（分析化学专业论文）碳纳米管在葡萄糖生物传感器中的应用.pdf

摘要 碳纳米管以其特有的机械强度、高比表面积、快速电子传递效应和 化学稳定性，成为各学科领域研究热成之_ 。+ 近年来碳纳米管因为独糙 的电子结构使其被广泛地应用于电化学生物传感器。：礞纳米管修饰电极! 不仅可以提高电子传递速度，而且由于其比表面积大能够作为一种优良 的催化剂载体。 本文采用多壁碳纳米管为研究对象，以扩展多壁碳纳米管在生物电 化学传感器领域中的应用为目的分成三部分开展了研究。第一部分探讨 了多壁碳纳米管在金电极上的共价固定及其构成的葡萄糖生物传感器 的电化学行为：先在金电极上自组装一层巯基乙氨，将除杂、羧基化后 的多壁碳纳米管( m w n t s ) 溶液滴在该电极表面上可获得a u m w n t s 修饰电极。通过电化学沉积纳米铂( p t ) 在c n t 电极上构建一种新型 的复合材料修饰电极。并用扫描电镜对该复合材料进行了表征。实验表 明高分散具有较大比表面积的纳米m w n t s 】p t 修饰电极对h 2 0 2 的氧化 呈现良好的电催化作用。以m w n t s 力x 为基底，通过纳米金吸附葡萄糖 氧化酶制成葡萄糖生物传感器，该传感器的灵敏度高，线性范围宽并且 保持良好的稳定性。第二部分探讨了胺基团修饰碳纳米管。利用多聚赖 氨酸对碳纳米管进行改性，再利用戊二醛的交联作用固定葡萄糖氧化 酶，这样种酶分子的固定方法可以增加固定的分子数量，从而增强反 应信号。n a f i o n 是一种全氟化的磺酸酯聚合电解质，：能够很好地溶解碳 纳米管。我们将修饰葡萄糖氧化酶的碳纳米管和n a f i o n 混合均匀，然后 涂在铂纳米颗粒修饰的金电极上成功制各成葡萄糖生物传感器。实验结 果表明该传感器具有响应时间短、灵敏度高、稳定性好等特点。第三部 分探讨了以多聚赖氨酸( p o l y l y s i i i e ) 包埋碳纳米管和葡萄糖氧化酶制备 葡萄糖生物传感器。多聚赖氨酸( p o l y 哆s i n e ) 对蛋白有较强的吸附能力和 保持蛋白结构不变的能力。将碳纳米管和葡萄糖氧化酶加入多聚赖氨酸 溶液中，充分混合超声3 0m i n 然后在铂电极上涂一层膜制成葡萄糖生 物传感器。实验表明，碳纳米管可以提高酶的催化活性。使酶电极的电 羹塞l 垂墓萝i | 耋薹冀耋萋奏霎墓萋至l i l 妻茎聋薹薹耋 囊篚辇妻羹妻号垂妻差耋薹i 喜童喜三i l 薯麦塞堇誊l 季喜囊薹；萋；重露! 童 孽垂薹三皇雪霉姜謇曼塞至篓至乏蕈妻量耋誊奏i 奏攀；：留萋摹! 壁妻l 塞i 羹蚕i 薹善l 薹妻；耄；垂曩誉i 篓薹；奏毛羹i 薹誊! 韦l l ； 童重羹； 茎l 菥 耋；i 暮萋萋圣蓄 耄鲁囊。 霍墓摹薹! ! 三耋i差i 蠡雾霉；薹差补重囊| 萋圣l 蚕垦亭 l 鍪| 圣羹琴量 耋季譬篓i 鑫鞋l 晕；萋妻i i ! 鐾薹重墓垂蚕l 要 萼耋耋薹墓警善釜垂量霎霎喜主童蠡藏耋 蚕矍至羔 量羹| 未鬟茧i 垂墓! 茎 彗羹孽蠹；差 奏l 赛耋i 妻蕈孽基强蓦i 鬯薹!蚕l 誊耋量毫事兰；薹蠹垂墨主蚕妻童l 薹茎i 蓁至鼍蘑l i 薹量i 毒量! 萎至墓 鐾；童薹莹垂l i 暮三， a b s t r a c t c a r b o nn a n o t u b e sh a v eb e c o m eo n eo ft h eq u i t ep o p u l a rp r o b l e mi n r e s e a r c ha r e ao ne a c hs u b j e c t ，o w i n gt ot h e i rs i g n i f i c a n tm e c h a n i c a ls t r e n g t h ， h i g hs u r f a c e a r e a e x c e l l e n te l e c t r o nt r a n s m i s s i o na n dg o o dc h e m i c a l s t a b i l i t y r e c e n t l y c a r b o nn a n o t u b e sh a v e b e e ne x t e n s i v e l yu s e di n e l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o rb e c a u s eo ft h e i rs u b t l ee l e c t r o n p r o p e r t i e s c a r b o nn a n o t u b e sn o to n l yh a v et i l ea b i l i t yt op r o m o t ee l e c t r o n 仃a n s f e r r e a c t i o nw h e nu s e da se l e c t r o d em o d i f i c a t i o nm a t e r i a l ，b u ta l s oi sp r o m i s i n g a sc a t a l y s tc a r r i e rd u et ot h e i rh i 曲s u r f a c ea r e a i no r d e rt od e v e l o pan e wp o t e n t i a la p p l i c a t i o no fm w n t si nt h ef i e l do f e l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r s ，w eh a v es t u d i e da p p l i c a t i o n so ft h em w n t si n t h i st h e s i s t h ec o n t e n tc o n s i s t so ff o l l o w i n gt h r e ep a r t s i np a r to n e ， c o v a l e n ti m m o b i l i z a t i o no fm w n t so n g o l d e l e c t r o d ea n dt h e e l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o ro fg l u c o s eb i o s e n s o r , w h i c hi su s i n gm w n t sw e r e d i s c u s s e d ：t h ee l e c t r o d ew a sf i r s ti m m e r s e di nalm ms o l u t i o no fc y s t e a m i n e i ne t h a n o lf o r10ht og i v eaa s s e m b l e dm o n o l a y e r ( s a m ) t h ee l e c t r o d e w a st h e nf u r t h e rm o d i f i e dw i t ho x i d a t i v e l ys h o r t e n e dm w n t st of o r ma a u m w n t sm o d i f i e de l e c t r o d e an e wt y p eo fc o m p o s i t en a n o m a t e r i a l m o d i f i e de l e c t r o d ew a sc o n s t r u c t e d b y e l e c t r o c h e m i c a l d e p o s i t i o n o f p l a t i n u mn a n o p a r t i c l e s o n t om w n t sm o d i f i e de l e c t r o d e a n dt h e m o r p h o l o g i e sw e r ec h a r a c t e r i z e db ys c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e l v o e x p e r i m e n t a lr e s u l t si n d i c a t et h a th i 【g hd i s p e r s e dp l a t i n u mn a n o p a r t i c l e so n m w n t s ( m w n t s p t ) ，w h i c hh a sl a r g es u r f a c ea r e a ，e x h i b i t e dag o o d e l e c t r o c a t a l y t i c a la c t i v i t yt o w a r dh y d r o g e np e r o x i d e t h eg l u c o s eb i o s e n s o r w h i c hw a sb a s e0 1 1a d s o r p t i o no fg l u c o s eo x i d a s ea tm w n t s p ts u b s t a n c e b yu s i n gg o l dn a n o p a r t i c l e sr e s u l t si ne x c e l l e n ts e n s i t i v i t y , l a r g el i n e a r r a n g e ( 0 5 m mt o1 7 5 m m ) ，a n dg o o ds t a b i l i t y i np a r tt w o ，a m i n og r o u p m o d i f i e dc a r b o nn a n o t u b e sw a sd i s c u s s e d ：w i t hg l u t a r a l d e h y d ea c t i n ga s i i i c r o s sl i n k e r , g l u c o s eo x i d a s eh a sb e e ni m m o b i l i z e do np o l y l y s i n em o d i f i e d c a r b o nn a n o t u b e s t h i sm e t h o do fi m m o b i l i z a t i o no fg l u c o s eo x i d a s ec a n i n c r e a s et h ee n z y m el o a d i n ga n dt h e r e f o r e 、c a ni n c r e a s ec u r r e n tr e s p o n s e n a t i o ni sap e r f l u o r o s u l f o n a t e dp o l y m e r t ! f d mw h i c hh a v et h ea b i l i t yi t o s o l u b i l i z em u l t i w a l lc n t t h e nt h eg l u o o s eb i o s e n s o tt h a sb e e nd e v e l o p e d b yl a y i n gp o l y m e rn a t i o na n dc a r b o n 。n a n o t u b e s ，w h i c hh a sb e e nc r o s s l i n k e dw i t hg o x ，o np l a t i n u mn a n o p a r t i c l e sm o d i f i e dg o l de l e c t r o d e t h e e x p e r i m e n t a l r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed e s i g n e db i o s e n s o r e x h i b i t e dh i g h s e n s i t i v i t y , r a p i dr e s p o n da n dl o n g - t e r ms t a b i l i t y i np a r tt h r e e ，t h ea b i l i t yo f p o l y l y s i n et os o l u b i l i z em u l t i w a l lc n t a n df o rt h ec o n s t r u c t i o no fg l u c o s e b i o s e n s o rw e r ed i s c u s s e d p o l y l y s i n ec a na d s o r b ep r o t e i ns t r o n g l ya n dk e e p t h es t r u c t u r eo fp r o t e i n i nt h i sa r t i c l e ，t h ec o m p o s i t eo fc n ta n dg l u c o s e o x i d a s ew e r el a y i n go nt h ep l a t i n u mm o d i f i e de l e c t r o d et op r e p a r eg l u c o s e b i o s e n s o r e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o wt h a tc n tc a ne n h a n t et h ea c t i v i t yo f e n z y m ea n di n c r e a s et h ec u r r e n tr e s p o n s e t h er e s u l t i n gb i o s e n s o rw e r e u s e dt od e t e c tg l u c o s ew i t h1 0 wd e t e c t i o nl i m i ta n df a s ta m p e r o m e t r i c r e s p o n s e m o r e o v e r , t h ef a b r i c a t i o no ft h i sb i o s e n s o ri ss i m p l ea n di ti s a f e a s i b l em e t h o dt od e t e c tg l u c o s e k e y w o r d s ：c a r b o nn a n o t u b e ，b i o s e n s o r , m o d i f i e de l e c t r o d e ，p l a t i n u m n a n o p a r t i c l e ，g o l dc o l l o i d a l ，g l u c o s eo x i d a s e ，p o l y l y s i n e ， n a t i o n 碳纳米管在葡萄糖生物传感器中的应用 1 1引言 第一章绪论 碳纳米管以其独特的物理和化学性质及巨大的潜在的高科技应用前 景，成为各学科研究的热点之一【l 8 】。电化学传感器是由各种生物分子( 酶、 抗体、受体或全细胞) 与电化学转换器( 电流型或电位型的电极) 组合构成， 其中生物分子识别的专一性决定了该传感器具有高度选择性。酶电极是最 早研发的生物传感器，将酶固定在电极表面，探测电流型或电位型催化反 应信号，酶的固定化是决定酶电极特性的关键技术。电流型酶电极基于探 测生物催化反应中生成或消耗的电活性物质，大量的氧化还原酶、n a d + 辅酶及脱氢酶可用于多种底物( 葡萄糖、乳酸、乙醇、有机磷等) 的检测。 纳米颗粒修饰葡萄糖酶电极是基于纳米颗粒的一类电化学传感器，它随着 多种纳米颗粒的制备而快速发展，其中碳纳米管修饰电极在酶电极中有特 殊的优点：化学稳定性高、导电性好、比表面积大。 1 2 碳纳米管的性质、制备及研究进展 1 2 1 碳纳米管概述 碳纳米管( c n t ) 又称巴基管( b u c k y t u b e ) ，属富勒( f u l l e r e n e ) 碳 系，是1 9 9 1 年由日本电镜专家s i i j i m a t 9 1 在用石墨电弧法制备c 6 0 的过程 中发现的。碳纳米管是由单层或多层石墨片围绕中心轴按一定的螺旋角卷 绕而成的无缝、中空的微管 1 0 - 1 2 1 ，每层碳纳米管是由一个碳原子通过s p 2 杂化与周围3 个碳原子完全键合所构成的六边形平面组成的圆柱面。根据 石墨管壁的层数，碳纳米管可以分为：单壁碳纳米管( s w n t ) 和多壁碳 纳米管娟悄t ) 。s w n t 是由单层石墨卷成柱状无缝管而形成，是结构完 美的单分子材料。m w n t 一般由几层到几十层石墨片同轴卷绕构成，形状 象个同轴电缆。多壁碳纳米管在开始形成时，层与层之间很容易成为陷阱 中心而俘获各种缺陷n 3 】，单壁碳纳米管不存在这样的缺陷。但无论是 硕士学位论文 s w n t 还是m w n t ，它们的直径长度比很大【7 1 ，一般情况下，长度 都是直径的几千倍，可以认为是具有特殊结构的一维量子材料。 国际上对碳纳米管的研究目前正处于蓬勃发展的时期。美国、日本等 国家在该领域的研究处于相对领先的地位。国际上关于碳纳米管的研究集 中在生长工艺、生长机理、结构分析、材料特性等方而。我国在碳纳米管 方而的研究也取得了国际瞩目的重大进展。中国科学院物理研究所的解思 深研究小组在大面积定向超长碳纳米管阵列生长技术上取得了重大的突 破。国内进行有关研究的单位还有d 匕京大学、清华大学、西安交通大学、 中国科学院上海原子核研究所、中国科学院金属研究所、浙江大学等。 1 2 2 碳纳米管的化学性质 c n t s 的特殊性能与它的独特结构密切相关。碳纳米管由石墨演化而来 所以它的结构与石墨的片层结构相同，具有很好的电学性能；而a n t s 的 c c 共价键是自然界最稳定的键，所以c n t s 又具有非常好的力学性能。 1 2 2 1 电学性能 就导电性而言，碳纳米管可以是金属性的，也可以是半导体性的，甚 至在同一根碳纳米管的不同部位，由于结构的变化，也可以呈现出不同的 导电性。此外，电子在碳纳米管的径向运动受到限制，表现出典型的量子 局域效应；而电子在轴向的运动不受任何限制。因此，可以认为碳纳米管 是一维量子导线。 1 2 2 2 力学性能 碳纳米管是由碳六边形构成的觅缝中空网格组成，其基面中的碳由碳 s p 2 杂化共价键直接相连，缺陷较涉。从结构推测它具有很高的强度，甚 至可能是迄今人类发现的最商强度的纤维 1 $ - 1 9 】。碳纳米管在经受弯曲时 不会出现断裂，而仅仅其六边形状及圆柱形状发生变化，因此在具有很高 强度的同时还具有很好的韧性。实验证明，在大气氧化条件下，c 卷r r s 在 9 7 3 k 的温度下失重很少，结构基本没有发生变化。c 卜兀隐在酸、碱的长 2 碳纳米管在葡萄糖生物传感器中的应用 时间浸泡下，结构基本不发生破坏，当被浓酸较长时间煮沸或高能球磨机 球磨后，c n t s 只是从缺陷( 主要是五边形碳环七边形碳环) 较多部位断 裂，变成较短、较直的且带开口的管，同时在管的表面形成一些化学官能 团。 1 2 2 3 热学性能 碳纳米管具有很高的长径比，使大部分热沿轴向传导，圆柱形碳纳米 管在平行于轴线方向的热传导性与金刚石相仿，而垂直方向又非常低。适 当排列碳纳米管可得到非常高的各向异性热传导材料。碳的石墨化程度越 高，其导热系数也越大。 1 2 2 4 催化性能 碳本身就是一种优良的催化材料，在化工生产中有广泛应用。目前，有 关碳纳米管作催化剂的报道不多，物质由宏观尺度进入纳米尺度时，许多性 质都会发生惊人的变化，纳米级的碳管也会产生不同于普通碳催化剂的特 性。 1 2 2 5 磁学性质 碳是抗磁性物质，但碳纳米管的磁性却有所变化。常温下碳纳米管的 轴向磁化系数为1 0 7 x 1 0 6e m u g ，为径向的1 1 倍，是6 0 的3 0 倍。 1 2 3 碳纳米管的制备 碳纳米管由于其显著的应用前景发展得较快。目前，碳纳米管的制备 方法很多，可以分为电弧法、气相热解法、固相热解法、离子或激光溅射 法【2 0 】。 1 2 3 1 电弧法 电弧法【9 ，2 的原理是：石墨电极在电弧产生的高温下蒸发，在阴极沉积出纳 米管。传统的石墨棒直流电弧放电法是在真空反应器中充以一定压力的惰 3 硕士学位论文 性气体，采用面积较大的石墨电极为阴极，细石墨棒为阳极。电弧放电的过 程中，阳极石墨棒不断消耗，同时在石墨电极上沉积出含有碳纳米管的结 疤。这种方法具有简单快速的特点，到目前为止，仍不失为一种好的制备方 法。 1 2 3 2 气相热解法 气相热解法【2 2 2 3 】是通过烃类( c 6 h 6 、c 2 h 2 ) 在f e 、c o 、n i 等催化剂的 催化下裂解而成的，具体制备一般是取少量催化剂，于固定床常压连续流动 反应器中，在6 0 0 、h 2 气氛下预还原o 5h ，迅速转换至反应所需温度，导 入纯净的烃类( 或蒸汽) 。该法的产率较高，但含管状结构的产物比例不高， 管径不整齐，形状不规则，且在制备过程中必须使用催化剂。 1 2 3 3 固相热解法 固相热解法 2 4 , 2 5 是采用常规固相热解含碳亚稳固体生长碳纳米管的 新方法。一般采用亚稳非晶碳氮化硅粉为原料，将其放入b n 坩锅中再放 入石墨炉体内。系统抽空之后再充入1 1 0 5p a 的n 2 ，密闭系统。然后升 温加热至一定温度。保温一段时间后冷却到室温，热解样品表面即有碳纳 米管生成。本法具有过程稳定、不需催化剂、原位生长等多种优点，但因 为受原料的限制，使其生产不能上规模和连续化。 1 2 3 4 离子或激光溅射法【2 6 2 7 】 利用等离子或激光蒸发石墨至相对的金属石墨靶上来生产碳纳米 管。利用激光器聚焦成6 - 7r a i n 的光束照射至含有金属的石墨靶上，激光 在计算机的控制下，平和定量地维持石墨蒸发，蒸发的烟灰被氩气从炉体中 带走，然后沉积在炉外的水冷铜收集器表面。此法易于连续生产，但由于设 备上的原因，限制了它的规模。 1 2 4 碳纳米管的纯化 单壁碳纳米管( s w n t s ) 和多壁碳纳米管 娟烈t s ) 因为它们的性质不 4 碳纳米管在葡萄糖生物传感器中的应用 同，所以其纯化方法也有所不同；而且由于不同的制备方法和实验条件引 入的杂质不同，所以纯化方法还因具体的制备方法而异。 目前己经报道的碳纳米管的纯化方法有许多种这些方法大致可分为 物理法、化学法和综合法。物理方法主要是根据碳纳米管与杂质物理性质 ( 如粒度、形状、比重、电性能等) 的不同而进行分离；化学方法主要是根 据碳纳米管与其它含碳杂质的化学稳定性不同，利用氧化剂对碳纳米管和 碳纳米微粒、无定形碳等杂质的氧化速率不同而逐步分离；综合法则是根 据物理法及化学法各自的优缺点，把二者结合起来使用的一种方法。 1 2 4 1 物理纯化方法 物理纯化方法：离心分离法、电泳纯化法、过滤纯化法、空间排斥色 谱法。 一离心分离法 由于石墨微粒、碳纳米粒子和无定形碳等杂质的粒度比碳纳米管大， 在离心分离时它们受到离心力的作用先沉积下来，而粒度较小的碳纳米管 则留在溶液中，从而分离。 二电泳纯化法 利用电泳原理根，据电泳速率的不同将c n t s 与其它杂质颗粒分离， 且所得c n t s 未受到损坏。 三。过滤纯化法 碳纳米管在具有水表面活性的溶液中可以呈动态稳定的凝胶状分散 物存在。通过控制凝絮，可按一定尺寸范围选择性分离c n t s 。 四空间排斥色谱法 空间排斥色谱法( s i z ee x c l u s i o nc h r o m a t o g r a p h y , s e c ) 也称凝胶渗 透色谱法。该方法是基于试样分子尺寸和形状的不同来实现分离。该方法 所用的填充剂是凝胶其孔穴大小应与被分离试样的大小相当。对于那些 太大的分子( 如碳纳米管) 不能进入孔穴而被排斥，故随流动相移动而最先 流出小分子能深入大大小小的孔穴，完全不受排斥，而最后流出；中等大 小的分子可进入较大孔穴，但会受到较小孔穴的排斥，所以在介于上述两 5 硕士学位论文 种情况之间流出。由于碳纳米管与其它杂质的尺寸不同，故该方法可有效 将单壁碳纳米管或多壁碳纳米管与其它杂质分离。 1 2 4 2 化学纯化方法 一气相氧化纯化法 气相氧化法主要是利用空气或氧气对含碳纳米管的样品进行氧化从 而达到提纯的目的，该方法不需要特殊的实验装置，反应条件容易控制， 操作简单、易行，有工业化应用前景。 二液相氧化纯化法 液相纯化法一方面用酸来去除金属催化剂颗粒，另一方面用氧化性酸 溶液将比碳纳米管更容易氧化的其它杂质除去。常用的氧化性酸溶液有硝 酸、混酸、重铬酸钾和高锰酸钾的硫酸溶液等。 1 2 4 3 综合纯化法 综合纯化法有：酸处理与电泳法的结合、微孔过滤与电解法的结合、 气相氧化、酸处理与微内孔过滤的结合、酸处理与离心分离的结合萃取、 酸处理与气相氧化的结合萃取以及酸处理与冷冻法的结合。 1 2 5 碳纳米管的应用研究 碳纳米管具有独特的电子结构和物理化学性质，可以在许多方面得 到广泛的应用。由于碳纳米管具有很大的表而积，可以用来作为催化剂的 载体，最大程度的提高催化剂的效率，由于在其表面存在大量的微孔，还 可以用来进行储氢，制造新型氢电池【2 引。同时，由于直径和螺旋结构的 影响，使碳纳米管既具有金属导电性又具有半导体性能。这种独特的电子 特性使得它在电学领域有潜在的应用前景 2 9 3 1 】。如：场效应晶体管【3 2 】、 纳米电子器件【3 3 】等。除此之外，碳纳米管还在复合材料【3 4 1 、传感器 3 5 1 和 探头方面有着广阔的应用前景。 1 2 5 1 碳纳米管在电化学传感器方面的应用 6 碳纳米管在葡萄糖生物传感器中的应用 c n t s 的特殊性能与它的独特结构密切相关。碳纳米管的弯曲结构使 得电子在其中的传播速度比石墨更快，具有高速电子传递效率。碳纳米管 用于电化学传感器，具有促进生物分子与电极的电子传递作用。目前已有 不少研究工作者报道了碳纳米管对不同具有氧化还原性质生物分子的优 良电催化特性。如b r i t t o 等首先将碳纳米管制成电极并用于对神经递质多 巴胺的电催化氧化开辟了碳纳米管应用的新领域 3 6 1 。王建秀等将单壁碳 纳米管修饰在玻碳电极和金电极上，单壁碳纳米管修饰的玻碳电极对去甲 肾上腺素的电化学氧化具有明显的电催化作用【3 7 1 。w a n g 等报道了n a t i o n 溶解单壁碳纳米管和多壁碳纳米管制备修饰电极对过氧化氢和儿茶酚胺 类神经递质具有优良的电催化性能【3 8 1 。 总之由于碳纳米管具有非常好的性能，其尺寸又处于纳米级因而具 有很好的应用前景，被誉为下世纪材料革命的引发剂。 1 3 葡萄糖氧化酶的直接电化学研究 葡萄糖氧化酶是一种重要的生物大分子，它是对葡萄糖专一的高效氧 化催化酶。研究葡萄糖氧化酶的电化学现象在生命科学中具有着重要的意 义。因为葡萄糖是人体中最基本的化学构成物质之一，它是为机体提供能 量的主要来源。进入循环系统与血液结合的葡萄糖称为血糖，血糖水平变 化常可反映糖在体内代谢的状况，测定血糖含量对于判断糖代谢是否正常 具有重要意义【3 9 】。目前，测试血液葡萄糖浓度的方法主要有3 种：显色 法、酶电极法1 4 0 和荧光方法【4 1 1 ，三种方法各有优点，其中酶电极法由于 速度快，检测方法简单，正被越来越多地使用。葡萄糖氧化酶的电化学研 究是制作方法简单、重现性好和响应快的酶电极的基础，因此也得到了广 泛关注【4 卜4 9 1 。 将g o x 用合适的方法固定在电极表面制成能响应其底物的生物电化 学传感器是生物电化学的重要研究课题，传统方法将g o x 固定在电极表 面有溶胶凝胶法 5 0 - 5 3 1 、聚合物包裹法【5 4 5 7 1 、共价键合法1 5 8 】以及吸附法【5 9 6 2 等。然而，目前对葡萄糖氧化酶的直接电子的转移报道较少，这主要是 因为：( 1 ) 酶在电极表面会发生强烈的吸附而变性，影响了酶与电极间的 7 硕士学位论文 电子传递，( 2 ) 酶分子具有庞大的空间结构，因其氧化还原中心被多肽链包 围，与电极表面较远，阻碍了其与电子传递， 6 3 1 ( 3 ) 酶表面电荷分布的不 对称性极大地影响了酶在电极表面直接电子转移反应的可逆性。为解决这 些问题，人们利用电子媒介体加速电极与酶活性点之间的电子传递，使传 感器的灵敏度有很大提高。使用的电子媒介体有二茂铁及其衍生物，醌及 其衍生物，铁氰化钾，四硫富瓦烯及钌化合物等。但目前这些传感器还存 在着媒介体易流失及一些电活性物质干扰等缺点，产生干扰的原因是这些 电活性物质如尿酸、多巴胺、抗坏血酸等在电极上被氧化或所采用的电子 媒介体本身对这些电活性物质有催化氧化作用。2 0 世纪7 0 年代以来，氧 化还原蛋白质和酶的直接电子转移反应引起了越来越多研究者的兴趣畔 7 2 i 。其中制备直接电子传递的第3 代电流型葡萄糖生物传感器成为葡萄糖 生物传感器的一个重要研究方向。而直接电子传递的葡萄糖生物传感器的 发展迫切需要寻找新材料和新的固定方法。纳米科学的发展为葡萄糖氧化 酶的直接电子转移带来了新材料，由于纳米粒子具有比表面积大，催化活 性高，亲和力强，表面活性中心多等特点，近年来倍受关注。如唐芳琼r 7 3 】 等用金、银、铂和s i 0 2 纳米颗粒固定葡萄糖氧化酶制备葡萄糖生物传感 器，使葡萄糖氧化酶0 3 0 x ) 的辅基与电极可进行直接电子传递。 1 4 金属纳米粒子 1 4 1 金属纳米粒子的特性及制备 由于金属纳米粒子具有量子尺寸效应、小尺寸效应、表面和界面效应、 宏观量子隧道效应，从而显现出独特的宏观物理、化学特性，因而使其成 为纳米科学与材料科学领域的重要研究对象。金属纳米粒子是指尺寸介于 l 1 0 0i l m 之间的金属细小颗粒。其制备方法可以分为物理法和化学法两 种。物理法主要包括气体蒸发法、金属蒸汽合成法、溅射法和真空蒸发法 化学法。化学法主要包括还原法、电解法和羧基法。 1 4 2 金属纳米粒子在酶生物传感器中的应用 近年来，人们对金属纳米粒子的制备研究越来越感兴趣，金属纳米粒 8 碳纳米管在葡萄糖生物传感器中的应用 子可以用于电学、催化、磁性材料、光催化、生物染色剂、药物运输等许 多领域。其中，传感器领域是金属纳米粒子最有前途的应用领域之一。将 金属纳米粒子引入酶电极中，能够使电极的响应增大，灵敏度提高，酶电 极的寿命延长。这是因为( 1 - ) 金属纳米粒子具有良好的化学活性和催化 活性。( 2 ) 纳米粒子的表面效应使得纳米粒子可以吸附大量的活性酶分子， 从而提高传感器的电流响应：( 3 ) 由于金属纳米粒子具有良好的导电性和 宏观隧道效应，可以作为固定化酶之间、固定化酶与电极之间有效的电子 中介体，从而促进酶的氧化还原中心与电极间通过金属粒子进行的电子转 移。目前已经有研究报道了将金属纳米粒子用于酶电极。女i j u n g u o z h a o t 7 4 】 等人利用金纳米颗粒制备出直接电子传递的过氧化氢电极。该电极的工作 电位可以降低为0v ( a g a g c i ) 。s a nh u al i m t 7 5 】等人通过电沉积方法将钯 纳米粒子和葡萄糖氧化酶固定在碳纳米管上成功制备了葡萄糖传感器。 1 5 论文设想 碳纳米管是一种独特的一维纳米材料，因其独特的结构、特殊的机械 及电子特性而引起人们越来越广泛的关注。碳纳米管的独特结构和电子性 质，预示着它具有非常巨大的潜在应用。例如储存氢气及其它的气体1 7 6 , 7 7 】， 量子导线【7 踟，电子装置【2 9 1 以及催化剂【7 9 8 2 1 等。由于电子在碳纳米管中的传 递速度比石墨快，碳纳米管还可以在电化学反应中用作电极。本文正是基 于这些特性对碳纳米管展开研究。首先通过用h 2 s 0 4 h n 0 3 处理将碳纳米 管羧基化再通过组装把碳纳米管固定在金电极上或通过共价交联技术在 管子上固定好葡萄糖氧化酶，从而实验碳纳米管在葡萄糖生物传感器方 面的应用；其次，将金属纳米粒子通过电化学方法沉积到电极表面上构建 特殊功能的p t c n t 或c n t p t 新型复合材料修饰电极，并应用于葡萄糖生 物传感器的电化学研究。最后，由于n a t i o n 是一种全氟化的磺酸酯聚合 电解质，不仅能够很好地溶解碳纳米管而且n a t i o n 膜是一种阳离子交换 膜能够将尿酸、多巴胺、抗坏血酸等电活性物质阻挡在电极外，防止其干 扰。多聚赖氨酸( p o l y l y s i n e ) 对蛋白有较强的吸附能力和保持蛋白结构不变 的能力。本文利用n a t i o n 和多聚赖氨酸溶解碳纳米管构建n a t i o n 膜和 9 硕士学位论文 p o l y l y s i n e 膜葡萄糖生物传感器。 1 0 碳纳米管在葡萄糖生物传感器中的应用 第二章基于共价固定碳纳米管的葡萄 糖传感器的研究 2 1 引言 碳纳米管作为一种新型的单质碳，自从1 9 9 1 年日本i i j i i i l a 教授在高 分辨透射电镜下发现以来，引起了人们极大的兴趣【9 】。碳纳米管与其它的 碳，例如玻碳、活性碳、石墨等显著不同，碳纳米管具有纳米尺寸、比表 面积大和提高电子传递速率等独特性质。目前人们越来越多的关注碳纳米 管在燃料电池【8 3 】、纳米电子器件【3 3 】、纳米管高能电容器【8 4 】和电化学传感 器【3 5 】等方面的应用。其中碳纳米管在电化学传感器和生物传感器方面的 应用最有前途。将酶、核酸等生物分子固定在碳纳米管上可以制备一系列 性能优良的生物传感器【85 8 6 】。由于碳纳米管不溶于水或有机溶剂而限制 了对其化学性质的研究。以前报道的碳纳米管修饰电极主要是将碳纳米管 溶液涂布在玻碳电极表面【8 7 1 或将碳纳米管溶解在n a f i o n 【8 引、t e n o n 【8 明和 d 【9 0 】中来进行电极表面化学修饰。本文我们报道了通过自组装制备碳 纳米管电化学传感器。碳纳米管通过共价键固定在巯基乙胺修饰的金电极 表面。这种碳纳米管自组装制备葡萄糖传感器的方法以前没有报道过。 许多葡萄糖生物传感器都是基于葡萄糖氧化酶。传统的酶固定方法有 纳米结构材料、碳糊电极、有机聚合物【5 4 5 7 】和凝胶溶胶【5 0 5 3 1 。纳米材料， 例如纳米尺寸的金溶胶、p t 纳米颗粒和s i 0 2 纳米颗粒在酶电极中非常重 要。因为纳米颗粒用于修饰工作电极表面时，不仅方法简单而且制备的酶 生物传感器灵敏度很高。p t 纳米颗粒是一种普通的金属催化剂，因为它 对h 2 0 2 具有很高的催化活性，可以修饰许多生物分子而且修饰电极时可 以增大电极比表面积，所以得到了越来越广泛的研究。在碳纳米管上沉积 p t 纳米颗粒操作简单，p t 沉积厚度可以很容易控制。纳米尺寸的金溶胶 具有良好的生物相容性，故可用来吸附氧化还原酶并保持酶的生物活性和 提高电子的传递速率。本文报道了在a 删a l l n 。n o 电极上吸附葡萄糖氧 化酶，结合了碳纳米管、p t 纳米颗粒和金溶胶的优点。 硕士学位论文 2 2 实验部分 2 2 1 仪器与试剂 c m 6 6 0 a 型电化学工作站，压电石英晶体微天平似r - c u t ，8 z ，金 电极) ( 上海辰华仪器公司) ；s b 2 2 0 0 型超声仪( 上海b 鼬蝌s o n ) ； g s p 2 7 7 2 0 3 磁力搅拌器；采用三电极体系，工作电极为自制酶电极( = 1 m m ) ，参比电极为饱和甘汞电极，对电极为铂电极。 多壁碳纳米管( m m ，c v d 法制备) ( 湖大材料科学工程学院) ；葡 萄糖氧化酶( g 0 x ：2 1 5u m g ) ，一d 葡萄糖，盐酸1 2 乙基2 3 2 ( 3 2 二 甲基氨基丙酸) 碳二亚胺( e d c ) 及n 2 羟基琥珀酰亚胺( n h s ) 均为 s i g m a 产品，5 0 i n l 磷酸盐缓冲溶液( p b s ) 由n a 2 船0 4 1 2 h 2 0 和 n a h 2 p 0 4 2 h 2 0 配置，h a u c l 4 、h 2 p t c l 6 、h n 0 3 、h 2 s 0 4 ( 购于上海化学 试剂厂) ；其它试剂均为分析纯，所用水为二次蒸馏水。 2 2 2 纳米金的制备 用化学还原法制备，按文献【9 1 1 ，1 的柠檬酸纳水溶液加入到沸腾的 h a u c l 4 溶液中。所用的玻璃仪器必须先用王水清洗( h c l ：删0 3 = 3 ：1 ) ， 然后用二次水冲洗。在5 0 0m l 三颈烧瓶中，2 5 0n 1 lo 1 的h c 1 4 剧烈 搅拌加热至沸腾，然后往里加入3 7 5m l1 的柠檬酸纳，2 0s 溶液变为 深蓝色，6 0s 后溶液变为酒红色，继续加热l om i n ，停止加热后，继续搅拌 1 5m i n 。溶液放置4 冰箱中保存，以备用。 2 2 3 传感器的制备 2 2 3 1 碳纳米管的纯化和羧基化 碳纳米管是用化学气相沉积法( c h e m i c a iv a p o rd e p o s i _ t i o n ，c v d ) 合成的，这种方法制备的碳纳米管中所含杂质主要为金属及金属氧化物颗 粒和无定形碳及石墨碎片，因此首先要对碳纳米管除杂。本文采用空气加 热氧化法和浓酸超声分散来除去碳杂质。具体操作如下：称取1 0 0m g 多 壁碳纳米管( m w n t ) 在3 5 0 下氧化2 小时，去除金属氧化物催化剂， 冷却后于浓盐酸中超声4 小时，再洗涤烘干。将纯化好的碳纳米管再置于 1 2 碳纳米管在葡萄糖生物传感器中的应用 2 3 结果与讨论 2 3 1 a 硼c n t 电极和a 硼：n t 】p t 电极的s e m 图 图2 - 1 ( a ) 是制备得到的碳纳米管修饰电极的扫描电子显微镜图。由图 可见，除杂后的碳纳米管很纯净，直径在1 0 5 0l l n l 。图2 1 ) 是碳纳米 管电极上沉积p t 纳米颗粒的扫描电子显微镜图。由图可见，p t 纳米颗粒 很均匀地沉积在碳纳米管上。 图2 l 碳纳米管修饰电极和碳纳米管铂修饰电极的扫描电子显微镜图 f i g 2 l r 1 1 l cs e m i i i l a g 嚣o f ( a ) a i | ，c n te l e c 呐d e 锄d ) a i l c n l 垤d 灯o d e 2 3 2 碳纳米管修饰的石英晶振的性能 硫原子与金、银及铂等金属基体有很强的相互作用，文献已经报道了 许多含硫化合物、二硫化物以及巯基化合物等与一些金属可组装形成致密 硕士学位论文 有序的单层膜。我们用巯基乙胺在金电极表面修饰自组装单层膜，然后把 自组装膜修饰电极放入e d c 和n h s 活化的碳纳米管溶液中浸泡：巯基自 组装单层膜上的末端氨基同碳纳米管的羧基反应形成酰胺键，从而实现碳 纳米管分子的共价固定。 石英晶体微天平( q c m ) 是通过测定振子的基频共振频率变化来测定 质量变化的一种现代化高科技技术【粤。根据s a u e r b r e y 方程【9 7 1 测定质量变 化如下：f = _ 2 2 6 1 0 6 昂2 m a 其中f 为石英晶体谐振频率变化， ( h z ) ；为石英晶振的基频，( m h z ) ；a 为石英晶体的有效面积，m 2 ； m 为晶振表面吸附质量变化；n g 。图2 2 显示巯基乙胺修饰的石英晶振 与碳纳米管溶液反应。从图2 2 可以看出，当将巯基乙胺修饰的石英晶振 插入溶液反应4 小时，频率迅速上升，1 0 小时之后趋于稳定。 寒 司 t i m e h 图2 2 频率响应曲线 f i g 2 21 面叽e d e p e n d e n t舭q u e n c yc h a n g e s( f ) o fa c y s t e a i n i n e 币m 胡o m d 溉da 峋u a r t zc 巧s t a lu p o nt 1 1 ec o u p l i ：n g o f a 叮tt 1 1 a tl 删au n d e r g o 鹏o 】( i d 撕v ed i g s t i o n 蠡”5 h 1 h q u e i e s 1 6 碳纳米管在葡萄糖生物传感器中的应用 2 3 3 电沉积p t 绝大多数葡萄糖传感器均采用在电极表面上修饰葡萄糖氧化酶( g o x ) 的方法来制备，以期获得高灵敏度和高选择性的电极响应。原理如下： 葡萄糖+ g o x ( f a d ) 叫葡萄糖内酯+ g o x ( f ：a d h 2 ) g o x ( f a d h 2 ) + 0 2 g o x ( f a d ) + h 2 0 2 产生的h 2 0 2 可在电极表面氧化产生响应。铂黑微粒具有高度分散性，不 仅有很大的表面积，而且对h 2 0 2 有很强的催化活性。我们利用即时电流 法分别在金电极和碳纳米管上沉积了一层p t 膜，图2 3 是不同沉积时间 下铂修饰金电极( a ) 和铂修饰碳纳米管电极( b ) 对h 2 0