（物理化学专业论文）荧光磁性纳米材料的制备及其在磁共振方面的应用.pdf

上海师范大学项士学位论文摘要 摘要 近十几年来，纳米科技得到了迅猛发展，并且广泛渗透于各个学科领域， 形成了一系列既相对独立又互相联系的分支学科，其中由纳米科学、生物学和 医学交叉结合形成的纳米生物医学，是最引人注目、最有生命力的发展方向之 一。生物医用功能纳米材料的制备与应用是其主要研究内容之一。其中，荧光二 氧化硅由于具有优越的荧光纳米效应，已经被应用于荧光标记探针、荧光传感器 的制备等研究中。磁性纳米材料由于具有粒径小和强的可操纵性而被成功地应 用于疾病的诊断与治疗以及生物物质的分离等方面，尤其是其作为造影剂在磁共 振成像方面具有非常好的应用前景。本文主要研究了荧光二氧化硅和磁性纳米材 料的制备，并对磁性纳米材料作为造影剂在磁共振方面的应用进行了初步探讨。 ( 1 ) 在没有加入任何无机和有机荧光团的情况下，采用一步法合成有荧光的二 氧化硅纳米粒子，用透射电子显微镜和扫描电子显微镜表征了粒子的形貌， 用红外光谱证明合成了二氧化硅纳米粒子，用荧光分光光度计测定了荧光强 度，并且进一步研究了煅烧温度对粒子荧光强度的影响。结果表明：所得二 氧化硅纳米粒子为球形，粒径均匀，直径在1 6 0 n m 左右；在二氧化硅的制备 过程中添加无荧光基团的有机硅烷，经煅烧可以产生荧光，荧光发射波长在 3 8 0n m 左右，荧光强度随煅烧温度先增后减，在5 0 0 煅烧后粒子的荧光 强度最强。 ( 2 ) 通过化学共沉淀法合成磁性纳米粒子，在其表面包裹高分子，形成高分子 包裹的磁性纳米粒子。再通过化学反应将细胞特异性抗体连接在包裹后的磁 性纳米粒子表面。将这样的纳米粒子生物分子复合物用于识别胰腺癌细胞。 结果表明，所制得的纳米粒子生物分子复合物能够有效地识别相应的胰腺癌 细胞，将胰腺癌细胞切片后在透射电子显微镜下观察，可以清楚的看到纳米 粒子生物分子复合物分散在细胞内部，从而为肿瘤在细胞水平上的诊断提供 了一种新的技术手段。 ( 3 ) 基于纳米粒子生物分子复合物在细胞水平上识别胰腺癌细胞的成功，制备 了磁性纳米粒子造影剂，并建立了人胰腺癌细胞株b x p c - 3 裸鼠皮下移植瘤 上海师范大学硕士学位论文摘要 模型用于胰腺癌的磁共振成像研究。结果表明，磁性纳米粒子造影剂能够有 效的识别裸鼠体内的胰腺癌肿瘤，提高肿瘤和正常组织在磁共振成像上的对 比度，从而为胰腺癌的早期磁共振诊断提供有用的参考。 关键字：荧光二氧化硅；磁性纳米粒子；c a l 9 9 抗体；胰腺癌细胞；动物模型； 造影剂；磁共振成像技术( m r i ) 上海师范大学硕士学位论文摘要 a b s t r a c t t h er a p i dp r o g r e s so fn a n o s c i e n c ea n dn a n o t e c l m o l o g yi np a s td e c a d eh a sm a d e i t s e l fb e i n gw i d e l ya p p l i e di n t om a n yo t h e rs u b j e c t s ，a n dc a u s e dt h ef o r m a t i o no fa s e r i e so fi n d e p e n d e n tb u tc l o s er e l a t e di n t e r d i s c i p l i n a r i e s b i o n a n o m e d i c i n e ，w h i c hi s c o m p o s e db yn a n o s c i e n c e ，b i o l o g y , m e d i c i n e ，i so n eo ft h em o s ts h i n i n ga n da c t i v e r e s e a r c hf i e l d o n em a j o rc o n t e n to fi ti st h ep r e p a r a t i o na n da p p l i c a t i o no ff u n c t i o n a l b i o m e d i c a lm a t e r i a l s t h el u m i n e s c e n ts i l i c ad i o x i d e ，w h i c hh a sas u p e r i o r f l u o r e s c e n c en a n o m e t e re f f e c t ，w a sw i d e l ya p p l i e di nr e s e a r c ha n dp r e p a r a t i o no f f l u o r e s c e n c em a r kp r o b ea n df l u o r e s c e n c es e n s o r s m a g n e t i cn a n o m a t e r i a l s ，w h i c h h a v ea d v a n t a g e so ft h es m a l ls i z ea n dt h es t r o n gc o n t r o l l a b i l i t y , a l ea p p l i e d s u c c e s s f u l l yi n d i s e a s e sd i a g n o s i sa n dt r e a t m e n t a sw e l la s b i o l o g i c a lm a t e r i a l s s e p a r a t i o n ，p a r t i c u l a r l yi th a st h ev e r yg o o da p p l i c a t i o np r o s p e c ta st h ec o n t r a s ta g e n t i nt h em a g n e t i cr e s o n a n c ei m a g e t h i sa r t i c l ei sf o c u s e do nt h ep r e p a r a t i o no ft h e l u m i n e s c e n ts i l i c ad i o x i d ea n dt h em a g n e t i cn a n o m a t e r i a l s ，a n dh a sc a r r i e do nt h e p r e l i m i n a r yd i s c u s s i o no nm a g n e t i cn a n o m a t e r i a l sa st h ec o n t r a s ta g e n tu s e di nt h e m a g n e t i cr e s o n a n c ei m a g i n g ( 1 ) t h i sa r t i c l ep r o v i d e sa o n e - p o t p r o c e s sf o rg r o w i n gl u m i n e s c e n ts i l i c ad i o x i d e s p h e r e su n d e rb a s i cc o n d i t i o n sw i t h o u tt h es u b s e q u e n t a d d i t i o no fi n o r g a n i co r o r g a n i cf l u o r o p h o r e s t h i sa r t i c l ea l s op r o v i d e st h ec o n f i g u r a t i o no fs i l i c ad i o x i d e s p h e r e sb yt e ma n ds e m i ta l s oi l l u s t r a t e sf l u o r e s c e n c ei n t e n s i o nb yf l u o r e s c e n c e s p e c t r o m e t e r ，a n di ta l s or e s e a r c h e st h ee f f e c to fc a l c i n a t i o n st e m p e r a t u r et o f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fs i l i c ad i o x i d es p h e r e s t h er e s u l ti n d i c a t e st h a t ：t h es i l i c a d i o x i d en a n o p a r t i c l e si ss p h e r i c a la n du n i f o r mi ns i z e ，a b o u t16 0 n mi nd i a m e t e r ；i n a d d i t i o no fo r g a n i cs i l a n ei np r o c e s s e sa n dc a l c i n a t i o n so f t e nm a k et h es i l i c ad i o x i d e s p h e r e se x h i b i tl u m i n e s c e n c e ，t h ef l u o r e s c e n c ee m i s s i o nw a v e l e n g t hi sa b o u t3 8 0 n t o a ta l lt i m e s a st h ec a l c i n a t i o n st e m p e r a t u r ec h a n g e s ，t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yc u t s a f t e r i n c r e a s i n gf i r s t ，a n d t h ef l u o r e s c e n t i n t e n s i t y m a x i m u ma p p e a r si nt h e c a l c i n a t i o n st e m p e r a t u r eo f5 0 0 。c i l l 上海师范大学硕士学位论文摘要 ( 2 ) t h em a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sw e r es y n t h e s i z e db yt h ec h e m i c a lc o p r e c i p i t a t i o n a n dt h e m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s w e r ec o a t e dw i t hm a c r o m o l e c u l e si nt h e m i c r o e m u l s i o n t h es u r f a c eo ft h e n a n o p a r t i c l e s w a s c o n j u g a t e d w i t ha c a n c e r - t a r g e t i n ga n t i b o d y t h e nt h ef u n c t i o n a lm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sw e r eu s e dt o d e t e c tp a n c r e a t i ct u m o rc e l l s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ef u n c t i o n a lm a g n e t i c n a n o p a r t i c l e sm a ye f f e c t i v e l yt a r g e tt op a n c r e a sc a n c e rc e l l s ，w h i c ho f f e r e dan e wt o o l f o ro r i g i n a ld i a g n o s eo fp a n c r e a sc a l l e ri nc e l ll e v e r ( 3 ) b a s e do nt h es u c c e s so ft h ef u n c t i o n a lm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e su s e di nd i a g n o s e o fp a n c r e a sc e l l si nc e l ll e v e r ，w ef a b r i c a t e dt h eb i o f u n c t i o n a lm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s c o n t r a s ta g e n t sa n de s t a b l i s h e dt h ep a n c r e a sc e l ll i n eb x p c 一3b a r em o u s eh y p o d e r m i c t r a n s p l a n tl u m pm o d e lf o rm a g n e t i cr e s o n a n c ei m a g er e s e a r c h m r ie x p e r i m e n t s r e s u l t si nv i v oi n d i c a t e dt h es y n t h e s i z e dc o n j u g a t e dn a n o p a r t i c l e sc a ns u c c e s s f u l l y t a r g e tt ot h ep a n c r e a sc a n c e ra n de n h a n c ec o n t r a s to ft h et u m o ra n dt h en o r m a lt i s s u e i nt h e m a g n e t i c r e s o n a n c ei m a g e t h e r e f o r e ，t h e s e t a r g e t - s p e c i f i cm a g n e t i c n a n o p a r t i c l e sh a v ep o t e n t i a la sc o n t r a s ta g e n t su s ei nm ri m a g i n g o fp a n c r e a sc a n c e r i n v i v o k e yw o r d s ：l u m i n e s c e n ts i l i c ad i o x i d es p h e r e s ：m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s ；c a l 9 - 9 i v a n t i b o d y ；p a n c r e a s c a n c e r c e l l s ； a n i m a l m o d e l ； c o n t r a s t a g e n t s ； m a g n e t i cr e s o n a n c ei m a g i n g ( m r l ) 上海师范大学项士学位论文 论文独创性声明 本论文是我个入在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了 特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究成果。 其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表示了谢 意。 作者签名：奄1 3 砖鸡 日期：) 哆j - 垃 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内 容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。 作者签名：暂嘲鸸导师签名：驴气石p 孰 日期：2 2f 2 2 上海师范大学硕士学位论文第一章 1 1 研究意义 第一章文献综述 1 9 5 9 年1 2 月，在美国物理学年会上，著名物理学家、诺贝尔奖获得者理查德费 思曼( r i c h a r df e y n m a n ) 教授作了题为“t h e r e sp l e n t yo fr o o ma tt h eb o t t o m 的报告，指出：“我认为物理学原理并不排斥通过操纵单个原子来制造物质。这 样做并不违反任何定理，而且原则上是可以实现的 。费恩曼的这一次报告被视 为纳米科技发展的起源。众所周知，自然科学发展到今天，产生了许多新兴学 科，各门学科之间的交叉也相应地产生了很多学科间的边缘交叉学科如：纳米物 理学、纳米化学、纳米电子学、纳米计量学等。纳米科学技术和生物医学之间的 结合与交叉也产生了相应的新的研究领域，那就是纳米生物医学。纳米生物医学 主要是将纳米科学领域的纳米材料应用于生物医学领域。由于纳米材料结构上的 特殊性，赋予其独特的小尺寸效应和表面或界面效应，使其在性能上与微米材料 具有显著性差异，表现出诸多优异的性能和全新的功能。纳米荧光材料能监测药 物在人体内的传输，而且能发挥控制药物释放、减少副作用并定向治疗的功效； 药物包裹的磁性纳米材料可主动搜索并攻击癌细胞或修补损伤组织并提高药效： 使用纳米技术的新型诊断仪器，只需检测少量的血液就能通过其中的蛋白质和 d n a 诊断出各种疾病；纳米粒子的尺寸小，可以在血管中自由流动，因此可以用 来检查和治疗身体各部位的病变。在纳米粒子的生物医学应用基础研究中，癌症 的早期诊断与治疗是其中的一个重要方面，而影像诊断对于癌症的早期诊断和治 疗起着及其重要的作用，磁性纳米材料作为磁共振成像造影剂的研究对于医学上 各种癌症的治疗具有非常重要的应用价值。近几年来，国际上纳米生物医学的研 究范围已经涉及到医学研究的众多方面，包括：药物( 基因) 靶向智能运送系统、 细胞和组织的再生与修复、单分子操纵技术和活体单细胞显微观测、植入性人工 器官和生物医学传感器、高分辨率医学影像、以及在纳米尺度上对生命基本过程 的理解等众多方面，而且研究的广度和深度都在不断增加。所以，综合各个方面 的发展态势，纳米生物医学已经作为- 1 7 独立的学科而吸引越来越多的研究人员 的关注。 上海师范大学硕士学位论文 第一章 1 2 研究进展 1 2 1 荧光二氧化硅纳米粒子及其在生物科学领域的应用 纳米二氧化硅是纳米材料中的一员，具有特殊的结构层次，通常只有在高倍 电子显微镜下才能观察到其颗粒形态。由于纳米二氧化硅的量子尺寸、量子隧道 效应和它的特殊光、电特性、高磁阻现象，非线性电阻现象以及高温下仍具有的 高强、高韧、稳定性好等奇异特性，使纳米二氧化硅可广泛应用于许多领域，几乎 涉及所有应用二氧化硅粉体的行业。近些年来，以二氧化硅为外壳，内部掺杂荧 光染料分子的荧光二氧化硅纳米颗粒以其高发光性能、优异的光稳定性及易于生 物化学修饰等优点被众多课题组所关注，并广泛地应用于超灵敏生物分析、生物 传感和生物成像等多种生物技术应用领域。 1 2 1 1 荧光二氧化硅纳米粒子的制备 首先，通常采用把荧光物质直接连接n - 氧化硅粒子上，使其具有荧光性能。 荧光素作为一种常用的染料，常用于非线性光学的研究，由于荧光素在近紫外到 蓝光波段内激发，都会出现较好的荧光发射峰，所以这种染料具备了很大的应用 前景随着固体染料激光器的迅速发展【3 一，人们常常采用溶胶凝胶法将这种有 机染料掺杂n - 氧化硅、玻璃、凝胶及其膜中以制备相应的光功能材料。同时， 以二氧化硅为核、荧光素为外层的聚酰胺树枝状聚合物的合成对荧光素应用到设 计和开发新型“壳一核 型纳米二氧化硅荧光传感器提供了有用的实验依据 其次，通过二氧化硅纳米粒子和染料分子的自组装，也可以获得荧光二氧化 硅纳米粒子。例如采用改进后的s t 6 b e r 方法和反相微乳液法合成不同尺寸的包 裹了水合二氯三( 1 ，1 0 一菲咯啉) 一钌( 1 i ) 染料分子的核壳结构荧光二氧化 硅颗粒【5 1 。聚乙烯吡啶是一种十分有效的表面修饰试剂并广泛的应用于纳米小颗 粒的固定，借助聚乙烯吡啶的粘连作用，将小尺寸的荧光二氧化硅纳米颗粒组装 到大尺寸的荧光二氧化硅颗粒表面，从而构建出一种具有分级结构的树莓状荧光 二氧化硅颗粒。在此基础上，将树莓状荧光二氧化硅颗粒组装到聚乙烯吡啶修饰 的玻璃片表面，最终获得具有粗糙表面的颗粒膜，而这种颗粒膜也兼有染料分子 的荧光性质。在实验过程中，改变反应物参数，可以调节这种树莓状荧光二氧化 2 上海师范大学硕士学位论文第一章 硅复合颗粒的荧光强度，同时对其表面形貌的粗糙程度进行控制。总的来说，这 种树莓状荧光二氧化硅颗粒与单一荧光二氧化硅颗粒相比，保留了优越的荧光性 能，并且荧光强度得到进一步的扩增，对于新型荧光纳米探针的设计与开发具有 一定的指导意义。 再次，把镧系金属如m 和量子点伸1 连接n - = 氧化硅粒子上，也可以获得荧光 二氧化硅纳米粒子，但大多数这样的过程需要复杂的反应步骤，或需要用昂贵的 和有毒的荧光团。因此合成自身具有荧光的二氧化硅纳米粒子成为一个新的研究 领域。 1 2 1 2 荧光二氧化硅纳米粒子的生物应用 据2 0 0 4 年1 0 月1 3 日参考消息援引英国新科学家周刊1 0 月4 日期文章 称，利用含有数干个荧光抗体分子的二氧化硅纳米颗粒，可以快速、精确地检测 极微量有害细菌。这种二氧化硅纳米粒子加入检测样本( 例如肉糜) 的溶解液里， 就会与细菌粘着在一块；然后通过离心方法，根据二氧化硅纳米粒子与细菌细胞 之间的大小的不同，可以使细菌与纳米颗粒分离，并沉淀下来；分离下来的细菌 上附着有来自于二氧化硅纳米颗粒上的荧光抗体，根据这些荧光抗体的发光现象 就可以确定所要检测的细菌是否存在。该检测法使用抗目标细菌的特异性抗体制 作荧光抗体，使检测的特异性很高。科研人员已开始开发能同时检测多种细菌的 方法，思路是对各种目标细菌分别使用连有不同颜色荧光抗体的二氧化硅纳米颗 粒。 生命体内痕量活性物质的分析与检测对获取生命过程中的化学与生物信息、 了解生物分子及其结构与功能的关系、阐释生命活动的机理以及疾病的诊断都具 有重要意义。生物荧光纳米颗粒的成功研制为在复杂的环境中进行最佳的单分子 研究提供了条件。生物荧光纳米颗粒的粒径为卜l o o n m ，具有巨大的比表面、尺 寸量子效应和化学反应活性，使其与生物体有特殊的相互作用，并得到了广泛应 用。将荧光染料( 联吡啶钉配合物) 嵌入二氧化硅纳米颗粒之中，制备出粒径小、 分布均匀、表面光滑圆润的荧光纳米颗粒，这种荧光纳米颗粒可作为一种新型光 稳定的d n a 标记物进行d n a 的检测，为生物荧光纳米颗粒的研究和应用开辟了新领 域，为发展新型d n a 的检测技术提供了依据，在d n a 传感器以至d n a 芯片的制作方 3 上海师范大学硕士学位论文 第一章 面都有广阔的应用前景 传统的光、电生物化学传感器已不能适应分析检测的要求，因为这类传感器 刺入细胞时，将导致生物学损伤及相关的生化恶果。而二氧化硅微球在涂料、催 化剂、色谱填料、高性能陶瓷、光子晶体、重金属吸附剂等方面应用广泛睁”1 ， 由于它具有良好的稳定性及生物亲和性n 4 1 5 1 ，功能化二氧化硅微球用作细胞分析 的探针具有很好的应用前景。利用溶胶凝胶技术制得单分散性很好的二氧化硅纳 米微球，表面通过共价偶联方式引入对p h 变化敏感的f i t c 分子，可作为p h 荧光纳 米传感器。这种荧光二氧化硅纳米微球的尺寸分布均匀，光稳定性好，p h 变化响 应快，灵敏度高，生理相关金属离子对微球的荧光无影响，可以对单个活细胞及 。其亚单位进行无损、实时、动态过程监测。将荧光二氧化硅微球作为单细胞的分 析探针已经成为人们的一个研究热点。 除上述所列应用领域外，荧光纳米二氧化硅在生物医学的其他领域中还具有 非常广阔的应用前景。荧光纳米二氧化硅作为纳米材料家族中的一员，对其开发 具有相当重要的实际意义。 1 2 2 磁性纳米粒子及其在生物医学领域的应用 磁性材料从组成上来分可以分为有机磁性材料和无机磁性材料1 1 6 1 。有机磁性 材料的代表是有机磁性高分子材料，主要是指金属有机络合型磁性高分子材料， 通常可以用作为记忆材料和轻质宽带微波吸收剂等，此外有机磁性高分子材料在 磁控传感器以及微波通讯器件方面也具有很广泛的用途；通常的无机磁性材料主 要包括铁、钴、镍、锰及其合金、氧化物和稀土金属永磁材料等，更为重要的是 这类的无机磁性材料具有有机磁性高分子材料无法比拟的磁学性质。磁性纳米材 料由于其特有的磁性性质，具有在外加磁场下进行可控运动的特点，从而使得磁 性纳米材料在生物活性物质的富集、药物运输和定向治疗等方面具有巨大的应用 潜力。磁分离是利用功能化磁性纳米粒子的表面配体与受体之间的特异相互作用 来实现对靶向生物目标的快速分离旧。目前，磁分离方法已广泛地用于细胞、 蛋白质、核酸和酶等多种生物物质的分离与纯化。 4 上海师范大学硕士学位论文第一章 1 2 2 1 磁性纳米粒子的制备方法 从总的方面来讲，磁性纳米粒子的制备方法可以分为物理法、生物法和化学 法。其中物理法以机械球磨法为主要代表，球磨法是将微米或亚微米的粒子进行 长时间研磨，然后分散到油基介质中而得。这种制备方法得到的粒子的粒径分布 比较宽，同时这种制备方法所消耗的时间也比较长，所以这种方法不适合用于制 备生物医用的磁性纳米材料。磁性纳米粒子的生物制备法主要是指：磁性纳米粒 子广泛地存在于各种生物体如细菌体内。利用生物法制备的粒子粒径比较均一且 形貌规则。生物法制备纳米粒子的主要缺点在于细菌培养较为困难，粒子提取的 过程也较为繁琐，最为主要的是所得到的粒子的粒径可控范围受到了很大的限制 【1 8 】。所以目前来说，对于研究磁性纳米粒子的合成主要还限于化学法制备的磁 性纳米粒子。磁性纳米材料的化学合成法又可以分为均相制备法和非均相制备 法，其中均相制各法包括共沉淀法( c o p r e c i p i t a t i o n ) 和高温分解法( h i i g h t e m p e r a t u r ed e c o m p o s i t i o n ) ，非均相制备方法有微乳液法( m i c r o e m u l s i o n ) 、溶胶 凝胶法( g e l s 0 1 ) 、超声化学法( s o n o c h e m i s t r y ) 、激光分解法( 1 a s e rp y r o l y s i s ) 和电化学沉积法等。在均相体系中，纳米粒子的形成过程主要包括成核过程和生 长过程。在非均相体系中，由于有反应微区，所以粒子的生长过程不仅受到其自 身生长动力学的控制，还同时受反应微区性质的控制。 共沉淀法是制备磁性纳米粒子的经典方法之一，其原理是通过在水溶液中同 时水解二价和三价的铁离子的方法来实现磁性铁氧体纳米粒子的制备。共沉淀法 具有实验操作简便、反应条件温和等特点。然而由于铁在自然界中存在近1 5 种 氧化物和氢氧化物，而且相互之间很容易转化，因此在水溶液中通过水解二价或 三价铁离子的方法来制备磁性纳米粒子，其产物组成的控制是该方法面临的重要 问题之一，即便在制备过程中严格控制反应体系的温度、p h 值、粒子强度，所 得产物的表面结构也往往是铁氧化物和铁氢氧化物的混合物1 1 9 2 0 1 。 高温分解法是通过在高沸点有机溶剂中加热分解有机金属化合物来制备纳 米粒子的一种方法。通常可采用两种投料方式来制备粒径均一的纳米粒子：一种 方式是将反应原料快速注入含有表面活性剂的高温溶剂中实现纳米粒子的快速 成核，再通过对反应温度和反应时间的控制得到不同尺寸的同时具有窄粒度分布 5 上海师范大学硕士学位论文第一章 的纳米粒子；另一种方式是将反应原料在低温条件下预先混合，然后缓慢加热至 反应开始，在粒子生长过程通过不断补加反应原料来维持体系中恒定的过饱和 度，最后得到窄粒度分布的粒子。高温分解法制备的磁性纳米粒子具有粒径分布 窄，尺寸和形貌可控等特点。尽管这些油溶性磁性纳米粒子在密封、阻尼、存储 等方面具有广阔的应用前景，然而粒子的疏水性却大大限制了它们在生物医学领 域的应用【2 1 3 1 1 。 微乳液和反相胶束法是利用水、油和表面活性剂三元体系形成的微乳液或反 相胶束为反应场所制备纳米粒子的方法。表面活性剂一方面可以有效地阻止纳米 粒子的聚集和进一步生长，从而实现对纳米尺寸的有效控制；另一方面可以为粒 子提供可溶解性或可分散性【3 2 1 。用这种方法制备的粒子在粒子的尺寸分布及其 形貌控制方面体现出了一定的优势，但所得到的粒子往往在结晶度和磁响应性等 方面还有待于提高，这主要是由于这一制备方法所采用的反应温度比较低而造成 的。 超声化学法是利用超声波的空化作用瞬间产生的高温( 5 0 0 0 k ) 、高压 ( 2 0 m p a ) 以及极高的冷却速率等极端条件促使氧化、还原、分解和水解等反应的 进行来制备纳米粒子【3 3 3 4 】。尽管超声化学法操作简便，但由于其是非均相反应方 法，粒子的成核和生长过程受活性物种的生成和扩散等因素的影响，因此该方法 在纳米粒子的尺寸和形貌控制方面仍有待于进一步提高。本实验室在磁性纳米粒 子的制备方面采用的是经典的化学共沉淀法。 1 2 2 2 核壳型纳米粒子的制备及表面的修饰 磁性纳米粒子由于其本身的一些性质如具有较高的比表面积和磁性性质造 成易于团聚的缺点。为了解决这样的问题，通过表面修饰以降低纳米粒子的表面 能从而得到具有可溶性或可分散性的纳米粒子。同时，适当表面修饰还可以调节 磁性纳米粒子与其他材料的相容性和反应特性，从而赋予其特殊的功能。磁性纳 米粒子的表面修饰可分为以下几类：( 1 ) 采用有机小分子修饰粒子：( 2 ) 采用有机 高分子修饰粒子表面：( 3 ) 采用二氧化硅修饰粒子表面；( 4 ) 采用其它无机纳米材 料修饰粒子表面。此外，有些磁性纳米粒子在胶体溶液中的稳定性较差，如f c 、 6 上海师范大学硕士学位论文第一章 f e 3 0 4 就很容易被空气氧化，形成y f e 2 0 3 粒子，而氧化反应的另一个结果是导 致粒子发生聚集和沉淀1 3 5 1 ，而通过适当的表面修饰可以提高上述粒子的抗氧化 性能【蚓。更为重要的一点是将磁性纳米粒子应用于生物领域时必须通过表面修 饰赋予其良好的水溶性和生物相容性。总之，磁性纳米粒子的表面化学修饰方法 多种多样，而表面修饰的效果则可以概括为以下几个方面：( 1 ) 调解和改变粒子 的溶解和可分散性；( 2 ) 为粒子提供表面功能性；( 3 ) 赋予磁性粒子特殊的物理 化学性质；( 4 ) 提高粒子的稳定性和抗氧化性及其胶体溶液的稳定性。总之，磁 性纳米粒子的表面修饰研究具有重要的科学意义和实际应用价值，在今后相当长 的一段时间内它将是磁性纳米材料研究领域的热点和难点问题之一。我们实验室 为了解决类似的问题采用了在磁性纳米粒子表面包裹有机高分子的方法。众所周 知，利用高分子壳层所带的功能基，如羧基、羟基等，可将一些活性生物分子修 饰在磁性微粒表面，从而赋予其一定的生物功能性。 1 2 2 3 磁性纳米粒子在生物医学中的应用 磁性纳米粒子在生物医学领域有着广泛的应用。将磁性纳米粒子用于细胞分 离的方法称为细胞磁免疫分离方法。这种方法是细胞生物学和医学研究中的重要 方法之一，大量的磁免疫分离都是基于磁性纳米粒子或微球表面的抗体与细胞抗 原之间的相互作用来实现细胞的快速分离的。一般来说，磁免疫分离分为直接法 和间接法m 删，直接法就是将偶联有抗体的磁性纳米粒子或微球加入待分离的细 胞混合体系中，经过孵育使靶向细胞与磁性粒子表面的抗体识别形成稳定的复合 体，然后在外磁场作用下实现被识别细胞与其它细胞的分离。间接法是先将适量 的生物素化( b i o t i n y l a t e d ) 的抗体加入到细胞混合体系中，过滤除去大部分未被 偶联的抗体，在通过磁性纳米粒子或微球表面的二抗或链霉亲和素 ( s t r e p t a v i d i n ) 与结合在细胞表面的抗体之间相互作用后形成稳定的复合体， 最后经外磁场作用实现细胞的分离。细胞磁性分离技术的优点主要体现在以下几 个方面：( 1 ) 磁性载体与细胞的识别过程基本上可以保证不破坏被识别细胞的形 态，同时也不影响非识别细胞；( 2 ) 分离纯度可高达9 5 一9 9 9 ；( 3 ) 不影响 细胞的功能和活性，经磁性分离的细胞存活率可以达到9 0 9 6 以上；( 4 ) 分离操 作方便、快捷。同时用磁性纳米粒子在细胞分离方面还有其它几个优势：首先， 7 上海师范大学硕士学位论文第一章 较小的尺寸可以避免与细胞发生识别作用后对细胞产生机械应力( m e c h a n i c a l s t r e s s ) ；其次，可以缩短孵育时间，加快分离流程；再次，磁性纳米粒子在磁 场中可形成稳定的胶体分散体系，不会发生粒子的聚集和沉淀；最后，具有生物 相容性的磁性纳米粒子不影响细胞的功能和发育。 蛋白质和核酸的分离是生物技术中一项艰巨而繁重的任务，到目前为止，还 没有一种成熟和完善的可以把任一组分从复杂生物混合体系中分离出来的方法。 对d n a 而言，通常采用的分离手段包括超速离心和电泳，电泳方法中可分为琼脂 糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳。虽然电泳的方法在d n a 的分析 和分离方面已经取得了巨大的成功，但相比较而言，蛋白质的分离方法就较为丰 富一些：柱层析、透析、过滤和梯度离心方法适用于分离具有不同分子量的蛋白 质；盐析、盐溶分离方法则是分离具有不同溶解度的蛋白质的方法；电泳方法主 要是依据蛋白质所带电荷密度不同来实现对蛋白质的分离和纯化；亲和层析是基 于蛋白质与被固载配体的亲和作用来实现蛋白质纯化和分离的方法h 叫。然而，这 些所有的传统的分离方法在许多方面还有待于进一步的提高和改进。采用磁性纳 米粒子来进行核酸分离与纯化的优点主要有以下几点：( 1 ) 在没有外磁场存在 的情况下，具有超顺磁性的纳米粒子的磁流体表现出非常低的黏度；( 2 ) 在外 磁场作用下所形成的磁柱之间的距离可根据器件内的通道尺寸和磁性颗粒浓度 在非常大的范围内进行调节；( 3 ) 该方法最重要的优势是有可能用来实现其他 中等尺寸生物体的分离。 目前，各种疾病如2 0 0 3 年的s a r s ，2 0 0 4 年的禽流感等的流行对于建立高效 快速的细菌、病毒检测方法提出了较高的要求。对于病毒和细菌，常规检测方法 的检测限通常只能达到l o o c f u m l ，而晟近报道的有关用磁性纳米粒子来进行细 菌分离检测的文献，其对细菌检测的灵敏度可以达到约1 5 c f u m l 。总的来说， 采用磁性纳米粒子实现对细菌和病毒的检测具有检测速度快和对人为因素不敏 感等优点，检测过程中不需要复杂的p c r 反应，其检测极限和检测效率与传统的 检测方法相比较具有明显的优势h 卜删。 此外磁性纳米粒子还可以在生物体内进行应用。磁性纳米粒子可以实现药物 的磁导向，核磁共振成像，肿瘤的磁流体过热治疗等应用。热疗法是治疗肿瘤的 8 上海师范大学硕士学位论文第一章 一种方法，是根据肿瘤细胞和正常细胞对热的敏感性不同，通过加热病灶部位来 杀死肿瘤细胞的方法。早期的磁致热是将一定尺寸的磁性物质通过手术置于肿瘤 部位，然后通过在外加交变磁场的作用下发热来达到杀死肿瘤细胞的目的。但有 着明显的缺点：( 1 ) 肿瘤内部温度分布不均匀，造成局部温度过高；( 2 ) 治疗前 后都需要手术植入或取出磁体。磁流体致热治疗肿瘤的原理与前面的相同，利用 肿瘤细胞和正常细胞对热的敏感性不同，通过将磁流体注射到肿瘤组织，然后在 外加交变磁场的作用下产生能量，再将产生的能量释放给肿瘤组织，由于肿瘤中 的血液供给不如正常组织充足致使肿瘤细胞中热量扩散较慢，结果造成局部温度 升高，从而达到杀死肿瘤细胞的目的。与早期的方法相比较有下列几个优点：( 1 ) 用于治疗的磁流体可以通过注射的方式注入到患者部位，从而避免手术给患者带 来的痛苦；( 2 ) 具有超顺磁性的磁流体较大尺寸的磁棒有更高的磁致热效率；( 3 ) 纳米尺寸的超顺磁性纳米颗粒可以很容易地进入细胞或组织内部，可以更均匀地 分布在病患处，有利于克服磁针或磁棒所面临的涡流效应导致的受热部位温度不 均匀。热疗法在治疗肿瘤和其他疾病方面都有着巨大的应用前景。但热疗法治疗 肿瘤的研究和应用目前还面临以下问题：( 1 ) 如何使磁性纳米粒子只被肿瘤细胞 吞噬，而不被其他正常细胞吞噬，这是实现对肿瘤细胞均匀加热的关键；( 2 ) 如 何将其应用于精细组织中肿瘤的治疗也是热疗法治疗肿瘤所要面临的挑战。 1 2 3 磁性纳米粒子作为造影剂用于核磁共振成像技术 磁共振成像技术由于可以用来对生物内脏器官和软组织进行无损的快速检 测，已经成为诊断软组织病变尤其是检测肿瘤的最为有效的临床诊断方法之一。 临床应用的磁共振成像一般是对组织中的氢核( 质子) 进行的，改变人体组织中 的质子密度是非常困难的，同时也是非常危险的。因此，临床m r i 检查往往通过 使用含有磁性的物质作为造影剂来改变组织的核磁共振参数( 水质子的驰豫时间 t 。和t ：) ，从而改变组织的核磁共振信号对比度和软组织图象的分辨率，分辨出 微小病灶和区分那些t 。、t ：驰豫时间与正常组织相仿的病灶直至鉴定人体内器官 功能的变化。磁共振造影剂种类很多，通常可分为顺磁性造影剂、铁磁性造影剂 和超顺磁性造影剂三大类，其中应用最广泛的是顺磁性造影剂和超顺磁性造影 剂。当磁性粒子直径达到其磁单畴尺寸时，粒子就可以在较弱的外磁场中产生巨 9 上海师范大学硕士学位论文第一章 大的磁性，当外加磁场撤消后，粒子的磁性也随之消失，这种磁学特性称之为超 顺磁性。超顺磁性物质具有较高的磁化率，对t 。几乎不影响但却能使t 。显著地 降低，而且每次所需要的浓度远远低于顺磁性造影剂，因而受到广泛的关注。目 前，可作为磁共振造影剂的超顺磁材料主要是以y - f e ：0 3 和f e 。0 4 两种铁的氧化物 为主。 磁共振( m r i ) 分子影像学是磁共振成像技术的重要组成部分，与传统的m r i 的最大区别在于，它是在传统m r i 技术基础上，以特殊分子或细胞作为成像对象 ( 靶结构) ，把非特异性物理成像转为特异性分子成像。m r l 分子影像学的研究范 围广泛，其中一种途径是应用特异性分子探针与靶结构结合，通过高分辨率、敏 感、快速的成像技术，特异性标志出靶结构，以求与背景结构形成良好对比，协 助病灶的定性定量诊断。为获取良好成像，特异性分子探针需要满足几个基本条 件：( 1 ) 与靶结构有特异性的高亲和力：( 2 ) 进入活体后能克服体内防御屏障，到 达靶结构部位；( 3 ) 可通过在活体内使用化学、生物方法使信号扩大。因此特异。 性分子探针的研发己成为该方面研究的关键。传统的m r i 对比剂主要有两类，一 类是顺磁性复合物，主要包括锰( m n 2 + 、m n 3 + ) 、g d 3 + 等离子大分子螯合物。其中g 矿 离子的应用最为广泛，其主要具有以下特点：有很高的顺磁性( 7 个未配对电 子) ；有相对较长的电子弛豫时间；可形成很稳定的螯合剂，在其内部含有1 或2 个水分子； g d 3 + 离子螯合剂具有很高的热动力学稳定性。另一类对比剂为超 顺磁性氧化铁微粒，它是一类阴性对比剂，主要被网状内皮系统中吞噬细胞摄 取因此在网状内皮细胞丰富的组织和器官如肝、脾、淋巴结聚集。超顺磁性氧 化铁颗粒使组织t 2 信号显示降低，主要应用于肝癌的诊断及肿瘤转移淋巴结的检 出。近年来，随着纳米核心材料制作工艺和包被水平的提高，这类分子探针方面 的研究有所进展，渐集中于通过配体标记的方法将其靶向导入至表达特异性受体 的组织和细胞中，从而达到对比增强的效果。现研究较多的靶细胞为各种肿瘤细 胞，其标记技术逐步成熟，初步研究取得满意结果。 i 2 3 1 肿瘤的磁共振诊断技术 肿瘤的早期诊断( 包括微小肿瘤与肿瘤转移灶) 是有效地降低恶性肿瘤致死 率的关键。由于m r i 可以用来对生物内脏器官进行无损的快速检测，已经成为诊 1 0 上海师范大学硕士学位论文第一章 断肿瘤的最为有效方法之一。通常为了增强病变组织与正常组织的图像之间的对 比度以提高病变组织的清晰度，需要选择合适的造影增强剂来显示影像学特征。 目前，临床上常用的造影剂是g d - - d t p a ，但g d _ d t p a 有明显的不足之处，如循 环时间短，注射后g d - - d t p a 可迅速通过细胞间隙，并经肾脏排泄，因此需要相 应的快速扫描设备。此外，g d - d t p a 在体内分布没有特异性，而且其价格也较昂 贵。相比较而言，超顺磁性氧化铁( s u p e r p a r a m a g n e t i ci r o no x i d e s ，s p i o s ) 可以局部扩增外加磁场，使磁场不均匀，当水分子弥散穿过不均匀磁场时加速了 质子的失相位，从而使组织的横向弛豫时间( t 2 ) 明显缩短，信号降低，而对纵 向弛豫时间( t 1 ) 影响较小。此外，超顺磁性氧化铁在生物体组织内存在很高的 特异性分布，可被网状内皮系统吞噬，有助于提高肿瘤与正常组织的m r i 成像对 比度，同时由于其高效、经济、安全等特点，作为造影增强剂被应用于m r i ，用 于各种肿瘤及其他疾病的检测。 1 2 3 2 超顺磁性造影剂的制备 制备超顺磁性造影剂的关键在于如何制备出磁性能优异( 高饱和磁化强度和 初始磁化率) 的超顺磁性材料，以及在此基础上对磁性粒子表面进行修饰，形成 具有壳核结构的磁性微球，以增强其稳定性、水溶性和生物相容性，并降低其毒 性。从国内外文献上来看，超顺磁性造影剂的制备方法主要有三种：化