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浙江工业大学硕士学位论文l 天冬氨酸a - 脱羧酶生产 丙氨酸的研究 l 一天冬氨酸a 一脱羧酶生产b 一丙氨酸的研究 摘要 本论文建立了2 ，4 二硝基氟苯柱前衍生高效液相色谱法直接检测 p 丙氨酸与l 天( f - j ) 冬氨酸盼新方法。该方法色谱条件为：色谱柱 为z o r b a xs bc 1 8 柱( 5 岫，4 6 2 5 0 m m ) ；流动相a 为o 0 2 m o l l n a a c - h a c 缓冲液，p h 6 2 ，流动相b 为乙腈，采用线性梯度洗脱：时 间( r a i n ) 0 - - , 2 0 ，流动相b ( 体积百分含量，) 5 3 3 ；流速为1 0 m l m i n ； 柱温为3 0 ；检测器为紫外可见光检测器，检测波长为3 6 0 n m ，参比 波长为6 0 0 n m ：进样量为2 0 皿。 采用基因工程的手段，用p c r 技术扩增了e c o l id h s a 中编码l 天冬氨酸小脱羧酶的p a n d 基因，将p a n d 基因连接入表达载体 p e t 2 8 b ( + ) 中形成重组质粒p e t 2 8 b ( + ) - p a n d ，再转化表达宿主菌ec o l i b l 2 1 ( d e 3 ) ，经卡那霉素抗性筛选获得了高表达l 天冬氨酸洳脱羧酶 的工程菌株ec o l ib l 2 1 ( d e 3 ) p e t 2 8 b ( + ) - p a n d 。对工程菌和对照菌株 ec o l d d h 5 a 、ec o l i b l 2 1 ( d e 3 ) 、ec o l i b l 2 1 ( d e 3 ) p e t 2 8 b ( + ) 进行产 酶比较，发现工程菌的产酶能力有极大提高，经0 4 m m o l l 的i p t g 和 s g i l 乳糖诱导后酶活分别为9 8 0 0 u 和1 5 0 9 1 u ，摩尔产物得率分别为 1 4 1 1 和2 1 7 3 ，而对照菌株用相同方法检测不到b 丙氨酸。 对工程菌ec o l db l 2 1 ( d e 3 ) p e t 2 8 b ( + ) - p a n d 的发酵工艺条件进行 优化，优化后的发酵条件为：以1 接种量将种子液接入装液量为 浙江工业大学硕士学位论文l 天冬氨酸* 脱羧酶生产b - 丙氨酸的研究 5 0 m l 2 5 0 m l 的发酵培养基中，3 7 、2 0 0 r m i n 培养2 h 后，添加乳糖 至终浓度为1 0 9 l ，3 0 c 、1 5 0 r r a i n 诱导2 4 h 。以优化后的工艺条件进 行发酵产酶，酶活达到2 2 4 9 6 u ，比优化前提高了4 4 8 0 1 。 对工程菌ec o l ib l 2 1 ( d e 3 ) p e t 2 8 b ( + ) - p a n d 的转化工艺条件进行 优化，优化后工艺条件：底物为0 0 2 m o l l 、p h 4 4 9 的l - 天冬氨酸钠盐； 转化温度为3 0 ；转化时间为4 8 h 。以优化后的条件进行转化实验，1 3 丙氨酸产量是优化前的1 1 0 倍，增加了1 0 。 关键词：l 天冬氨酸q 一脱羧酶，p 一丙氨酸，i - i p l c ，基因工程，发酵， 转化，优化 玎 浙江工业大学硕士学位论文l 天冬氨酸a 脱羧酶生产争丙氨酸的研究 s t u d yo np r o d u c t i o no fp - a l a n i n eb y l - a s p a r t a t e c 【d e c a r b o x y l a s e a b s t r a c t i nt h i sp a p e r , an e wm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fp - a l a n i n ea n d l - a s p a r t a f i ca c i db yr e v e r s e dp h a s eh i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h yw i t l lp r e c o l u m nd e r i v a t i z a t i o nw a s e s t a b l i s h e d t h e s a m p l e sw e r ed e r i v a t i z e dw i t hd n f ba n da n a l y z e do na5 p mz o r b a xs b c 1 8 c o l u m na t3 0 cu s i l l gg r a d i e n te l u t i o nw i t hd i o d ea r r a yd e t e c t i o na t 3 6 0 n m t h em o b i l ep h a s eaw a sn a a c - h a cb u f f e r ( p h 6 2 ) ，a n dt h em o b i l e p h a s eb w a sa c e t o n i t r i l e f r o m0t o2 0m i n u t e s ，t h ep e r c e n t a g eo f m o b i l e p h a s ebi n c r e a s e d 锄5 t o3 3 t h ef l o wr a t ew a s1 0m l r a i n 1a n d t h ei n j e 圮t i o nv o l u m ew a s2 0 i 皿 p a n dg e n ee n c o d i n gl - a s p a r t a t e - a - d e c a r b o x y l a s ew a sc l o n e df r o m e c o l id h 5 ab yp c ra m p l i f i c a t i o n t h eg e n ew a si n s e r t e di n t ot h ev e c t o r p e t 2 8 b ( + ) t oc o n s t r u c ta ne x p r e s s i o np l a s m i dp e t 2 8 b ( + ) - p a n d t h e ni t w a st r a n s f o r m e di n t oec o l i b l 2 1 ( d e 3 ) ，a n do v e r e x p r e s s i o n o f l a s p a r t a t e - a - d e c a r b o x y l a s e i nec o l ib l 2 1 ( d e 3 ) w a so b s e r v e d t h e l - a s p a r t a t e a - d e c a r b o x y l a s ea c t i v i t y o fr e c o m b i n a n ts t r a i nec o l i 1 n 浙江工业大学硕士学位论文 l 天冬氨酸a 脱羧酶生产b - 丙氨酸的研究 b l 2 1 ( d e 3 ) p e t 2 8 b ( + ) - p a n di n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y a r e ri n d u c e db y 0 4 m m o l li p t ga n ds g ll a c t o s e ，t h ee t i z y m ea c t i v i t yw e l e9 8 0 0 ua n d 1 5 0 9 1 u ，a n dt h ep r o d u c ty i e l do f t h er e c o m b i n a n ts t r a i nw e r e1 4 11 a n d 21 7 3 r e s p e c t i v e l y ，w h i l ep - a l a n i n ef r o mc o n t r o ls t r a i n se c e l ld h 5 a ，e c o l d b l 2 1 ( d e 3 ) a n dec e l lb l 2 1 ( d e 3 ) p e t 2 8 b ( + ) c o u l d n tb e d e t e r m i n e db yt h es a m em e t h o d t h r o u g ho p t i m i z a t i o ne x p e r i m e n t s ，e 1 1 z y m es y n t h e s i sc o n d i t i o n so f e c o l d b l 2 1 ( d e 3 ) p e t 2 s b ( + ) 一p a n dw e r eg i v e n a sf o l l o w s ：5 0 m l f e r m e n t a t i o nl i q u i dc u l t u r ew a si n o c u l a t e dw i t ha1 v o l u m eo fi n o c u l u m a n di n c u b a t e df o r2 ha t3 7 2 0 0 r m i n ；t h e nl a c t o s ew a sa d d e dw i t hf i n a l c o n c e n t r a t i o no f1 0 9 la n di n c u b a t e df o r2 4 ha t3 0 0 ，1 5 0 r r a i n u n d e r o p t i m a l c o n d i t i o n s ，l - a s p a r t a t e - a - d e c a r b o x y l a s ea c t i v i t y o fec o i b l 2 1 ( d e 3 ) p e t 2 8 b ( + ) - p a n d w a s2 2 4 9 6 1 3w h i c hi n c r e a s e d4 4 8 0 1 t h r o u s ho p t i m i z a t i o ne x p e r i m e n t s ，t h eo p t i m a lb i o t r a n s f o r m a t i o n c o n d i t i o n sw e r eg i v e na sf o l l o w s ：t h es u b s t a n c es o l u t i o nw a so 0 2 m o l l l - a s p a r t a t es o d i u m ( p h 4 4 9 ) ；t h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ew a s3 0 ca n dt h e o p t i m a lt i m ew a s4 8 h u n d e ro p t i m a lc o n d i t i o n s ，t h e1 3 - a l a n i n ey i e l do fe c e l lb l 2 1 ( d e 3 ) p e t 2 8 b ( + ) - p a n di n c r e a s e d1 0 k e y w o r d s ：l - a s p a r t a t e - a d e c a r b o x y l a s e ，1 3 - a l a n i n e ，h p l c ，g e n e e n g i n e e r i n g ，f e r m e n t a t i o n ，b i o t r a n s f o r m a t i o n ，o p t i m i z e 浙江工业大学硕士学位论文 l 天冬氨酸* 脱羧酶生产b - 丙氨酸的研究 符号与缩略语 l - a s p ( l - a s p a r t i ca c i d ) 舭l a ( b - a l a n i n e ) h p l c ( h i g h 脚o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ) p c r ( , p o l y m c r a s ec h a i nr e a c t i o n ) u v ( u l t r a v i o l e ts p e c t r u m ) s d s ( 1 a u r y ls u l f a t e ) a m p ( a m p i c i l l i n ) k a n ( k a n a m y c i n ) t r i s 0 1 i s - h y d r o x y m e t h y l - a m i n o m e t h a n e ) e d t a ( e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a e e t i ca c i d ) t e c t a b ( c c t y l t r i m c t h y la m m o n i u mb r o m 眦 i p t o ( i s o p r o p y l - p - d - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e ) x n l 天( 门) 冬氨酸 肛丙氨酸 高效液相色谱 聚合酶链式反应 紫外光谱 十二烷基磺酸钠 氨苄青霉素 卡那霉素 三( 羟甲基) 胺基甲烷 乙二胺四乙酸 t r i s - - e d t a 缓冲液 溴化十六烷三甲基铵 t r i s 乙酸缓冲液 异丙基硫代1 3d 半乳糖苷 5 一溴- 4 氯3 吲哚- b - d 一半 乳糖昔 天 小时 分钟 秒 转速= = 触 浙江工业大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研 究工作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文不包 含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙江工业大 学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献 的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。 作者签名：鼋翮胡日期：碲多月2 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本 学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“4 ”) 日期：a 川年多月二日 日期：硪z 月日 浙江工业大学硕士学位论文 l 天冬氨酸十脱羧酶生产b _ 丙氮酸的研究 1 ip 一丙氨酸研究进展 1 1 1b 丙氨酸简介 第一章综述 肛丙氨酸( b - a l a n i n e ) ，即3 - 氨基丙酸( 3 一a m i n o p r o p a n o i ca c i d ) ，又称为争氨 基丙酸，肛丝析氨酸， 初油氨基酸。b 丙氨酸的化学索引号( c a s ) 为1 0 7 9 5 9 ， 心n 久c 些洲 心 温度为1 9 7 - 1 9 8 c ，熔点( m p ) 为2 0 0 ( 1 9 7 - 1 9 8 ) 。p 丙氨酸溶于水，微溶于甲 醇和乙醇，不溶于乙醚和丙酮。2 5 水溶液中溶解度为5 5 5 9 ，等电点p i 为6 9 。 1 1 2b - 丙氨酸的应用 随着对争丙氨酸及其衍生物的研究日趋成熟，p - 丙氨酸在医药、化工、食品、 环境等领域的作用日渐突起。下面对争丙氨酸的应用作一简要介绍。 1 1 2 1 合成泛酸钙【3 , 4 1 浙江 1 - 业大学硕士学位论文l - 天冬氨酸m 脱羧酶生产b 丙氨酸的研究 泛酸( p a n t o t h e n i ca c i d ) 又名本多生酸、遍多酸、维生素b 5 ，有时被称为维生 素b 3 ，化学名称为n ( 2 牛二羟基- 3 ，3 二甲基丁酰) p 氨基丙酸，它是辅酶a 的组成 部分，其生物活性是：帮助细胞形成，维持正常发育和中枢神经系统的发育；参 与蛋白质、脂肪、糖在体内的新陈代谢；参与抗体的合成等。微生物和植物能自 行合成泛酸，而哺乳动物不能，需要从外界摄取泛酸作为营养因子。泛酸产品在 医药、食品、饲料工业中应用广泛。 泛酸具有旋光性，具右旋型式的泛酸才有活性，具有维生素的效果。游离性 的泛酸具有淡黄色黏油状，能溶于水与酒精中，不溶于苯与氯仿，对于酸、碱及 热等不稳定。以醇式泛酸( p a n t h e n 0 1 ) 易被机体吸收，吸收后在体内马上会转变为酸。 由于泛酸对热、碱、酸均不稳定，其商品形式主要为d 泛酸钙。 工业上合成泛酸钙的工艺路线主要有两条，均以b 丙氨酸为初始原料： ( 1 ) 先合成d l - 泛酸内酯，经拆分得到d 泛酸内酯，再与合成的b 丙氨酸钙缩合，得到 产品；( 2 ) b 丙氨酸钙与合成的d l 泛酸内酯缩合得到d l 泛酸钙，再经拆分制得 d 泛酸钙。 1 1 2 2 合成肌肽【5 6 】 肌肽( 丙氨酰组氨酸，肛丙氨酰- 组氨酸二肤，c a r n o s i n e ) ，分子式c 9 i l 斜和3 ， 是发现于多数脊椎动物骨骼肌中的水溶内源性二肤，在生物体内由b - 丙氨酸和l 组氨酸通过肌肽合成酶催化合成。肌肽是一种有效的天然抗氧化剂，分子中含有 咪唑基，具有螯合金属离子的能力，特别是铜离子。肌肽侧链上的组氨酸残基可 以作为氢的受体，具有捕捉羟基自由基、单质氧和过氧化自由基的作用，抑制非 金属离子引起的脂肪氧化作用。目前，肌肽被广泛用于药物辅助剂、化妆品、食 品及饲料添加剂等领域。 由争丙氨酸和l 组氨酸化学法合成肌肽的工艺路线为：在p 丙氨酸的氨基上引 入叔丁氧甲酰基( b o c ) 保护基团；n - 羟基琥珀酰亚胺( s u o h ) 活化羰基；酰化 l 组氨酸；酸化去氨基保护基团、分离结晶得到产品。 1 i 2 3 合成b - 丙氨酸金属配合物【7 。1 1 l c a s c l l a 等嘲研究报道，氨基酸水杨醛席夫碱配合物是磷酸吡哆醛催化氨基酸 2 浙江工业大学项士学位论文 。天冬氨酸m 脱羧酶生产争丙氨酸的研究 酶反应极好的模型体系，而且具有良好的抗菌、抗癌活性。过渡金属氨基酸类席 夫碱结构广泛存在于生物体的金属蛋白及金属酶中，过渡金属离子( 如c u , n i ，m n ， 勖等生命元素) 能和蛋白质分子中某些肽键上的羰基和亚氨基配位，从而改变蛋白 质的多极结构。研究表明过渡金属c o 的b 丙氨酸席夫碱配合物是天然氧载体血红 蛋白、肌红蛋白及血蓝蛋白等极好模型配合物。合成争丙氨酸金属配合物的工艺 路线分为两步：( 1 ) f , - 丙氨酸与有机物合成配体；( 2 ) 配体与金属合成b - 丙氨 酸金属配合物。 1 1 2 4 合成帕米膦酸钠 1 2 j 3 1 帕米膦酸钠( p a m i d r o n a t e ) ，即氨羟丙双膦酸二钠，商品名博宁、阿可达， 是一种重要的骨吸收抑制剂，用于治疗肿瘤高血钙、p a g e t s 病以及恶性肿瘤骨转 移。 丙氨酸合成帕米膦酸钠的工艺路线为：争丙氨酸、无水亚磷酸、三氯化磷在 无水氯苯或无溶剂下加热反应，经水解、酵沉淀得到帕米膦酸，氢氧化钠溶液中 和帕米膦酸得到无水帕米膦酸钠，水重结晶得到终产品。 1 1 2 5 合成巴柳氯【1 4 ，1 习 巴柳氮( b a l s a l a z i d e ) ，即水杨酸偶氮苯甲酰- p 丙氨酸，其二钠盐称为巴柳氮 钠，商品名c o l a z z i d e ，是一种新型非特异性抗炎药物，应用于治疗溃疡性结肠炎、 直肠炎及克罗思氏病，是目前较为理想的抗结肠炎药物。b 丙氨酸合成巴柳氮的工 艺路线为：肛丙氨酸与对硝基苯甲酰氯氨化反应，产物氢化生成对氨基苯甲酰p 丙氨酸，然后重氮化，生成的产物与水杨酸偶合得到终产品。 1 1 2 6 其它应用 p 丙氨酸还可作为药剂制备中的沉淀剂，水的净化絮凝剂，电镀缓蚀剂，铅中 毒解毒剂6 1 ，以及用于合成甜味剂l 刀等。 1 1 3b 一丙氨酸在生物体内的主要合成代谢途径 3 斯江工业大学硕士学位论文b 天冬氨酸p 脱羧酶生产争丙氨酸的研究 图1 - 2p 丙氨酸的代谢途径 f i g 1 - 2i b _ - a l a n i n em e t a b o f i z er o w t e b 丙氨酸在生物体内的合成途径目前报道有8 条。 第1 条：在大肠杆菌( e s c h e r i e h i ac o l i ) 、谷氨酸棒杆菌( c o r y n e b a c t e r i u m g l u t a m i c u m ) 等细菌体内，在l 天门冬氮酸静脱羧酶( e c 4 1 1 1 1 ) 催化下， o 天 门冬氨酸脱羧生成p 丙氨酸。c r o n a n 研究【1 q 证明ec o l i 中p 丙氨酸主要是经由这 条途径合成的。第2 条：在动物、ec o l i 等生物体内，尿嘧啶被还原为5 ，6 - 二氢尿 嘧啶，再降解成p 脲基丙酸( 即n - 氨甲酰p 丙氨酸) ，n - 氨甲酰p 丙氨酸在争丙 氨酸合成酶( e c 3 5 1 6 ) 的作用下生成肛丙氨酸【1 恻。第3 条：丙二酸半醛氨基 化，o 丙氨酸和3 氧丙酸( 3 - o x o p r o p a n o a t e ) 或丙二酸半醛( m a l o n a t es e m i a l d e h y d e ) 在p 丙氨酸丙酮酸转氨酶( e c 2 6 1 1 8 ) 的催化下生成p 丙氨酸和丙酮酸【2 4 】。第4 条：在酿酒酵母中，b 丙氨酸来源于精氨酸、脯氨酸的降解产物精胺，精胺氧化产 4 浙江工业大学硕士学位论文 卜天冬氨酸m 脱羧酶生产争丙氨酸的研究 生的3 氨基丙醛在醛脱氢酶( e c l 2 1 3 ) 的作用下生成争丙氨酸 2 5 1 。第5 条：肌 肽在丙氨酰组氨酸二肽酶( e c 3 4 1 3 3 ) 的作用下生成p 丙氨酸和组氨酸。第6 条：p 丙酰基一精氨酸( p - a l a n y l a r g i n i n e ) 或p 丙酰基- 赖氨酸( p a l a n y l 1 y s i n e ) 在n 2 ( 4 氨基 丁酰) - l 一精氨酸( 或赖氨酸) 水解酶( e c 3 4 1 3 4 ) 催化下生成争丙氨酸和- l 精氨 酸( 或赖氨酸) 第7 条：n - 乙酰一争丙氨酸在n 乙酰b 丙氨酸酰胺水解酶 ( e c 3 5 1 2 1 ) 催化下生成p 丙氨酸和乙酸。第8 条：鹅肌肽、肌肽在丙氨酰甲基 组氨酸二肽酶( e c 3 4 1 3 5 ) 的作用下生成b 丙氨酸。 这8 条途径是目前发现的生物体内合成6 丙氨酸的可能途径，通过对这些途 径的研究，可以找到生成争丙氨酸的关键酶系，从而找到一条生物法生产争丙氨 酸的最佳途径。 1 1 4b - 丙氨酸的生产方法 1 1 4 1 化学法 目前国内外生产d - 丙氨酸主要采用化学合成法，根据初始原料的不同可以分 为以下几类： 1 1 4 1 1 丙烯腈法 丙烯腈与氨水发生氨化反应生成p 氨基丙腈，再于酸性或碱性条件下水解即 得。反应方程式： 氨化n a o h c h 2 h c n 卜n h 2 c h 2 c h 2 c n - n i - 1 2 c h 2 c h 2 c o o n a l 嬲 n i - 1 2 c h 2 c h 2 c o o h 副反应： 叫墨= d n i c c h 2 - c h 删2 - c = n c h 2 = c h - c n + c h 2 = c hc n ；= = 皂j 1 工、f 、u r w r n b u c 等t 2 6 】报道通过该方法合成b 丙氨酸，第一步反应产率为3 9 ，第二步反应 产率为9 0 - 9 4 。 该方法原料易得，成本较低，但有副反应，且水解过程生成大量无机盐，产 浙江工业大学硕士学位论文 。天冬氮酸a 脱羧酶生产b 丙氨酸的研究 物较难纯化，影响下一步产品的质t - 1 2 7 】。 1 1 4 1 2 丙烯酸法 在较高的温度和压力条件下，丙烯酸、丙烯酸酯或丙烯酸盐与氨水氨化反应， 得到b 丙氨酸，反应过程如下嘲： 高温、高压 h 2 c - - - - c h - - c o o h + n h 3 卜 b i n c h 2 一c h 2 一c 0 0 h 其副反应1 2 8 1 为： c h 2 c i - 1 2 c o o h 1 - 1 2 c = c h - - ( ：x 3 0 h + 印4 - c h 2 一c h 2 一c 0 0 h ；昔删 c h 2 删n 其平衡反应为： c h 2 c h 2 c o o h h n x + n h 3 + 2h 2 n - - c h 2 一c h 2 一c o o h x c h 2 c h 2 c o o h 碰d 叩1 l 【i 等例通过对丙烯酸加氨生产肛丙氨酸研究发现，反应主要副产物3 。3 亚氨基二丙酸的产生会极大地影响b 丙氨酸的产率，通过加入碳酸盐或通c 0 2 到反 应体系中可以防止副反应的发生。陆乃宸等1 3 0 , 3 1 1 研究了丙烯酸的氨化反应，推导 出反应动力学模型，并求出了模型参数，反应的单程收率约为3 0 5 0 通过控制反应条件或采用其他一些措施，在丙烯酸的氨化反应中产品的最终 收率可达9 0 ，纯度达9 5 以上嘲。该合成方法由于工艺简单，收率高，产品纯度 也较高，是较理想的工业化方法，但需打破化学平衡 2 7 1 。 1 1 4 1 3 琥珀酰亚胺( 丁二酰亚胺) 降解法 琥珀酰亚胺在碱性氯酸钠溶液( 次氯酸钠、氢氧化钠及碳酸钠的混合液) 中 发生降解反应生成d 一丙氨酸，反应方程式如下： 0 o 骂h 2 n c hh2coona三e2h2nch2ch2h 2 n c h 2 c h 2 c o o h + a = = + oh。 6 浙江工业大学硕士学位论文 。天冬氨酸a 脱羧酶生产b 丙氨酸的研究 生产工艺：把碱性氯酸钠和冰投于反应釜中，搅拌下加入琥珀酰亚胺，于 1 8 2 5 反应半小时，4 0 5 0 反应l 小时，加盐酸中和到p h4 0 5 0 ，减压浓缩， 加9 5 乙醇使无机盐析出，过滤，回流1 小时，加活性炭脱色，过滤，离子交换 树脂交换精制，脱色，减压浓缩冷却结晶，最后重结晶即得成品( 含量兰9 5 ) 。 该方法的工艺条件要求苛刻，原料成本较高且易发生其它副反应，不适宜工 业化f 2 7 l 。 1 1 4 1 ab 氨基丙腈法 p - 氨基丙腈在酸、碱及酶的催化下，可以一步合成争丙氨酸。p 一氨基丙腈在氢 氧化钡中水解的反应方程式如下： n h ，c h ，c h ，c n ! b a ( o i - i 、, _ 一c n ，一一a 巡m c n ，一 f o r d 等【3 2 】研究发现b - 氨基丙腈在2 5 5 0 氢氧化钡中9 0 由5 下反应2 0 m i n ， 争丙氨酸产率为8 8 , - 9 2 。 该法的特点是产率较高，但产生大量盐，后续分离纯化困难。 化学法生产b 丙氨酸除了以上方法外，乙烯氰醇、双氰乙基胺、亚氨基二丙酸 与氨水反应，液氨与甲基丙烯酸甲脂作用，争氨基丙醇氧化，丙烯腈与氢氧化铵加 成，3 氨基丙醇在硫酸中电解氧化都能制得b - 丙氨酸。 1 1 4 2 生物法嗍 日本在生物法制备争丙氨酸方面的研究起步较早。及川利洋等利用产有机腈降 解酶的微生物催化p 氨基丙腈水解合成b 丙氨酸，微生物j a l c a l i g e n e ss p o m t - m y l 4 ，a c h r o m o b a c t e r x e r o s i s i f 0 1 2 6 6 8 ，p s e o d o n o c a r d i a t h e r m o p h i l a a t c c l 9 2 8 5 ，a m i n o b a c t e ra m i n o b r a n c ea t c c 2 3 3 1 4 能够催化b 氨基丙腈水解，其中 a l c a l i g e n e ss p o m t - m y l 4 催化效果最佳，在3 0 c 下，其游离细胞在缓冲液中催 化1 o 的p 一氨基丙腈水解反应1 h ，争丙氨酸浓度达4 7 r e t o o l l 一。田肠新一郎等利 用微生物如m i c r o c o c c u sl y s o d e i k t i c u sa t c c - 4 6 9 8 、m i c r o c o c c u sl u i c u sa t c c 1 2 6 9 8 、 c o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u ma t c c - 2 1 2 5 3 等转化p 一氨基丙醇，3 0 ( 2 下反应3 0 1 1 , 阻丙 7 浙江工业大学硕士学位论文k 天冬氨酸p 脱羧酶生产争丙氨酸的研究 氨酸浓度达4 o m g m l 1 1 2l 天冬氨酸洳脱羧酶研究进展 l 天冬氨酸小脱羧酶( l - a s p a r t a t e - a - d e c a r b o x y l a s e ，e c 4 1 1 1 1 ，缩写为p a n d ， a d c ) 又称l 天冬氨酸l - 脱羧酶，能催化脱去l 一天门冬氨酸的o r 羧基，生成b 一丙 氨酸。目前，人们已经对ec o l i1 1 邸 7 l 、cg l u t a m i c u m 3 8 1 、结核分枝杆菌 ( m y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s ) p g l 、幽门螺杆菌僻砌6 舭r 刀怕哟【柏】等多种微生物的 p a n d 有所研究，其中研究最多的微生物是ec o l i 。 1 2 1p a n d 的结构及形成机制 1 2 1 1p a r d ) 的结构 图1 3 ec o l i l 天冬氨酸刚兑羧酶的四聚体晶体结构 f i g 1 - 3t e u a m e r i cc r y s t a ls t r u c t t t r e 磺e c o l il - a s p a r t a l ea - d e c a r b o x y l a s e 人们研究发现ec o l i 、h p y l o r i 和m t u b e r c u l o s i s 的p a n e ) 结构相似。其中ec o i l 的p a n d 晶体结构已经用2 2 a 分辨率的潮t 线衍射法确定口3 】：该酶是一个四聚体， 有四个假折叠的旋转对称体( 见图1 3 ) 。电子密度分析显示具有催化能力的丙酮酰 基存在于三个活性位点，位于第四个活性位点的是一个酯基，这个酯基是自身催 加工形成丙酮酰基的中介。在蛋白链的9 、l l 、5 4 、5 7 和5 8 位分别是赖氨酸，组 8 浙江工业大学硕士学位论文 l 天冬氨酸a - 脱羧酶生产b - 丙氨酸的研究 氨酸，精氨酸，苏氨酸和酪氨酸残基，而且绝对保守，在p a n d 催化反应时发挥重 要作用。 1 2 1 2p a n d 的形成机制 p a n d 是一个不寻常的酶，它的催化能力依赖于自身加工形成的丙酮酰基。 r a m j o e 等1 3 町提出：四聚体酶合成时，每个单体首先形成一个分子量1 3 8 k d a 的无 活性的酶原。卜蛋白) ，其中三个单体在特殊的g l y - s e r 键上进行剪切，形成c 末端 含有羟基的b 亚基( 2 8k d a ) 和n _ 末端含有丙酮酰基的舡亚基( 1 1k d a x 见图1 4 ) 。 酶原经加工后，用荧光素氨基硫脲标记显示，其四聚体包含三个丙酮酰基，说明 该四聚体的三个亚基发生了剪切并产生了活性。ec o l i 的p a n d 晶体结构显示【3 5 1 ， 酶的三个亚基含丙酮酰基，另一个亚基在g l y 2 4 s e x 2 5 没发生剪接而经过重排形成 酯基。 g l v 2 4 s e f 2 5 m e n z y l n e ( 1 3 8 3 5 d a ) + o 图1 - 4p a n d 蛋白剪切反应机制 f i g 1 - 4m e c h a n i s mo f t h ea c t i v a t i o nr 删o i lo f p a n d 1 2 2p a n d 的酶学性质 1 2 2 1p a n d 的专一性及反应常数 9 眦 | u o 咄嘞舻o b 4 刚 粥 p g 浙江工业大学硬士学位论文 l 天冬氨酸* 脱羧酶生产b - 丙氨酸的研究 p a n d 只能以l 天门冬氨酸为底物，专一性很强。酶的反应常数在不同的实验 条件下测得的结果有所区别。w i l l i a m s o n 等p 6 1 报道用同位素标记法，在4 2 c 、 o 1 m o l l 磷酸钾缓冲液( p h 7 ，5 ) 、5 m m o l le d t a 、i m m o l ll - 天门冬氨酸的反应条 件下反应2 0 m i n ，ec o l iw p a n d 的米氏常数k m 值是1 6 0 1 m z o l l 。c r o n a n 1 蜘研究指出 用同位素标记法，在3 7 、o i m o l l 磷酸钾缓冲液( p h 6 8 ) 、2 3 p m o f ll - 天门冬氨 酸的反应条件下反应1 - 2 h ，ec o l iwp a n d 的米氏常数k m 值约为8 0 1 u n o l l 。瞄i 等洲用荧光胺衍生l - 天门冬氨酸和争丙氨酸再经h p l c 分析，重组ec o l id h 5 a p a n d 的米氏常数k m 和转换数k e a t 分别为1 5 1 士1 6p m o f l 和o 5 7 f 1 。c h 0p r ：a 等口9 1 用相 同的h p l c 分析重组彪t u b e r c u l o s i sp a n d 的酶活，动力学参数k m 和k c a t 分别为 2 1 9 6 岫l l 和o 6 5 s - 1 。 1 2 2 2p a n d 的最适温度和最适p h 值 p a n d 的最适温度和最适p h 值随菌种而异。 据报道ec o l ip a n d 的最适温度是5 5 c t 3 6 1 ，而c g l u t a m i c u m 和膨t u b e r c u l o s i s p a n d 的最适温度是3 7 【3 例。 w f l l i a m s o n 等嗍报道ec o l ip a n d 的最适p h 范围为p h 6 8 - 7 5 。c r 锄【1 观深入 研究发现ec o l ip a n d 的最佳p h 值是7 5 ，在p h 6 8 和8 0 溶液中的反应速率约为 p h 7 5 的6 0 。c h o p r a 等 3 9 1 发现膨t u b e r c u l o s i s 中p a n d 的最佳p h 值是7 0 。 1 2 2 3p a n d 的酶活抑制剂 各种能与羰基反应的试剂，如n a b i - 王4 、d - 环丝氨酸、肼、苯肼等x c p a n d 均有 抑制作用，其中羟胺是最有效的抑制剂。6 0 “m o 扎羟胺对p 髓d 有8 1 抑制率1 ”日。 这说明p a n d 有羰基化合物作为活性基团。w f l l i a m s o n 等证明p a n d 活性中心的羰基 本质上是一个丙酮酰基残基。 b 谷氨酸、琥珀酸、草酰乙酸、l 丝氨酸、l 半胱氨酸、争羟基- d l 天冬氨酸、 m 丝氨酸等l 天门冬氨酸的结构类似物都是该酶的竞争性抑制剂，而k 天门冬氨 酸的立体异构体d 天门冬氨酸既不是底物也不是酶活抑制剂。 浓度为1 0 m m o f l 越j 单价离子如l i + 、n 矿、n h 4 + 、k + 和二价离子如m n 2 、m 【矿、 c a 2 + 、f e 2 + 、c 0 2 + 不抑制p 孤d 酶活，但浓度为2 0 0 m m o l l 的k c i 对p a n d 有6 3 的抑 l o n 窿l ：y _ _ q k 大学硕士学位论文 l 天冬氨酸p 脱羧酶生产b 丙氨酸的研究 制作用，1 0 m m o l l 的c u c l 2 对p a n d 有8 8 的抑制作用。 1 2 3 酶活的测定方法 p a n d 酶活测定方法是研究该酶的基础，在不断建立和改进。现已有的活性测 定方法包括以下两种。 1 2 3 1 放射性同位素标记法 放射性同位素标记是早期测定p a n d 酶活的方法。根据标记的羧基不同，相应 的可以生成两种不同的标记产物：1 4 c 0 2 和b 1 - 1 4 c 1 丙氨酸。 1 2 3 1 1 测定1 4 c 0 2 含量【1 8 ，6 】 p a n d 将l - 1 _ 1 4 e 1 天门冬氨酸转化成争丙氨酸，释放出c c h ，收集1 4 c 0 2 ，通 过电闪仪测定1 i c 0 2 含量。 1 2 3 1 2 测定i b - 1 _ 1 4 c 】丙氨酸含量 p a n d 将l - w 1 4 e 1 天门冬氨酸转化成m l 一1 e l 一丙氨酸，转化一定时间后经离心、 洗涤等处理，进行纸层析网或硅胶薄板1 8 l 层析，然后用放射自显影测定b 丙氨酸 含量。另外可以用离子交换的方法纯化1 4 c 标记的p 丙氨酣堋，再用放射自显影测 定p - 丙氨酸含量。 该法灵敏度高，但放射性物质使用不安全，一般实验室也不具备该条件。 1 2 3 2 高效液相色谱法 柱前衍生高效液相色谱法现在已经广泛用于氨基酸检测。在p a n d 酶活测定上， r a 画c e 等剀使用荧光胺、n i c o l e 等1 3 s 】则用邻苯二甲醛柱前衍生l 天门冬氨酸和b 丙氨酸，然后用c 1 8 柱反相h p l c 定量。 1 2 4 p a n d 基因的克隆与表达 随着p a n d 研究的不断深入，脚孵d 基因的克隆和表达也取得了较大进展，目前 浙江工业大学硕士学位论文b 天冬氨酸* 脱羧酶生产6 - 丙氨酸的研究 已经有多个微生物的瑚，z d 基因得到了克隆并在宿主中得到表达。 1 2 4 1c g l u t a m i c u mp a r d ) 的克隆与表达 n i e o l e 等1 3 1 1 将cg l u t a m i c u m p a n d 基因克隆到ec o l i 中表达，获得了泛酸的高产 菌株。序列分析显示cg l u t a m i c u m p a n d 区包含4 11 个碱基，编码一个含1 3 6 氨基酸 残基、分子量为1 4 1 k d a 的蛋白质。cg l u t a m i c u m p a n d ：突变株完全缺失p a n d 活性， 显示p - 丙氨酸营养缺陷型。将cg l u t a m i c u m f l c j p a n d 基 ( p a n d c 亭) 与ec d 站的珊d 基 因觎d e 。) 克隆到双功能质粒表达载体p z 8 - 1 饴。t a i c 启动子) 中，使得在c g l u t a m i c u m 与ec o l i 中都能进行基因分析。在cg l u t a m i c u m 中，通过转) k 含p a n d c 8 的p z 8 一l 来加强p 鲫d c g 的表达，p a n d 活性提高t 2 8 8 倍，转入含砷h 啦。的p z 8 1 来 加强p 口桕的表达，p a a d 活性只提高了4 倍。在ec o l i 中，加强p a n d c g 的表达，p a n d 活性提高t 4 1 倍，加嘞a n d e 。的表达，p a n d 活性提高了3 倍。n i c o l e 等还对ec o i l 中p 觎d c 亭和p 册p 娩基因的表达对泛酸积累的影响作了研究，结果显示妒桕c 量基 因的表达能消除 丙氨酸对泛酸合成的限制，泛酸产量高达1 4 0 n 鲫g 1 ( 干重) h 1 ，而 表达p a n d e 。基因的培养基中仍需外加p 丙氨酸才能获得泛酸的最大积累。这说明 不管在cg l u t a m i c u m 还是ec o l i 体内，在p z 8 1 质粒中t a e f d 动子作用- i r p a n d c g 比 p a n d e 。更易表达。 1 2 4 2ec o l i p a n d 的克隆与表