（微生物学专业论文）真菌产生的低分子活性物质研究.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出 重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责 任由本人承担。 论文作者签名：缝奎聱 日期：2 笪玺p 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校 保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被 查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文 和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：盔生碴翌导师签名： 山东大学博士学位论文 真菌产生的低分子活性物质研究 摘要 通过生理生化及生物信息学研究得到如下具有一定创新性的结果： i 真菌产生低分子多肽为一普适特性，此类多肽在天然纤维素降解中起重要作 用。 试由青霉菌p e n i c j l l i u ms p m 0 3 中筛选到两种具有抗菌活性的低分子物质，有 望开发为抗耐药菌的新型抗生素。 1 真菌产生低分子多肽为一酱适特性，它在天然纤维素降解中与纤维素酶有协 同作用。 本实验室前期工作表明真菌产生的低分子多肽形成的羟基自由基( h 0 ) 对 纤维素具有氧化降解的作用，有多篇报道，为对纤维素生物降解机理的新发展。 但已有的结论均是以纯纤维素材料为底物进行研究得到的，此类多肽在真菌中是 否普遍存在以及在天然纤维材料降解中是否也起同样作用，是利用微生物转化可 再生性木质纤维素实现生物量全利用，解决资源、环境可持续协调发展问题的关 键。本文对分属于自腐菌、褐腐菌和软腐菌3 大类3 4 个属共5 7 株真菌( 见表1 ) 进行研究，证明纤维分解真菌产生分子量低于5 k d 并具有形成羟基自由基能力 的低分子多肽为一普适特性。同时证实低分子多肽与纤维素酶协同作用能显著促 进秸秆、木屑等天然纤维材料的降解。研究结果已刊出( b i o t e c h n o l o g y l e t t e r s ，2 0 0 4 ，2 6 ：1 7 9 9 ；自然科学进展，2 0 0 4 ，1 4 ：1 2 3 0 ) 。 表1 用于普适性研究的5 7 株真菌 对多株纤维素降解真菌进行研究，发现具有络f e 3 + 及还原f e 3 + 为f e “能力 的低分子多肽在真菌中普遍存在，且与纤维素降解能力相关。典型的纤维素降解 茵能强烈络和f e 3 + ，并能将其还原为f e 2 + 。f e n t o n 反应需要f e 2 + 的参与，络和f e 3 + 山东大学博十学位论文 并还原f e 3 + 为f e 2 + 的能力为依赖于f e 2 + 的h o 氧化机制提供了证据。采用t b a ( t h i o b a r b u r i ca c i d ，硫代巴比妥酸) 法检n 5 7 株纤维素降解真菌产生的短肽 形成h o 的相对活力，发现这些真菌在纤维性材料上生长得到的培养滤液中，分 子量小于5 k d6 j 组分均具有t b a 反应，表明纤维素降解真菌产生分子量低于5 k d 并具有形成羟基自由基能力的短肽，为一普适特性。 检测7 株真菌产生的低分子多肽，发现它们降低羧甲基纤维素钠( c m c n a ) 粘度的能力与产生羟基自由基的能力直接相关。说明h o 能够断裂羧甲基纤维 素( c m c ) 的糖苷键，使c m c 聚合度降低。 以小麦秸、玉米秸和木屑为底物，研究来源于拟康氏木霉$ 3 8 、青霉、链格 孢、疫霉及小麦全蚀病菌的低分子多肽和纤维素酶的协同作用，用还原糖产率来 表征纤维素降解效率。与纤维素酶单独作用相比，来源于拟康氏木霉$ 3 8 、青霉、 链格孢的低分子多肽和纤维索酶共同作用后显著提高了还原糖产率，以杨木木屑 为底物时还原糖产率提高尤为明显。而非纤维素降解菌疫霉和小麦全蚀病菌产生 h o - 的水平低，协同作用后没有提高纤维素降解程度。证实了低分子多肽在天然 纤维材料降解中的作用。见表2 1 。 纤维素降解涉及氧化还原反应，氧气对其起促进作用。 2 羟基自由基的抑菌作用依赖于作用条件( 体外试验) 。 产生羟基自由基的低分子多肽在纤维素降解真菌中普遍存在。羟基自由基反 应性极强，几乎可以和所有的有机分子发生反应。观察到纤维降解菌产生的 h o 具有广谱杀菌作用。探讨了来源于纤维素降解真菌的低分子多肽产生的羟基 自由基的抑菌作用。发现h 0 对大肠杆菌( e c o l i ) 有一定抑制作用，但反应体 系的复杂性使这种抑制作用难以定量。 选择高产羟基自由基的纤维素降解菌，采用活菌计数法检测低分子多肽与 f d + 反应产生的h o 对大肠杆菌的抑制作用。 浓度高于1 0 5 m o l l 的f e 3 + 可对大肠杆菌产生抑制作用，浓度为1 0 。2 的f d + 对大肠杆菌的抑制率为10 0 。降低f e 3 + 的浓度，发现低分子多肽和f e 3 + 反应对 细菌的抑制率高于f e 3 + 单独作用，说明低分子多肽产生的h o 对细菌有一定抑 制作用。f e ”的浓度需要在产生h o 与避免对细菌产生抑制作用之间很好协调。 可以肯定低分子多肽产生的h o 对细菌的抑制作用，但因为反应体系比较 山东大学博士学位论文 复杂，有多个因素对细菌起作用，难以确定抑制率。检测h o 对 噬菌体的抑 制作用存在同样问题。 h o 对天然纤维材料和在纤维降解真菌培养过程中都表现出作用，但其抑 菌作用却依赖于反应条件，比较来看两者的差别应来自e c o l i 菌体对f e n t o n 体 系作用的不耐受性。我们进行以上研究，是因为h o 作用的无选择性，这样抗 性菌就不会形成。但看来，由于反应条件的复杂和检测的困难，目前直接应用 h o 作为抑菌剂还不成熟。 3 从青霉菌p e n i c i l l i u ms p m 0 3 中筛选到2 种具有抑菌活性的低分子化合物， 进行了系统研究，可望开发为新型抗生素。 3 1 日趋严重的细菌耐药性给临床用药带来很大困难，抗耐药菌的新型抗生 素开发迫在眉睫。从多株真菌发酵液中筛选到具有抗菌活性的低分子组分( a f ) ， 经形态鉴定确定产生菌为p e n i c i l l i u ms p m 0 3 。a f 分子量范围为1 0 0 0 2 0 0 0 ，等 电点为3 6 ，对b 内酰胺酶、羟胺、酸、碱稳定，热稳定性好，室温可长期保持 活性，5 0 保温3 0 m i n 活性不下降，煮沸3 0 m i n 活性保持5 0 以上，但冻融对 其活性有影响。以上研究表明它不是青霉素。 3 2 用试管二倍稀释法测得m i c 为8 m m l ，m b c 为3 2 m g m l 。a f 对多抗金 黄色葡萄球菌及野生菌株具有相同的m i c 。在亚m i c 的a f 中传代至2 0 0 代未 见m i c 升高，说明a f 不易产生抗性菌，这与常用广谱抗生素明显不同。a f 对 革兰氏阳性和阴性细菌均有作用，对真菌没有作用。供试的8 株大肠杆菌，a f 只对一缺失突变株具有抑制作用，而对其它7 株常规菌均无作用，可能与a f 独 特的作用机制相关。抗菌谱研究中的供试菌多为人体和植物病原菌，如金黄色葡 萄球菌、肺炎链球菌、黄单孢杆菌、欧氏杆菌，a f 对此类菌及多抗金黄色葡萄 球菌有抑制作用，且不易产生抗性菌的特点，证明对其进行研究的意义和价值。 在l m g m l 的a f 中生长的金黄色葡萄球菌生长曲线变为倒“v ”型，说明 a f 不仅可以杀死细菌，还使菌体发生溶解或者使细胞质外渗，降低了菌液的浊 度。扫描电镜图像表明，a f 损伤了金黄色葡萄球菌的细胞膜，导致细胞质渗漏， 使菌体出现凹陷和凹沟；a f 损伤菌体外的粘膜，使之黏附力下降。透射电镜图 像( 图1 ) 表明a f 对金黄色葡萄球菌的内部结构造成了损伤，使核区消失或减 山东大学博士学位论文 少，细胞内物质混乱弥散。结合婀组电镜观察结果，判断a f 对金黄色葡萄球菌 内部结构的损伤与对细胞膜的损伤直接相关，a f 的抑菌机制涉及膜损伤和胞质 渗漏。 图1a f 作用前( a ) 后( b ) 金黄乜葡萄球菌的透射电镜图 3 3 p e n i c i l l i u m 印m 0 3 能够利用多种培养基合成a f ，尤以麸皮，玉米秸粉培 养基为佳。p e n i c i l l i u ms p m 0 3 在固体培养基上生长可以直接抑制点种于菌落前 沿的细菌生长。a f 的生成量及活性与菌体牛物量无直接关系，弧生长状态埘a f 合成有利，但a f 的合成需要定生物量支持。在合成培养基中，硝酸钠为适宜 氮源。p e n i c i l l i u ms p m 0 3 合成a f 对碳源的选择与温度有关，2 5 发酵，麦芽糖 为最佳碳源3 0 ( 2 时，最佳碳源则为葡萄糖，但总体来讲，麦芽糖对于合成a f 是一种很好的碳源。考虑多方面因素，将a f 的最佳发酵条件确定为：采用改良 的查贝壳培养液( 葡萄糖1 5 9 ，k 2 n 0 4lg ，k c io 5 9 ，n a n 0 33g ，m g s o d 7 h 2 0 o 5g ，f e s 0 4 0 0 lg ，蒸馏水1 l ，p h 7 0 ) ，3 0 c 发酵5 天。 a f 适合在较低的温度杀灭细菌，其抑菌活性随温度升高而降低，在1 4 到 3 0 。c 之间变化明显。a f 的抑菌活性随p h 值升高l 町降低，在p i l l 0 时完全失去杀 菌能力，酸碱度对a f 的影响曲线呈倒s 形。 3 4 经s e p h a d e x u 卜一2 0 分子筛层析和h p l cs c r - 1 0 1 c c a 型糖柱分离纯化， 得到两个具有抑菌活性的纯组分a f l 和a f 2 。二者均在2 0 0 n m 有唯一吸收峰， 但a f 2 的吸收比同浓度a f l 约低1 0 倍。 山东人学博十学伉论文 -_n-_- 一 图2a f 的h p l c 分离图 苯酚硫酸法测得二者均含糖。糖组成分析表明a f 2 含有葡萄糖和木糖，a f l 未得到与标样一致的单糖峰。氨基酸组成分析表明a f l 不含氨基酸：a f 2 含丙 氨酸、谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和异亮氨酸5 种氨基酸残基。已报导的抗菌肽 及抗菌糖肽多含有稀有氨基酸，给常规氨基酸分析带来困难。 利用红外光谱、核磁共振1 h 和1 3 c 、飞行质谱对a f l 、a f 2 进行结构测定， 结果表明a f l 为氨基糖苷类物质，分子量为1 4 6 5 ，结构示意图见图3 ；a f 2 含 有由谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和异亮氨酸或其衍生物组成的短肽结构 和双糖结构，说明a f 2 为一糖肽类物质，分子量为1 0 1 7 ，结构示意图如图4 。 图3a f l 的结构示意图 f i g 3 s t r u c t u r es k e t c hm a po f a f l 觚 图4a f 2 的结构示意图 f i g 4 s t r u c t u r es k e t c hm a po f a f 2 关键词低分子活性物质，纤维素降解，抑菌，分离纯化，结构解析 些变查堂堡主堂堕堡苎 s t u d yo fl o wm o l e c u l a ra c t i v ef a c t o r p r o d u c e db yf u n g l a b s t r a c t t w oi r m o v a t o r yc o n c l u s i o n sw e r eg o tb yb i o c h e m i s t r ya n db i o i n f o r m a t i c ss t u d y ： i p r o d u c t i o no f l o wm o l e c u l a rp e p t i d e sb yf u n g ii sau n i v e r s a lp h e n o m e n o n i i t w o1 0 wm o l e c u l a rs u b s t a n c ew i t ha n t i b a c t e r i a lf u n c t i o nw e r es c r e e n e do u t ，a n d i ti sh o p e f u lt h e yb eu s e da sn o v e la n t i b i o t i c s 1 p r o d u c t i o no fl o wm o l e c u l a rp e p t i d e sb yf u n g ii sau n i v e r s a lp h e n o m e n o na n d t h e r ew e r es y n e r g i ee f f e c t so ft h ep e p t i d e sa n de e l l u l a s e sd u r i n gn a t i v ec e l l u l o s e d e g r a d a t i o n f u n c t i o no fh o p r o d u c e db yl o wm o l e c u l a rp e p t i d e so ff u n g id u r i n gc e l l u l o s e d e g r a d a t i o nw a sr e p o r t e df o rt i m e s b u ta l lc o n c l u s i o n sw e r eb a s e do ns t u d i e so f p u r ec e l l u l o s es u b s t r a t e s w h e t h e rt h i sk i n do fp e p t i d ec o u l dd e g r a d en a t i v e c e l l u l o s ea sp u r ec e l l u l o s ea n dw h e t h e ri tw a su b i q u i t o u si n 铀舀h a da l r e a d yb e e n k e yf a c t o r st os e t t l et h eq u e s t i o nh o w t ot r a n s f o r mc e l l u l o s eb ym i c r o o r g a n i s m st ou s e c e l l u l o s em a s se f f e c t i v e l ya n de c o n o m i c a l l ya n dh o wt o d e v e l o pr e s o u r c ea n d e n v i r o n m e n t c o n t i n u a l l ya n dh a r m o n i z e f i f t y - s e v e nc e l l u l o l y t i cf u n g is t r a i n s b e l o n g i n gt o4 7s p e c i e so fw h i t e r o t ，b r o w n - r o ta n ds o f t r o tf u n g iw e r et e s t e d ，t h e r e s u l t sv e r i f i e dt h a tt h ec a p a c i t yo fl o wm o l e c u l a rp e p t i d e sf o rp r o d u c i n gh oi sa u n i v e r s a lp h e n o m e n o ni nc e l l u l o l y t i cf u n g i ，t h es y n e r g i ce f f e c t so f t h ep e p t i d e sa n d c e l l u l a s e sd u r i n gn a t i v ec e l l u l o s ed e g r a d a t i o nw e r ea l s of o u n do u t 1 0 wm o l e c u l a rp e p t i d e sp r o d u c e db yf u n g iw e r et e s t e d r e s u l t ss h o w e dt h a tt h e p e p t i d e sw h i c hc o u l dc o m p l e xf e 3 + a n dr e d u c ei tt of e 2 + w e r eu n i v e r s a l l yi nf _ u n g i f u r t h e r m o r e ，t h e s ea b i l i t i e sr e l a t e dt oc e l l u l o s ed e g r a d a t i o n t y p i c a lc e l l u l o l y t i c f u n g ic o u l dc o m p l e xf e 3 + s t r o n g l y t h e s ea b i l i t i e sw e r ef o u n d a t i o nt oo x i d a t i o n m e c h a n i s mo fh o ，b e c a u s ef e 2 + w a sn e c e s s a r yt of e n t o nr e a c t i o n t b a ( t h i o b a r b u r i ca c i d ) m e t h o dw a su s e dt ot e s tt h ea c t i v i t yo fh o p r o d u c e db yl o w 山东大学赙十学位论文 m o l e c u l a rp e p t i d e sw h i c hw e r eg e n e r a t e db y5 7c e l l u l o l y t i cf u n g i p o s i t i v er e a c t i o n s o f t b aw e r ef o u n di na l lo ft h el o wm o l e c u l a rc o m p o n e n t s ( m m 5 k d ) o f e x c e l l u l a r f i l t e ro f5 7c e l l u l o l y t i cf u n g ic u l t u r e do nc e l l u l o s em e d i a ，w h i c hm e a nt h a tc a p a c i t yo f l o wm o l e c u l a rp e p t i d e sf o rp r o d u c i n gh o w a sau n i v e r s a lp h e n o m e n o ni n c e l l u l o l y d cf u n g i t h ea b i l i t yt or e d u c em u c o s i t yo fc a r b o x y m e t h y lc e l l u l o s e - n a ( c m c - n a ) r e l a t e dt o h o p r o d u c i n gw e r ef o u n db yt e s t i n gl o wm o l e c u l a rp e p t i d e so fs e v e nf u n g i t h i s i n d i c a t e dt h a th o c , a nb r e a kt h eg l y c o s i d i cb o n d so f c m ca n dt h e nr e d u c e m u c o s i t y o f c m c n a s y n e r g i s t i ce f f e c t o fl o wm o l e c u l a rp e p t i d e sa n dc e l l u l a s ef r o mt r i c h o d e r i m a p s e u d o k o n i n g i i8 3 8 ，p e n i c i l l i u ms p ，a h e r n a r i aa h e r n a t a ，p h y t o p h t h o r as p ， o p h i o b o l u sg r a m i n i sw a ss t u d i e da n dd r yw h e a ts t r a w , c o i ns t r a w , a n dw o o dp o w d e r w e r eu s e da ss u b s t r a t e s t h ep r o d u c t i o no f r e d u c i n gs u g a r sw a ss e l e c t e da sa l li n d e x f o re f f i c i e n c yo fc e l l u l o s ed e g r a d a t i o n t t h ey i e l do f r e d u c i n gs u g a rw a si n c r e a s e d t h r o u g ht h es y n e r g i s t i ce f f e c t so fl o wm o l e c u l a rp e p t i d e sa n dc e l l u l a s ef r o mz p s e u d o k o n i n g i i $ 3 8 ，p e n i c i l l i u ms p ，a a l t e r n a t ao nc e l l u l o s ee s p e c i a l l yw h e nt h e s u b s t r a t ew a sw o o dp o w d e r w h i l ep h y t o p h t h o r as p a n d0 g r a m i n i sw e r en o t t y p i c a lc e l l u l o l y t i cf u n g ia n dt h e i ra b i l i t yo fh op r o d u c t i o nw a sv e r yp o o r , s ot h e y i e l do fr e d u c t i o ns u g a rw a sn o ti n c r e a s eb ys y n e r g i s t i ce f f e c t a l lr e s u l t sv e r i f i e d t h ef u n c t i o no fs f g fo dn a t i v ec e l l u l o s ed e g r a d a t i o n c e l l u l o s ed e g r a d a t i o nc o u l db ep r o m o t e db yo x y g e nb e c a u s ei ti n v o l v e do x i d a t i o n a n dd e o x i d a t i o nr e a c t i o n 2 a n t i b i o t i ce f f e c t so fh o 。d e p e n do nr e a c tc o n d i t i o n ( e x t e r n a le x p e r i m e n t ) i tw a sau n i v e r s a lp h e n o m e n o nt h a tl o w m o l e c u l a rp e p t i d e sg e n e r a t e db yc e l l u l o l y t i c f u n g ic o u l dp r o d u c eh o w h i c hc o u l dr e a c tw i t ha l m o s ta l lk i n d so f o r g a n i s m s o w ed e d u c e dt h a th o p r o d u c e db yc e l l u l o l y t i c f u n g ic a r la n t i m i c r o b e sg e n e r a l y a n t i b i o t i ce f f e c t so fh o 。g e n e r a t e db yl o wm o l e c u l a rp e p t i d e sw e r ed i s c u s s e d r e s u l t ss h o w e dt h a th o c o u l di n h i b i tg r o w t ho f e s c h e r i c h i ac o n ? b u tt h ee f f e c tw a s h a r dt om e a s u r eb e c a u s eo f t h e c o m p l e xr e a c t i o ns y s t e m 山东人学博士学位论文 c e l l u l o l y t i cf u n g iw i t hh i g ha b i l i t yo fh o p r o d u c i n gw e r es e l e c t e d t o s t u d y a n t i b a c t e r i a lf u n c t i o no fh o a f t e rr e a c t i n gw i t hf e a + a n dn u m b e ro fb a c t e r i a c o l o n i e sw a su s e da sa l li n d e xo f a n t i b a c t e r i a lr a t i o f e 3 + c o u l di n h i b i tec d l iw h e ni t sc o n c e n t r a t i o nw a sm o r et h a n10 5m o l l b u t h o p r o d u c e db yl o wm o l e c u l a rp e p t i d e ss h o w e di t sa n t i b a c t e r i a lf u n c t i o nw h e n c o n c e n t r a t i o no ff e 3 + w a sr e d u c e d i tw a sn e c e s s a r yt oh a r m o n i z ec o n c e n t r a t i o no f f e 3 + b e t w e e nh o d r o d u c t i o na n dn o n - 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