（植物学专业论文）蛋白激酶c参与调控青杆花粉管的极性生长.pdf

蛋白激酶c 参与调控青杆花粉管的极性生长 摘要 细胞质中蛋白质可逆磷酸化，即蛋白质的磷酸化与去磷酸化是 调节酶活性的两个主要翻译后反映，是细胞内普遍存在的生理调节反 应，并广泛参与细胞内各种生理过程。近年来，在动物细胞和酵母的 研究中表明，蛋白激酶c 主要是通过调节钙通道活性、微丝骨架和 细胞壁建成等方面调控细胞的形态建成，如极性生长，但有关蛋白激 酶c 在花粉管极性生长过程中的作用机理却鲜为报道。本实验中， 利用花粉的离体培养和最佳培养基的筛选及其统计学分析、透射电镜 观察、蛋自免疫印迹、免疫荧光标记以及显微红外光谱分析等技术， 我们研究了蛋白激酶c 抑制剂b i s i n d o l y m a l e i m i d e ( b i m ) 对裸子植物 青杆( p c i e aw i l s o n i im a s t ) 花粉萌发、花粉管生长速率、花粉管形 态、花粉管超微结构、微丝骨架以及细胞壁成分等方面的影响，旨在 从细胞水平上探讨蛋白激酶c 在花粉管极性生长模式的建立和维持 中的作用。主要研究结果如下： 1 根据对青杆花粉萌发率和生长状况的观察统计，确定了离体 花粉萌发和生长的优化条件，其培养基的蔗糖、硼酸和氯化钙的最适 含量分别为：1 2 ，0 0 2 和0 0 3 。 2 应用免疫印迹技术，我们利用单克隆抗p k c 抗体在青杆花粉 管的蛋白提取物中检测出了一条5 5k d a 的蛋白条带，证明了p k c 确 实存在于青杆花粉管中，相比之下，p k c 抑制剂b i m 处理导致花粉 管中p k c 含量在降低。p k c 的活力测定进一步证实了免疫印迹结果。 3 f l u o - 3 a m 标记结果表明对照花粉管顶端普遍存在一个极陡 的c a 2 + 梯度，而b i m 处理后c a 2 + 梯度受到破坏，说明p k c 调控花粉 管生长过程中胞外c a 2 + 的内流，并参与维持花粉管顶端的c a 2 + 梯度， 显示了在调节花粉管生长过程中对c a 2 + 信号调节的重要性。 4 应用f i t c 标记的鬼笔环肽染色显示，我们发现在对照花粉 管中束状微丝以与长轴平行的方向从花粉粒一直延伸到花粉管亚顶 端，而花粉管顶端微丝的分布成不规则状。b i m 处理导致微丝发生解 聚，且解聚状态依赖于生长受抑制的程度，通常抑制生长越严重，微 丝解聚程度越高。 5 透射电镜观察发现，在对照组的花粉管中，细胞器呈极性分 布，顶端有明显的分泌囊泡透明区；而b i m 处理导致花粉管中细胞 器极性分布模式破坏，顶端分泌囊泡的数量减少，透明区消失，液泡 大量聚集在顶端，并导致高尔基体解体和线粒体膜膨胀。这些结果充 分地说明了抑制剂处理破坏了花粉管的分泌系统。 6 利用单克隆抗体j i m 5 和j i m 7 ，我们发现对照花粉管中酯化 果胶主要聚集于花粉管项端，而酸性果胶则主要分布在花粉管两侧 壁。荧光标记结果表明正常青杆花粉管中纤维素和胼胝质在整个花粉 管壁上均有分布。而b i m 处理明显导致花粉管壁上的酸性果胶、酯 化果胶和纤维素含量下降以及胼胝质在花粉管顶端的沉积。此外，我 们还利用f t i r 技术进一步分析了b i m 处理对花粉管壁的组分变化， 实验结果再次表明b i m 处理导致花粉管壁果胶组分的含量大量下降， 使得花粉管壁的结构随之变得疏松，破坏了细胞壁的正常构建。 综上所述，我们可以认为，p k c 通过( 1 ) 调节质膜c a 2 + 通道活 性参与维持花粉管顶端的c a 2 + 梯度；( 2 ) 磷酸化微丝结合蛋白调节微 丝骨架的组装来保证正常的分泌系统的运转和细胞壁的构建，因此 p k c 在青杆花粉萌发、花粉管的极性生长起着重要的作用。我们的 结果为蛋白激酶c 抑制剂破坏花粉管极性生长模式的机制提供了新 的思路和证据。 关键词：青杆，花粉管，蛋白激酶c ，超微结构，细胞壁 p r o t e vk i n a s eci si n v o l v e di nr e g u l a t i n g p o l a r i z e dg r o w t ho fp o l l e nt u b e 烈p c i e aw i l s o n i i a b s t r a c t r e v e r s i b l e p r o t e i np h o s p h o r y l a t i o n i n c y t o p l a s m i sc e n t r a l p a s t - t r a n s l a t i o n r e a c t i o no fr e g u l a t i n g a c t i v i t y o fe n z y m e sa n di s u b i q u i t o u s i n v o l v e di nv a r i o u s p h y s i o l o g i c a lp r o c e s s e s r e e e n t l n r e s e a r c ho na n i m a lc e l la n dy e a s ts h o wt h a tp r o t e i nk i n a s ec ( p k c ) r e g u l a t e sf o r m a t i o no fc e l lm o r p h o l o g ys u c ha sp o l a r i z e dg r o w t hv i a c a l c i u mc h a n n e l s ，a c t i ns k e l e t o na n dc e l lw a l le t c h o w e v e r , t h e r ea r ef e w r e p o r t sc o n c e r n i n gt h em e c h a n i s mo fp k cr e g u l a t i n gp o l a r i z e dg r o w t ho f p o l l e n t u b e i nt h e p r e s e n ts t u d y , t h ee f f e c t s o fb i mo np o l l e n g e r m i n a t i o na n dt u b eg r o w t h ，u l t r a s t m c t u r e ，a c t l ns k e l e t o na n dc e l lw a l l w e r es t u d i e d u s i n g s t a t i s t i c a n a l y s i s ，u l t r a s t r u c t u r eo b s e r v a t i o n , i m m u n o f l u o r e s c e n tl a b e l i n g ，a sw e l la sf t i ra n a l y s i s t h em a i nr e s u l t s o b t a i n e df x o mt h ee x p e r i m e n tw e r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 b a s e do no b s e r v a t i o na n ds t a t i s t i ca n a l y s i so f p o l l e ng e r m i n a t i o n r a t ea n dt u b e g r o w t h , w eo p t i m i z e d c u l t u r em e d i u mo fp o l l e n d e v e l o p m e n ti nv i t r o ：1 2 s u c r o s e ，0 0 2 b o r o na n d0 0 3 c a l c i u m 2 u s i n gw e s t e r ni m m u n o b l o t t i n g ，w ed e t e c t e da5 5 k d ap e p t i d eb y m o n o c l o n a la n t i b o d ya n dc o n f i r m e dt h a tp k cw a sp r e s e n ti np i c e a w i l s o n i im a s t i nc o n t r a s t t r e a t m e n tw i mb i mp r e v e n t st h e s t r o n g a c c u m u l a t i o no fp k ci np o l l e nt u b e s t h ea c t i v i t ya s s a y so fp k cf u r 也e r c o n f i r m e dt h er e s u l to fw e s t e r ni m m u n o b l o t t i n g ，3 f l u o r e s c e n tl a b e l i n gw i t hf l u o - 3 a mr e v e a l e dm a tc o n t r o lt u b e s o fp w i l s o n i id i s p l a y e dat y p i c a lt i p f o c u s e dc y t o s o l i cf r e ec a 2 + g r a d i e n t w h i c hw a sd i s t u r b e db yb i m t r e a t m e n t ，i n d i c a t i n gt h a tp k c i si n v o l v e d i nr e g u l a t i n gc a 2 + i n f l u xa n ds u s t a i nc a 2 + g r a d i e n ti nt i pz o n e 4 f l u o r e s c e n tl a b e l i n gw i t l lf i t c - p h a l l o i d i ns h o w e dad e n s ea r r a y o ff m ef i l a m e n t s ，a n daf e wt l l i c kb u n d l e so ff i l a m e n t se x t e n d e da l o n gt h e l e n g t ho f t h ep o l l e nt u b eb e y o n dt h ec o l l a ri n t ot h ea p e x i nt h ep r e s e n c e i v o fb i m ，t h eo r g a n i z a t i o no ff i l a m e n t sw a so b v i o u s l yd i s t u r b e d ，r e s u l t i n g i nam e s h w o r ko fs h o r ta c t i nf i l a m e n t s 5 t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y ( t 鼢田r e v e a l e dt h a tt h e r e e x i s t saz o n ef i l l e dw i t hn u m e r o u ss e c r e t o r yv e s i c l e sa t 也ee x t r e m ea p i c a l z o n eo fp o l l e nt u b eg r o w i n gi nc o n t r o lm e d i u m b i mi n d u c e ds h a r p d e c l i n ei nt h en u m b e ro fs e c r e t o r yv e s i c l e sa n dt h ei n c r e a s eo fv a c u o l e i n a d d i t i o n ，t h eg o l g ia p p a r a t u sd i s i n t e g r a t e da n dm i t o c h o n d r i am e m b r a n e s s w e l l e d ，i n d i c a t i n gt h a tt h es e c r e t o r ys y s t e mw a si n t e r f e r e d 6 u s i n gm o n o c l o n a la n t i b o d yj i m 5a n d 姗，w ef o u n dt h a t e s t e r i f i e dp e c t i nw a sl i m i t e dt ot h eg r o w i n g a p e xi np o l l e nt u b e sw h e r e a s a c i d i cp e c t i nw a sd e p o s i t e da l o n gt h et u b e ，e x c e p ti nt h ea p i c a lr e g i o n f l u o r e s c e n c el a b e l i n gd e m o n s t r a t e dt h ep r e s e n c eo fc a l l o s ea n dc e l l u l o s e i nt h ea p e xa n da l o n gt h ee n t i r ef l a n k so fc o n t r o lp o l l e nt u b e s h o w e v e r , b i mt r e a t m e n ti n d u c e dt h ed e c r e a s eo fe s t e r i f i e dp e c t i n , a c i d i cp e c t i n ， c e l l u l o s ea n dd e p o s i t i o no fc a l l o s ei nt i pz o n e 1 1 1 ed e c l i n eo fc e l lw a l l c o m p o n e n t sr e s p o n d e d t ob i mt r e a t m e n tw a sc o n f i r m e db yf t i r a n a l y s i s ，t h u sd e m o n s t r a t i n gt h a ti n h i b i t o ri n d u c e dw e a k e n i n go fc e l l w a l l sa n dt h e nt h ec o n s t m c t i o nw a sd i s t u r b e d t a k e nt o g e t h e r , t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a tp k cm a y p a r t i c i p a t ei nt h e r e g u l a t i o no fc y t o p l a s m i cc a l c i u m ( c 矿) g r a d i e n ta n dt h eo r g a n i z a t i o no f a c t i n ，i ns e c r e t o r ys y s t e ma sw e l la st h eb i o s y n t h e s i so fe e l lw a l l c o m p o n e n t s ，a l lp r o c e s s e st h a to c c u ri nt h et i pr e g i o no fp o l l e nt u b e s ， p r o v i d i n gam e c h a n i s t i cf r a m e w o r kf o rt h ef u n c t i o n so fp k ci nt h et i p g r o w t ho f p o l l e nt u b e s k e yw o r d s ：p i c e aw i l s o n i i i ，p o l l e nt u b e ，p k c ，u l t r a s t m c t u r e ，c e l lw a l l v 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人 或其他机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做 的贡献均已在论文中作了明确的声明并表示了谢意。 研究生签名：田絮士辜 日期：2 一，) ；- 口 。 学位论文使用授权声明 本人完全了解浙江师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩 印或扫描等手段保存、汇编学位论文。同意浙江师范大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播论文的全部或部分内容。保密的学位论文在解密后遵守此协议。 研究生签名：i 召爹士享导师签名：? ( 爱泸期：乒。n 7 ) 7 牙 j r ，1 hv i 。， 1 1 前言 研究背景 细胞质中蛋白质可逆磷酸化( r e v e r s i b l ep r o t e i np h o s p h o r y l a t i o n ) ，即蛋白质 的磷酸化与去磷酸化是调节酶活性的两个主要翻译后反映，是细胞内普遍存在 的、一种共价修饰的生理调节反应，它几乎涉及所有的生理及病理过程，如代谢、 细胞的生长发育、神经递质的合成与释放、甚至癌变等【”】。而且许多比较复杂 的信号转导系统都牵涉到瀑布式的由多个蛋白激酶所催化的磷酸化反应，使一开 始接到的信号得到放大。另外，由于某些蛋白激酶处于不同信号转导路线的交叉 点上，因而可以建立起信号转导网络，以便于细胞协调对各种信息的反应。蛋白 质磷酸化反应是由蛋白激酶催化的把a t p 或g r p r 位的磷酸基转移到蛋白质底物 氨基酸残基上的过程。蛋白质的磷酸化在信号转导中所起的无可替代的作用已经 是人所共知的事实，负责蛋白质磷酸化的蛋白激酶的作用也早己受到了广泛的重 视1 4 】。 几乎所有的蛋白激酶都属于同一个大的蛋白激酶家族。对蛋白激酶超家族的 分类并没有统一的标准，最为普遍的分类方法是根据底物蛋白质被磷酸化的氨基 酸残基的种判矶，包括：( 1 ) 酪氨酸型蛋白激酶，被磷酸化的是底物的酪氨酸残 基。( 2 ) 可以使底物蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化的丝氨酸苏氨酸型蛋 白激酶，即蛋白激酶c ，是最早被确认的蛋白激酶之一。i n o u e 等旧在1 9 7 7 年首 先将大鼠脑组织中的蛋白激酶确认为p k c ，发现它具有组蛋白激酶活性，并能 被限制性蛋白水解酶所激活。以往我们对于蛋白激酶的了解绝大部分来自动物和 酵母。植物中蛋白激酶的研究工作一直到1 9 8 9 年p a u e k 等【7 】人利用抗体检测技 术发现了第一个植物p 3 4 甜吐的相似蛋白之后才逐渐得以重视，而发现的蛋白 激酶的数量也远远少于动物和酵母。但在酵母和动物蛋白激酶研究的基础上，植 物蛋白激酶的研究己取得了很大的进展，特别是对蛋白激酶c 的研究一直是一 个非常活跃的领域，不断有新的有关终述总结这方面的研究成果【4 o ，9 埘。植物 蛋白激酶c 的研究为了解植物生长发育的机理提供了新的手段，也开创了植物分 子生物学新的领域。可以预见，随着植物分子生物学的进一步发展和人们对蛋白 激酶c 作用的越来越重视，蛋白激酶c 在植物生长和发育的功能将得到更加深入 的了解。本章在前人工作的基础上系统地介绍了蛋白激酶c 及其在花粉管极性生 长中的作用。 1 2 蛋白激酶c ( p r o t e i nk i n a s ec ，p k c ) 概述 1 2 1 蛋白激酶c ( p r o t e i nk i n a s ec ，p k c ) 的种类与结构 p k c 自2 0 世纪7 0 年代末发现以来，对其理化性质进行了非常深入的研究， 并取得很多重要的成果。起初仅知道p k c 是一种依赖于c a 2 + 和磷脂的蛋白激酶 【i l 】，后来发现二酯酰甘油( d i a c y l 甜y c e r 0 1 ，d a g ) 也参与p k c 的活性调节，其作用 是可以提高p k c 与c a 2 + 和磷脂的亲和力，使之在c a 2 + 的生理浓度( 1 矿m 左右) 条件下就可被激活【j 2 j 13 1 。首先介绍p k c 的种类与结构。 p k c 是由一个大基因家族编码的一类钙、磷脂依赖性磷酸化酶，广泛存在 于动物、微生物等有机体内，并分布在几乎所有的组织和器官中。迄今为止，已 分离、鉴定十三种p k c 的亚型，根据p k c 同工酶的结构、特性、激动剂等的不 同将其分为三大类【1 4 】( 表1 - 1 ) ： 1 ) 经典p k c ( c l a s s i c a lp k c s ，c p k c ) ，包含a 、pi 、p i i 和y 亚型；c p k c 可以被 c a 2 + 、二酯酰甘( d i a c y l g l y c e r o l - d a g ) 、磷脂酰丝氨酸( p h o s p h a t i d y l s e r i n e ， p s ) 、肿瘤促进剂佛波醇酯( p h o r b o le s t e r ，t e a ) 激活，溶血磷脂酸胆碱( l y s op c ) 具有部分激活作用： 2 ) 新型p k c ( n o v e l p k c s ，n p k c ) ，包含6 、t 1 、e 和亚型；n p k c 不含c a 2 + 结合位点，不能被c a ”激活，但可被d a g 、p s 、t p a 、l y s op c 激活； 3 ) 非典型p k c ( a t y p i c a lp k c s ，a p k c ) ，包含们，、 3 0 0 k d a s i g m a 产品) 粘附在载玻片上，在激光共聚焦显微镜( b i o r a d ，u s a , m r c l 0 2 ) ， 用4 8 8n r n 对样品进行扫描，发射波长5 1 5 n m 采集图象，记录及花粉管细胞质中 钙离子的分布情况。每个实验重复三次。 2 4 6 荧光标记花粉管中的微丝骨架 培养1 8 h 的花粉管( 对照和处理) 在新鲜配制的4 多聚甲醛( 5 0 m m o l l p i p e s 缓冲液，p h6 9 配制) 固定1 h ，固定时同时抽气3 5m i n 。用5 0 m m o l l p i p e s 缓冲液彻底清洗后三次，以含有1 t d t o nx 1 0 0 的p b s ( p h7 2 ) 抽提1 h 。然 后用含有l m g m ln a b h 4 的p b s 处理1 5 r a i n ，以去除醛基产生的荧光。经清洗后， 加f i t c 标记鬼笔环肽( 1 ：1 0 0 稀释母液，最终浓度l r t m ) ，室温孵育2 - 3 h 后清 洗、封片，并置共聚焦显微镜下观察，激发波长4 8 8 n m 。每个样品去2 0 5 0 个木 同光切面扫描，最后将所有光切面的图象叠加成像。 2 4 7 电镜观察花粉管的超微结构 对照和4 1 t m b i m 处理的花粉管培养2 0 h 后，过滤去除培养基，p b s ( 0 i mp b s 配制，p h 7 2 ) 清洗3 次后，以预冷的含2 5 戊二醛( o 1 m 磷酸缓冲液p h7 2 ， 另加2 多聚甲醛) 固定材料2 h 。经p b s ( 0 1 mp b s 配制，p h 7 2 ) 清洗3 次后 ( 每次1 0 r a i n ) ，用1 锇酸( o 1 mp b s 配制，p h 7 2 ) 再固定2 h 样品用系列 乙醇冲洗，环氧丙烷过渡，e p o n 8 1 2 树脂包埋，热聚合。用l k b v 切片机切 片，切片厚度为7 0 n m ，以5 0 目铜网捞取。染色后在j e m 1 2 3 0 电子显微镜( j e o l l t d t o k y o ，j a p a n ) 下观察、拍照。 2 4 8 花粉管细胞壁成分的标记 2 4 8 1 免疫化学标记果胶质 果胶质标记主要参照l i ( 1 9 9 7 ) 等人【”】的方法，并略做修改，具体操作过程 简述如下：将培养1 8 h 后的花粉管( 对照和处理) 低速离心滤去培养基，用含 3 多聚甲醛的p v i e 缓冲液固定3 0 m i n ，滤去固定液，用p m e 缓冲液及p b s ( p h 7 2 ) 洗3 次。识别多聚半乳蓿醛酸决定簇( 即酸性果胶质) 的单克隆抗体j i m 5 和识别甲酯化果胶决定簇的单克隆抗体j i m 7 由清华大学细胞与发育生物学教研 室李一勤教授馈赠。j i m 5 和j i m 7 均用p b s 以l ：5 的比例稀释，与样品在室温 下共育2 5h 。阴性对照不加一抗，将萌发的花粉悬浮于p b s 中。离心机离心滤 去一抗后样品，用p b s 洗3 次，然后与结合f i t ( 的二抗( 1 ：1 0 0 稀释于p b s 中) 在室温下共育2 h 。用p b s 洗3 次后，在激光共聚焦扫描显微镜( 1 3 i o r a d ， u s a ，m r c l 0 2 4 ，k r a r 激光，激发波长4 8 8 n m ，发射波长5 2 2 n m ) 。每个样品取 1 5 - 2 6 个光学切面，间距为0 9 1 2 6 m n ，然后将所有光切面的图象叠加成像。 2 4 8 2 荧光标记纤维素 根据l a z z a r o ( 2 0 0 3 ) 等人t 7 6 1 的方法。花粉管( 对照和处理) 培养i g h 后，过 滤收集花粉管，并以p m e 缓冲液冲洗，然后以新鲜配制的4 多聚甲醛( 5 0 r n m o l l p i p e s 缓冲液，p h7 2 配制) 固定3 0 m i n 。经过固定的样品用p m e 缓冲液冲洗 三次( 每次约1 5 m i n ) ，以去除残留在花粉管中的多聚甲醛。临用前将荧光增白 剂c a l c o f l u o rw h i t em 2 r 储备溶液于1 4 0 0 0 9 离心5 m i n ，取上清液与培养液按1 ： 1 0 混匀，暗中孵育4 5 分钟，然后用p v i e 缓冲液冲洗三次( 每次约1 5 r a i n ) ，以 去除残留在花粉管中的荧光增白剂。经过彻底清洗后，取适量花粉管于载波片上， 在荧光显微镜( a x i o s k o p4 0 ，z e i s s ，g e r m a n y ) 下激发波长4 3 6 n m ，发射波长5 2 0 n m 观察、拍照。 2 a 8 3 荧光标记胼胝质 经过低速( 5 0 0r p m ) 离心后，收集培养1 8 h 的花粉管( 对照和处理) 再用 正常培养基洗3 次，用3 多聚甲醛室温固定3 0r a i n ，p b s ( p n7 2 ) 洗三次后， 用o 1 水溶性苯胺蓝染色，激光扫描共聚焦显微镜观察( b i o r a d ，u s a , m r c l 0 2 4 ) ，k r a r 激光，激发波长5 1 4n l n ，发射波长5 8 5 n m ，每个样品取1 5 2 0 个光学切面，间距为1 - 2 5 l a i n ，然后将所有光切面的图象叠加成像。 2 4 8 4 显微红外光谱分析 花粉管的显微红外光谱分析按照s h e n g 等( 2 0 0 6 ) 5 8 1 并略做修改，具体操作过 程如下：取不同的培养基中培养2 0 h 的花粉管，滤去培养基，先用p b s 洗3 次， 再用双蒸水洗3 次。清洗干净后的样品置于b a f 2 晶片上，置6 0 c 烘箱中干燥。 红外光谱分析在北京大学化学分析测试中心进行，采用m a g n a 7 5 0f t i r 光谱 仪( n i c o l e tc o r p o r a t i o n , t o k y o ，j a p a n ) ，配备同一公司的显微镜，m c t 检测器， 光谱分辨率8e m ，测量范围2 0 0 0 8 0 0c m 1 ，扫描次数1 2 8 次。 三实验结果与分析 3 1 青杆花粉培养基的优化选择 青杆花粉的萌发对培养基中蔗糖浓度有较为严格的要求，并有明显的域值效 应。如果蔗糖浓度低于1 0 ，花粉壁破裂，花粉中的内容物被析出，从而导致花 粉失去生活力( 图3 一l e ) ；如高于1 8 ，则花粉不能萌发。通过试验表明，1 2 的蔗糖浓度对青杆花粉的离体培养较为适宜。 图3 1 不同培养条件下生长的花粉菅 f i g 3 - 1p o l l e nt u b e sc u l t u r e di nd i f f e r e n tm e d i u mb a r f f i l 0 0 p mf o ra a n db a n d5 0 u r nf o rc f 青杆花粉的萌发对硼反应敏感，当培养基中缺硼时，花粉的萌发率较低，仅 为2 9 1 ( 图3 一l b ) ，花粉管的生长速率较慢，同时花粉管的形态也发生异常( 图 3 一ld f ) 。在培养基中加入0 0 1 浓度的硼酸时，能显著促进花粉萌发，并且随 着硼酸浓度增至为0 0 2 时，花粉萌发率达到最高值，接近7 0 。而当硼酸浓度 为0 0 3 时，花粉萌发率稍有下降( 6 5 2 ) ，在硼酸浓度继续增加到0 1 时，花 粉萌发率则显著下降至2 4 7 ( 图3 2 ) 。比较花粉管生长和花粉萌发的硼酸最适 浓度略有不同，前者浓度为0 0 1 5 ，培养3 5 h 后其花粉管长度的最大值可达 ( 2 2 9 9 1 7 4 5 ) 岬，而后者在0 0 2 硼酸的培养基中，花粉管的最大长度为( 2 2 4 8 1 1 3 ) p m ，两者无显著性的差异( p 0 0 5 ，图3 _ 3 和3 4 ) 。由上可见，在青杆 花粉离体培养的培养基中，以硼酸浓度以0 0 2 较为适宜。 0 0 0 0 10 0 10 0 1 50 0 20 0 2 50 0 30 1 硼酸农度h 1 8 0 1 图3 - 2 硼酸对花粉萌发的影响 f 培3 - 2e f f e c t so f h a b 0 3o ni nv i t r op o l l e ng e r m i n a t i o n 00 0 0 l0 0 10 0 1 50 0 2o 0 2 50 0 30 1 硼酸衷度h q ( ) 硼酸对花粉管生长的影响 3 - 8 7 6 5 4 3 2 1 o o 0 o 0 0 o 0 o 萎童霉i骨琦哥8iiod许标拿堪 姗瑚枷啪m如o a导霍。h。q暑里一od犁舡枣肆 酊晦 1 21 82 4 3 0 培养时间c u l t m et i m e 图3 _ 4 花粉在优化培养基、未加 硼酸培养基和未加钙培养基中生 长速率( 3 6 h ) 的比较 f i g 3 - 4c o m p a r i s o n o f t u b e g r o w t ho f p o l l e n 粤面n sc u l t u r e di n s t a n d a r dm e d i u m ，b o r o n - d e f t c i e n t m e d i u ma n dc a l c i u m - d e f i c i e n t m e d i u mf o r3 6 h 如图3 5 和图3 - 6 所示，在不同浓度c 扩存在下，青杆花粉萌发和花粉管生长 的情况不尽相同。当加入低浓度c a 2 + ( 0 0 0 1 ) 后，花粉萌发率有所增加( 6 4 2 ) ， 但未见显著的差异( p o 0 5 ) 。然而，当c a 2 + 浓度增加至0 1 时，萌发率开始下 降( 4 6 2 ) 花粉管的生长受到较大的抑制( 1 8 2 2 p m ) 。在高浓度c a 2 + ( 1 ) 下，则完全抑制了花粉的萌发。另外，通过测定不同浓度c a 2 + 条件下花粉管的长 度发现，当c a 2 + 浓度为0 0 3 时，花粉管平均生长长度达到( 2 2 4 8 1 1 3 ) 岬，是 对照花粉管平均长度( 1 7 3 2 - - + 4 5 ) 岬的1 3 0 倍，差异极显著( p o 0 0 1 ) 。而且花 粉管生长正常，直径均匀( 图3 - 1 a , c ) ，花粉管的平均生长速率为6 2 4v m h ， 而对照仅为4 8 1g m h ( 图3 4 ) ，其花粉管顶端常出现破裂现象。另外，此时花 粉的萌发率也达到最大值6 9 2 ，为对照花粉萌发率( 6 4 2 ) 的1 2 6 倍( 图3 6 ) 。 由此可见，离体培养基中适合青杆花粉萌发和花粉管生长的钙浓度应为0 0 3 。 巷 | 蒌 弘2 档 00 0 0 1o o lo j q 2o 0 30 1 钙浓度c a l c i t t mc 潮 图3 - 5 钙对花粉萌发的影响 f i g3 - 5e f f e c t so f c a l c i u mo ni nv i t r op o l l e ng e r m i n a t i o n 拗 撕 瑚 啪 如 o 目暑髻鲁田。qj8iiod恻舡牵肆 2 5 0 2 0 0 1 5 0 1 0 0 5 0 0 壬 壬 壬 ， ；几 00 0 0 10 0 10 0 20 0 30 1 钙f f , f f c a l c i u m 疰 3 - 6 钙对花粉管生长的影响 f i g 3 - 6e f f e c t so f c a l c i u m o i li nv i t r op o l l e nt u b eg r o w t h 综上所述，青杆花粉的离体萌发和花粉管生长的最佳培养基为：1 2 蔗糖， 0 0 2 硼酸，0 0 3 氯化钙，在此条件下其花粉萌发率可达6 9 2 ，花粉管的平均 生长长度为( 2 2 4 8 - 4 - 11 3 ) i a m 。上述研究结果将为进一步研究青杆花粉花粉萌发和 花粉管生长的分子机理，及其花粉管生长过程中的信号传导等提供重要的参考。 3 2b i m 对青杆花粉萌发和花粉管生长速度及其形态的影响 利用上述最佳培养基进行青杆花粉的离体萌发，花粉萌发实验表明，不同培 养基培养的青杆花粉萌发率一般在1 8 h 达到最大值，本实验认为，1 8 h 仍然不能 萌发的花粉粒为异常的，所以在1 8 h 时统计花粉的萌发率。为了检验b i m 对青 杆花粉萌发和花粉管生长的影响，不同剂量的b i m ( o ，l ，2 ，4 ，s u m ) 于花粉培 养的初期( o h ) 被分别加x n 培养基中。结果发现b i m 对青杆花粉萌发具有显著的 剂量依赖性的抑制作用。如图3 7 所示，花粉培养1 8 h 后，经l ，2 ，4 ，8 t t m b i m 处理组花粉的萌发率仅为5 9 8 ，4 5 麟，3 1 5 ，和1 5 8 ；而此时，在正常条件 下培养的青杆花粉的萌发率已经达到6 5 6 ，对照和处理之间存在显著性差异。 8 9 mb i m 处理几乎完全抑制了青杆花粉的萌发，4 1 t mb i m 对青杆花粉萌发抑制 率是3 1 5 ，为中等抑制水平，所以确定4 t t mb i m 为半抑制浓度。以下各部分 实验所用的b i m 浓度均为4 1 t m 。 目to暑享。虚尝亘iod卓缸集肆 c ki248 抑制荆浓度b dc o n c e n t r t i o n ( i i m ) 图3 7 抑制荆b i m 时花粉萌发的影响 f i g 3 - 7e f f e c t so f b i mo ni nv i t r op o l l e ng e r m i n a t i o n 花粉管生长长度测量结果表明，b i m 不仅抑制花粉的萌发率，还强烈抑制 花粉管的生长( 图3 - 8 ) 。在正常条件下，青杆花粉萌发后以平均每小时9 9 1 m 的速率生长，经过2 8 h 培养后花粉管平均长度达到，此后花粉管生长趋向缓慢。 而经过l ，2 ，4 ，8 p mb i m 处理组其花粉管生长速率分别为8 2 0 i _ t m ) ，6 1 8 ( 2 h o 5 4 ( 4 1 t m ) ) t m h ，3 6 3 ( 8 p m ) i t m h 1 。相应地，经过2 8 h 培养后花粉管平均长度分别 为。对照和处理之间的差异极显著。 1 2 hl 曲2 0 h2 4 i l2 胁 培养时闻t i m e o f q 血i r ( ” 图3 - 8 抑制剂b m i 对花粉管生长的影响 f i g 3 - 8e f f e c t so f b i m o i li nv i t r op o l l e nt u b eg r o w t h 日c k 盈l 岬 田2 t i m 目4 p a n 8 岬 帅如加o 爨一 差茸导。口当。山甘埘标牵肆 聊 瑚 啪 啪 o 一口暑00n工c当od鲁g一蜒犁舡睿僻 显微镜观察结果还表明，b i m 不仅明显抑制花粉的萌发和花粉管生长，而 且还显著影响花粉管的形态。在正常条件下，青杆花粉萌发后，其花粉管顶端即 出现一个帽状透明区，透明区之后为富含各种细胞器区域( 图3 - 9 a , c ) 。正常生 长的花粉管直保持这一结构特征，直到花粉管停止生长。而b i n 处理显著影 响花粉管形态，其中最明显的变化是花粉管发生分叉、螺旋甚至扭曲( 图3 9 b ，d ， e f ) 。 图3 - 9 抑制剂对花粉管形态的影响( a ) ( c ) 正常条件下生长的花粉管；( b ) 抑制荆处理后花粉 管的群体形态；( d ) 一个花粉粒萌发出2 个花粉管；( c ) 顶端膨大的花粉管；( d 螺旋生长的 花粉管标尺( a ) ( b ) 为1 0 0 m ；( c ) ( 匀为5 0 m f i g 3 - 9e f f e c t so fb i mo np o l l e ng e r m i n a t i o na n dp o l l e nt u b em o r p h o l 0 9 3 r ( a ) a n d ( c ) p o l l e n t u b ei ns t a n d a r dm e d i u m ；( d ) p o l l e n 罾曲sw i t ht w ot u b e s ；( e ) p o l l e nt u b es w o l l e na tt h e 邱；( o s p i r a l i n gp o l l e nt u b e b a ri n a a n db = 1 0 0p r a ；i nct of - - 5 0m 3 3b i m 对花粉管不同生长时期p k c 表达含量的影响 为了检测p k c 是否在花粉管生长发育中表达，我们应用蛋白免疫印迹技术 证实了p k c 在青杆花粉管生长发育中的表达，并且检测了不同培养时期p k c 表 达含量的变化。结果如图3 1 0 所示，单克隆抗p k c 抗体识别出一条5 5k d a 的 蛋白条带，这一结果与n a n m o r ie ta 1 ( 1 9 9 4 ) 0 1 4 等的研究结果一致。正常培养6 h 的划分中已经可以检测到p k c ，并且随着时间的延长，p k c 的表达含量增加， 到萌发初期1 2 h 达到最大值，然后又逐渐降低。相比之下，b i m 处理导致花粉 管中p k c 含量在相应的培养时间段上降低。 图3 1 0 蛋白免疫印迹分析抑制剂b i m 对花粉发育过程中蛋白激酶c 表达的影响b 6 ，b 1 2 , b 1 8 ，b 2 4 分别代表花粉以4 州b n 订处理6 ，1 2 ，1 8 ，2 4 h ：c 6 ，c 1 2 ，c 1 8 ，c 2 4 分别代表在正常 培齐基中培养6 ，1 2 ，1 8 ，2 4 h a 为凝胶图，b 为印迹图左边列出的是蛋白分子量( k d a ) f i g 3 1 0w e s t e r ni m m u n o b l o r i n ga n a l y s i sw i t he f f e c t so fb i mo ne x p r e s s i o no fp k cd u r i n g p o l l e nd e v e l o p m e n t l a r l ：b 6 ，b 1 2 ，b 1 8 b 2 4 ：p o l l e ng r a i n s t u b e st r e a t e dw i t h4 州b i mf o r6 ， 1 2 ，1 8 ，2 4 l l r e s p e c t i v e l y ；c 6 ，c 1 2 c 1