（无机化学专业论文）辣根过氧化物酶的化学修饰及其应用.pdf

中文摘要 辣根过氧化物酶( h r p ) 是一种来源最为广泛而价格较为低廉的过氧化物酶， 在过氧化氢或烷基过氧化物存在时能催化有机物的氧传递反应。辣根过氧化物酶 在有机合成、聚合物合成和含酚废水的治理上具有广泛的应用，但目前真正商业 化的工业过程仍未研发成功。其主要原因就是天然酶在有机溶剂中催化效率低几 个数量级低，而且其稳定性也低。为了改善辣根过氧化物酶的催化性能，作者在 查阅并分析了大量文献的基础上，确立了硕士论文的研究内容。选择了两种化学 小分子修饰剂对辣根过氧化物酶进行修饰，深入研究了修饰酶在稳定性、催化性 能及耐有机溶剂能力等方面的变化，取得了较为满意的结果。论文的主要内容如 下： 1 选取了两种化学小分子修饰剂( 柠康酐和马来酸酐) 对辣根过氧化物酶 表面的赖氨酸进行修饰后，发现修饰后的酶不仅没失活，反而在热稳定性、酸碱 稳定性方面得到了改善。其中，与天然酶相比，热稳定性提高了大约4 7 倍，酸 碱稳定性的范围拓宽，而且柠康酐修饰酶和马来酸酐修饰酶的修饰度分别为5 6 1 和4 6 7 。从它们在水相中的动力学常数可以判断，与天然酶相比，修饰酶与 底物的亲和力大，而且对于酚的去除反应的催化效率高。这就证明了只要选择合 适的修饰剂和修饰方法，就能够利用化学方法快速、廉价地提高酶的稳定性。 2 在有机溶剂中催化研究，发现修饰酶与天然酶相比，耐有机溶剂( 与水 互溶) 的能力得到了改善，即在有机溶剂中的催化性能得到了改善。尤其当甲醇 的含量低于4 0 时，酶的相对酶活不但不随甲醇含量的增加而降低，反而增加。 通过酶在有机溶剂中酶比活和动力学常数的测定，验证了修饰酶耐有机溶剂能力 确实是得到了提高。在同一种有机溶剂中，对酶比活、亲和力、催化性能来说： 柠康酐修饰酶 马来酸酐修饰酶 天然酶。 3 将修饰酶和天然酶用于染料的脱色，通过测定脱色的最佳条件，我们发 现相同条件下，修饰酶的脱色效率高于天然酶，尤其是柠康酐修饰酶。并且对溴 酚兰来说，几乎可以完全脱色，而对甲基橙来说，脱色率大约在7 0 8 0 。 同时我们测定了不同p h 值下两种染料脱色的动力学常数，发现动力学常数进一 步验证了前面最佳脱色p h 的范围，并且与天然酶相比，修饰酶对染料底物的亲 和力要大，且对染料脱色的催化效率也要高。 关键词：化学修饰，辣根过氧化物酶，有机相，染料脱色，动力学 i i a b s t r a c t t h ec h e m i c a lm o d i f i c a t i o no fh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e a n dt h e i r a p p l i c a t i o n s m a j o r ：b i o i n o r g a n i cc h e m i s t r y n a m e ：w a n gt e n g l i s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rj il i a n g n i a n a s s o c i a t ep r o f e s s o rl i u j i a n z h o n g h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h i 冲) c a t a l y z e st h eo x i d a t i o no fa q u e o u sa r o m a t i c c o m p o u n d si n t h e p r e s e n t o fh y d r o g e np e r o x i d e i tw a ss u c c e s s f u l l y a p p l i e d i n o r g a n i cs y n t h e s i s ，p o l y m e rs y n t h e s i sa n dr e m o v a lo fp h e n o l i c sf r o mw a s t e w a t e r b u t t h e r ei sn or e p o r to i lt h e s ei nc o m m e r c i a lu s ey e t ni sm a i n l yd u et ol o w e r c a t a l y t i c p r o p e r t ya n ds t a b i l i t yi no r g a n i cs o l v e n tt h a ni nw a t e r i no r d e rt oe n h a n c ee n z y m e s t a b i l i t y ( t h e r m o s t a b i l i t y , p h ，a n d t o l e r a n c eo fo r g a n i c s o l v e n t s ) a n dc a t a l y t i c p r o p e r t i e s ，c h e m i c a lm o d i f i c a t i o no fh r pb yc i t r i e o n i ca n h y d r i d e ( c a ) a n dm a l e i c a n h y d r i d e ( m a ) w a si n v e s t i g a t e d t h es t a b i l i t ya n dc a t a l y t i cp r o p e r t i e sw e r ed e e p l y s t u d i e da n d c o m p a r e d w i t hn a t i v eh a p t h e a p p l i c a t i o n so f n a t i v eh r pa n dm o d i f i e d h r pi nd y e b l e a t i n g w e r ea l s oi n v e s t i g a t e d t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 h r pw a sm o d i f i e d b y c i t r i c o n i c a n h y d r i d e a n dm a l e i c a n h y d r i d e ， r e s p e c t i v e l y c a a n dm a m o d i f i e dh r pa l m o s td i d n tl o s et h e i ra c t i v i t ya n dt h e i r t h e r m o s t a b i l i t yw a si n c r e a s e da b o u t4 7 一f o l dc o m p a r e dt on a t i v eh i t p r e s p e c t i v e l y t h ed e g r e eo fm o d i f i c a t i o no fc a a n dm a - m o d i f i e dh r p w a s5 6 1 a n d4 6 7 r e s p e c t i v e l y t h ek i n e t i cp a r a m e t e r sc a na l s oi n d i c a t et h a tb o t hm o d i f i e dh r p ss h o w g r e a t e ra f f i n i t ya n ds p e c i f i c i t yo f p h e n 0 1 i i i 2 t h e s t a b i l i t yo f c a - a n dm a h r pi nd m f - d m s 0 ，t h fa n dm e t h a n o lw a s i n c r e a s e dt oac e r t a i ne x t e n tc o m p a r e dt on a t i v eh r p t h ek i n e t i ce x p e r i m e n tr e s u l t s a l s oi n d i c a t et h a tb o t hm o d i f i e dh r p ss h o wg r e a t e ra f f i n i t ya n ds p e c i f i c i t yo fp h e n o l i no r g a n i cs o l v e n t 3 t h ec a a n dm a m o d i f i e dh r pw e r es u c c e s s f u l l ya p p l i e di nd y eb l e a c h i n g a tf i r s t ，t h e q u a n t i t a t i v er e l a t i o n s h i p sb e t w e e nb l e a c h i n ge f f i c i e n c i e so fd y e sa n d r e a c t i o nc o n d i t i o n sw e r e d e t e r m i n e d c o m p a r e d t on a t i v e h r p , t h eb l e a c h i n g e f f i c i e n c yo fa y eb y b o t hc a - a n dm a - m o d i f i e dh r pw e r ei n c r e a s e d m o r e o v e r , t h e b l e a c h i n ge f f i c i e n c yo f b r o m o p h e n o l b l u ew a s h i l g h e rt h a nm e t h y lo r a n g e t h ek i n e t i c p a r a m e t e r si n d i c a t et h a tb o t hm o d i f i e dh r p s h a dg r e a t e ra f f i n i t yt h a nn a t i v eh r pa n d t h ec a t a l y t i ce f f i c i e n c yo fc a a n dm a - - m o d i f i e dh r pw e r eh i g h e rt h a nn a t i v eh r p , e s p e c i a l l yc a m o d i f i e dh r p k e y w o r d s ：c h e m i c a lm o d i f i c a t i o n ，h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e ，o r g a n i cs o l v e n t ，d y e b l e a c h i n g ，k i n e t i c s i v 中山大学顾士学位论文 第1 章辣根过氧化物酶 的化学修饰的研究及应用概况 1 1 辣根过氧化物酶 1 1 1 辣根过氧化物酶的结构及特征 过氧化物酶是通过h 2 0 2 或相关化合物来催化多种有机和无机物氧化的血红 素蛋白，一般含有铜或铁等金属离子。并且它是一种高效生物催化剂，催化性能 高、专一性强。从动物中获得的过氧化物酶主要有甲状腺过氧化物酶、乳过氧化 物酶、髓过氧化物酶等：从植物中获得的过氧化物酶主要有辣根过氧化物酶、细 胞色素c 过氧化物酶，一般都以正铁血红素i x 作为辅基吧 而辣根过氧化物酶( h r p ，h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ) 是一种典型的过氧化物酶， 它的结构和作用机理研究得较为透彻。辣根过氧化物酶是广泛存在于辣根体内的 过氧化物酶，分子量为4 0 k d ，它是一种糖蛋白，糖的含量约1 8 ，酶活性中心 含有一个正铁血红素卟啉环化合物，在4 0 3 n m 和2 7 5 n m 处有两个吸收峰，纯的 h r p 呈米色。h r p 具有高度多态性，功能多种多样而且互异，根据电泳行为将 h r p 分为酸性、碱性和中性同工酶，其中中性同工酶最具有应用价值【舶。h r p 是结合了氧化血红素的糖蛋白，除f e 外每分子中还含有两个c a 2 + 。肽链由3 0 8 个氨基酸组成。另有8 个糖链( 占分子质量的1 8 ) 分别与1 3 、5 7 、1 5 8 、1 8 6 、1 9 8 、 2 1 4 、2 5 5 和2 6 8 位的天冬酰胺残基连接，它们分布在分子表面。肽链n 末端为 一个吡咯烷酮羧基所封闭，c 末端为丝氨酸1 3 1 。 辣根过氧化物酶在过氧化氢或烷基过氧化物下能催化有机物的氧传递反应， 它催化的反应式为a h 2 + h 2 0 2 一a + 2 h 2 0 ，该酶对过氧化物的需求很专一，其 活性中心是铁卟啉( h e m e ) 。辣根过氧化物酶很长时间以来一直被人们认为是一 种在较高温度下也比较稳定的酶。d u n f o r d 等人推测，这种性质可能是和与酶相 2 0 0 1 级手腾利 连的碳氢化合物有天。 1 1 2 辣根过氧化物酶的反应机理 辣根过氧化物酶与众多的过氧化物酶相比，价格并不昂贵，对有机溶剂的失 活作用抵抗力较强，适用的反应底物的范围广，因此成为研究过氧化物酶的首选 对象。在h 2 0 2 存在的时候，h r p 能催化苯酚、苯胺及其取代物的聚合反应。由 于聚合物具有大n 共轭体系，因此可用作有机导电聚合物、非线性光学材料及用 于制作发光二极管( 用于大屏幕全色显示器件) 。另外，h r p 以标记物的形式在 免疫分析、分子的酶法分析方面也有广泛用途。h r p 的催化反应过程通常描述 如下： h r p + h 2 0 2 卜h i 冲- i + h 2 0 h r p i + a h 2 + h r p i i + a h h r p i i + a h 2 + h r p + a h + h 2 0 2 a h + p r o d u c t s ( 1 1 ) ( 1 2 ) ( 1 3 ) ( 1 4 ) 此反应是一个过氧化循环过程( p e r o x i d a t i c c y c l e ) 【4 】首先是在h 2 0 2 作用下， h r p 失去两个电子氧化成中间物i ( h r p i ) ，此时血红素铁为o x y f e r r y ( f e 4 + = o ) 状 态且血红素的卟啉失去一个电子形成正自由基，h r p i 相当不稳定。天然h r p 自由酶形式的再生是两个连续单电子反应步骤：先是正自由基获得一个电子形成 中间态i i ( h r p - i f ) ，且在4 1 6 n m 处有特征吸收；其后，h r p i i 进一步还原成原酶 状态，而当h 2 0 2 大大过量时( 与h r p 的摩尔比大于1 0 0 ) 进一步形成复合物i i i r 5 1 。 含有铁卟啉的蛋白质或酶在4 0 0 n m 附近总存在一个非常强的吸收带f e = 1 0 5 ) ，称为s o r e t 带或九带【“。其中辣根过氧化物酶很具有典型性，天然的h r p 在4 0 3 n m 处有特征的吸收光谱【7 l ，各种h r p h z 0 2 也有各自的光学性质，h r p i 、 h r p i i 和h r p - 1 1 1 分别在4 1 0 、4 1 6 和4 1 8 n m 处有特征的吸收光谱。前两者是 h r p 催化循环中的两个中间态，后者不是i m p 正常催化循环中的一个环节，但 它可以在过量的h 2 0 2 存在下产生，它较不活泼。溶剂或取代作用都能够引起血 红素微环境的改变，从而导致了s o m t 带的强度发生改变及波长发生漂移5 ，羽。当 血红素辅基从酶上解离下来后，s o r e t 带最大波长发生迁移至3 9 8 n m ，同时伴随 中山大学硕十学位论文 着强度的降低；当血红素暴露到溶剂中但并没有解离下来时，s o r e t 带的强度上 升，但最大吸收波长不会漂移引。由于h r p 的活性部位特殊的标记基团( 血红 素辅基) 及其与h 2 0 2 的复合物的特征吸收光谱易受外界环境( 特别是溶剂) 的 影响【s y , i ，故对其血红素辅基的研究有助于了解活性部位结构的变化。 a n d e r s o n l9 l 等人用动力磁场效应研究了h r p 的中间产物，认为h r p 循环反 应的立体结构可用图l 一1 表示 逆p 幽 一c 乏沁。弋。彳一c 0 篡 一c 萼、名势n ( h i s ) n h 螂3 c 芦, 一c 宅 d u f f o r d 等人 1 j 认为，在中性和酸性溶液中，辣根过氧化物酶的第一步反应产物 除化合物i 以外，还形成了一种中间体化合物0 。近年来，b e r g l u n d 1 o 】和d o h a l d l l 1 】 等人还用光化学的方法，对h r p 的中间化合物进行了研究。 综上所述可知：从反应机理方面来看，对h r p 中间化合物的结构和形成过 程的研究已经比较详细，但还没有从利用的角度进行探讨，例如各种影响因素对 活性点的作用机制；有利于更多的催化活性的中间化合物( i 、i i ) 生成条件的 选择等。 1 1 3 辣根过氧化物酶在不同介质中的动力学研究 双底物酶促反应中，酶与底物结合形成三元络合物称为序列机制。若酶与底 物不形成三元络合物则其反应为乒乓机制。a l b e r t y 用推导出的双底物反应一般 速度方程如式( 1 - - 5 ) d 2 1 ： v o2 ( v m 。【蛳【b o 】) ，( k b 。【m + k a 。 b o l + a o b 0 1 + k a s k b 。)( 1 - - 5 ) 2 0 0 1 级王腾利 式中， v 。为a 、b 都饱和时的最大初速度； k 为b 饱和，v o = l 2 v 。时的a 的浓度； k 8 。为a 饱和，v o = l 2 v 。a x 时的b 的浓度； k “。为酶和底物a 的复合物e a 的解离常数。 此类反应在固定一个底物浓度而改变另一底物浓度时服从米氏方程。固定 b o ( 或 】) 时，根据l i n e w e a v e r - b u r k e 作图法，以l “o i a 作图可得一条直线。在 序列机制中，直线斜率为( k a m + k a 。k b o ) ( 1 。) ，截距为 ( 1 十k 8 。 b o 】) ( 1 v m 。) ，因此，固定的底物浓度 b o l 取一系列不同的数值时，作 图得到的几条直线的斜率和截距都会发生变化。而在乒乓双双机制中，由于在初 速度范围内释放的产物浓度极低，逆过程可忽略，故k a ；= o ，因此k a s k b 。= o ， 固定的底物浓度 b o 】取一系列不同的数值时，作图得到的几条直线的斜率( k m ： v 。) 是一常数。根据在不同固定底物浓度下，动力学曲线是否平行可以区分出 酶促反应是序列机制还是乒乒机制。 张彤等人的实验固定h 2 0 2 浓度并使其过量，改变苯酚浓度进行酶促反应机 制的研究，结果发现固定h 2 0 2 浓度而改变苯酚浓度时，a l b e r t y 一般速度方程相 应的双倒数作图为线性，并且所得到的一系列直线基本平行( 斜率= k m v 。) ，符 合乒乓反应机制的特征。因此可以初步判定，酚类在过氧化物酶催化下发生的反 应属于“乒乓机制”，当然，这还需要用其它方法进一步验证【1 3 】。 要最终确定酶催化的反应机理及其与结构的关系，就需要动力学的实验数 据，从宏观和微观两个方面探讨反应的本质。陈建波等人1 4 1 从水相、胶束体系及 有机相三种不同的体系环境来叙述h r p 反应的动力学。 1 ) 水相体系的反应动力学 h r p 与0 2 反应，首先形成化合物i 。化合物i 的形成速率是1 0 1 0 7 2 o 1 0 7 m o l 。$ - 1 【1 , 1 5 ，与扩散控制的速率相接近。p h 值与速率的关系说明，p h 值在5 - - 9 之间，化合物的形成速率k 1 与p h 值无关。化合物的f e = o 结构中的o 来自于h 2 0 2 中的两个氧原子【1 6 j ；然后，化合物i 经过单电子还原形成化合物。 这一过程的表观二级速率常数( k 2 ) 因底物的不同而不同：化合物i i 与底物可继 续反应得到h r p 表观二级速率常数( k 3 ) 也因底物不同而变化。表1 列出了部 4 中山大学硕士学位论文 分底物与化合物i 、i i 反应的表观二级速率常数。由表中可以看出，在选择辣根 表l 一1h r p 中间体的表观二级速率常熟k 2 、k 3 过氧化物酶催化反应的合适底物时，应从两方面考虑：一是有合适的空间结构， 有利于和酶活性中心结合；二是有较强的还原性。动力学研究表明，底物被化合 物i 氧化的速率要比被化合物i i 氧化的速率高l o 1 0 0 倍。在逆反应中也可观 察到相似的趋势，即由化合物i i 氧化产生化合物i 的速率比由h r p 氧化生成化 合物i i 的速率高。 2 ) 胶束体系 与人们熟知的水相及新发展的有机相相比，表面活性剂分子的引入，将使酶 及底物分子所处的微环境发生显著变化。胶束体系是酶学研究比较理想的体系， 因为它所具有的诸如热力学稳定性、光学透明性及能增溶亲水分子、亲油分子或 两性分子等性质，使许多酶在胶束体系中的反应速率及转换数( k c 砒) 都高于在水相 中1 7 】。从目前的研究情况来看，大多从宏观方面来研究h r p 的反应条件，而从 微观方面研究的较少。许多科学家发现影响反应的因素有表面活性剂浓度、底物 浓度、温度和p h 等。 3 ) 有机相中的酶催化 近几年，有机相中的酶催化有了迅速的发展。然而酶在有机溶剂中易于失活 和变性，使其在工业上的应用大受限制。为此，科学家们尝试了许多方法。除了 对酶本身迸行化学修饰和经过特殊处理制备酶与表面活性或高聚物的复合物以 外，选择和优化酶的反应介质是另一个十分重要的途径。研究表明酶在有机相中 2 0 0 l 级土腾利 的催化作用与反应介质有着密切联系。亲水性较强的有机溶剂对酶结构破坏大。 处于疏水性较强的有机溶剂中，酶则很难溶解，内部传质受到限制【i 。而反相胶 束体系中，大部分酶难溶于疏水有机溶剂，在这种非常规的环境当中，酶表现出 许多令人感兴趣的性质，如较高的热力学稳定性、新异的化学选择性、对映选择 性和区域选择性。对于有机相的定义中水含量的问题，即水含量是小于o 0 1 还 是小于l ，至今还没有统一的观点 1 9 , 2 0 1 。水是酶催化过程中最重要的因素，在 完全无水的情况下，酶是没有活性的。只有被酶吸附的一层左右的水，对酶的催 化活性才是至关重要的，这些水称为“必需水”。真正的酶反应就是在围绕着酶 分子的水层内进行的。底物分子必须先从主体有机相进入微水相，然后才能与酶 发生作用。因为蛋白质分子表面含有大量带电基团和部分极性基团，在完全无水 的情况下，这些基团相互作用形成一种锁定结构，适量的水可以打开这种锁定结 构，使酶活性升高；但过量的水会引起酶中心内部水簇的形成，从而改变酶活性 中心的结构，使酶活力降低。不同的酶结合的“必需水”是不同的，这种差异是 由酶分子的结构、性质以及维持催化活性构象的要求所决定的【1 9 j 。目前，对酶在 亲水性的有机溶剂里的催化特性的研究较少，故我们可以选择水溶性的有机溶剂 作为研究对象。 综上可知，从反应动力学方面来看，需要对各种体系中的h r p 催化过程进 行系统探讨，以便选择一种最有利的体系，进行应用方面的研究。有机相中的酶 催化是需要继续探讨的重点课题。酶作为一种生物催化剂，其发展前景十分诱人。 目前用于研究酶催化方面的技术手段是多种多样的，如x r a y 技术、电子顺磁共 振、停流技术等，使人们对酶的结构和性质有了更清楚的认识随着科学技术的 发展，酶必将更加广泛地服务于人类社会川。 1 2 辣根过氧化物酶的应用 工业生物催化是生物技术产业化的核心技术，被认为是继医药和农业后的生 物技术的第三次浪潮，其核心是高效生物催化剂的开发和生化反应过程的分子水 平控制。酶作为一种高效生物催化剂，在常温常压和中性p h 下，能够催化许多 化学方法难以完成的反应；酶催化性能高、专一性强、可减少或避免副反应、符 中山大学硕十学位论文 合将废弃物控制在最小限度、实现绿色化学的要求。尤其，酶在有机相反映取得 成功后，酶的用途更加广泛。 1 2 1 辣根过氧化物酶在环保方面的应用 1 2 1 1 酶对工业废水中酚或苯胺类物质的去除 芳香族化合物，包括酚类和苯胺类物质，广泛存在于工业废水( 如煤气与炼 焦、石油化工、造纸、木材加工、钢铁、塑料制造业等工业) 中。酚类化合物都 是有毒物质，有些还是致癌物质，对人、畜和农作物都有危害。由于含酚废水的 大量排放对水体、土壤造成严重的污染，进而危害到人类的健康，因此从工业废 水中除去酚类物质越来越受到人们的关注。我国规定。地面水中酚类化合物最高 允许浓度为o 0 1 m g l 。目前所用的除酚方法主要有微生物降解、活性炭吸附、 化学氧化等。由于传统方法处理酚类化合物的浓度有限，而且处理成本高、净化 不完全、以及产生有毒的副产物。因此这就要求发展一种更加快速、便捷、廉价、 没有有毒副产物产生的处理方法。自麻省理工k l i b a n o v 教授在s c i e n c e 上发表了 有关过氧化物酶去除含酚废水的论文以来【2 0 1 ，过氧化物酶应用于含酚、氯酚和胺 的废水的去除取得了很大的进展。由于酶处理技术因其具有高效、专一、反应条 件温和等优势和特点，日益受到广泛关注。在所有的酶类中，国内外学者对过氧 化物酶处理研究得较多i j ，表现出十分诱人的前景。 在含酚的溶液中加入辣根过氧化物酶和h 2 0 2 后，溶液变成棕黑色，沉淀逐 渐产生，但只加入其中一种物质，就不会产生这种现象。这类酶催化反应分为两 步。先形成游离基，然后自由基发生聚合生成高分子化合物而沉淀。整个反应过 程和以往的酶处理反应过程不同，先是酶反应，接着是化学反应，克服了酶反应 中基质特异性的限制，用一种酶可以处理废水中多种含羟基的芳香族化合物。这 种酶促反应的激励称为氧化偶合。采用酶技术处理煤加工废水中的酚时，在较 宽的p h 和污染物浓度范围，其处理效率都可达9 7 9 9 ，无论是人工配水还是 实际废水都有较好的处理效果。其他污染物，如p c b 可以和酚发生共沉淀【2 0 1 。 其他研究者也发现辣根过氧化物酶可以从水溶液中去除酚和芳香胺，并可以使含 2 0 0 1 级_ 下腾利 酚废水脱色 2 2 , 2 3 。采用过氧化物酶，添加过氧化氢，可以将一系列的酚和芳香胺 氧化成相应的自由基，并聚合形成较难溶于水的沉淀物质1 2 。 目前我们小组研究发现，利用一些小分子化合物如邻苯二酸酐、氨基葡萄糖、 柠康酐、马来酸酐等，对辣根过氧化物酶表面的赖氨酸进行化学修饰后再将其应 用于酚和氯酚的去除，酚的去除率提高了2 0 - - - 3 0 0 0 ，酶的用量减少了2 5 ，在 动力学上修饰后的酶的亲和力和底物专一性k 。瓜。都有提高，2 5 ”j 。 1 2 1 2 酶在工业脱色中的应用 合成染料广泛的应用于纺织工业，印染印刷工业，彩色摄影，石油产品添加 剂等方面。每年染料的产量都要超过7 0 00 0 0 吨，其中有1 0 一1 5 流失【2 ”，故 染料废水具有排放量大、组成复杂、色度高( 稀释倍数从2 0 0 到1 0 0 0 倍) ，水质 变化大，有毒且难生物降解、物质浓度高等特点，并且有些可能致癌，因此是难 处理的工业废水之一。染料的种类极其繁多，分子结构式也很复杂，并且大多是 难阻生物降解的芳香族化合物，就其结构而言可以分为偶氮、蒽醌、三苯甲烷、 杂环等，其中偶氮染料的数量比例在5 0 以上，因而这类染料的降解研究备受 关注。染料废水用常规处理方法难以奏效，当前以高效作用微生物为活性物质的 处理工艺，由于其耗能少，费用低，效率高，不易产生二次污染的优点，使它在 染料废水处理中的应用得到广泛关注【2 8 2 9 , 3 0 】。由于微生物降解染料的过程是由酶 控制的，因而，提高微生物降解效率的关键是促进染料与酶的结合。由于酶系反 应的总速度决定于其中反应速度最慢的一个反应，称为控制反应或限速反应，它 控制着全部反应的总速度，因此，研究限速酶的特性及作用机理对提高染料废水 的处理效率有重要意义【3 l j 。 自从w e l i n d e ra n da n d e r s e n 申请了用c o p r i n u s 过氧化物酶改善h 2 0 2 的稳定 性作为脱色剂的专利【3 2 j 后，高浓度的过氧化物酶就被应用于脱色系统改善脱色 率。其后a m 0 b r i e n a n d c o f a g a i n 研究了p a 和e g - - 修饰的辣根过氧化物酶 在不同的氧化底物中对染料的脱色率【2 7 】。此后，ab h u n i a ，sd u r a n ia n dp r w a n g i k a r 研究了辣根过氧化物酶在染料脱色中的影响因素【3 3 l 。 8 中山大学硕t 学位论文 1 2 2 辣根过氧化物酶在有机合成方面的应用 辣根过氧化物酶在过氧化氢或烷基过氧化物下能催化有机物的氧传递的反 应，如图l 一2 。故辣根过氧化物酶在有机相中反应的成功使它在有机合成、聚 合物合成上具有广泛的应用 3 4 3 5 j ： ( 1 ) 催化脱氢制备光电功能高分子聚合物。功能高分子材料，有机固体功能 材料的研究由于其重要的理论意义和在高技术方面的潜在应用前景近十几年来 得到了迅猛的发展。这些有机光电高分子的共同特点是具有共轭长链体系的高分 子有机化合物，其中许多材割，尤其是芳香族高分子聚合物独具电学、光学和磁 学性质，包括聚苯胺、聚苯酚、聚并苯等。 过氧化物酶能在温和条件下，对应选择性催化酚、胺类物质的氧化聚合，生 成新型的聚酚、聚胺类高分子材料1 8 , 3 6 1 。尤其能催化化学氧化难于完成的丁香酸 的聚合。过氧化物酶催化聚合己成为聚合物合成的一种新型的方法，它不仅具有 反应条件容易控制的优点，还能够制备传统的有机反应无法合成的产物，h r p 及其多种过氧化物酶已被广泛地应用于合成功能聚合物和其它具有特殊结构的 化合物1 3 ”。h r p 能将给电子的芳香化合物( 如苯酚或苯胺) 氧化，得到可控结构的 新型聚合物，该类反应通常由自由基反应历程完成。h r p 催化合成n 的聚酚类 物质是种无甲醛的酚树脂，而且这类聚酚、胺类物质因具有n 共轭的电子结构， 在光电材料方面显示了极强的应用潜力，如聚酚类物质是一类重要的三阶非线性 光学材料。它不仅具有反应条件容易控制的优点，还能够制备传统的有机反应无 法合成的产物，h r p 及其多种过氧化物酶已被广泛地应用于合成功能聚合物和 其它具有特殊结构的化合物1 3 8 - 4 ”。h r p 能将给电子的芳香化合物( 如苯酚或苯胺) 氧化，得到可控结构的新型聚合物，该类反应通常由自由基反应历程完成。 ( 2 ) 硫氧化。光学纯的硫氧化物是不对称合成中重要的手性材料，也是一类 重要的药物。h i 冲能催化许多烷基芳- 香基硫化物( a t k ya r y ls u l f i d e ) 的对映选择 性硫氧化。 ( 3 ) 环氧化。光学纯环氧化物在开环时能提供双功能基团，因而是重要的手 性合成材料。环氧化无论是对生物体系而言还是在不对称合成中都具有非常重要 的作用。一些h r p 突变体已成功的应用于烯烃的环氧化以制备环氧化物。 9 2 0 0 1 级王腾利 ( 4 ) 苄基和烯丙基化。著名酶学家麻省理工的k l i b a n o v 教授利用h r p 成功 地将芳香族化合物进行羟化，制备了三个重要的药物：多巴、d 一( 一) 3 ，4 一：羟基苯 甘氨酸和l 肾上腺素。除这些外，辣根过氧化物酶还成功应用于氮氧化、加氧、 醇氧化和吲哚氧化、卤化等有机合成反应，以制备许多有用的医药化工中间体 3 8 - a l l 。 由上可知，以有机溶剂作为反应介质，极大的拓宽了酶的应用领域。辣根过 氧化物酶，由于被广泛的用作有机高分子合成的生物催化剂，故可作为氧化酶在 有机相中反应的代表，具有重要的应用价值。国内外的学者对辣根过氧化物酶在 有机相中的应用，尤其在功能高分子材料制各中的应用进行了深入的研究。 1 3 酶的化学修饰研究及进展 酶作为一种高效生物催化剂，其催化效果比一般无机催化剂高1 0 0 0 多倍， 在常温常压有氧存在和接近中性的条件下，酶对底物有高度的专一性，这是酶造 成的微环境效应所致，酶中的多个活性分子m 】，形成一个陷阱。这几个活性分子 称为活性子 ( a c t i v o n o m e ) ，活性子的立场相互交汇形成活性子场( a c t i v o n f i e l d ) ， 当底物落入这个陷阱时，就被活性子场捕获，发生多点协同反应，在其中将底物 分别切断或装配成大分子，故产物纯度很高。但是酶对热、酸、碱、氧化剂、有 机溶剂和重金属离子的稳定性差，同时酶在有机相反应的效率比在水相中低几个 数量级，这已是一个公认的事实。这些从而限制了酶的工业化应用f 纠。因此，如 何提高酶在有机相的催化功能便成为了酶在有机相催化过程能否在工业上广泛 应用的关键，也是近年来酶催化的一个研究热点。 目前许多科学家都致力于这方面的研究工作，开发了许多方法，概括起来主 要有两大类： 1 基因工程法，如定点突变和分子进化等。 2 利用化学方法的酶分子改造，即分子酶工程( 又称酶的化学修饰) 。 由于基因工程方法只能利用天然氨基酸取代酶蛋白原有的氨基酸，选择余地 不大，而化学修饰法却可以任意接上一些化学功能基团，选择余地大，可塑性强， 目前的酶的化学修饰方法主要有： 1 0 中山大学硕士学位论文 1 ) 蛋白质交联 酶是一种高效的生物催化剂。生物催化学家的主要任务之一就是提高生物 催化剂的稳定性，尤其是在非水溶液中的稳定性。利用双或多功能交联剂对酶进 行分子问或分子内交联，已取得了较好的进展。双功能试剂如二异硫氰酸脂 f s = c = n n = c = s ) 、戊二醛( o h c ( c h 2 ) 3 c h o ) 等可与酶分子中或分子间肽链的两 个游离氨基分别发生反应使它们交联起来，增加酶的稳定性和活性回收率m 】。 2 ) 单功能聚合物化学修饰蛋白质 最常用的化学修饰剂是聚乙二醇( p e g ) 、非离子型聚氧乙烯十二烷基醚 ( m p e g ) 和糖酯等，这方面的研究已取得了很大的进展f 2 0 】。 3 ) 小分子化合物的化学修饰法 在蛋白质结构与稳定性的关系的研究中发现蛋白质结构对稳定性而言并非 最合适的。x - 射线测试结果表明，蛋白质表面的一半基团由非极性氨基酸组成， 蛋白球体的非极性表面原子簇与水接触不利于酶的稳定。因此，利用小分子化合 物使蛋白球表面亲水化以提高酶的稳定性，这已在a 胰蛋白酶中取得了成功【”1 ； 罗贵民等相继在s o d 、胰激肽释放酶的研究中获得成功【“1 。证明了小分子化合 物共价结合在酶上是一种非常有效的、能改变酶特性的方法。已采用的小分子化 合物包括单功能或双功能试剂，主要有氨基葡萄糖、醋酸酐、硬脂酸、邻苯二酸 酐、醋酸- n 丁二酰亚胺酯、辛二酸一二- n 羟基丁二酰亚胺酯 ( s u b e r i c a c i d b i s ( n - h y d r o x y s u e c i n - i m i d e e s t e r ) 、 二甲基辛二酸亚胺酯 ( d i m e t h y l s u b e r i m i d a t e ) 、t - - 酸酐等们。 4 ) 辅因子引入法 酶在低温和中性介质中具有很高的底物专一性和催化活性。为了拓宽 酶催化的底物，研制出了一些人工酶，其中最主要的方法是在一已知蛋白或酶的 特定位点引入一个辅因子或新的功能基团，以合成新的蛋白或酶，如使 c u f p h e n h ”配合物与脂肪细胞类脂键合蛋白( a d i p o c y t el i p i db i n d i n gp r o t e i n ，a l b p ) 共价结合，生成半合成金属酶a l b p - p h e n - c u ( i i ) 【4 8 】。该酶可对映选择性水解多 肽，其对映体过量值( e e ) 达8 6 ，同时其水解芳香族酰胺化合物的活性也明显提 高。很多酶都含有辅酶或辅基活性基团。天然酶中这些基团的种类有限，因而限 制了酶的功能。如果能利用化学方法在这些辅因子中接上一些其它基团，再将修 2 0 0 1 级王腾利 饰后的辅因子取代天然酶的原有辅因子，便可制造出多种多样的新型酶。 5 ) 定点突变与化学修饰结合法 由于天然酶的催化底物非常有限，从而限制了其在有机合成中的应用。分子 生物学家利用定点突变法来改变酶的底物专一性，开发出了一些新型的酶制剂。 但由于定点突变只是用天然氨基酸进行取代，有一定的局限性，仍然无法满足有 机合成的需要。为此，人们便将定点突变所得酶迸行化学修饰，得到一些新颖的 酶制剂。先用定点突变技术在酶的关键活性位点引入一个氨基酸残基，然后利用 化学修饰法修饰突变的氨基酸残基，即引入一个小分子化合物，得到一种化学修 饰突变酶( c h e m i c a l l ym o d i f i e d m u t a n te n z y m e ，c m m ) 。最成功的例子是利用定点突 变法在b a c i l l u s l e n t u s 枯草杆菌蛋白酶( s b l ) 的特定位点中引入半胱氨酸，然后用 甲基磺酰硫醇( m e t h a n et h i o s u l f o n a t e ) 试剂进行硫代烷基化，得到一系列新型的化 学修饰突变枯草杆菌蛋白酶 4 9 - 5 ”。 综上所述，化学修饰法往往能在天然酶分子上接上一些化学功能基团，可得 到多种多样的修饰酶。因此，酶的化学修饰仍然是一个有效的蛋白质工程的手段 5 2 , 5 3 1 。化学修饰改善酶催化特性作为分子酶工程手段之一，其里程碑成果是1 9 8 8 年k a i s e r 成功地将黄素共价结合在木瓜蛋白酶上，从而将蛋白酶转变成氧化还原 酶【5 4 。自此以后，分子水平的酶蛋白质改造以改进酶的催化功能再次成为了人们 的研究热点，尤其近3 年来在国际学术干4 物上可看到越来越多的文章5 ”。国外又 兴起了一股利用化学修饰改造酶的研究热潮，出现了许多成果。这些大量的事实 已充分说明，只要选择合适的修饰荆和修饰方法，就能够利用化学修饰法快速、 廉价的提高酶的稳定性 60 1 ，甚至合成出新的酶。故酶的化学修饰可解决天然酶对 某些特殊化学反应，在稳定性与立体选择性方面( 即活性子组的形成与保持方面) 尚不能满足要求的问题【l8 】。因此，酶的化学修饰的发展前景是非常诱人的，不仅 在理论上，而且在使用上均具有重要意义。 1 4 选题意义 为此本论文以具有广泛应用前景的辣根过氧化物酶作为研究对象，利用分子 酶工程手段( 小分子修饰法) ，对辣根过氧化物酶进行分子水平的化学改造，以 1 2 中山大学硕士学位论文 提高其稳定性( 热稳定性、酸碱稳定性和耐有机溶剂能力) 尤其在有机溶剂中的 催化功能，并利用波谱学从分子水平上研究其结构与功能关系，揭示其催化特性 得以改善的机制。因此我们提出的辣根过氧化物酶的分子酶工程研究，不仅将给 酶的分子水平改造甚至创造新酶提供一个廉价、快速的技术平台，总结出酶结构 与稳定性方面的一些规律，促进我国酶学研究的发展，而且也将提供一种稳定性 尤其在有机相中催化功能更佳的辣根过氧化物酶，推动辣根过氧化物酶在我国的 工业化应用。 2 0 0 1 级王腾利 第2 章辣根过氧化物酶的化学修饰 2 1 前言 为了提高酶的热稳定性、酸碱稳定性，我们甫柠康酐、马来酸酐修饰辣根过 氧化物酶。并对其进行了一些表征以研究修饰酶的性质是否得到了改善，也对修 饰酶和天然酶进行了光谱测定以便分析修饰酶的结构是否发生了变化。 2 2 实验部分 2 2 1 实验试剂与仪器 辣根过氧化物酶( h r p ) ，上海丽珠东风生化技术有限公司，r z 3 0 活力： 2 5 0 单位m g 以上。柠康酐( c a ) ，a r ，北京丰特斯有限公司。马来酸酐，a r ， 广州化学试剂厂。柠檬酸，a r ，广州化学试剂，一。磷酸二氢钠，a r ，广- l i 化学 试剂厂。磷酸氢二钠，a r ，广州化学试剂厂。苯酚，c p ，广州化学试剂厂。4 一氨基安替比林，a r ，中国医药( 集团) 上海化学试剂公司。三硝基苯磺酸 ( t n b s ) ，a r ，上海丽珠东风生化技术有限公司。过氧化氢( 3 0 v v ) ，a r ， 汕头市光华化学试剂厂。 日本s h m a d z u 公司的u v - - 2 4 5 0 紫外可见分光光度计；苏州三发电子有 限公司的d k - - $ 2 6 型电热恒温水浴锅：广州市华南医疗器械有限公司的万用电 炉：上海雷磁仪器厂新泾分厂的j b 一2 型恒温磁力搅拌器；日本h i t a c h i 公司 的f 一4 5 0 0 型稳态荧光光谱仪；日本j a s c o 公司的j 一8 1 0 圆二色光谱仪；上海 雷磁仪器厂新泾分厂的p h b 一3 型便携式p h 计；日本s h i m a d z u 公司的a y l 2 0 型分析天平；透析袋。 2 2 2 柠康酐修饰辣根过氧化物酶 1 4 中山