（植物学专业论文）高山离子芥线粒体交替途径介导的抗寒特征研究.pdf

兰州大学博士学位论文 摘要 高山离子芥是一种典型的高海拔寒区适应性物种，生长于海拔3 8 0 0 米以上 的冰缘地带，整个生活周期受到寒冷，强紫外辐射和低氧分压的影响。高山离子 芥不具备特殊的形态学特征来抵御寒冷胁迫，体内细胞活动承担了主要的防御能 力。线粒体是一个重要的产能细胞器，植物线粒体具有多种交替途径所介导的能 量耗散系统，主要包括末端交替氧化酶途径，解偶联途径和交替n a d ( p ) h 脱氢 酶途径。虽然已经有很多的研究发现这些途径参与了植物的抗逆过程，但是对于 高山离子芥的相关研究尚属空白。本论文以高山离子芥为材料，研究了冷胁迫时 的植物线粒体抗性特征及线粒体交替途径在抗寒中的作用特征。同时，研究了参 与植物线粒体交替型n a d ( p ) h 脱氢途径的蛋白质之间的相互作用与抗寒性的关 系，从而深入了解该途径在植物抗寒中的作用机制。取得了以下研究结果： 1 采用h p l c 对高山离子芥悬浮细胞的泛醌氧化还原性水平在不同温度处 理下的变化进行了研究。结果表明早期低温诱导下，细胞活性氧水平和线粒体功 能保持正常，泛醌的氧化还原状态之间的转变加剧，氧化性水平升高，这种氧化 还原转变使得泛醌发挥了其抗氧化活性，在高山离子芥细胞受到早期低温胁迫诱 导时可以降低随之产生的活性氧的积累。 2 w e s t e r n b l o t t i n g 研究结果发现，高山离子芥不具备类似于其它植物的电 子传递链末端交替氧化酶，k c n 对细胞色素氧化酶的抑制使线粒体的呼吸耗氧 完全受到抑制，而交替氧化酶抑制剂s h a m 对呼吸功能没有影响。尽管抗体检 测发现了线粒体解偶联蛋白( u c p ) 的存在，但它对增强高山离子芥的抗寒能力贡 献不大，低温诱导并不会引起u c p 蛋白的积累。因此，高山离子芥线粒体具有 特殊的能量耗散体系。 3 质膜1 4 3 3 蛋白在受到低温诱导时积累增加，表明高山离子芥跨质膜转 运调节能力增强，但是，随着低温强度的升高此调节作用受到限制。低温诱导引 起了线粒体n a d ( p ) h 氧化功能的显著升高，这种增强的n a d ( p ) h 氧化途径对 鱼藤酮的敏感性很低，表现为交替型n a d ( p ) h 脱氢酶( a t n d h ) 特征，这条交替 途径介导了重要的抗寒途径。 4 利用n m i v e p a g e 和g e l f i l t r a t i o n ，从高山离子芥线粒体中分离得到一个 兰州大学博士学位论文 具有催化n a d h ：q u i n o n e 氧化还原功能的脱氢酶复合体。该复合体由5 个亚基 组成，催化n a d h 脱氢不受鱼藤酮抑制，选择性的以泛醌类似物c o q o 为电子受 体，其中5 8 k d 亚基为催化亚基，以黄素腺苷二磷酸( f a d ) 作为辅酶， w e s t e r n - b l o t t i n g 研究发现该催化距基为硫辛酸脱氢酶2 ( l p d 2 ) ；2 6 k d 亚基为一个 小分子伴侣蛋白s h s p ，和l p d 2 发生真接的相互作用。因此，l p d 2 在高山离子 芥线粒体中以复合体形式存在，行使类似a t n d h 催化功能，小分子伴侣蛋白s h s p 可以稳定复合体组装，保证酶活性即使在低温胁迫条件下也免受损伤。 5 利用n a t i v e p a g e 从拟南芥线粒体中分离得到了一个类似于高山离子芥 l p d 脱氢酶的复合体，此复合体由5 个亚基组成，催化n a d ( p ) h ：q u i n o n e 氧化 还原反应，高选择性的以c o q 0 作为电子受体，并且以n a d p h 作为底物时的反 应速率高于对n a d h 的催化速率。m o l d i t o f 鉴定发现l p d 2 和n - 乙酰吖- 谷氨 酰磷酸还原酶( n a g p r ) 分别催化n a d h 和n a d p h 的脱氢，另外3 个亚基分别 为：苹果酸脱氢酶( m d h ) ，天冬氨酸转氨酶( a a t ) 和分子伴侣c p n 2 0 。 6 利用免疫共沉淀技术进一步验证拟南芥n a d ( p ) h ：q u i n o n e 复合体各亚 基之间的相互作用，对其组装及作用机理进行研究。n a g p r 抗体免疫沉淀研究 发现，l p d ，m d h 和c p n 2 0 可以得到共纯化，表明这些蛋白质确实可以通过 相互之间作用形成复合体。细胞免疫荧光共定位则进一步证实了这些亚基在体内 也存在类似的相互作用。因此通过蛋白质相互作用可以得到该复合体的作用机 制：线粒体n a d h ：q u i n o n e 氧化还原和节果酸天冬氨酸穿梭相偶联，其中l p d 2 和n a g p r 催化n a d ( p ) h ：q u i n o n e 氧化还原，m d h 和n a g p r 介导n a d h 通过 苹果酸天冬氨酸穿梭进入线粒体基质，直接被l p d 2 利用，这种偶联机制可能依 赖于分子伴侣c p n 2 0 。该复合体的生理功能在于催化一个双电子传递过程，避免 泛醌类自由基在线粒体中积累，对植物抵御环境胁迫，避免氧化性损伤具有重要 意义。 以上研究结果表明，高山离子芥可以在细胞水平上对冷冻胁迫作出适应性调 节。在早期冷诱导下，细胞泛醌活跃的氧化还原性调节既可以保证电子传递链的 流畅又可以稳定细胞活性氧水平，避免细胞遭受氧化性损伤。高山离子芥线粒体 能量耗散系统不同于其他植物，其特殊性表现在末端交替氧化酶的缺失，a t n d h 在抗寒过程中扮演了重要角色。l p d 2 复合体催化类似a t n d h 的反应过程，可以 兰州大学博士学位论文 和s h s p 蛋白相互作用，使l p d 2 功能得以稳定发挥，对高山离子芥抗寒具有重 要功能。拟南芥n a d ( p ) h ：q u i n o n e 氧化还原途径和苹果酸天冬氨酸穿梭偶联机 制的发现，有助于理解植物线粒体n a d ( p ) h 的消耗机制。 关键词；高山离子芥；植物线粒体；电子传递链；交替途径；抗冻；n a d ( p ) h 醌脱氢酶；n a d h 穿梭 毫i 警o 净。饕 兰州大学博士学位论文 a b s t r a c t c h o r i s p o r ab u n g e a n af i s c h & c a m e y ( cb u n g e a n a ) i sar e p r e s e n t a t i v ea l p i n e s u b n i v a lp l a n t i tm a i n l yd i s t r i b u t e si na l li c ef r e ec i r q u e ( w i t ha3 8 0 0 - 3 9 0 0 mh e i g h t a b o v es e al e v e l ) b e s i d et h eg l a c i e rn o 1i nt h es o u r c ea r e ao fu r u m q ir i v e ri n t i a n s h a nm o u n t a i n s ，x i n j i a n gp r o v i n c e , c h i n a , w h e r et h ea v e r a g et e m p e r a t u r ei s b e l o ws u b z e r od u r i n gt h eg r o w t hp e r i o df r o mj u n et os e p t e m b e r i tc a ns u r v i v eu n d e r m a n ye n v i r o n m e n t a ls t r e s s e sl i k ef r e e z i n g ，e n h a n c e du v - bi r r a d i m i o na n dl o w e r o x y g e np a r t i a lp r e s s u r e g r e a ta t t e n t i o nh a db e e np a i dt ot h ee x p l o r a t i o no f i t ss p e c i a l m e c h a n i s mt or e s i s te x t e r n a lf r e q u e n tt e m p e r a t u r ef l u c t u a t i o n sa n d f r e e z i n g t e m p e r a t u r e s p l a n tm i t o c h o n d r i ap o s s e s sm u l t i p l ee n e r g yd i s s i p a t i n gp a t h w a y sl i k e a l t e r n a t i v eo x i d a s e p a t h w a y , u n c o u p l i n gp a t h w a y a n da l t e r n a t i v e n a d ( p ) h d e h y d r o g e n a s ep a t h w a y , b u tt h ef u n c t i o no f t h e s ep a t h w a y si ncb u n g e a n ai ss t i l ln o t c l e a r t h ep r e s e n tr e s e a r c hi sf o c u so nt h ea n t i s t r e s sc h a r a c t e r i s t i co fp l a n t m i t o c h o n d r i aa n dc o l dr e s i s t a n c em e c h a n i s mo fa l t e r n a t i v ep a t h w a y si nc b u n g e a n a f u r t h e r m o r e ，w es t u d yt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nc o l dr e s i s t a n c ea n dp r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o no fa l t e m a t i v en a d ( p ) hp a t h w a y , w h i c hh e l pu st of u a h e ru n d e r s t a n dt h e a n t i f r e e z i n gm e c h a n i s mo f t h i sp a t h w a y t h er e s u l t sa sf o l l o w i n g ： r e s u l t so fh p l cf o u n dt h a tr e d o xs t a t eo fc e l l u l a ru b i q u i n o n ei sv e r ya c t i v ei n e a r l yc h i l l i n gs t r e s s c o m p a r i n gw i t h2 5 。c ，t h el e v e lo fr e d u c t i v eu b i q u i n o n ek e p t d e c r e a s i n gu n d e rd i f f e r e n tc h i l l i n gt e m p e r a t u r e m e a n w h i l e ，c h i l l i n gi n d u c t i o nc a l ln o t i m p a i rc e l la c t i v i t y s i n c em m pk e p ts t a b i l i z i n gu n d e re a r l y c h i l l i n ga n dt h e a c c u m u l a t i o no fr o sp r o d u c t i o nd i dn o tf l u c t u a t ea tt h es a m et i m e t h e s ef i n d i n g s s u g g e s t e dt h a tt h es p e c i a lm e c h a n i s mo fc h i l l i n gr e s i s t a n c ei nt h ea l p i n es u b n i v a l p l a n ti st i g h t l yl i n k e dw i t hr e d o xb a l a n c eo fi t sc e l l u l a rr e d o xm o l e c u l ea n d ，i ne a r l y c h i l l i n g ，t h er e d o xt r a n s i t i o no f u b i q u i n o n ec a nn o to n l ye n s u r et h ef l u e n c yo f e l e c t r o n t r a n s f e ri nm i t o c h o n d r i ab u ta l s of a c i l i t a t et h er e g u l a t i o no f t h ew h o l e c e l lr e d o xs t a t e s l e a d i n gt oa d a p t a t i o no f c e l l u l a rr e g u l a t i o n s ：? 鼍17 一j 萎 兰州大学博士学位论文 a c c u m u l a t i o no f1 4 - r 3 - 3p r o t e i ni np l a s m am e m b r a n ew a sv e r yp r o n o u n c e dd u r i n g c h i l l i n gb u ti t sq u i c k e ru n d e r o 。ct h a nt h a tu n d e r4 0 c ，t h i sr e g u l a t i o nu n d e r4 。cw a s p e r s i s t e n tb u tw a sl i m i t e db yl o n g - t e r m0 0 cc h i l l i n ga n d1 4 3 - 3p r o t e i n sd e c r e a s e dt o t h en o r m a ll e v e la f t e r o n e d a yo 。cc h i l l i n g m i t o c h o n d r i a l a l t e r n a t i v en a d h o x i d a t i o n s u p p l i e d m o r ee f f i c i e n t a b i l i t y t or e s i s ts e v e r ec i r c u m s t a n c e t h e e n h a n c e m e n to fr o t e n o n e - i n s e n s i t i v en a d hd e h y d r o g e n a s eu n d e r4 0 ca l s os h o w e d a l la c c u m u l a t i v ee f f e c ta n dt h er e s p o n s eu n d e r0 0 cw a sq u i k e rt h a nt h a t4 0 c ，h o w e v e r , t h i si n c r e a s ec o u l dn o tb ei m p a i r e db yp r o l o n g e d0 。cc h i l l i n g n e i t h e ra n t i b o d y s c r e e nn o ro x y g e nc o n s u m ea s s a yc o u l df i n dt h ee x i s t e n c eo fa l t e r n a t i v eo x i d a s ei n c b u n g e a n am i t o c h o n d r i a u n c o u p l i n gp r o t e i nc o u l db ef o u n db ya n t i b o d ys c r e e nb u t i td i d n tr e s p o n dt oc h i l l i n g i tw a sc o n c l u d e dt h a tp l a s m am e m b r a n ea n d m i t o c h o n d f i a la l t e r n a t i v en a d h d e h y d r o g e n a s ea c t i v e l yf u n c t i o n e dw i t hc o o p e r a t i v e o rc o m p l e m e n t a r yw a yt or e s i s tc o l ds t r e s si ncb u n g e a n a b a s e do nn a d h t e t r a z a l i u ma c t i v i t ya n dh i s t o l o g i c a ls t a i ni ng e l ，w ei s o l a t e d l p di nn a t i v es t a t ew i t hu n d e n a t u r e dp a g ef r o mt h em i t o c h o n d r i ao fc b u n g e a n a t h ef o l l o w i n gs i z e e x c l u s i o nc h r o m a t o g r a p h ya n dn a t i v e s d s p a g ea n a l y s i ss h o w e d t h a tl p df o r m e dac o m p l e xw i t ho t h e rp r o t e i n s t h i si s o l a t e dl p ds h o w e da n a d ( p ) hq u i n o n ec a t a l y s i sl i k ei t sm a m m a l i a na n a l o g ，a n dc o q 0c o u l db eu s e da s e l e c t r o na c c e p t o rw i t hh i g hs e l e c t i v i t yi nt h ec a t a l y s i so f n a d ( p ) ho x i d a t i o n e x c e p t f o rb i n d i n gw i t hf a d ，f m na l s ow a sf o u n di nt h i sc o m p l e x ，b u ti td i dn o tp a r t i c i p a t e i nt h el p dc a t a l y s i sp r o c e s sb e c a u s el o s so ff m na f t e rf u r t h e rp u r i f i c a t i o no n b n p a g ed i dn o ti m p a i rt h ee n z y m ea c t i v i t y a l s o ，a n t i b o d ys c r e e ns h o w e dt h a tt h e c o p u r i f i e d2 6 k ds u b u n i t sb e l o n g e dt os m a l lh e a t - s h o c kp r o t e i n ( s h s p ) ，w h i c hw a s f o u n dt ob ea b l et oi n t e r a c tw i t hl p d b yc o i m m u n o p r e c i p i t a t i o na s s a y , b u ti td i d n t i n v o l v ei nt h ec a t a l y s i ss i n c et h ed i s s o c i a t i o no nb n p a g er e s t o r e dt h ea c t i v i t yo f n a d ( p ) ho x i d a t i o n s ol p di ncb u n g e a n am i t o c h o n d r i ac o u l df u n c t i o na n a d ( p ) hq u i n o n eo x i d o r e d u c t i o ni nn e wf o r m a t i o nw i t hs h s pp a r t i c i p a t e di ni t ，a n d t h i sp r o c e s sm a yc o n t r i b u t et ot h er e c o v e r yo ft h eo x i d i z e dc e l l u l a ru b i q u i n o n ea n d m e d i a t es t r e s sr e s i s t a n c e 。：，呼，矿? 兰州大学博士学位论文 f u r t h e r m o r e ，b a s e do nn a t i v ei s o l a t i o no nu n d e n a t u r e dp a g e ，w eg o to n e p r o t e i nc o m p l e xf r o ma r a b i d o p s i sm i t o c h o n d r i aw h i c h m e d i a t e dan a d ( p ) hq u i n o n e o x i d o r e d u c t i o na n dm a n ys u b u n i t sw e r ei n v o l v e di ni t a f t e ri d e n t i f i c a t i o nw i t h m a l d i t o fa n de n z y m ea s s a y s ，l p da n dn a c e t y l - y g l u t a m y l p h o s p h a t er e d u c t a s e ( n a g p r lw e r f o u n dt oc a t a l y z et h eq u i n o n e d e p e n d e n tn a d ( p ) hd e h y d r o g e n a t i o n m e a n w h i l e ，m a l a t ed e b y d r o g e r m s e ( m d h ) ，a s p a r t a t ea m i n o t r a n s t e r a s e ( a a t ) a n d c h a p e r o n i n2 0 ( c p n 2 0 ) c o m b i n e d w i t ht h e mt of o r mc o m p l e x t h r o u g h i m m u n o f l u o r e s e e n c ea s s a yw ef o u n dt h a tl p d ，n a g p ra n dc p n 2 0p a r t i a l l y c o 1 0 c a t e di nt h ec e l l s f u r t h e r m o r e ，a l lo ft h e s ep r o t e i n si n t e r a c t e da n da s s e m b l e d t o g e t h e ri nv i t r o ，l p da n dc p n 2 0c o u l dc o i m m u n o p r e c i p i t a t e ( c o i p ) w i t hn a g p r f r o mt h el y s a t eo fi s o l a t e dm i t o c h o n d r i a , m d ha c t i v i t ya l s ow a sa s s a y e di nt h e e l u t i o no fc o - i p s oi tc a nb es u g g e s t e dt h a tt h e s ek n o w np r o t e i n si nm i t o c h o n d r i a l m a t r i xc o u l dc o m b i n ew i t he a c ho t h e r , w h i c hr e s u l t e di nc o u p l i n go fn a d ( p ) h q u i n o n eo x i d a t i o nw i t hn a d hi n f l u x u n d e rp h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n , l p da n d n a g p ra c t e da sc a t a l y z i n gs u b u n i t s ，t h e yc o u l dr e s p e c t i v e l yo x i d i z en a d ha n d n a d p h ，m d ha n da a tm e d i a t e dn a d hi n p u tt h r o u g hm a l a t e a s p a r t a t es h u t t l e t h e s ef i n d i n g se f f i c i e n t l yf a c i l i t a t e du st ou n d e r s t a n dt h ee x a c tm e c h a n i s mo f m i t o c h o n d r i a ln a d ( p ) ho x i d a t i o ni np l a n t k e yw o r d s ：c h o r i s p o r ab u n g e a n a ；p l a n tm i t o c h o n d r i a ；e l e c t r o nt r a n s f e r c h a i n ； a l t e r n a t i v ep a t h w a y s ；a n t i f r e e z i n g ；n a d ( p ) h ：q u i n o n ed e h y d r o g e n a s e ；n a d hs h u t t l e 原创性声明 本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立 进行研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发 表的成果、数据、观点等，均已明确注明出处。除文中已经注明 引用的内容外，不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研 成果。对本文的研究成果做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以 明确方式标明。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名： 瘴是绛 日期： 兰! 1 2 ：兰z 关于学位论文使用授权的声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属 兰州大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规定，同 意学校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许 论文被查阅和借阅；本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用任何复制手段保存和汇编本学 位论文。本人离校后发表、使用学位论文或该论文直接相关的学术论文 或成果时，第一署名单位仍然为兰州大学。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：奔垒钵导师签名：麦糍日期；汹7 t 巧 兰州大学博士学位论文 第一章研究背景及立题依据 一、冷冻胁迫与植物的适应性调节 因为植物生长的固定性，当受到环境胁迫时要么能够抵御得住胁迫得以生存 要么抵御不了胁迫而死亡。胁迫相关的外界信号包括生物因素( 例如病原体的浸 染和草食性动物) 和多种环境因素( 例如冷冻，高温，高盐，厌氧，紫外辐射和空 气污染) 。植物可以通过进化来适应环境，或者被短期的非致死性胁迫所驯化， 从而获得较强的抵御胁迫的能力，一年生植物可以通过季节性生长，在冬季来临 之前完成生殖生长逃避寒冷胁迫。 冷胁迫一般指的是温度在1 0 。c 左右，会对温暖环境生长的植物造成胁迫。 冷胁迫可以导致冷敏感植物细胞膜的伤害，引起细胞离子的释放，光合作用效率 和呼吸作用a t p 产量下降，叶子受损萎蔫。冷敏感植物含有高比例的饱和脂肪 酸，膜的损伤可以直接导致膜的流动性降低以至于丧失功能。冻胁迫主要是指温 度降低至冰点，引起细胞内冰晶产生，从而损伤细胞结构。冷冻首先引起冰晶在 细胞壁和胞间产生，随着冰晶的生长逐渐扩展至细胞质。当细胞温度降低至临界 温度时，胞内液体水分处于过冷状态，冰晶的形成来自于过冷水向固体状态的转 变，细胞壁水分一旦完全结冰，胞内温度再次开始下降，冰晶向细胞内扩展，对 细胞造成机械损伤，细胞被破坏。因此，在植物受到冷冻胁迫时，控制胞内水分 相变温度对植物避免冷冻伤害具有重要的意义。许多植物之所以耐冷，主要是因 为它们能够抵抗胞内水分的深度过冷作用，在阔叶木材当中比较多见，有些过冷 温度甚至可以降低至一3 5 。c ，一旦温度低于- 4 0 0 c ，冰晶的形成将变成一个完全的 自发过程，当温度达到一3 至- 5 0 c 时，细胞壁水分形成冰晶，随着温度的持续降 低胞内水分被拖出来以满足冰晶的生长，这些植物胞自j 距比较大，能够满足冰晶 在细胞外生长而胞质及细胞膜组分不受物理机械力损伤( g e o 唱e e t a t , 1 9 7 4 ) 。草本 植物最常采用的忍耐策略就是抵抗细胞内水分的丧失。对农作物来说，因为土壤 冰点恰恰接近0 0 c ，是极佳的冰核，因此试图通过阻止晶核的形成来防止冻害不 大可能。冬小麦叶片原生质体能够积累冰核形成蛋白和抑制冰晶形成蛋白这两种 蛋白来影响冰晶生长模式，因此使结冰过程从一个无序状态转变为一个可控制的 兰州大学博士学位论文 过程( p e a r c e ，1 9 8 8 ) 。 冷冻胁迫可以引起一系列的细胞调节过程。外界冷冻刺激通过改变基因调 控，细胞代谢和积累抗性分子来实现细胞调控。c b f ( c r t d r eb i n d i n gf a c t o r ) 是 低温信号转导途径中一个感受冷信号的转录因子，调节下游的冷诱导基因的表 达，拟南芥c b f 家族包括c b f i ，c b f 2 和c b f 3 ，转基因研究发现，三者均可 以促进c o r ( c o l dr e s p o n s i v e ) 基因的表达，转基因植株的抗冻性和抗旱能力增强 ( a r t u se t a l ，1 9 9 6 ；s t e p p o n k u se t a l ，1 9 9 8 ) 。抗冻蛋白是一类能够降低溶液冰点而对 熔点影响甚微的蛋白，具有能够结合冰晶并调节冰晶生长形状，抑制重结晶的功 能。在高浓度下可以导致热滞作用，降低溶液的冰点温度而不改变其融化温度； 低浓度的抗冻蛋白可以抑制冰的重结晶，避免因为温度在冰点上下波动对植物细 胞的损伤，避免重结晶过程中小冰晶持续变大对细胞的损伤。尽管在从极区鱼到 昆虫，细菌以及高等植物当中均发现有抗冻蛋白的报道，植物抗冻蛋白的热滞活 性并不明显，因此，在植物中抗冻蛋白的存在主要是抑制冰的重结晶，这对避免 因为温度在冰点附近剧烈波动对植物细胞的损伤具有重要意义( a n t i k a i n e na n d g r i f f i t h ，1 9 9 7 ；h o ne ta l , 1 9 9 4 ) 。 在抗冻锻炼过程中，植物体的代谢发生显著变化，结果导致代谢产物水平和 酶活性的改变。因此有观点认为冷冻抵抗和特殊的代谢产物积累有关，这些代谢 产物做为冷冻保护剂存在使细胞在反复冻融过程中免受伤害。可溶性糖组分和淀 粉储备在冷诱导下发生显著变化。随着持续的低温诱导，白菜叶子中蔗糖，葡萄 糖和果糖的含量逐渐增自1 ( s a s a k ie ta l ，1 9 9 6 ) 。而在苜蓿的研究却发现，抗冷品种 和冷敏感品种的差异主要在于低聚糖如三糖和四糖的积累而和蔗糖的水平变化 不相关( c a s t o n g u a ye l a , 1 9 9 5 ) 。冷冻锻炼引起渗透浓度增加。渗透势的变化是因 为糖类的积累，而糖分的积累和抗冻能力密切相关，它的功能主要体现在以下方 面：降低组织冰点，作为营养物质和能量储备，抵抗失水状态下膜功能的改变， 作为细胞保护剂防止蛋白质结构改变和功能丧失i n c h ae t a t , 1 9 9 6 ) 。同时，冷驯 化促使组织失水的同时积累淀粉，这样可以最大限度的抵制冰晶形成对细胞的损 伤。脂类在受到冷冻处理时不饱和程度明显升高( l y n c ha n ds t e p o n k u s ，1 9 8 7 ； s t e p o n k u s ，1 9 8 4 ) 。拟南芥受到冷诱导时，磷脂在所以脂类的比例从4 6 8 上升至 2 兰州大学博士学位论文 5 7 1 而磷脂的种类并未发生变化，尽管磷酸卵磷脂和磷脂酰乙醇胺的双不饱和 脂肪酸的比例升高，但是单不饱和脂肪酸仍然占主导地位( u e m u r ae la l , 1 9 9 5 ) 。 抗冻能力的获得可能来自生长调节物质a b a 的诱导。未经过a b a 诱导的莲花 愈伤组织在零下温度处理时很快失活，而经过a b a 前处理的在温度下降至- 8 0 c 时依然生长旺盛( k e _ i t ha n dm e k e r s i e ，1 9 8 6 ) 。钙离子和蛋白质磷酸化，或者两种 作用的偶联植物获得抗冻能力具有重要的作用，冷休克可以引起细胞游离钙离子 的突然增加，钙离子的内流扮演了重要的角色而且一个钙离子库参与了这一过程 ( k n i g h te la l ，1 9 9 6 ) 。化学处理抑制钙离子通道，拮抗钙离子作用或者抑制蛋白质 激酶活性显著的抑制了细胞获得抗冻性的能力( m o n r o ye ta l ，1 9 9 3 ) 。钙离子载体 的添加在2 5 0 c 下可以诱导两种冷驯化特异性基因的表达( m o n r o ya n dd h i n d s a , 1 9 9 5 ) 。 冷冻诱导的膜损伤主要体现在膜张力的丧失，电解质和水分的外渗。利用原 生质体的研究显示，因为细胞的破裂，冷冻损伤继而引起膜半透性的彻底丧失 ( s t e p o n k u s ，1 9 8 4 ) 。冷冻处理引起洋葱细胞水分丧失和电解质外渗之后，依然能 够发生质壁分离，胞质活动和醋酸荧光素染色。这些结果表明，冷冻胁迫的早期 事件是膜转运和膜半透性的细微调节而非细胞破碎。深入的研究发现，k 在恢复 期流入细胞，需要活性的 r a t p a s e 的参与，k 离子的回流伴随着水分重新进入 细胞，组织失水症状消失( p a l ma n dl i ，1 9 s 0 ) 。因此，有人认为亚致死冷冻胁迫引 起的膜转运性质的变化特异性的和仃一a t p a s e 相关( a r o r aa n dp a l t a , 1 9 9 1 ) 。 致死性冻融伤害可以引起过氧化物和丙二醛水平的升高，同时抗氧化剂的水 平下降，谷胱甘肽还原异构酶动力学特性发生改变( l o u b a r e s s ee la l , 1 9 9 1 ； h a n s l a d e na n da l s c h e r , 19 9 4 a ；h a n s l a d e na n da l s c h g r , 1 9 9 4 b ) 。因此有观点认为， 冷冻损伤导致的共同结果都来源于氧化性损伤，因此控制来自冷冻胁迫所导致的 氧化性胁迫造成的危害是增强抗冻能力的重要策略( k e n d a l la n dm c k e r s i e 1 9 8 9 ) 。无论氧化胁迫是冷冻胁迫的初始应答还是次级应答，耐冷能力均能够通 过遗传操作改进抗氧化防御机制得到改善。超量表达m n s o d 的转基因苜蓿的抗 冷能力得到增强，子代中获得该基因稳定遗传的部分耐冷性大大改善( m c k e r s i e e a l , 1 9 9 3 ) 。 “：警，j 孝 兰州大学博士学位论文 二、逆境胁迫与活性氧的关系 r o s 包括超氧阴离子自由基( 0 2 3 、羟自由基( h o ) 、过氧自由基( r o o ，) 、过 氧化氢( h 2 0 2 ) 、单线态氧( 1 0 2 ) 等。r o s 在机体的产生和清除处于动态平衡。一方 面，它们参与许多重要的生理、生化过程如细胞信号传导、基因转录、细胞增殖 分化等，是生命活动不可缺少的。另一方面，r o s 产生过多或者机体内的抗氧 化防御体系不能对抗过量的r o s ，机体就处于氧化应激状态。r o s 就会进攻生 物大分子如膜脂质、d n a 、蛋白质，导致生物大分子的氧化性损伤。r o s 引发 的生物膜( 质膜、线粒体膜、内质网膜) 不饱和脂肪酸氧化会造成膜的迅速破坏， 改变镶嵌于膜系统上的许多酶空间构型，膜的孔隙扩大，通透性增加。r o s 对 d n a 分子氧化性损伤可导致脱氧核糖和核苷酸碱基修饰、双链断裂，受损的d n a 进行复制。 多种环境胁迫信号需要通过r o s 进行胞内信号传递继而引起植物体的应答 反应。因此，r o s 被认为是环境胁迫的第二信使。然而，r o s 本身具有两面性， 一旦积累超出机体的清除能力，细胞即遭受氧化胁迫，活性氧自由基直接作用于 细胞及其生物大分子物质，导致细胞功能受损。温和缺水( 1 3 m p a ) b 起豌豆细 胞丙二醛( m d a ) ，玉米素的积累，同时细胞超氧化物歧化酶( s o d ) i 拘活性升高， 随着缺水强度的升高( 一1 9 m p a ) ，细胞光合作用完全受到抑制。叶绿素含量下降， 叶黄素，胡萝h 素等的含量也大大下降，从而导致了紫黄质向玉米素的转变，因 此光合作用元件受到破坏。由此产生的直接结果是催化性铁离子，m d a 和氧化 蛋白的含量随之升高，细胞处于氧化胁迫状态之下( i t u r b e o r m a e t x ee t a l 1 9 9 8 ) 。 活性氧的产生是缺氧特别是再复氧过程中的主要特征，其中过氧化氢和超氧 阴离子在很多细胞反应包括铁离子催化的f e n t o n 反应和过氧化物酶催化过程中 产生。由此产生的活性氧对多种细胞组分包括脂类( 膜质不饱和脂肪酸的过氧 化) ，蛋白质( 变性) ，碳化合物和核酸造成损伤，但损伤程度主要取决于物种特异 性，因为不同的物种含有的抗氧化剂的含量有差异，抗氧化系统对缺氧损伤的抵 抗能力不同。但是，长期的缺氧造成的抗氧化剂的状态与其它两种胁迫的差异较 大，抗氧化剂的大量增加并不能显著的增强抗氧化防御能力，其作用范围有限 ( b l o k h i n ae ta l ，2 0 0 3 ) 。 4 i ，甍；铂i 兰州大学博士学位论文 在冷敏感植物中，冷冻胁迫可以导致氧化性损伤，经过冷驯化的植物则可以 通过增强自身的抗氧化能力来提高抗寒性。玉米植株受到4 。c 处理后存活不会超 过7 天，但是经过1 4 。c 锻炼3 天以后的植株存活率达到6 9 ，0 1 m m h 2 0 2 在2 7 。c 预处理4 小时或者a b a 处理2 4 小时可以达到同样的存活效果。研究发现，n 2 0 2 在这期间行使双元作用：冷诱导初期，瞬间积累导致信号传递至抗氧化酶例如过 氧化氢酶和过氧化物酶来清除h 2 0 2 ；在没有经过预处理或者抗冻锻炼的植株当 中，因为抗氧化剂能力的限制导致了h 2 0 2 在体内积累至破坏性水平，而经过h 2 0 2 和a b a 前处理的植株产生了对寒冷环境的抗性。尽管冷处理可以损伤呼吸功能， 抑制电子传递的细胞色素c 氧化酶( c y t o c h r o m eco x i d a s e ，c o x ) 途径和a t p a s e 活 性，但经过预处理的植株其线粒体过氧化氢酶3 和过氧化物酶的活性升高至对照 的好几倍，抗氧化酶活性的升高意味着线粒体受到氧化胁迫时可以启动线粒体保 护机制( a l i s o n e ta l , 2 0 0 5 ) 。 在哺乳动物的研究中发现，线粒体基因组的稳定需要正常的细胞能量代谢。 线粒体呼吸产生的活性氧可以直接损伤线粒体d n a ，诱发神经退行性疾病，癌 症和衰老。m t d n a 的