（分析化学专业论文）高盐样品的毛细管电泳在柱预富集方法研究.pdf

q 科学技术人学嘲卜学位论文 中文摘要 摘要 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，简称c e ) 因其分离效率高、分析速度 快、样品消耗小、操作成本低等优点，已成为一种强有力的分离分析技术。但由 于c e 采用极细的毛细管内径和极小的进样体积，紫外可见检测法的灵敏度较差。 为克服这种缺点，必须对检测器进行改进或对样品进行预富集，特别是在柱预富 集技术。对紫外可见检测灵敏度的改进，常用延长吸收光程的方法，如已有报道 的泡型池和z 型池等。另外，增大样品注入体积或压缩大体积样品的在柱预富 集技术也得到迅速发展。前者如场放大进样( f a s i ) 、大体积进样( l ，v s i ) 等。 后者如瞬间等速电泳( t i t p ) 、利用p h 不连续性和胶束电动毛细管色谱( m e k c ) 扫描富集等。其中，样品堆积技术应用最为广泛，它利用了样品溶液比背景缓冲 液低得多的电导率。尽管这种简单的富集方法可以达到较好的富集倍数，但对含 有大量无机盐的生物样品却难以直接应用，如血液和尿液。通常需对样品进行稀 释或渗析，而这些步骤繁琐且耗时，甚至由于稀释而不适于c e 的紫外可见检测。 所以，高盐样品的c e 在柱预富集研究已引起了分析工作者广泛的兴趣。 论文基于样品堆积原理和电泳移动界面理论，以高盐样品中药物阳离子的富 集为研究对象，主要取得了以下几个方面的创新性结果： ( 1 ) 提出了场放大进样一酸堆积的毛细管区带电泳在柱复合富集技术，研究了 各步富集在整个预富集过程中所起的作用及其相互关系。不仅给出了合理 的理论解释，还用实验进行了证明。 ( 2 ) 利用c e 间接检测法对s h i h a b i 提出的乙腈高盐样品堆积属准瞬间等速电 泳的观点进行了证明。 ( 3 ) 将c e 间接检测法应用于瞬间等速电泳中尾随离子的选择，操作简便，结 果直观，方法易于推广。 ( 4 ) 利用场放大迸样一酸堆积的复合富集技术，取得了乘积倍的富集效果，将 检测灵敏度提高了近三个数量级。 另外，论文还对硅胶整体柱的制备机理、结构特性及应用领域的最新进展进 行了综述，在聚四氟乙烯模具内成功合成颗粒聚集形的硅胶整体柱，并对其性能 进行了初步的探讨。 i l 中国科学技术大学硕士学位论文 樊业摘要 a b s t r a c t a sap o w e r f i f ls e p a r a t i o nt e c h n i q u e ，c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) p o s s e s s e si t s s i g n i f i c a n ta d v a n t a g e s ，s u c ha sh i g hs e p a r a t i o ne f f i c i e n c y , s h o r ta n a l y s i st i m e ，l o w s a m p l ec o n s u m p t i o na n dl o wp e r f o r m a n c ec o s t ，h o w e v e r ，i t su v d e t e c t i o ns u f f e r s f r o mp o o rs e n s i t i v i t yb e c a u s eo ft h et i n yi n j e c t i o nv o l u m ea n dt h en a r r o wc a p i l l a r y i n n e rd i a m e t e r i no r d e rt os o l v et h i sp r o b l e m ，ag r e a td e a lo fe f f o r th a sb e e nm a d et o a m e l i o r a t et h ed e t e c t o ra n dd e v o t e dt ot h eo n c o l u m ns a m p l ep r e c o n c e n t r a t i o n w i t h r e g a r dt oi m p r o v i n gt h ed e t e c t i o nc a p a b i l i t i e s ，s e v e r a la p p r o a c h e sb ye x t e n d i n gt h e o p t i c a lp a t hl e n g t hw e r er e p o r t e d ，s u c ha sb u b b l ea n dz - s h a p e dc e l l s o nt h eo t h e r h a n d ，m a n yo n c o h m mp r e c o n c e n t r a t i o nt e c h n i q u e sw e r ed e v e l o p e dt oi n c r e a s et h e s a m p l ei n j e c t i o nv o l u m eo rt o n a r r o wt h e l a r g e v o l u m es a m p l ez o n ei n c e f o r i n s t a n c e ，t h e f o r m e ri n c l u d e d f i e l d a m p l i f i e ds a m p l ei n j e c t i o n ( f a s i ) a n d l a r g e v o l u m es a m p l ei n j e c t i o n ( l v s i ) e t c ，a n d t h el a t t e ri n v o l v e d t r a n s i e n t i s o t a c h o p h o r e s i s ( t i t p ) ，p hd i s c o n t i n u i t y m e t h o d sa n d s w e e p i n g i nm i c e l l a r e l e c t r o k i n e c t i cc h r o m a t o g r a p h y ( m e k c ) e t c a m o n go n c o l u m np r e c o n c e n t r a t i o n t e c h n i q u e s ，e l e c t r o s t a c k i n gi st h em o s tc o m m o n l y u s e dm e t h o d ，w h i c hi sb a s e du p o n t h el o w e rc o n d u c t i v i t yo fs a m p l ez o n et h a nt h a to fb a c k g r o u n db u f f e r r e g i o n a s a t i s f a c t o r yc o n c e n t r a t i o nf a c t o rc a nb ea c h i e v e db yt h i ss i m p l em e t h o d h o w e v e r ，i t u s u a l l yb e c o m e si n e f f e c t i v ef o rs o m eb i o l o g i c a ls a m p l e sc o n t a i n i n gh i g h s a l tm a t r i x ， s u c ha sp l a s m aa n du r i n e a l t h o u g hd i l u t i o no rd i a l y s i sc a nb ee m p l o y e dt or e d u c et h e m a t r i xc o n c e n t r a t i o n p r i o r t o s e p a r a t i o n ，t h ep r e t r e a t m e n tp r o c e s s e s a r eo f t e n t r o u b l e s o m ea n dt i m e c o n s u m i n g ，a n dm a yb eu n s u i t a b l ef o rt h ec e u vd e t e c t i o n b e c a u s eo fi t sd i l u t i o n c o n s e q u e n t l y , a n a l y t i c a lc h e m i s t sh a v es t u d i e dt h et o p i co f o n - c o l u m np r e c o n c e n t r a t i o nf o rh i g h - s a l ts a m p l e s a t t e n t i v e l y , b a s e do nt h e p r i n c i p l e s o f s a m p l es t a c k i n g a n d e l e c t r o p h o r e t i cm o v i n g b o u n d a r i e s ，t h i sd i s s e r t a t i o nf o c u s e do nt h ep r e c o n c e n t r a t i o no fp h a r m a c e u t i c a l c a t i o n si nh i g h s a l ts a m p l e sa n do b t a i n e dt h em a j o ri n n o v a t i v ec o n c l u s i o n sa sf o l l o w s ： ( 1 ) a d u a lp r e c o n c e n t r a t i o nt e c h n i q u eo ff i e l d - a m p l i f i e di n j e c t i o n ( f a i ) a n da c i d 1 1 1 【f 】田f ： 学技术大学硕士学位论文英文摘要 s t a c k i n g i nc z ew a sp r o p o s e d ；t h er o l eo fb o t h s t e p sd u r i n g t h ew h o l e p r e - c o n c e n t r a t i o np r o c e s sa n dt h er e l a t i o nb e t w e e nt h e mw e r es t u d i e d h e r en o t o n l ya r e a s o n a b l ee x p l a n a t i o no fm e c h a n i s m ，b u ta l s oe x p e r i m e n t a le v i d e n c ew a s p r e s e n t e d ( 2 ) a n o v e li n d i r e c td e t e c t i o ne x p e r i m e n tw a sd e s i g n e dt ov a l i d a t et h eo p i n i o nt h a t a c e t o n i t r i l e f a lw a sap r o c e s so f p s e d u o t r a n s i e n ti s o t a c h o p h o r e s i s ( t - i t p ) ， w h i c hw a sa d v a n c e db ys h i h a b i ( 3 ) i n d i r e c td e t e c t i o ni nc ew a sa d o p t e dt oc h o o s et h et e r m i n a t i n gi o ni nt r a n s i e n t i s o t a c h o p h o r e s i s t h em e t h o d i ss i m p l e ，c o n v e n i e n ta n d e a s i l ym a n i p u l a t i v e ( 4 ) b yu s i n gad u a lp r e - c o n c e n t r a t i i o nt e c h n i q u ec o m b i n i n ga c e t o n i t r i l e f a lw i t h a c i ds t a c k i n g ，t h ep r e - c o n c e n t r a t i o nf a c t o ro fa p r o d u c to f t w o t e c h n i q u e sc a n b e o b t a i n e d t h es e n s i t i v i t ye n h a n c e m e n tw a sn e a r l yt h r e eo r d e r so fm a g n i t u d e h i g h e rt h a nn o r m a l l ye l e c t r o k i n e t i ci n j e c t i o n i na d d i t i o n ，t h i sd i s s e r t a t i o np r o v i d e sar e v i e wo nt h ep r e p a r a t i o nm e c h a n i s m ， s t r u c t u r ep r o p e r t i e s ，a n du p t o d a t ed e v e l o p m e n to fm o n o l i t h i cs i l i c ac o l u m n a t y p e o f p a r t i c l e - a g g r e g a t e dm o n o l i t h i cc o l u m n w a s p r e p a r e di np t f em o d e l ，a n dt h ei n i t i a l d i s c u s s i o no fi t sp r o p e r t i e sw a sa l s op r e s e n t e d i v 中科学技术人学硕卜学位论文 致谢 致谢 本论文是在导师何友昭教授的悉心指导下完成的。 何老师严谨求实的科学态度、勇于创新的研究精神和对科研工作的刻苦奉献 精神为我树立了一名优秀科研工作者的典范。他的精心指导和对我的严格要求使 我初步体会到了科研工作的乐趣和艰辛，两年短暂的实验室工作将使我终生受 益，在此向何老师表示由衷的感谢。 另外特别感谢张汉昌老师在我几个月的毛细管电泳电化学检测实验中给予 我的指导与帮助。张老师的不倦教诲以及富于启发性的引导为我的工作开启了另 外一扇门，使我收获颇多。 我们的实验室是一个积极进取和团结协作的温暖集体。在我的实验期间，胡 艳云、王营、邓宁、张召香、许庆平、钱立立、傅国妮、皮昀丹、高勇都给予了 我极大的帮助和支持，在此表示深深的谢意。 还要感谢我周围其它老师和同学的关心和帮助，伴我度过了在科大美好的三 年时光。 最后，感谢我最敬爱的父母和姐姐，在我最困难时给予了我极大的精神鼓励， 让我重新振作起来，战胜困难! 本论文也献给他4 f 。 李云 2 0 0 4 年5 月于科大 r l _ i 删科学挫术大学坝f 学位论立第一章绪论 第一章绪论 第一节毛细管电泳简介 1 1 毛细管电泳的发展 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，简称c e ) 的历史可以归溯到1 9 6 7 年 h e i e r t e n 发表的博士论文( 1 】，现在人们普遍将c e 定义为在内径1 0 0g m 以内的 毛细管中进行的电泳分析，它的出发点应归功于1 9 7 9 年m i k k e r s 等人在内径o 2 m m 的聚四氟乙烯管中进行的研究1 2 1 。1 9 8 1 年j o r g e n s o n 和l u k a c s 发表的研究 论文对c e 的发展做出了决定性的贡献( 3 】，他们用内径7 5g r n 的毛细管对荧光标 识氨基酸化合物进行c e 测定，获得理论塔板数高达4 0 万的高分离性能；论文 还深入地阐明了c e 的些基本性能和分离的理论依据。1 9 8 4 年t e r a b e 4 等人 提出了胶束电动毛细管色谱法叫e k c ) ，使许多电中性化合物的分离成为可能， 大大拓宽了c e 的应用范围。到8 0 年代后期，c e 的研究成为分析化学领域的热 门课题，至今已有各种英文专著1 0 多部，其中3 部与药物分析有关【5 7 】。从8 0 年代末开始每年都有多次国际性c e 学术会议，t a b 1 列出比较有代表性的国际 性h p c e 会议召开地点和专辑情况，可以看出到目前为止c e 研究的中心仍然还 在美国。通过s t l n ( t h es c i e n t i f i c & t e c h n i c a li n f o r m a t i o nn e t w o r k ) 对美国化学文 摘的检索结果表明，9 0 年代以来，c e 的论文数几乎成直线上升。应用范围迅速 扩大，大有与目前广泛应用的高效液相色谱( h p l c ) 并驾齐驱之势。 t a b ，ti n t e m a t i o n a is y m p o s i u m so nh i g h - p e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( h p c e ) a n dt h e i rs p e c i a li s s u e s y m p o s i u m y 音a rp l a c e s p e c i a li s s u e f i r s t1 9 8 9 b o s t o n ，m a ( u s a ) jc h r o m a t o g r , 19 8 9 ，4 8 0 s e c o n d 1 9 9 0s a nf r a n c i s o ，c a ( u s a ) jc h r o m a t o g r , 1 9 9 0 ，5 1 6 t h i r d1 9 9 1 s a nd i a g o ，c a ( u s a )jc h r o m a t o g r , 1 9 9 1 ，5 5 9 叶i 旧科学技术人学坝卜学位论文第一章绪论 f o u r t h1 9 9 2a m s t e r d a m r n e t h e r l a n d ) jc h r o m a t o g r , 19 9 2 ，6 0 8 f i f t h1 9 9 3 o r l a n d o ，f l ( u s a ) jc h r o m a t o g ra ，1 9 9 3 ，6 5 2 s i x t h1 9 9 4s a n d i e g o ，c a ( u s a ) jc h r o m a t o g ra ，19 9 4 ，6 8 0 s e v e n t h1 9 9 5 w t l r z b u r g ( g e r m a n y ) jc h r o m a t o g r a ，19 9 5 ，7 1 6 e i g h t h 1 9 9 6 o r l a n d o ，f l ( u s a ) jc h r o m a t o g r a ，19 9 6 ，7 4 4 1 9 9 6 ，7 4 5 n i n t h1 9 9 7 a n a h e i m ，c a ( u s a ) jc h r o m a t o g r a ，19 9 7 ，7 8 1 t e n t h1 9 9 7 k y o t o ( j a p a n ) jc h r o m a t o g ra ，1 9 9 8 ，8 0 2 e l e v e n t h1 9 9 8 o r l a n d o ，f l ( u s a ) jc h r o m a t o g r a ，19 9 8 ，8 1 7 t w e l f t h1 9 9 9p a l ms p r i n g s ，c a ( u s a ) jc h r o m a t o g r a ，19 9 9 ，8 5 3 t h i r t e e n t h2 0 0 0 s a a r b r f i c k e n ( g e r m a n y ) jc h r o m a t o g r a ，2 0 0 0 ，8 9 5 f o u r t e e l i t h2 0 0 1 b o s t o n ，m a ( u s a ) j c h r o m a t o g ra ，2 0 0 1 ，9 2 4 f i r e e n t h2 0 0 2 s t o c k _ h o l m ( s w e d e n ) jc h r o m a t o g r a ，2 0 0 2 ，9 7 9 1 2 高效毛细管电泳( h p c e ) 的特点 1 , 2 ih p c e 的突出优点 高效毛细管电泳法( h i g h p e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，简称h p c e ) 是以石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为推动力，依据各组分之间淌度和 分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。与传统的电泳技术和现代色 谱技术相比，h p c e 的突出优点是： ( 1 ) 仪器简单，操作简便。 ( 2 ) 分柝速度快，分离效率高。 ( 3 ) 操作模式多，开发分析方法容易。 ( 4 ) 实验成本低，消耗少。 ( 5 ) 应用范围广。 中国科学技术大学坝十学位论文 第一章绪论 f i g 1 - ld e v i c eo f c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s 毛细管电泳的实验装置如f i g 1 1 所示，整个装置由高压电源、检测系统、 毛细管柱及数据记录系统等组成。其主要分离模式包括：毛细管区带电泳、毛细 管凝胶电泳、毛细管等电聚焦、电动毛细管色谱、胶束电动毛细管色谱、毛细管 电色谱、毛细管等速电泳、亲和毛细管电泳和非水相毛细管电泳。可用于核酸， 核苷酸、蛋白质多肽氨基酸、糖类，糖蛋白、碱性药物分子、手性化合物和无机 及有机离子有机酸分离、单细胞分析、药物与细胞的相互作用研究等方面。 1 2 2h p c e 的限制及其改进 由于毛细管电泳依据与色谱不同的分离机理，在开发新的分析方法上引起了 分析工作者的普遍关注。并且许多不能用普通液相色谱分离的样品可用毛细管电 泳分离【8 - l1 】。但在实际应用中，因为其检测灵敏度较低和重现性不够理想等原 因，在很多领域至今仍无法取代高效液相色谱，尤其是对痕量物质的测定，如生 物样品( 血液和尿液) 中的毒素、药物残留及代谢物等。 导致毛细管电泳检测灵敏度差主要有两方面原因： 第一，常规紫外可见吸收法的灵敏度较差。紫外可见吸收法是一种通用型的 检测方式，在h p c e 中应用最广泛。h p c e 中，检测光程短是限制灵敏度的主要 因素。毛细管内径通常为2 5 - 1 5 0 1 1 m ，由于毛细管的曲率，毛细管内的实际光程 总是小于内径，只有一部分光经过轴心，因此所提供的光程很短。对于5 0 i _ t mi d 毛细管，若要获得5 l o 4 a u 的紫外吸收信号，被分析物的浓度大约为1 0 m o l l 中国科学技术大学硕：卜学位论文 第一章绪论 ( 若摩尔吸光度为1 0 4d m 3m o l 1c m 1 ) 。但是，由于被分析物在分离过程中的扩散 或管壁的吸附，为获得良好的响应，进样时的浓度应更高，故毛细管电泳的检测 灵敏度较低。 第二，毛细管的负载能力极小。在毛细管电泳进样过程中，减小样品塞长度 非常重要。如果其长度超过因扩散造成的区带分散，分离效率和分离度将受到损 失。进样对分离峰总方差的贡献可由下式表示： 夺等 ( 1 - 1 ) 其中彬为进样长度。 在理想状态下，样品塞长度必须小于扩散引起的标准偏差，2 d ，。对进样 长度的一个实用限制是低于毛细管总长度的1 - 2 ，对于7 0c m 长的毛细管，1 长度相当于7m m ( 或1 4n l ，5 0 岬内径时) 。虽然目前使用仪器可以重现地将如 此少量的样品引到毛细管中，但在一般的情况下，解决灵敏度的不足需要更长的 进样长度。 鉴于前者，为改进紫外检测器的灵敏度，应适当延长吸收光程，设计特殊类 型的检测池。泡型池 1 2 1 、z 型池【1 3 】、多次反射检测池【1 4 】和矩形毛细管检测池 1 5 1 7 】的使用已有报道，但也同时会产生光路调整困难、制作困难、背景吸收较 大、分离效率和分离度下降等问题。最近又提出一种改进的吸收法检测装置一电 荷耦合阵列检测器( c c d ) 【1 8 ，有效地提高了信噪比。此外，使用高灵敏度的 检测器，如激光诱导荧光( l i f ) 1 9 - 2 4 】、化学发光( c l ) 2 5 2 8 、质谱( m s ) 2 9 ，3 0 、电化学( e c ) 【3 1 3 5 检测器等，可将毛细管电泳的检测灵敏度问题得 到显著改善。但由于相关检测设备费用昂贵或技术上还不成熟，致使这些检测器 未能得到广泛应用。 鉴于上述原因，为改进c e 的检测灵敏度常采用在柱样品预富集技术，利用 色谱和电泳两种技术对样品进行预富集。增加注入毛细管的被分析物量，并同时 压缩注入样品的体积。这些预富集技术可与毛细管电泳分离有下面四种不同方式 结合：( 1 ) o f f - l i n e ，预富集与电泳分开独立进行。( 2 ) a t 1 i n e ，通过一机械系统将 预富集和电泳分离组合。( 3 ) o n 1 i n e ，两者经接口装置转换结合。( 4 ) i n 1 i n e 预 4 中国科学技术大学硕二 ：学位论文 第一章绪论 富集直接在分离毛细管内发生。有关毛细管电泳预富集方法的总结详见第三节。 第二节样品堆积和电泳界面理论 2 1 欧姆定律( o h m sl a w ) e o2j ( 1 2 ) 式中，e 为电场强度( v m 1 ) ，o 为特定区域的电导( o 1 i l l 1 ) ，j 为电流密度( a m 一2 ) 。 对于一恒定横截面的毛细管，电流密度j 在整个电泳过程中的任意时刻是不变的。 此定律表明局部低电导区拥有更高的场强。在这里某区域的电导为 盯= e l m ，f ( 1 - 3 ) 式中c 和l m 。1 分别为离子浓度和淌度的绝对值，f 为法拉第常数。i 代表离子的 种类。 根据式( 1 - 2 ) 和( 1 3 ) ，在浓度界面中，界面两侧的电场强度关系是 堡：譬。等( 1 - 4 ) e p盯。c “ 所以电泳时，界面两侧的同种离子( 非两性和变价离子) 以不同的速度移动，其 速度关系为 乓：壁：譬。善( 1 - 5 ) v ?e p盯“c 。 上标q 和b 分别代表界面两侧的两相，方程( 1 5 ) 说明离子在低电导溶液( 即 稀溶液) 中迁移较快，而在高电导溶液( 浓溶液) 中迁移较慢。这一原理现已被 用在c e 中的电堆积和场放大进样。 样品区带和背景缓冲液的电导差异可以产生三种主要的影响：( a ) 扭曲峰 形；( b ) 溶质浓缩或堆积( s t a c k i n g ，低电导样品) 或去堆积( d e s t a c k i n g ，高电 导样品) ：( c ) 由于过剩某种离子( 如c l ) 而同时发生等速电泳过程。 电导的差异引起各区带中电场强度的变化，从而导致了如f i g 1 2 中峰形的 e 中闯科学技术大学硕士学位论文 第一章绪论 畸变。当样品区带离子淌度高于背景缓冲液时( 即高电导，低电阻) ，离子区带 的前沿以与其迁移相同的方向扩散，进入缓冲溶液区域时，遇到了一个较强的场 强。这使得扩散中的离子加速离开样品区带，产生区带前伸。当后沿的样品扩散 进入背景缓冲液时，同样也遇到了一个加强的场强，但与其迁移方向相同，从而 使它们加速返回样品区带，保持后沿尖锐。同样可以解释，带相反电荷的离子得 到陡峭前沿和扩散后沿的原因。电中性物质不受电导差异的影响。 a 低电导低电导 + 高电导 oo b u 丘j roob u 疗b r oo 国国 样品区带 l iii fl：i i b 等电导 oo b u f f e roob u f f e r o o j b 一 样品区带 c 高电导高电导 + 低电导 一 。日 b u f f e reb u 位r o日 甫伟 f i g 1 - 2e l e c t r o m i g r a t i o n a ld i s p e r s i o no fb o u n d a r i e sb yt h ec o n d u c t i v i t yd i f f e r e n c e b e t w e e n s a m p l ea n d b u f f e rs o l u t i o n 【3 6 e ：e l e c t r i cf i e l ds t r e n g t h 尽管这些畸变经常发生，但它们可能相对于其它分散过程( 如扩散) 来说比较 小。然而对于含有较大范围不同淌度溶质的样品，畸变变得特别明显。只要分离 度有损失，峰形畸变就是有害的。虽然这种现象只能通过缓冲溶液与样品电导之 间的匹配才能消除，但峰形畸变在c e 中往往是可以忽略的。 2 2k o h l r a u s c h 3 7 调整函数( 或o m e g a 函数) 6 中国科学挫术大学硕i j 学位论文 笫一章绪论 电泳中，移动界面的k o h l r a u s c h 调整函数表达式为 = 告= = c o n s t a n t ( 1 - 6 ) 朋? 。 式中c 为离子的当量浓度，m 为离子淌度。上标斫口鼢别代表界面两边的两相， 具有正负性，如果离子带有正电，就为正值，相反为负值。 这一函数显示，在移动的界面系统中，各种离子的当量浓度除以其淌度的加 和，在界面的两边相等。不随时间和位置的不同而变化。这个调整函数说明移动 界面会对最初状态进行调整使体系符合k o h l r a u s c h 调整函数。例如，毛细管充 满0 0 0 3m 0 1 l k c l ，则值为 暑十熹=老熹+嘉等踟。灿7州vsm4(1-m2 x ， ，川， 7 6 1 0 咄7 9 1 1 0 - 。 如果在电泳过程中引入一纯n a + 区带取代k + 的区带，则n a + 的浓度将自动调整 到0 0 0 2 4 2m o l l 以维持相同值。 k o h l r a u s c h 调整函数也表明，当样品区带比背景缓冲液的淌度高时，样品区 带的前沿将会扩散而后沿尖锐。相反，当样品区带具有比背景缓冲液低的淌度时， 前沿尖锐而后沿扩散。当电导相同时，则不会出现上述畸变峰形( 见f i g 1 2 ) 。 2 3 区域的界面及其特性 电泳中主要存在两类不同性质的界面。第一类分为静止界面( s t a t i o n a r y ) 和 移动( m o v i n g ) 界面；第二类分为稳定( s t a b i l i z e d ) 和不稳定移动( n o n s t a b i l i z e d m o v i n g ) 界面。 2 3 1 静止界面和移动界面1 3 8 4 6 】 如果界面两边存在相同的离子，但其浓度不同。若通过界面前后的质量流速 相同，则界面并不发生迁移，我们称之为静止( 非移动) 界面。分离毛细管横截 面上的质量流速为 f = v a e = m e a c m o l s 1 】 ( 1 8 ) 式中v 为离子的迁移速度，a 为横截面积，c 和m 分别为离予的浓度和淌度，e 中闺科学投术大学硕二l 学位论文第一章绪论 为电场强度。 此类界面最简单的一种就是仅有一种阳离子和一种阴离子组成的背景电解 质位于界面两侧。若离子在界面两边的淌度不变，且e c 为常数，结合欧姆定律 ( 1 - 2 ) 及等式( 1 3 ) 可知界面两侧的质量流速相等，因此界面是静止的。静止 界面通常又称为浓度界面。 当在界面两侧存在几种阳离子或明离子时，情况会变得复杂这时会得到一 系列移动界面。 2 3 2 稳定界面和不稳定移动界面 在电泳过程中，移动界面通常是存在的。有时界面两侧同时存在某种离子， 有时某离子只存在于其中一侧，这样的移动界面可能是稳定的或不稳定的。一个 界面的稳定与否通常由欧姆定律决定，如果某一离子离开它所在的区域，通过其 迁移方向上的界面而到达一更高电导区，即低电场强度区，它的迁移速度会变慢 从而被自己的区带超过，获得一稳定的界面。相反，如果它到达一较低电导区， 它的迁移速度会增加结果离开自己的区带，导致界面发生扩散，这样的界面是不 稳定的。因此不稳定移动界面又被称之为扩散界面。总之，在离子迁移方向上的 场强下降得到一稳定界面，而场强增加将产生一不稳定界面。 稳定界面中存在一自我校正效应 4 7 4 9 ( s e l f - c o r r e c t i n ge f f e c t ) 或自我锐化 ( s e l f - s h a r p e n n i n g ) 效应，可与扩散作用相抵消，得一陡峭界面。如何获得稳定 界面( 又称为稳态界面) 的报道很多，1 9 8 0 年，m i k k e r s 和e v e r a e r t s 5 0 在等速 电泳体系中阐述了“i n s t a c k ”和“o u to fs t a c k ”的概念；1 9 8 5 年m o s h e r 和 t h o r m a n n 5 1 1 给出了稳态界面条件的一般情形，这一理论明确表明在强电解质体 系中，在界面迁移方向上电场强度的梯度下降是获得稳定界面的前提。若界面两 侧存在不同的离子，则前导离子( 与界面迁移同向且位于界面前的离子) 的淌度必 须大于尾随离子的淌度。若两种离子在界面两侧都存在，则需满足以下条件：界 面前的最高淌度离子与最低淌度离子的浓度比要比界面后相应的比值高。以k ， ( 】9 ) 中国科学技术大学硕二l 学位论史 笫一帝绪论 如果上述这些条件都不符合，势必会出现一扩散界面。 2 3 3 界面的电迁移扩散 如上述所述，稳定界面中电泳的自锐化效应( s e l f - s h a r p e n i n g ) 可抵消扩散 效应，且前者强于后者。然而，当界面不稳定时，并不意味着自锐化效应不存在。 只是在这种情况下，电泳迁移主要表现出边界的展宽并带来扩散。如某一离子由 于扩散离开自身所在的区域，通过迁移方向的界面到达一高电场区，它会加速迁 移且离原来自身所在的区带越来越远，这现象被称为电迁移扩散。这一理论说 明对于简单的强电解质系统，电迁移扩散的大小与被分析物离子和背景电解质中 同离子的淌度比成正比。 第三节样品预富集技术简介 3 。1 基于色谱法的预富集技术 建立在色谱机制上的在线预富集方法已经应用于不同基体中被分析物的富 集。这种技术通常可以分为两类：低专一性的预富集法，如囿相萃取( s p e ) 【5 2 6 5 、固相微萃取( s p m e ) 【6 6 、膜萃取( m p c ) 6 7 ，6 8 、液相色谱 6 9 和空 心光纤柱 7 0 ，7 1 ；高专一性的富集方法，如免疫亲和色谱法 7 2 ，7 3 和分子印记聚 合物 7 4 ，7 5 】。目前这些预富集方法已经广泛应用到生物样品的预富集。f i g 1 3 给出了一般固相萃取( a ) 和膜萃取( b ) 与毛细管电泳联用的接口。 f i g 1 - 3s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f i n l i n es p e - c e ( a ) a n dm p c - c e ( b ) g u z m a n 等f 6 3 】首次将圃相萃取技术应用于c e 的在线样品富集，用填充结合 9 中国科学技术大学硕士学位论文 第一章绪论 抗体的玻璃球富集柱置于分离毛细管前端，成功地实现了尿液中脱氧麻黄碱的在 线富集和c e 分离分析。s t r a u s b a u c h 研究小组【5 5 】报道了制作渐变固相萃取一c e 在线富集装置的方法。他们用直径相匹配的聚乙烯或t e f l o n 小管接合分离毛细 管，其中填充5 0 1 0 0n l 的反相色谱c 1 8 或c 8 填料，并以少量玻璃纤维封口。 富集样品采用压力进样( o 5p s i x l 0 m i n ) ，4 0 1 0 0n l 的乙腈稀盐酸混合液洗 脱，灵敏度的增强可以简单地通过富集样品量( 1 1 0 0n 1 ) 和洗脱剂量的比值来 确定。d e b e t s 等 7 6 1 参考h p l c 柱切换方法，设计了一个带有微量固相预柱的旋 转进样切换阀，以液相色谱柱塞泵驱动，实现大体积样液柱前富集。切换阀旋转 后，电渗流解吸和c e 分离分析，结果检测罂粟碱灵敏度可提高2 3 个数量级。 分子烙印( m o l e c u l ei m p r i n t i n g ) 技术是近年来得到广泛关注的一种新兴技术 7 7 ，7 8 。由于分子烙印聚合物( m o l e c u l ei m p r i n t i n gp o l y m e r ，m i p ) 能够选择性地 从复杂样品中吸附烙印分子或与烙印分子结构相近的某一类化合物，因此它非常 适合用作固相萃取介质来分离富集复杂样品中痕量的被分析物，以达到分离净化 的目的，能够降低检出限，提高分析的精密度和准确度f 7 9 t 。 3 2 基于电泳法的预富集技术 基于离子淌度和溶液电导差异的预富集方法也得到迅速发展，如场放大样品 堆积( f i e l d - a m p l i f i e ds a m p l es t a c k i n g ，f a s s ) 【8 0 - 9 3 、大体积样品堆积 ( l a r g e v o l u m es a m p l es t a c k i n g ，l v s s ) 9 4 1 0 3 、利用p h 值不连续性进行富集 1 0 4 1 2 0 】、乙腈一盐基体堆积【1 2 1 - 1 2 9 、等速电泳( i s o t a c h o p h o r e s i s ，i t p ) 1 3 0 - 1 5 5 、胶束电动色谱法( s a m p l es t a c k i n g f o r m e k c ) 堆积、扫描( s w e e p i n g ) 1 5 6 1 7 0 等富集方法。 3 2 1 场放大堆积( f a s s ) 1 0 中国科学技术大学顿_ ：学位论文 第一章绪论 f i g 1 - 4 g e n e r a lf a s sm o d e lf o ra n i o n s 1 9 7 9 年m i k k e r s 等 8 0 】首次解释了注入低电导基体样品的效果。场放大堆积 利用了样品溶液与背景缓冲液之间的电导率差，当快速迁移的离子从低电导率的 样品区进入高电导率的缓冲液区时，迁移速度剧减，从而在两者的界面处实现堆 积。完成堆积实验最简单的方法就是将样品溶解在水或低电导的缓冲溶液中( 如 分析用的缓冲溶液浓度的1 1 0 0 t 1 1 0 0 0 ) 。进样方式采取流体力学或电动方式均 可，堆积可以自动完成，十倍以上的样品富集都可以得到。如果样品的电导与缓 冲溶液的相同，可以在进样前先进一小段水来产生堆积效果 8 l 】。另一种堆积的 方法是将毛细管的一半充满样品，缓冲溶液由电渗流逆向驱动，样品就堆积在毛 细管端的小区带中。在水和缓冲溶液界面上的电渗流压力差会限制了这种方法的 有效使用，这个压力差会产生一个抛物面层流使谱带扩张。当缓冲溶液的浓度约 是样品浓度十倍并且进样长度是扩散引起的峰宽的十倍时，才能获得最佳的堆积 效果。b u r g i 和c h i e n 8 2 建立了一个模型以优化样品区和管内缓冲液的浓度，并 讨论了f a s s 中提高堆积效率的限审1 j 8 3 。 场放大进样时还要考虑到样品区带产生的热量。在堆积的条件下，大部分的 电压降都加在了堆积的区带上，会使温度升高。实际上，即使在毛细管恒温的条 件下，样品区带的温度达到9 0 c 的情况已有报道【8 4 】。这一点对热敏样品尤其要 当一。 目前f a s s 已应用到d n a 片段的分析【8 5 】，尿液中药物的分析 8 6 和违禁药 物的分析 8 7 ，8 8 等。富集倍数高达1 0 0