（植物学专业论文）壳聚糖诱导烟草抗病机理研究.pdf

摘要 1 以9 种植物病原真菌为试验材料，利用p d a 为培养基，研究了离 体条件下不同浓度的壳聚糖处理对植物病原真菌的抑制活性和抑菌 作用的持效时间。结果表明，壳聚糖对9 种植物病原真菌的菌落形态、 菌丝生长和繁殖等均有一定的影响。当壳聚糖浓度 1 2 o g l 时，除葡 萄炭疽病菌( c o l l e t o t r i c h u mg l o e o s p o t i o i d e s ) 外，其他8 种植物病原 真菌的生长都受到了显著抑制( p o 0 5 ) ；在o 7 5 9 l - - 5 o g l 的浓度 范围内，浓度越高抑菌效果越明显，但抑菌强弱与浓度不成正比；而 浓度o 7 5 9 i n 时对葡萄炭疽病菌的生长具有促进作用。高浓度壳聚 糖抑菌持效期长，抑菌率下降慢。9 种真菌的最低抑菌浓度( m i n i m u m i n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n ，m i c ) 从3 0 9 l 到5 o g l e 。壳聚糖对植物 病原真菌抑制活性受浓度、时间和病原真菌种类等因素影响。 2 烟草黑胫病菌( p h y t o p h t h o r a p a r a s i t i c av a rn i c o t i a n a e ，p p n ) 是严 重危害烟草生产的一种致病真菌，试验中以p p n 为材料，探讨了4 种不同分子量的壳聚糖在不同浓度和p h 时对印乃的菌落、菌丝的形 态结构和菌丝生长的影响，以及对孢子萌发的抑制作用。在壳聚糖处 理后p p n 菌丝出现畸变，正常的新陈代谢和细胞壁结构受到明显影响 和破坏。在低浓度下( o 6 2 5 m g l ) ，壳聚糖抑菌效果随分子量增大 而增强；分子量越小受浓度影响越大，浓度5 o m g l 时，分子量为 4 7 x 1 0 4 的壳聚糖抑菌效果最强。除分子量为5 0 x 1 0 3 的壳聚糖外，其 它分子量较大的壳聚糖受p h 影响明显。壳聚糖分子量不同，其抑菌 主要机理可能也不同，浓度、p h 和分子量是壳聚糖抑菌活性的重要 t 影响因素。 3 配制四种壳聚糖溶液，直接喷洒到对烟草黑胫病易感和具有抗性 的两种烟草的叶片上，观测其对烟草叶片中p o d 、p a l 两种抗病相 关酶的活性的诱导，同时作了p o d 的同工酶分析。壳聚糖诱导后两 种烟草的p o d 、p a l 在9 6 h 内均出现酶活性高峰。出现时间和强弱 在两种烟草中不同，抗病性的中烟1 0 0 活性较高。同工酶电泳也发现 4 条同工酶带染色均加深，但并没又发现新的酶带和不同品种的特征 性酶带。同时，病菌p p n 感染也激发了烟草叶片中两种酶活性的升高， 但都只有一个酶活性峰。壳聚糖能够诱导烟草抗病能力的升高，诱导 强度与浓度、分子量有关，整体上c s l 诱导效应产生更快一些。 4 采用s d s 电泳和红外光谱分析了壳聚糖对p p n 和两种烟草可溶性 蛋白和化合物合成的影响。总体上，壳聚糖抑制p p n 中蛋白的合成， 而对烟草的蛋白具有激发活性，但没有发现蛋白带的缺失或增加。红 外光谱分析发现光谱吸收峰与壳聚糖分子量有关，接菌处理也能促使 部分峰的升高，但与壳聚糖处理有差别。没有蛋白带和光谱吸收峰的 出现或消失，主要是量的增加或减少，说明壳聚糖诱导烟草抗病和抑 制印托生长是系统性的复杂反应。 5 直接将壳聚糖喷洒到烟草上，测定相对电导率和烟草病情指数变 化。壳聚糖能够降低烟草叶片的相对电导率，增强烟草的抗逆能力。 能够诱导烟草抗病能力的提高，对红花大金元和中烟1 0 0 诱导防效分 别在7 2 h 、4 8 h 最高达到2 9 9 和4 4 1 。壳聚糖诱抗效果与壳聚糖 处理时间长短和壳聚糖浓度、分子量等有关。壳聚糖能明显诱导烟草 抗病能力的升高。 关键词：壳聚糖，烟草，烟草黑胫病菌，抗病性，抑菌活性 i i i t o b a c c o sd e f e n s er e s p o n s ea n d i t sm e c h a n i s mi n d u c e db yc h i t o s a n a b s t r a c t 1 t h ea n t i f u n g a la c t i v i t i e so fc h i t o s a nw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so n8 p a t h o g e n sw e r ei n v e s t i g a t e di nv i t r o i tw a sf o u n dt h a tt h ec h i t o s a nh a da d i r e c te f f e c to nt h em o r p h o l o g y , g r o w t ha n dm u l t i p l i c a t i o no ft h e c h i t o s a n t r e a t e dp a t h o g e n s w h e nc o n c e n t r a t i o nw a s o 2 ，g r o w t ho f7 p a t h o g e n ss h o w e ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( p 9 0 ，粘度 lo o e p s ) 购自上海源聚生物科技有限公 司。 供试9 种真菌： 终极腐霉( p y t h i u mu l t i m u m ) 黄瓜炭疽病菌( c o l l e t o t r i c h u ml a g e n a r i u m ) 向绢病菌( s c l e r o t i u mr o l f s i i )香蕉炭疽病菌 ( c o l l e w 护w h u mm 1 , t s a e ) 赤星病菌 臼l t e r n a r i aa l t e r n a t a ) 大丽轮枝菌 ( v e r t i c i l l i u md a h l i a e ) 尖孢镰刀菌( f u s a r i u mo x y s p o r u m ) 葡萄炭疽病菌( c o l l e t o t r i c h u mg l o e o s p o t i o i d e s ) 烟草黑胫病菌( 脚t o p h t h o r ap a r a s i t i c av a rn i c o t i a n a e ，p p n ) 由浙江省农科院植微所和浙江大学植保系提供。 p d a 培养基：马铃薯2 0 0 9 ，葡萄糖2 0 9 ，琼脂粉2 0 9 ，水1 0 0 0 m l 。 2 方法 2 1 不同壳聚糖浓度p d a 培养基的配制 取九个锥形瓶并编号( 1 - - 9 ) ，每个锥形瓶中倒入1 0 m l1 ( v ) 的乙酸， 将壳聚糖依次加入2 9 号锥形瓶中，l 号加入等量1 乙酸作对照。壳聚糖完全 溶解后，再分别向每个锥形瓶中倒入8 5 m lp d a 培养基，用4 0 的n a o h 调p h 至5 9 0 ，无菌水定容至1 0 0m l ，配制成壳聚糖终浓度分别为o 、0 1 2 5 9 l 、0 2 5g l 、 0 5 9 l 、0 7 5 9 l 、1 0 9 l 、2 0 9 l 、3 0 9 l 、4 0 9 l 和5 0 9 l ( w v ) 的p d a 培 养基，1 2 1 灭菌1 5 m i n 备用。 2 2 接种与计量 向直径9 c m 的培养皿中各加入2 0 m l 上述p d a 培养基，每个浓度设三个重 复。用直径6 m m 打孔器沿菌落边缘取5 d 龄菌饼转接到培养基中心，保鲜膜封口， 放培养箱中2 8 c 培养。采用十字交叉法，每1 2 h 测量一次菌落直径，连续测量 7 2 h 。 2 3 抑菌率计算 培养4 8 h 后测定壳聚糖的抑菌率： 抑菌率= 1 n d n o ；式中n o 为对照组菌丝生长量，n l 为处理组菌丝生长量。 在2 8 。c 下培养7 2 h 后确定最低抑菌浓度( m i n i m a li n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n ， m i c ) 。 2 4 数据分析 运用s p s s 软件对试验结果作方差分析，确定浓度和处理时间对抑菌效果的 作用和影响。 3 结果与分析 3 1 壳聚糖对病原真菌形态结构的影响 9 种植物病原真菌用壳聚糖处理后，真菌菌落和菌丝形态均发生了变化。对 照组菌落形状规则，处理组随着壳聚糖浓度的升高，菌丝逐渐变粗，并变形，菌 落显得更为致密浓厚( 见图2 1 ，a 、b ，以大丽轮枝菌为例) 。 对大丽轮枝菌在光学显微镜下进一步观察发现，壳聚糖处理后菌丝明显增 粗，细胞壁增厚，细胞内含物细小稀少，极少量的颗粒状内含物主要存在于隔膜 1 4 挪佗，呈环状分布，细胞中h 现人量透明泡状结构，菌丝分枝明显减少，畸形比 例增加。与对照相比轮性状分生孢于桂明显减少，产于乜! 量极度下降。说明真菌的 【r 常代谢和繁聃行为受到了壳策糖的较大影u q 和破坏( | 冬| 2 1 ，c 、d ) 。壳策糖 浓度越南r 述变化越明显。 a】cd 图2 - 1 壳聚糖对大丽轮枝菌苗落和菌丝形态( 10 0 ) 的影响 f i g2 - ie f t e lo f c h i t o s a no n t h ec o l o n ya n dh y p h a f l0 0 ) o f r d a h l m e 32 壳聚糖浓度对病原真菌生长的影响 3 2l 对菌落的影u 向( 以赤星病菌a b e r n a r i aa l t e r n a t a 为例) 图2 - 2 不同浓度壳浆糖对赤星病菌茵落的影响 f i 9 2 2 t h cc f f e c lo fc h i t o s a n0 1 1 t h ec o l o n yo f a l t e r n a r l a a l t e r n a t a 壳聚糖处理浓度从左到右依农为： 上排00 1 2 5 9 l ，02 5 1 0 5g lo7 5 9 l t 排：io g l 、2 0 9 l 、3 0 9 l 、4 0 班和50 9 i 对照学i 落形态规则，低浓度时变化j ：i 大，随着浓度的列岛，菌落颜色变深， j t 其边缘巫为叫届，闲丝牛k 逐渐受到抑制，菌落大小与壳聚糖浓度呈现规律性 的对应关系。当浓度1o g l 时曲落已很难形成，仅有极少的变形菌丝靠转接的 培养l 营养块l 】的营养生长。浓度3o t ，时菌落已无法形成，赤星病菌牛艮被 完全抑制。浓度能够明显地影i l 目壳策糖对真菌的抑制活性( 罔2 - 2 ) 。 322 刘茼始生长量的影响 为了比较不川浓度的壳聚糖对真菌影响程度对培养4 8 h 的真苗茼缒生长量 的差异作了显著性分析。结果表明，壳聚辅浓度时其抑菌澈粜有明显影响。在蚓 5 一浓度不同真菌之间和同一真菌不同浓度之间，壳聚糖的抑菌效果有较大差别 ( 表2 1 ) ，说明真菌对壳聚糖敏感性是不同的。抑菌效果随浓度( o 1 2 5 9 l 5 o l ) 增加而增强，但两者并不成正比。浓度o 7 5g l 时的各个处理反而能够促 进葡萄炭疽病菌的生长，以0 5 l 促进作用最强。浓度达到o 5 l 时，除白绢 病菌和葡萄炭疽病菌外，其它6 种病原真菌的生长受到明显抑制( p o 0 5 ) 。 表2 1并r - 4 8h 后壳聚糖对9 种植物病原真菌菌丝生长的影响 t a b l e 2 1e f f e c to fc h i t o s a no nt h eg r o w t ho f8p l a n tp a t h o g e n sa f t e ri n c u b a t e df o r4 8 h * 形d a h l i a e1 7 0 81 6 7 81 5 1 b1 3 3 。1 2 8 。8 0 d3 2 。3 2 e2 2 f1 7 f r o l f s i i 5 7 45 2 84 9 84 4 83 9 83 7 80 60 60 b0 b a a l t e r n a t a9 5 89 1 b 8 5 。8 0 84 5 。2 5 1 0 80 “0 h0 “ c g l o e o s p o r i o i d e s 7 0 b8 7 89 3 89 8 89 7 86 7 b 6 3 b5 7 b5 3 b5 0 b eo x y s p o r u m1 6 0 81 3 3 b1 2 2 。1 1 3 d1 0 7 d4 0 。1 7 f 1 o f g 0 9 0 9 c 1 a g e n a r i u m 8 0 37 5 a b7 2 曲6 5 b5 3 。4 5 。2 7 d2 3 d2 0 d1 7 d c m u s a e9 3 88 2 a b8 0 a b7 3 b5 5 。4 5 c d4 1 c d 3 8 c a3 5 d3 3 d pu t m u m1 4 0 81 0 9 b1 0 0 。8 0 d7 9 d7 3 d0。0。0。0。 e p n 9 3 8 1 7 b1 2 。0 8 d 0。0。0。0。0。0。 砌上标表示各浓度处理均值与对照相比差异显著性变化( p 1 o g l 的处理在 培养1 4 4 h 后抑菌率仍高于7 7 0 。( 图2 3 ) 本试验结果表明较高浓度( 1 o g l ) 的壳聚糖抑茵持效期长，可达到6 天 以上，较低浓度( 1 o g l ) 的壳聚糖抑菌持效期短，仅能维持2 天左右时间。 抑菌效果随时间和浓度表现出规律性变化，具有明显的相关性，这在b e n h a m o un 等【7 6 】对fo x y s p o r u m 的研究中也有过类似的报道。 - - 0 - - 0 2 5 | l 一o2 5 1 l 十o5 i l l 00 07 5 | l 8 一lo | l + 2o | l 00 - - 4 - - 3o i 几 4o | l - 5o | l 0 4 ab 图2 。3 壳聚糖对两种真菌的抑茵活性随时间的变化 f i g 2 3c h a n g e si na n t i f u n g a la c t i v i t yo fc h i t o s a na g a i s tt w of u n g i a 白绢病菌( r o l f s i i ) b 终极腐霉( p u l t i m u m ) 3 4 九种植物病原真菌的最低抑菌浓度( m i c ) 以培养7 2 h 后真菌完全无法在培养基上生长的壳聚糖处理浓度为相应的 m i c 7 7 , t m 】。9 种真菌的m i c 值见表2 2 。 表2 2 壳聚糖对9 种真菌的最低抑菌浓度 t a b l e 2 - 2 m i n i m a li n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n ( g l ) o fc h i t o s a na g a i n s t9d i f f e r e n tf u n g i 2 8 c 培养7 2 h 后测定最低抑菌浓度 m i n i m u mi n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n ( g l ) a f t e ri n c u b a t i o nf o r7 2ha t2 8 c 随着培养时间延长，浓度 2 o g l 的处理也逐渐失去完全抑菌作用。7 2 h 后在所 1 7 采用的浓度范围内只能测到5 种真菌的m i c 。烟草黑胫病菌m i c 值为o 7 5 9 l ， 赤星病菌和终极腐霉的m i c 为3 o g m ，测试的= l e e 炭疽病菌和大丽轮枝菌受壳 聚糖影响相对较小，m i c 5 o g l 4 讨论 已有大量研究表明，壳聚糖具有广谱抗菌活性，能够抑制多种微生物的生长。 本文同样发现，除壳聚糖对测试的9 种植物病原真菌均具有一定的抑制效果，但 抑制作用强弱因壳聚糖浓度、病原菌的种类等而异，抑菌时效与浓度有明显相关 性。 在壳聚糖处理后，测试真菌的菌落和菌丝的形态、结构发生了明显的变化， 这可能是由于壳聚糖本身对真菌的细胞壁有破坏作用造成的。在壳聚糖处理后， 为了阻止壳聚糖穿过细胞壁对细胞膜及细胞内部结构造成扰乱，真菌相应的合成 大量的细胞壁成分，积累壁物质，以此对抗壳聚糖的破坏作用，适应环境的胁迫， 从而导致细胞壁增厚。同时，壳聚糖除了在菌体外成膜外，更重要的可能是直接 干扰了真菌细胞内的生理生化反应，甚至核内基因表达，破坏细胞内大分子【3 引， 导致细胞新陈代谢紊乱，使菌体细胞结构受到破坏，菌丝变形。但关于菌丝变形 与细胞骨架的关系及繁殖行为遭破坏的机理并不明确。 各不同浓度对真菌的影响具有一定的变化规律，又有差异。不同病原菌对浓 度变化的反应也有差别，敏感性不同。受壳聚糖溶解性能的影响，当达到一定浓 度时，继续增大壳聚糖浓度后抑菌效果差别不显著，这是因为当浓度增高到一定 程度时，其在菌体内外已达到饱和，若再继续增加浓度会造成壳聚糖自身絮凝， 遮盖部分氨基，有效浓度降低，这样可能会弱化壳聚糖的抑菌作用【6 引。浓度 o 7 5 9 l 处理一直促进黄瓜炭疽病菌的生长，而0 1 2 5 9 l 的壳聚糖在对大丽轮 枝菌处理9 6 h 后也由抑制转为促进其生长，具体机理并不清楚。 壳聚糖对真菌的抑制效应较细菌弱些【7 5 】，我们的试验结果也验证了这一点。本 文9 种真菌中烟草黑胫病菌的m i c 为0 7 5 9 l ，其他最小值则为3 0 9 l 。这可能 与细菌和真菌及真菌菌种之间本身的结构，尤其是细胞壁和细胞膜的成分、结构 和生化组成等不同有关，由此壳聚糖对其作用机理也会有所不同，导致不同的抑 菌效应和微生物反应。 1 8 壳聚糖抑菌时效因浓度不同而有较大差别，这可能是因为壳聚糖抑菌能力与 其分子量和分子内- n h 2 质子化程度造成的。随着处理时间延长，壳聚糖逐渐分 解，同时，真菌代谢产物积累，改变了基质环境，对壳聚糖的理化性质也能产生 影响，n h 3 + 数量发生变化，导致其对真菌的生长抑制效应减弱。低浓度壳聚糖 分子数目少，受此影响自然大些，所以会出现这种差异。从试验结果来看，壳聚 糖浓度1 0 9 l 抑菌率低，下降太快，抑菌效果不理想，而浓度 1 0 9 l 对两种 病原菌抑制活性高，持效期长，离体条件下在一周内仍保持较高的抑制活性。因 此，在农业生产中选择使用较高浓度的壳聚糖溶液用于作物相关病害的预防会更 为合适一些。当然，壳聚糖本身溶解性较差，浓度过高会导致其自身絮凝，造成 有效浓度降低，影响了壳聚糖在生产实践尤其农业上的应用，因此研究开发高溶 解性的壳聚糖及其衍生物，探究其诱抗机理已是当今甚至今后壳聚糖应用研究的 热点之一。 除了病原菌种类、时间和壳聚糖浓度等因素对抑菌效果有影响以外，壳聚糖 分子量( 粘度) 、储藏时间和p h 等【3 6 】对抑菌效果也有影响。总之，壳聚糖具有 广谱抗菌性，其抗菌效果受很多因素影响，具体机理还处在推测当中。阐明离体 条件下壳聚糖对真菌的作用机理，从而为植物尤其是农作物植株上的抗病研究提 供依据是非常必要的。相信随着壳聚糖抑菌机理研究的逐渐深入，其在农业上的 应用与开发一定具有良好的前景。 1 9 第三章壳聚糖对烟草黑胫病菌的抑制作用 壳聚糖能够抑制多种真菌 2 8 , 6 8 , 7 9 】的生长，但相对而言对真菌抑制机理的研究 较少，到现在为止具体抑菌机理仍不明确。 烟草黑胫病菌( 尸鲤o p h t h o r ap a r a s i t i c av a rn i c o t i a n a e ，p p n ) 是一种严重危 害烟草的病原真菌，大田里产生孢子囊释放大量游动孢子，可以危害包括烤烟、 晾烟、晒烟、香料烟、白肋烟等所有栽培烟草，破坏性极强，大田侵染后常造成 烟株成片凋萎死亡【8 0 】，给烟草生产造成严重损失。p p n 主要的传播形式就是产生 大量的孢子囊，在适宜的条件下放出游动孢子感染烟草的伤口或直接侵入，侵染 部位主要是茎基部。以厚垣孢子和休眠菌丝体在土壤、粪肥中的病残体上越冬， 可以存活3 年左右【8 1 , 8 2 】。也有报道认为，厚垣孢子在土壤中至少可以存活8 个月， 而菌丝体单独在土壤中只能存活2 个月【8 3 】，因此p p n 的危害很大，防治难度较 高。本文以烟草黑胫病菌为试验材料，研究了离体条件下壳聚糖对烟草黑胫病菌 和孢子萌发的抑制作用，并就其与壳聚糖分子量和溶剂环境条件的关系进行了探 讨，以期为壳聚糖抗真菌研究和烟草生产中对黑胫病的预防等应用提供参考。 1 材料 壳聚糖：四种不同分子量的壳聚糖( c s l ，分子量为5 0 1 0 3 ；c s 2 ，分子量 为4 7 x 1 0 4 ；c s 3 ，分子量为2 0 1 x 1 0 5 ，c s 4 ，分子量为9 0 1 0 5 ) 购自金壳生物 化学有限公司。 烟草黑胫病菌：p p n 由浙江师范大学微生物实验室保存。 2 方法 2 1 壳聚糖浓度和分子量对 p n 生长的影响 用1 ( v v ) 的冰醋酸溶解适量的各分子量壳聚糖，将壳聚糖溶液加到p d a 培养基中，制得壳聚糖最终浓度分别为8 0 m g l 、4 0 m g l 、2 0 m g l 、l o m g l 、5 m g l 、 2 5 m g l 、1 2 5 r n g l 和o 6 2 5 m g l 的p d a 培养基，对照以等量乙酸溶液代替壳聚 糖溶液。调p h 至5 8 0 + 0 0 1 ，1 2 1 灭菌1 5 m i n ；将上述培养基倒入培养皿中， 2 0 每个浓度设3 个重复。 2 2 壳聚糖p h 对p p n 生长的影响 用1 的冰醋酸溶液配制浓度为1 0 m g l 的四种分子量壳聚糖的p d a 培养 基，用4 0 ( w v ) 的n a o h 溶液调p h 至4 5 0 、5 0 0 、5 5 0 、5 8 0 、5 9 0 、6 2 0 ， 1 2 1 灭菌1 5 m i n ，倒平皿，各p h 设3 个重复。 用直径6 m m 打孔器沿3 d 龄p p n 菌落边缘打取菌饼，转接至上述培养皿中， 保鲜膜封口，生化培养箱中2 8 。c 培养，每1 2 h 采用十字交叉法测量一次菌落直 径。 2 3 壳聚糖对p p n 孢子萌发的影响 配制燕麦培养基( o a ) ：燕麦片3 0 9 ，葡萄糖2 0 9 ，琼脂2 0 9 ，水1 0 0 0 m l 。 四层纱布过滤后加入四种分子量的壳聚糖，浓度均为6 0 m g l 。1 2 1 灭菌 1 5 m i n ，倒薄层平板，设3 个重复。每个平板接l m l 浓度为1 0 x 1 0 6 l 的孢子液， 涂抹均匀。生化培养箱中2 8 。c 培养1 0 h 后显微镜下计数孢子萌发数目，测算孢 子萌发率；以芽管长度达到孢子长度1 2 为萌发。 计数方法：取三个培养平板，每个培养平板各随机取三个视野，计数； 萌发率= 萌发孢子数观测孢子总数。 2 4 数据分析 用s p s s 统计软件对试验数据进行分析。 7 2 h 时对菌落、菌丝形态和生长量作分析，以真菌不能生长的壳聚糖浓度为 其最低抑菌浓度( m i c ) ； 抑菌率( g r o w t hi n h i b i t o r yr a t e ，g i r ) = ( 对照菌丝生长量- 处理菌丝生长量) x 寸照菌丝生长量。 2 1 3 结果与分析 31 壳聚糖对l p n 形态结构的影响 3 i1 尸聊茼落形态变化 陶3ip p n 不同浓度壳聚糖处理后茁落形态 f i 9 3 - it h es h a p e o f p p nc o l o n y t r e a t e d w i t hc h i t o s a no f d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s 浓度是影j 】曲壳聚拈抑菌效果的醇要凶誊之一。在吐定的系列浓立1z ，我们发 现，际rc s i 柏：o6 2 5 m g l 时促进e p n 的生长外，其它处理都小旧稗度地抑制 真菌的化陡。其巾，在2 0 m g l 浓度范l 目内c s 2 能够完全抑制p 肼的- 长。苗 落随浓度，叟化见幽3 - 1 ( 以c s 2 为例) 。低浓度i 时菌潞形态利菌丝牛长黾与对照 差别较小，浓度越大，菌落越小，l 刊时菌丝变形，变密，颜色加深。至2 0 m g l 时助”已根本不能，k 长，苗蒋无法形成。与前面所测的8 种植物真茼相比，壳 聚特对l p n 的抑制作用卫为有效。 3 12 茼娃形态结构变化 在壳聚槠处理后菌丝形态变化较为叫拈，见图3 2 ( 以c s 4 为例) 。对照菌 丝形态规则，内古物丰富，常见苗体细胞内含大量的大颗粒代谢物；而壳聚糖处 理过的菌丝形态出现了较多的扭曲、嘭胀等畸变，苗丝分枝不规则，颗粒细小稀 少，内含物较少。壳聚槠对p p n 的j 侈态结构年新陈代十具有i 蚓缸i 1 勺影响。 、 蠲 熏薏蔫i 笺荨禳j 。t 一j ：! j i i 塞。j ：潮 图3 - 2 壳聚糖对p p n 菌丝形惠的影响( 1 0 1 0 0 ) f i 9 3 2e f f e c to f c h d o s a n 。nt h em y c e l i u mo f p p n ( 1 0 1 0 0 爨霎鬓 3 2 壳聚糖分子量对p p 规生长的影响 许多资料表明，壳聚糖的抗菌活性与其分子量大小有关。s h i g e h i r o 等指出 低分子量壳聚糖和壳聚糖寡聚体对多种病原菌具有强烈抑制作用，而高分子量的 壳聚糖仅有微弱的抑制作用。c h e n 等研究表明：分子量在1 o 1 0 4 1 o x l 0 5 的壳 聚糖对细菌的生长有抑制作用。t o k u r a 等曾报道平均分子量为9 3 0 0 的壳聚糖对 大肠杆菌的抑制最明显，平均分子量为2 2 0 0 的壳聚糖反而促进其生长。因此， 分子量是影响壳聚糖抗菌活性的重要因素【7 ，四种不同分子量壳聚糖抑菌活性 如图3 3 。 低分子量的c s l 抑菌活性较低，而其它三种壳聚糖则相对较强，虽因浓度 有所变化，但在所测浓度范围内一直保持着较高的抑菌活性( g i r 5 8 0 ) 。壳 聚糖对e p n 生长的影响与分子量密切相关，同一浓度下，不同分子量的抑菌效 果存在较大差异，浓度为6 2 5 m g l 时，分子量越大抑菌效果越强，壳聚糖的抑 菌活性与分子量成正相关性。但随着浓度的增加，c s 2 的抑菌活性增加较快，在 浓度 ，5 m g l 后，四种壳聚糖抑菌效果由强到弱的顺序变为：c s 2 c s 4 c s 3 c s l 。因此，分子量明显能够影响壳聚糖的抑菌活性，同时与浓度也相关。 00 6 2 5i 2 52 551 02 04 0 8 0 _ 一l 图3 - 3 不同浓度壳聚糖对砟聊的影响 f i g3 - 3 e f f e c to f c h i t o s a nw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so nt h eg r o w t ho f p p n 3 3 壳聚糖浓度对e p n 生长的影响 浓度的增加能够增强壳聚糖的抑菌效果，分子量越小抑菌活性受浓度影响越 明显。在浓度1 2 5 m g l 时，c s l 并不能抑制e p n 的生长，反而对其生长起促 进作用。但随着浓度升高e p n 生长量近线性减小，在浓度 ；，2 0 m g l 时，同其它 三种壳聚糖类似，c s l 已能有效抑制 p n 的生长( g i r 7 0 ) ，其中，c s 2 能 2 3 够完全抑制印行的生长。在浓度 2 0 m g l 时印胛对浓度的增加已较迟钝( 图3 3 ) ， 这可能是因为菌体内外壳聚糖已饱和，浓度继续增加并不能使其有效浓度有相应 幅度的增加。c s 2 的m i c = 2 0 m g l ，其它三种壳聚糖m i c 8 0 m g l 。 3 4p h 的影响 3 4 1p h 对e p n 生长的影响 不同的微生物都应有其生长最适的p h 环境，p h 值的变化必然会影响微生 物的生长和繁殖。 试验发现，培养基p h 的变化对p p n 生长的影响较大( 图3 4 ，c o n t r 0 1 ) ，尸明 在弱酸性环境中生长状况更好，最适p h 为5 9 0 。过酸的培养环境( p h = 4 5 0 ) 对p p n 的生长是不利的，与其它p h 下e p n 菌丝生长量相比有着极显著( p o 0 5 ) ，但与p h 5 8 0 、5 9 0 和6 2 0 之 间差距仍然是显著的( p o 0 5 ) 。随p h 升高，菌丝生长量逐渐增加，在5 9 0 时 达到最大值，当p h 继续增加到6 2 0 时菌丝生长量开始下降。 3 4 2p h 对壳聚糖抑菌效果的影响 大分子量壳聚糖本身并不溶于水，只能溶于酸性溶液，在酸性溶液中壳聚糖 的n h 2 结合h + 形成- n h 3 + ，而n h 3 + 量是影响壳聚糖抑菌生物活性的重要因素， 因此溶液的p h 必然会影响其抗菌效果。为此本文通过进一步试验分析了p h 对 壳聚糖抑菌效果的影响，试验结果见图4 4 。 口- 三- o - - c o n 4 5 05 0 0 5 ，5 05 8 0 5 9 0 6 2 0p l l 图3 - 4 不同p h 对枷生长的影响 f i g3 - 4e f f e c to fp ho nt h eg r o w t ho f p p n 与对照相比，四种分子量的壳聚糖在所测p h 下对 p n 的生长均具有抑制作 用，但壳聚糖对p h 敏感性不尽相同。 p h 的变化并未明显影响c s l 的抑菌效果。同其它壳聚糖相比，c s l 在所测 2 4 p h 下抑菌活性仍是最低，受p h 的影响也是最小的，p p n 菌丝生长量因p h 不同 表现出弓空白对照类似的变化( 图3 _ 4 ) ，抑苗活性变化不明显。其它三种壳聚糖 存设定的p h 下均