量特别低，可用的原料也 比较少，所以生产g s h 的成本非常贵。经过几十年的发展，目前g s h 的生产方 法主要为：化学合成法、生物发酵法和酶催化法。 酶催化法：在酶催化合成中，几种关键的化合物和条件包括：g s hi 、g s h i i 、氨基酸原料( l 一谷氨酸、甘氨酸和l 一半胱氨酸) 、a t p 、保持g s hi 、g s h i i 活性所必需的辅因子( m g ”) 和一个适当的p h 值环境。合成中，需求大量a t p ， 给g s h 的工业化生产带来麻烦，大大提高了g s h 生物合成的成本，所以只能寻求一 个a t p 生成系统来耦联a t p 消耗系统。两种系统同在一种生物体内的称为自耦联系 统，在多种生物体内的称为共耦联系统。自耦联系统研究的比较少，因为很难找 到一种生物体同时含有a t p 生成系统军n a t p 消耗系统。共耦联系统就比较好找到， 如：在大肠杆菌中一个被乙酸激酶催化的反应“”。然而，这种乙酸激酶的底物稳 定性不好而且比较贵。m u r a t a 等人”发现酒酵解菌( s c e r e v i s s e ) 中的葡萄糖 中山大学硕十毕业论文 第一章前言 分解是最简单的a t p 生产系统之一，可以提供足量的a t p 用来g s h 的生物合成。 生物发酵法：酶催化法合成g s h 的浓度可以达到9 9 ，l ，但是所用的氨基酸 原料比较贵，提高了g s h 生物合成的成本。然而生物发酵法克服了这一缺点。 生物发酵法是利用糖作为原料合成g s h 的方法。现在，在工业上，生物发酵 法一般都用s c e r e v i s a e 和c a n d i d au t i l i s 发酵。由野生型的菌种发酵，g s h 含 量一般可以达到0 1 1 0 ( 干细胞体重) 。通过物理或者化学的方法使细胞株 突变，包括紫外、红外、y 一射线s n n 一甲基一n 一硝基一n 一亚硝基胍( n t g ) ，用l ，2 ，4 一 三唑、氰化钠和亚硫酸盐来清除g s i i 类似物( 甲硫氨酸，乙硫氨酸酪酸) ，得至i j g s h 更高含量的细胞株。如对甲硫氨酸敏感的c a n d i d au t i l i sn 7 4 8 细胞株，处理 后的g s i i 含量由原来的0 6 6 5 提高到3 o 。利用突变的方法，一般可以使g s h 的含量达到3 5 。利用s c e r e v i s a e 发酵培养得到的g s h 含量高达9 5 “。 另外，通过程序优化和控制培育条件也可以提高细胞株内的g s h 含量。选择 营养丰富的培育基及其合适的浓度是g s h 发酵法的一个重要因素。研究较多的是 用s c e r e v i s a e 来研究葡萄糖、蛋白胨、k h 。p o 。、维生素和半胱氨酸对细胞生长 和g s t 的浓度的影响。u d e h 等人用优化后的条件培养：将g s h 的含量提高了近一倍 5 j 在发酵时，细胞株的生长速度( u ) 必须得控制，以免降低细胞内g s i t 的含 量。s h i m i z u 等人建立了u 与g s h 含量的数学模型，得出了最优化公式，并通过控 制细胞株的生长速度，将g s h 的含量提高了4 l 。 虽然糖是g s h 发酵中培养基中主要成分，但试验中，加入氨基酸原料可以很 容易的提高g s h 的产率。l 一半胱氨酸被认为是其中最有效的氨基酸。但如果用葡 萄糖作为碳原子的唯一来源时，l 一半胱氨酸在s c e r e v i s a e 生长的第二阶段却表 现出一定的抑制作用。因此，只能添加适量的l 一半胱氨酸，用来提高g s h 的产率， 而不会抑制细胞株的生k 。a l f a f a r a 等人发现“”，一次性加入l 一半胱氨酸比分次 加入效果要好。他们还建立了质量平衡模型，一次性把l 一半胱氨酸加入到培养基 中，再加入g s h 生产系统中，结果产率提高了近2 倍。后来发现，除了l 半胱氨 酸，还有其他几种物质也对g s h 的生成有刺激作用。如蛋白胨、乙醇和乳酸钠。 在g s h 的生物合成中，一个重要的问题就是g s h 会通过反馈作用抑n 6 s hi 、 g s t ti i 的合成活性”。其中，g s hi 催化的反应是速率决定步。g s hi $ f l g s hi i l i 山大学硕士毕业论文第一章前言 是由基因g s h a s w g s h b 合成的。在研究中，发现了一种对反馈机制不敏感的大肠杆 菌细胞株，把此细胞株的基因( g s h a + ) 与g s h b 一同克隆出来，并重组到质粒p g s 5 0 0 中，转导到大肠杆菌r c 9 1 2 中，得至u g s hi 的含量提高了1 0 倍，g s h i i 的含量 提高了1 4 5 倍的细胞株。但是细胞内的g s h 浓度较野生型只提高了1 3 倍。分 析认为主要的原因有：( 1 ) g s h 的反馈仍然抑制了g s hi 的活性；( 2 ) y g t p 降解 了细胞内的g s h 。重组后的细胞株，在有l _ 谷氨酸、甘氨酸、l 一半胱氨酸 n a t p 时，细胞内的g s h 浓度可以达到5 9 l 。 化学合成法：由于其方法比较复杂，产物可能会发生消旋而影响活性等多种 不利因素，所以有关g s h 的化学合成研究的不如生物合成那么广泛。而且由于经 济的利益因素，很多有关化学法合成g s h 的专利和期刊都没有公开报道。 上世纪3 0 年代，h a r i n g t o n c r 。“和v i g n e a u d 。”分别研究了谷胱甘肽的化学 合成方法。 h a r i n g t o n 等人先把n 一苄氧羰基保护的半胱氨酸酰氯化，在碱的存在下接上 甘氨酸乙酯，得到n 一苄氧羰基半胱氨酸甘氨酸乙酯。在碘化鳞的作用下，脱去 苄氧羰基，得到半胱氨酸甘氨酸乙酯。再把n 一苄氧羰基谷氨酸做成酸酐，与甲 醇钠反应生成a 一单甲酯的n 一苄氧羰基谷氨酸，用五氯化磷酰氯化后，再接上半 胱氨酸甘氨酸乙酯，得到保护了的三肽。用氢氧化钠脱去酯基，再用碘化鳞 ( p h o s p h o n i u mi o d i d e ) 脱去苄氧羰基，得到还原型的谷胱甘肽。如卜7 所示： n 图卜7h a r n g t o n 等人合成咎胱甘肽的路线 最终产物用醇溶解后，再用乙醚沉出来，反复几次，直到产物成颗粒状。用 水溶解此沉淀物后，再用热的丙酮把谷胱甘肽沉出来( 除去反应残留的碘) 。再 用05n 的硫酸溶解，加入氧化亚铜，出现丝状的沉淀。过滤后，母液加入硫酸 中山大学硕：i 。毕业论文第一章前言 汞，得到谷胱甘肽的汞盐。用水洗过之后，悬浮在水中，通入h 2 s 。除去硫化盐 的母液，放入有五氧化二磷、氢氧化钠和一碟乙醇的干燥器中。过夜后，得到结 晶，为纯的谷胱甘肽。与s t e w a r t 和t u n n i c l i f f e 得到的产品无明显的差异。 此方法的缺点有：由于谷氨酸的n 一羧基和y 一羧基选择性甲酯化比较差，副 产物很难分离；半胱氨酸羧基酰氯化时巯基没保护，使得合成二肽和三肽的反应 复杂，所以此方法的最终产物的产率很低。用酰氯法将半胱氨酸和甘氨酸缩合起 来，可能会发生消旋化。使用了毒性大、昂贵的碘化鳞来还原苄氧羰基。 v i g n e a u d 等人提出的方法是在h a r i n g t o n 的基础上进一步改进的。据l o r i n g 和d uv i g n e a u d 的报道”“，二苄氧羰基胱氨酸二甘氨酸 ( d i c a r b o b e n z o x y c y s t i n y l d i 9 1 y c i n e ) 和s 一苄氧羰基半胱氨酸甘氨酸都可以在 金属钠和液氨的作用下，还原成半胱氨酸甘氨酸，所以他们用n ，n - - - - - 苄氧羰基 胱氨酸为原料合成二苄氧羰基胱氨酸二甘氨酸，在金属钠、液氨和苄氧羰基氯作 用下得到s 一苄氧羰基半胱氨酸甘氨酸；用h a r i n g t o n 的合成方法得到。一单甲酯 的n _ 苄氧羰基谷氨酸酰氯。将两者缩合得到全保护的三肽，如图卜8 所示： 鼯巷溉一员茹。 孓ho 詈了2 靖o 强o 叽曼 图1 8v i g n e a u d 等人合成谷胱甘肽的方法 全保护三肽的脱保护与纯化处理参照h a r i n g t o n 法。 此方法是h r a i n g t o n 方法的改进，用胱氨酸替代半胱氨酸，避免了半胱氨酸 中巯基的保护。用液氮和金属钠取代碘化鳞，来还原苄氧羰基。但由于谷氨酸还 是采用了h r a i n g t o n 保护法，导致最终产物的产率难以提高；用酰氯法缩合同样 存在消旋的危险。用苄氧羰基保护半胱氨酸甘氨酸时，反应的选择性差。 1 9 5 7 年k i n g 等人”进一步改进了谷胱甘肽的化学合成方法。他们采用氯甲 吨 警r 脚 。亭券 砖丫 拶 莎 中山大学硕士毕业论文 第一章 前言 酸乙酯作为缩合剂；先用丙酮保护半胱氨酸的巯基和氨基，再用甲酸进一步保护 氨基，得到3 一甲酰基一2 ，2 - 二甲基一4 一羧基噻唑：3 一甲酰基一2 ，2 - 二甲基一4 一羧基 噻唑与甘氨酸甲酯缩合得n - - 肽：脱去甲酰基之后，再与n 一苯羰基谷氨酸酐反应 得到全保护了的三肽。此三肽在阱的作用下，脱去苯甲酰基：在氢氧化钡的作用 下，脱去甲酯；最后在汞盐的作用下，得到产物谷胱甘肽。如图1 9 所示： 寸a + b 。挚 警少r u l l 憾 甲酸6l 。， b a ( o h ) 2 硫酸汞 图卜9k i n g 等人合成谷胱甘肽的方法 此方法较前两种方法，有了很大的改进，避免了苄氧羰基的使用；使用了氯 甲酸乙酯作为缩合剂，提高了反应的产率。但谷氨酸是以n - 苯甲酰基谷氨酸酐 的形式参与反应，选择性差、反应产率低、产物难分离；用汞盐脱保护时，产率 只有1 2 5 ，大大降低了整条路线的总产率；且此方法步骤繁多。 1 3 工作的设想和主要内容 从上面的综述可以看出，已有的莱克多巴胺和谷胱甘肽的合成方法都存在各 种各样的的不足，使得其工业化生产难以实现。如谷胱甘肽，国际上的供货商主 要是日本协和，采用发酵法生产，目前对中国市埸实行垄断性销售，严重防碍了 我国相关药物的开发应用。本工作的的主要目标是针对上述两个具有重要应用价 值的有机小分子，在前人报道的基础上，寻找步骤简单，产率高，生产成本更低 的合成方案，使之更适用于工业化生产。 1 3 1 莱克多巴胺的合成工艺研究 ( 1 ) 探索了中间体r a c 1 的合成条件，发现利用优化l e u c k a r t 反应，可一 步将原料覆笳子酮转化为目标中间体，大火精简了反应步骤，提高了产品收率； ( 2 ) 用溴化亚酮溴代对羟基本乙酮，得到中问体r a c 2 ： 1 4 ”挚丫薄 詈等疆 。畦 凡 中山大学硕士毕业论文第一章前言 ( 3 ) 将中间产物r a c 1 和中间产物r a c 2 在乙酸乙酯和碳酸钠中反应，得 到中间体r a c 3 ； ( 4 ) 系统研究了中间产物r a c 3 的还原条件，成功利用硼氢化钠还原得到 产物r a c 。 1 3 2 谷胱甘肽的合成工艺研究 ( 1 ) 对合成用氨基酸原料分别进行保护，得到中间体g s h - 1 ，g s h 一2 等； ( 2 ) 将中间体g s l t - 1 和中间体g s h 一2 缩合，得到二肽中间体g s h 一3 ； ( 3 ) 将中间体g s h - 3 与保护的甘氨酸缩合，得到全保护三肽g s h - 4 ； ( 4 ) 将全保护三肽g s h 一4 在选定的条件下分别脱除各保护基保护，得到目 标产物。 参考文献： 1 p r i n g l etd ，c a l k i n scr ，k o o h m a r a i em ，j o n e ssj e f f e c t so v e rt i m eo ff e e d i n ga b e t a - a d r e n e r g i ca g o n i s tt ow e t h e rl a m b so na n i m a lp e r f o r m a n c e ，m u s c l eg r o w t h ， e n d o g e n o u sm u s c l ep r o t e i n a s ea c t i v i t i e s ，a n dm e a tt e n d e r n e s s j o u r n a lo f a n i m a l s c i e n c e s ，1 9 9 3 ，7 1 ( 3 ) ：6 3 6 - 4 4 2 w h e e l e rtl ，k o o h m a r a i em e f f e c t so f t h eb e t a - a d r e n e r g i ca g o n i s tl 6 4 4 ，9 6 9o n m u s c l e p r o t e i nt u r n o v e r ，e n d o g e n o u sp r o t e i n a s ea c t i v i t i e s ，a n dm e a tt e n d e r n e s si n s t e e r s j o u r n a lo f a n i m a ls c i e n c e s ，1 9 9 2 ，7 0 ( 1 0 ) ：3 0 3 5 4 3 3 陈洪亮，许梓荣不同饲料蛋白水平下莱克多巴胺对肥育猪生长性能、胴体品 质的影响匆群薄觉：1 9 9 9 ，1 1 ( 3 ) ：3 5 4 丁焕中，陈杖榴，杨志凌营养重分配剂莱克多巴胺的药理作用和应用孝地 与饲料添蕊裁，2 0 0 2 1t 1 8 2 0 5 a n t i g n a cjp ，m a r c h a n dp ，b i z e cbl ，a n d r ef i d e n t i f i c a t i o no fr a c t o p a m i n e r e s i d u e si nt i s s