（无机化学专业论文）多苯并咪唑金属配合物的合成及促进dna凝聚性质.pdf

摘要 合成了两种多苯并咪唑配体：n ，n ，n ，n 一四( 2 一苯并咪唑甲基) 一l ，l o 一二氮- 4 ，7 一 二氧癸烷( e g t b ) 和1 ，l ，4 ，7 ，7 - 五( 2 一苯并咪畔甲基) 一二乙基三胺( d t p b ) ，以其为主 配体合成了5 个金属配合物。对所合成的配合物 c u 2 ( e g t b ) ( a c ) 2 ( a c ) 2 7 h 2 0 ( 1 ) 、 【c u 2 ( d t p b ) c 1 2 c 1 2 5 h 2 0 2 c h 3 0 h ( 2 ) 、【c 0 2 ( d t p b ) c 1 3 c i ( 3 ) 、 m n ( d t p b ) a c a c 8 h 2 0 ( 4 ) 和 m n 2 ( d t p b ) ( n 0 3 ) 2 ( h 2 0 ) 2 m n 2 ( d t p b ) ( n 0 3 ) 2 h 2 0 c h 3 0 h ( n 0 3 ) 4 4 c h 3 0 h 。h 2 0 ( 5 ) 的晶体结构进行了表征，其结构特征如下： 1 为双核配合物，其中的每个c u ( i i ) 与e g t b 中的三个n 原子，一个o 原子及 羧酸根中的两个o 原子配位，形成八面体构型。 2 为双核配合物，其中的一个c u ( i i ) 与d t p b 中的两个苯并咪唑n 、两个烷胺 n 和一个游离的c l 。配位，形成四方锥构型；另一个c u ( i i ) 与d t p b 中的三个苯并 眯哗n 、一个烷胺n 和一个游离的c l - 配位，形成三角双锥构型。 3 为双核配合物，其中的一个c o ( i i ) 与d t p b 中的三个苯并咪唑n 、两个烷胺 n 和一个c l - 配位，形成八面体构型；另一个c o ( i i ) 与d t p b 中的两个苯并咪唑n 、 一个烷胺n 和两个c 1 配位，形成三角双锥构型。 4 为单核配合物，其中的m n ( i i ) 与d t p b 中的三个苯并咪唑n 、两个烷胺n 和 醋酸根中的一个o 原子配位，形成八而体构型。 5 为双核配合物，其中的一个m n ( i i ) 与d t p b 中的三个苯并咪唑n 、两个烷 胺n 和硝酸根中的两个o 原子配位，形成五角双锥构型；另一个m n ( i i ) 与d t p b 中的两个苯并咪唑n 、一个烷胺n 、硝酸根中的一个o 原子、两个水分子中的o 原 子配位，形成八面体构型。 利用紫外一可见光谱和荧光光谱研究了配合物4 和5 与d n a 的相互作用，结果 发现这两利t 配合物能够与d n a 结合。通过琼脂糖凝胶电泳、9 0 0 直角光散射( r a l s ) 、 动态光散射粒度分布分析仪( d l s ) 研究了配合物4 和5 促进d n a 凝聚性质，结果 表明，在近中性条件下，两种配合物能够促使d n a 发生凝聚，并用透射电镜( t e m ) 观察到了不同的凝聚体形态。 关键词：e g t b ；d t p b ；晶体结构；d n a 凝聚 硕士学位论文 m a s t e r = st h e s i s a b s t r a c t t w op o l y b e n z i m i d a z o l el i g a n d s ：n , n ，n n - t e t r a k i s ( 2 - b e n z i m i d a z o l y l m e t h y l ) 一1 ，4 一d i e t h y l e n ea m i n og l y c o le t h e r ( e g t b ) a n d l ，1 ，4 ，7 , 7 - p e n t a k i s ( 1h b e n z i m i d a z o l 一2 一y l m e t h y l ) - 1 ，4 ，7 一t r i a z a h e p t a n e ( d t p b ) h a v eb e e ns y n t h e s i s e d w r ea l s os y n t h e s i s ef i v em e t a lc o m p l e x e s 、析t he g t bo rd t p b a l lo ft h ec o m p o u n d s c u 2 ( e g t b ) ( a c ) 2 ( a c ) 2 7 h 2 0 ( 1 ) 、 【c u 2 ( d t p b ) c 1 2 c 1 2 。5 h 2 0 2 c h 3 0 h ( 2 ) 、【c 0 2 ( d t p b ) c 1 3 c i ( 3 ) 、【m n ( d t p b ) a c a c 8 h 2 0 ( 4 ) 、【m n 2 ( d t p b ) ( n 0 3 ) ：( h 2 0 ) 2 1 m n 2 ( d t p b ) ( n 0 3 ) 2 。h 2 0 。c h 3 0 r q ( n 0 3 ) 4 4 c h 3 0 h 。h 2 0 ( 5 ) h a v eb e e nc h a r a c t e r i z e db yx r a yd i f f r a c t i o n ，t h es t r u c t u r ec h a r a c t e r sa r ea sf o l l o w s ： 1i sad i n u c l e a rc o m p l e x e a c ho ft h ec e n t e rc u ( 1 i ) i sb o n d e dt ot h r e ena t o m s ，o n e oa t o mf r o me g t ba n dt w ooa t o m sf r o ma c 一，t of o r mao c t a h e d r o ng e o m e t r y 2i sad i n u c l e a rc o m p l e x o n eo ft h ec e n t e rc u ( i i ) i sb o n d e dt ot w ob e n z i m i d a z o l y l n i t r o g e n s ，t w oa m i n en i t r o g e n sf r o md t p ba n d t w oc 1 。，t of o r mat e t r a g o n a lp y r a m i d ； t h eo t h e ri sb o n d e dt ot h r e eb e n z i m i d a z o l y in i t r o g e n s ，o n ea m i n en i t r o g e n sf r o md t p b a n dac 1 。，t of o r mat r i g o n a lb i p y r a m i d 3i sad i n u c l e a rc o m p l e x o n eo ft h ec e n t e rc o ( i i ) i sb o n d e dt ot h r e eb e n z i m i d a z o l y l n i t r o g e n s ，t w oa m i n en i t r o g e n sf r o md t p ba n dac 1 ，t o f o r mao c t a h e d r o n g e o m e t r y ；t h eo t h e ri sb o n d e dt ot w ob e n z i m i d a z o l y ln i t r o g e n s ，o n ea m i n en i t r o g e n s f r o md t p ba n dt w oc i ，t of o r mat r i g o n a lb i p y r a m i d 4i sam o n o n u e l e a rc o m p l e x t h ec e n t e rm n ( i i ) i sb o n d e dt ot h r e ena t o m s ，t w o a m i n en i t r o g e n sf r o md t p ba n do n e0a t o mf r o ma c 4 ，t of o r mao c t a h e d r o ng e o m e t r y 5i sad i n u c l e a rc o m p l e x o n eo ft h ec e n t e rm n ( i i li sb o n d e dt ot h r e e b e n z i m i d a z o l y ln i t r o g e n s ，t w oa m i n en i t r o g e n sf r o md t p ba n dt w ooa t o m so fn c b 一，t o f o r map e n t a g o n a lb i p y r a m i d ；t h eo t h e ri sb o n d e dt ot w ob e n z i m i d a z o l y ln i t r o g e n s ，o n e a m i n en i t r o g e n sf r o md t p b ，o n eoa t o ma n dt w ooa t o m so fw a t e rm o l e c u l e ，t of o r ma o c t a h e d r o ng e o m e t r y i n t e r a c t i o n sb e t w e e nc o m p o u n d4 、5a n dd n ah a v eb e e ni n v e s t i g a t e db yu l t r a v i o l e t - v i s i b l es p e c t r aa n df l u o r e s c e n c es p e c t r a t h er e s u l t sm a n i f e s tt h et w oc o m p o u n d sc a n b o n dd n a t h ei n d u c t i v er o l e so ft h et w oc o m p l e x e si nd n ac o n d e n s a t i o nh a v eb e e n s t u d i e db yg e l o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s ，r a l sa n dd l s 1 1 1 er e s u l t si n d i c a t et h ec o m p o u n d s c a ni n d u c ed n ac o n d e n s a t i o ni nn e u t r a lc o n d i t i o na n dd i f f e r e n td n ac o n d e n s a t e sh a v e b e e nd e t e c t e db yt e m k e y w o r d s ： e g t b ；d t p b ；c r y s t a ls t r u c t u r e ；d n ac o n d e n s a t i o n 2 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名： 同砉4 日期：叫年u 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权 中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通 过网络向社会公众提供信息服务。 作者签名：l 氟右4 喊叫年6 月歹日 撕娩主f 麟 嘲必f 各月p 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程 ，同意将本人的 学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库罗中全文发布，并可按“章程”中的 规定享受相关权益。回意途塞超童卮溢卮；箕睦生；旦二生；旦三生筮盔! 作者签名：r 斋4 帆砷年6 月3 - 日 撕签名：瓦( 纠壮一 日期舻7 年参月蛹 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 本论文主要创新点 合成了5 种新的含多苯并咪唑配体的第一过渡系金属配合物，对其晶体结构 进行了表征，同时研究了两种锰配合物诱导d n a 凝聚的性质，实验表明，此类配 合物在水溶液中外围离子离去使其变成多价阳离子，能够直接与d n a 相互作用并 可以有效的促进d n a 凝聚，是一种潜在的新型d n a 凝聚剂，为开发一种新的基因 转运载体提供了可能性。 3 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 第一章绪论 1 1 基因治疗 基因治疗有广义和狭义之分，广义的基因治疗是指利用基因药物的治疗，而狭 义的基因治疗即通常所说的基因治疗是指通过基因转移技术将正常的外源基因直 接导入患者病变部位的靶细胞，以纠正基因缺陷，从而达到治疗疾病的目的 1 】。其 常用技术有2 种，即体内疗法( i n v i v o ) 和体外疗法( e x v i v o ) ，目前研究和应用较多的 是体外基因治疗，即将有基因缺陷的细胞取出，在体外将外源基因导入到载体细胞， 然后将基因转染后的细胞重新输入到病人体内，使携有外源基因的载体细胞在体内 表达治疗产物，以达到治疗目的。体内疗法是将外源基因导入受体体内有关的器官 组织和细胞，以达到治疗的目的【2 】。这些基因药物包括完整基因和基因片段( 包括 d n a 或r n a ) ：治疗的方式可以是替代治疗，也可以是抑制性治疗( 包括d n a 转录 水平和m r n a 翻译水平) 。基因药物不但能够治疗疾病，而且也能用于预防疾病。目 前，基因治疗不仅用于治疗遗传病( 如血友病、囊性纤维病等) 、恶性肿瘤、心血管 疾病、感染性疾病( 如艾滋病、类风湿等) 等 3 ，4 】，而且也能用于亚健康状态的治疗， 如疲劳、肥胖、脱发、衰老等 1 ，2 】。 将外源基囚转运至目标细胞是人类基因治疗的首要问题。静脉注射时，自由的 低聚核苷酸和d n a 易被血液巾的m 清核酸酶分解，因而基因转染的首要步骤是促 使d n a 凝聚，其目的有二：第一，保护d n a 不受核酸酶分解；第二，减小d n a 分子体积便于跨膜 5 】。而d n a 凝聚是一个有多种因素共同调控的极其复杂的过程， 所以充分了解d n a 凝聚的作用机理找出凝聚的合适条件对基因治疗的发展具有重 要意义。 1 2d n a 凝聚 d n a 分子从伸展地占有很大体积的无规则卷曲状态转变为紧密的、具有规则 形态且高度有序的状态，称为d n a 凝聚( 图1 1 ) 【6 9 】。凝聚体有以下特征：结构稳 定且有序，在一定条件下凝聚是一个可逆过程；d n a 分子本身的负电性被大大中 和，凝聚体多趋于中性；在凝聚状态中，分子内的各折叠部分之间，或者分子之间 可能只是被含有一层或二层水分子的水化层隔开。凝聚很难区别于聚集或沉淀，一 般来说，术语“凝聚的使用通常被限制在形成的凝聚体的尺寸有限且有一定形态 的情形 6 ，8 】。 6 长期以来，研究者采用多种技术方法【7 】，如显微技术光散射技术，荧光技 术和量热技术等，在凝聚的能量、形态和作用力等方面做了大量研究工作。但凝聚 的详细机制目前仍不是很清楚。近年来，迅速发展的基因治疗等生物技术又使凝聚 领域的研究成为人们关注的焦点。 豳参 图i id n a 凝聚体 巳 1 2 1 常用的凝聚剂 通常认为，凝聚试剂能够起作用足由以r 因素中的一个或者是燕同作用引起 的：改变了d n a 片断间的静电作用力、减少t d n a - 溶剂问的相互作用、促使了双 螺旋结构的局部弯曲或扭曲。 常用的凝聚试剂主要有以下几种：高价阳离子、醇、碱性蛋白、聚合物和阳离 子脂质体。 1 高价阳离子 一价或二价金属离子在室温下均不能使d n a 发生凝聚，除非在特殊环境中 1 0 1 ， 但在水- 乙醇混合溶液中可以引起d n a 凝聚一13 】。室温下，在水溶液中三价或更 高化合价的阳离子可以诱导d n a 凝聚。例如正三价的亚精胺、正四价的耪胺【1 4 】、 c o ( n h 3 ) ， 6 1 5 等。最近的研究表明，m n 2 + 能够促使超螺旋的质粒d n a 形成环状凝 聚体，对于线状质粒d n a 却不具有这种作f l t o l 。在含有亚甲基基团的二胺类物质 n h 3 + ( c h 2 h n h 3 + ( n - 1 4 ) t p ，当n - 3 和5 时，能够压缩单一的t 4 d n a 分子。当n = 2 4 和6 时，则不具有这种作用 1 6 1 。这表明了链的k 度、疏水拥互作用和电荷在凝聚中起 了作用【7 】。 2 醇 8 0 的乙醇通常用来沉淀d n a ，但是当离子强度较低时，在c o ( n h 3 ) 6 3 + 的协同 作用下，1 5 一2 0 的乙醇能够引起d n a 凝聚，形成形态规则的凝聚体 1 2 】。同样条 件下，甲醇和异丙醇也能引起d n a 凝聚。 3 组蛋白 许多组蛋白能够使d n a 产生环状或棒状的凝聚体。如海胆蛋i 3 h 1 、鸡红血球蛋 白h 5 及鲱精蛋白，而且这三种蛋白所形成的凝聚体的大小和形态与d n a 链的长度没 有太大关系 1 7 】。转运蛋白t p 2 能够使染色质凝聚，凝聚过程中t p 2 中的z n 2 + 起着决 定作用 1 8 】。 4 高聚物 在足量盐存在时，高浓度的中性聚合物如聚乙二醇( p e g ) 、聚乙烯吡咯烷酮( p v p ) 都能引起d n a 的凝聚【7 ，8 ，1 9 】：阴性聚合物聚天冬氨酸、聚谷氨酸和阴离子多肽等的 高浓度溶液也可以引起d n a 凝聚【8 】。 此外，一些多聚物凝聚剂已经作为非病毒载体用于基因治疗的研究中。例如， 1 9 7 5 年，l a e m m l i 发现了聚赖氨酸( p l l ) ( 图1 2 ) 可以诱导d n a 凝聚的性质 2 0 ，随 后这种载体被广泛用作体外 2 l 】和体内 2 2 】的基因载体。通常只有分子量大于 3 0 0 0 d a 的多聚赖氨酸才可以凝聚d n a 为稳定的复合物，说明分子中胺基数目对 d n a 凝聚有主重要影n l h j 7 】。聚乙烯胺( p e i ) 被认为是最为卓越的基因载体之一 【2 3 】，1 9 9 5 年，b e h r 等人首次以p e i 为载体成功转运了低聚核苷酸【2 4 ，此后p e i 在 物化性质、生物学性质上都得到改进，使其成为一种更加有效的基因载体 2 5 】。 0 n h 2 o n h 2 p o l y l y s i n e 、一：h ) 八n i h 2 l 、jj 洲心n 、n h州、n 厂m 、n n h n h 图i - 2p l l 矛i i p e i 的分子结构图 m a t t h i a sw i t t m a r 等【2 6 】用氨基修饰的多聚乙二醇( a m i n e m o d i f i e dp o l y ( v i n y l 8 硕士学位论文 m a s t e i z st h e s i s a l c o h o l s ) ( p v a s ) ( 圈1 - 3 ) ) 诱导d n a 凝聚，通过原子力显微镜( a f m ) 观察到环状d n a 多聚物凝聚体。s a n g o h 等 2 7 】通过多聚乙胺( p o l y e t h y l e n i m i n e ( p e l ) ) 并t l 氯甲酸胆甾酯 ( c h o l e s t e r y lc h o l e s t e r 0 1 ) 反应制得一种水溶性无毒多聚酯( 图l - 4 ) ( w s l p ) - p o l y ( e t h y l e n i m i n e ) 一c o i n - ( 2 一a m i n o e t h y l ) n i m i n e ) 一c o 一 n 一( 2 一a m i n o e t h y l ) e t h y l e n e i m i n 一c o n 一( n c h o l e s t e r y l o x y c a r b o n y l 一( 2 a m i n o e t h y l ) 一e t h y l e n i m i n e ) ，其可以诱导质粒d n a 凝聚保护 其免受核酸酶降解，提高核酸在哺乳动物细胞内的转染效率。j o r d a nj g r e e n 等 2 8 】 通过高通量合成并比较一系列结构独特的p o l y ( 1 3 一a m i n o e s t e r s ) ( p b a e s ) ( 图1 - 5 ) d n a 的凝聚作用，发现分子结构中的末端基团是影响基因转染的关键因素。 r 1r 。o r 1 南，r 2 飞n h 2 旦 r 1 南、r 2 一、n h 义n 飞n 1 r 1 - - - c h 2 。c 2 h 4 r 2 = a n 3 ，c 2 h 5 譬o c h a ，o h ；2 c o c h 3 一上一 c h 2 0 6 h h h c h 2 0 6 h u i c h 2 孚h e 巾瞄h 珏c h 2 晶母上。怕洲栌心洲洲2 0 芦。 2 r 2 岁飞 叶融c 峪时等驴c 咿 w s l p 图1 - 4w s l p 的合成路线 9 0 知吖n 2 土十k 篁以叶 姒咿知+ ? 弋与亡。k 州r 以叶 5 阳离子脂质体 h 3 q9 小v v ，4 v h 3 c 一劓：人，o 、八八八：、一入 h 3 c d o t m a ( u p o f e c t i n t m ) + h 3 一锚啾1 一 删一斟锚薹辫一 、d o s p a ( u p o f e c t a m i n e t m ) 阳离子脂质体由阳离子和融合脂质组成，其中正电荷分子由三个基本部分构成： 带正电荷的极性头部、疏水锚着区和连接极性与非极性区域的连接键 7 ，2 9 。这些 化合物能够凝聚d n a ，保护d n a 免受核酸酶的分解，而且由脂质覆盖的d n a 具 有良好的膜透性【5 】，使其成为一种有效的基因转染- i 式：f f t 1 7 ，3 0 1 ，具有潜在的基因治 1 0 o ，z 、c 苍心 疗性质【3l ，3 2 】。尽管它们诱导d n a 的凝聚体没有规则的形态，但是由于其特殊的 生物性质引起了广大的研究兴趣【7 】。许多已经成为具有商业可行性的基因转染试剂， 包括【7 】n 一【1 一( 2 ，3 一d i o l e y l o x y ) p r o p y l 一n ，n ，n t r i m e t h y l a m m o n i u m c h l o r i d e ( d o t m a ) ， 2 ，3 d i o l e y l o x y - n 一 2 ( s p e r m i n e c a r b o x a m i d o ) e t h y l - n ，n d i m e t h y l l p r o p a n a m i n i u m t r i f l u o r o a c e t a t e ( d o s p a ) ，1 ，2 - d i o l e o y l 一3 一t r i m e t h y l a m m o n i u m p r o p a n e ( d o t a p ) ，a n d d i o c t a d e c y l a m i d o g l y c y l s p e r m i n e ( d o g s ) ( 图l 一6 ) 。 1 2 2d n a 凝聚条件 如果只将d n a 的稀溶液与一种多价阳离子简单的混合，并不能产生结构稳定的 凝聚物，这是因为d n a 上每个碱基对间的净引力很小，不足以产生足够的分子内或 分子间作用驱动d n a 发生凝聚。因而d n a 要发生凝聚存在链长的最小值 3 3 1 ，而且 d n a 的凝聚是一个复杂的过程，需要在一定条件下才能进行。一般情况下，要使d n a 发生凝聚需具备以下条件：首先，d n a 的链长须比它的持久长度( p e r s i s t e n c el e n g t h ) 大几倍，通常水溶液中的d n a 持久长度约为15 0b p 3 4 ，表明了d n a 链长至少达到几 百个b p 才能发生凝聚，符合w i d o m 和b a l d w i n 提出的最d 、d n a 凝聚链长为4 0 0b p 的要 求3 5 1 ；再者，由于d n a 在临界电荷中和比时刚性会大大下降从而产生自发的弯曲， 要使凝聚能够发生需中和d n a 中8 9 以上的负电荷【3 6 】。此外，在离子强度较低时， 向d n a 的稀溶液中加入多价阳离子，很低浓度的阳离子并不能使d n a 发生凝聚，只 有当多价阳离子浓度达到一定临界值时，才能d n a 使发生有效的凝聚 8 ，l o 】，这意 味着d n a 凝聚是在一定的凝聚剂浓度下进行的。 1 2 3 凝聚体的形态 在用电子显微镜观察到的d n a 凝聚体中，最显著和常见的形态足环形( t o r o i d ) 。 早在1 9 7 6 年，g o s u l e 和s e h e l l m a n 3 7 就发现多价阳离子可以引起d n a 在溶液中凝 聚成环形物；h u d 和d o w n i n g 3 8 用原子力和电子显微镜观察到了在哺乳动物的精 子细胞中，精蛋白将精子d n a 压缩成外径为9 0 n m ，内径为1 5 n m 的环形物；在水 溶液中，c o ( n h 3 ) 6 3 + 诱导l d n a 凝聚产生的凝聚体也主要为环形物 3 5 】。 除了环形，棒形( r o d ) 和球形( s p h e r o i d ) 也是d n a 凝聚体呈现的典型形态。在醇 一水的混合溶液中，c o ( n h 3 ) 6 3 + 和醇可以协同促进d n a 凝聚，产生较多的棒状( r o d ) 凝聚体，当醇大量存在时，则出现有分枝的纤维状凝聚体 1 3 】；由皿精胺诱导d n a 产生的凝聚体中也有许多棒形物【3 9 】，这可能与亚精胺的疏水性有关；而聚赖氨酸 或组蛋白h l 诱导d n a 凝聚成压缩程度不同的球状凝聚体【7 】。 另外，短的d n a 分子由于其长度不足以环绕成核，通常不能形成环状凝聚物 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 【3 3 】。在单价离子存在时，大约一个持久长度的单核小体d n a 当其浓度接近 2 0 0 m g m l 。1 时会自发形成液态结晶体( 1 i q u i dc r y s t a l s ) d 0 ，而亚精胺也可以引起单核 小体d n a 在稀溶液中凝聚成液态结晶体【4 1 】。此外也存在不同阶段的中间产物。 f a n g 等【4 2 观察到了一些花形( f l o w e r - s h a p e d ) 和碟形( d i s k l i k e d ) 结构的早期中间产 物。b u t t c h e r 等【4 3 】报道的一些d n a 平行簇状结构则属于较晚期的中间产物。 1 2 4d n a 凝聚的可能机理 尽管研究者对d n a 凝聚做了大量的研究，然而由于实验手段的缺陷如电镜对环 形凝聚体的观测缺少细节形态信息，而光散射等实验手段仅能够提供平均信息， 目l j i 关于凝聚行为的详细机制并不是十分清楚。一些机理也只停留在理论猜想上， 并未得到实验的验证。 d n a 凝聚是由多种复杂的相互作用开始i 堑j 4 4 】。这些作用包括 7 1 ：多价平衡离 子涨落( f l u c t u a t i o n ) 所引起的静电相互作用；与d n a 螺旋表面基团接近的水分子的 水合作用( h y d r a t i o n ) 以及d n a 分子从伸展的刚性较强的卷曲态塌陷过程中，导致熵 的减少和自由能的消耗。另外，在配合物诱导的d n a 凝聚中，配合物与d n a 间的插 入作用、配合物问的7 【- 兀相互作用及疏水相互作用 4 5 4 8 1 也都是驱动凝聚的作用力。 这些作用力中起主要作用的是静电相互作用。 m a r q u e t 等 4 4 】认为平衡离子不仅能够屏蔽d n a 中磷酸根一i j 的静电斥力，而且能 通过平衡离子的涨落产生引力。此外，静电斥力被屏蔽将引起d n a 持久长度减小 【4 9 】，使d n a 的占有体积减小。因而，在阳离子诱导的d n a 凝聚过程中，离子强度 和阳离子的电荷起重要作用。这主要因为平衡离子通过屏蔽静电斥力降低了d n a 的 刚性同时也减小了d n a - 溶液分子的相瓦作用，从而引起凝聚。凝聚过程中，引力 主要来自于平衡离子的涨落和水的极化作用【7 】。其中关键作用是平衡离子对d n a 磷酸基上负电荷的中和 7 】。 z i m m 等 5 0 】将聚合物构象的卷曲一球状转换( c o i l g l o b u l et r a n s i t i o n ) 理论应用到 d n a 凝聚中，认为：由于d n a 链较强的刚性，其本身并不能发生大幅度的弯曲，然 而将弯曲自由能的损失减到最小时，d n a 链能够从伸展的卷曲状弯曲成圆从而形成 中心空洞的小球。这能够用于定性的解释环形凝聚体的形成及稳定性。 m a n n i n g 5 l 】提出的平衡离子凝聚理论( c o u n t e r 。i o nc o n d e n s a t i o nt h e o r y ) 认为随 着溶液的介电常数、碱基构成等的不同，当7 6 一9 4 的磷酸基负电荷被中和时将引 起d n a 弯曲，进而生成了环状凝聚体。h u d 等 5 2 】提出了环形凝聚体形成的结构模 型，在这个模型中，d n a 被卷曲成一系列具有相同大小和弯曲半径且相互邻近的小 环。环形物的形成经过以下过程：首先，在含有凝聚剂的溶液中，伸展的d n a 分子 1 2 硕士学位论文 m a s t e r st t t e s i s 在热运动的作用下，两个序列分离的区域相互接触，在d n a 分子上自发形成一个环； 然后，凝聚剂连接互相接触的两部分并使这个坏稳定；随后，凝聚剂继续连接d n a 的伸展部分和坏化部分，逐渐形成环形物。 1 2 5 过渡金属配合物诱导d n a 凝聚 由于过渡金属配合物种类和结构的多样性。长期以来人们把它作为d n a 结构 探针 5 3 ，5 4 、化学药物的设计 5 5 j j n 以研究。然而，有关金属配合物作为d n a 凝聚 剂的报道却寥寥无几。此外，除了c o ( n h 3 ) 6 ”，作为d n a 凝聚剂的配合物的主配 体集中在含有平面或芳香环的有机物 4 5 - 4 8 】。 在水溶液中，c o ( n u 3 ) 6 3 + 能够诱导l d n a 凝聚产生环形物，同时圆二色光谱可 以检测到凝聚体中有b d n a 3 5 ；在乙醇一水的混合溶液中，c o ( n h 3 ) 6 ”和乙醇可以 协同促进d n a 凝聚，且随着溶液介电常数的减小，凝聚体的形态会由环形转变为 棒状，凝聚体的大小受乙醇浓度的影响。此外，在c o ( n h 3 ) 6 3 + 和醇诱导d n a 凝聚 的过程中会发生d n a 构型的变化 1 3 】。c o ( n h 3 ) 6 3 + 促进的d n a 凝聚对介质的离子 强度和组成也非常敏感，要求的凝聚剂浓度通常随着介质中一价阳离子浓度升高而 上升；在低离子强度的条件下，其大小由环状凝聚体核的形成和生长的动力学决定； 加入一定量的m 9 2 + ，环状凝聚体的大小则受到热力学控制；表明环状凝聚体主要是 一种非平衡结构【5 6 】。 李壮等 4 5 】报道了在乙醇一水的混合溶液中c o ( p h e n ) 3 ”( p h e n = l ，1 0 一p h e n a n t h r o l i n e ) 能够使d n a 发生凝聚，在原子力显微镜下主要呈现环状形态，且随着乙醇浓度的 增加，环状凝聚体变得更加紧密。表明减少溶液介电常数将有助于d n a 凝聚，同 时也说明了c o ( p h e n ) 3 3 + 诱导d n a 凝聚过程中静电引力是主要作用力。与c o ( n h 3 ) 6 3 + 和乙醇协同促进d n a 凝聚不同的是：c o ( p h e n ) 3 3 + 诱导d n a 凝聚体的大小不受醇浓 度的影响，而且乙醇浓度较低时，在凝聚过程中不会伴随d n a 二级结构的变化； 只有乙醇浓度超过6 0 时，才会有b a 构型的转变。此外，在d n a 凝聚成环状的 过程中，强烈的静电引力可能会阻碍但不会消除c o ( p h e n ) 3 3 + 与d n a 的插入作用； 当乙醇浓度高于8 0 时，会产生类似纤维的网状凝聚体。 多吡啶配合物 r u ( b p y ) 2 ( p i p s i ) 】2 + 、 r u ( b p y ) e ( p i p n h ) 2 + b p y - 2 ，2 - b i p y f i d i n e ； p i p s h = 2 - ( 4 一b e n z o t h i a z o l y l ) p h e n y l i m i d a z o ( 4 ，5 - f ) ( 1 ，10 ) p h e n a n t h r o l i n e ；p i p n h = 2 一( 4 一b e n z o i m i d a z o l y l ) p h e n y l i m i d a z o ( 4 ，5 - f ) ( 1 ，1 0 ) p h e n a n t h r o l i n e 】在中性条件下能够使质粒 d n a 凝聚成微粒结构 4 7 】；多苯并咪唑配合物 4 8 c u 2 ( d t p b ) c i e ( h 2 0 ) ( n 0 3 ) 2 和 【c u 2 ( d t p b ) c 1 2 c 1 2 在中性条件下能够使线性k d n a 和超螺旋质粒d n a 凝聚成有序 的纳米粒子。m u s a t k i n a 等 4 6 】设计合成了配合物 r u ( d i p ) 2 ( l _ l ) 】2 十( d i p = 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 4 ，7 一d i p h e n y l l ，1 0 一p h e n a n t h r o l i n e ；l - l = 4 , 4 d i c a r b o x y - 2 ，2 - b i p y r i d i n e ) ，并发现其能够 使d n a 凝聚而且该化合物能够发出荧光，具有低毒性、良好的膜透性和生物相容性， 是一种潜在的细胞中的d n a 染料和基因转染载体。 和其他多价阳离子一样，配合物诱导d n a 形成凝聚体的形态以环状最为常见， 此外，还有棒状、球状和纤维网状结构( f i b e r - l i k en e t w o r k ) 4 5 】。在凝聚过程中，驱 动d n a 凝聚的作用力不仅有典型的静电引力，而且插入作用、疏水作用、配合物间 的1 9 - i i ：相互作用【4 8 】也是较为普遍的作用力。 1 3 选题意义 基因治疗的关键是d n a 跨膜，d n a 凝聚后则为其成功跨膜提供了可能，设计 有效的d n a 凝聚剂成为基因治疗的研究热点。尽管关于d n a 凝聚剂已有大量报道， 但主要集中在有机分子、高价金属盐等，强烈的细胞毒性使他们的应用受到限制， 所以开发新的高效、安全d n a 凝聚剂，获得理想的非病毒载体，将有助于基因治 疗的发展。 与其他凝聚剂相比，金属配合物具有较好的水溶性，结构多样性和合理的正电 荷密度，而且易制各的特点。此外，苯并咪唑类金属配合物存在于各种重要的分子 中，具有良好的生物活性。而我们课题组前期的工作发现多苯并咪唑铜配合物能够 诱导d n a 凝聚 4 8 】，因而设汁合成含多苯并咪唑配体的金属配合物并测定其促进 d n a 凝聚性质，开发一种新型的d n a 凝聚剂，可能使其成为一种新的基因载体， 对于基因治疗的发展具有重要的意义。 1 4 硕士学位论文 m a s t e r st he s i s 参考文献 1 】陶铭基因治疗及其研究生物学通报2 0 0 8 ，4 3 ，1 6 1 8 f 2 1 虎艳基因治疗研究进展生物学教学2 0 0 8 ，3 3 ，2 - 4 【3 】张峰，霍金龙，曾养志基因治疗的应用及研究进展生物发术通掇2 0 0 7 ，1 8 ， 6 7 7 6 7 9 【4 】a n d e r s o n , w f h u m a ng e n e t h e r a p y n a t u r e1 9 9 8 ，3 9 2 ，2 5 3 0 【5 】a ) m i n t z e r , m a ；s i m a n e k , e c n o n v i r a lv e c t o r sf o rg e n ed e l i v e r y c h e m r e v 2 0 0 9 ，1 0 9 ，2 5 9 3 0 2 b ) g r e e n ，j j ；l a n g e r , r ；a n d e r s o n , d ga c o m b i n a t o r i a lp o l y - m e rl i b r a r ya p p r o a c hy i e l d si n s i g h ti n t on o n v i r a lg e n ed e l i v e r y a c e c h e m r e s 2 0 0 8 ，4 1 ，7 4 9 7 5 9 【6 】b l o o m f i e l d ，v a d n ac o n d e n s a t i o nb ym u l t i v a l e n tc a t i o n s b i o p o l y m e r s1 9 9 7 ，4 4 ， 2 6 9 2 8 2 【7 】b l o o m f i e l d ，v a d n ac o n d e n s a t i o n c u r r o p i n s t r u c t b i 0 1 1 9 9 6 ，瓯3 3 4 3 4 1 8 】宋旭，张振中，王照川多价阳离子诱导的d n a 缩合研究进展叨严陛物绣? 笋 进展2 0 0 7 ，7 ，9 1 3 9 1 5 【9 】9 张炳琦，刘文广，唐聪，吉伟航，姚康德d n a 体外缩合的研究进展纪学迸露 2 0 0 6 ，1 8 ，6 2 7 - 6 3 4 10 】m a , c ；b l o o m f i e l d ，v a c o n d e n s a t i o no fs u p e r c o i l e dd n a i n d u c e db ym n c l 2 b i o p h y s z1 9 9 4 ，6 7 , 1 6 7 8 1 6 8 1 1 1 】w i l s o n ，r w ；b l o o m f i e l d ，v a c o u n t e r i o n i n d u c e dc o n d e n s a t i o no fd e o x y r i b o n u c l e i ca c i d al i g h t - s c a t t e r i n gs t u d y b i o c h e m i s t r y1 9 7 9 ，1 8 ，2 1 9 2 2 1 9 6 【1 2 】v o t a v o v 毛h ；k u c e r o v f i , d ；f e l s b e r g ，j ；s p o n a r , j c h a n g e si nc o n f o r m a t i o n ， s t a b i l i t y a n dc o n d e n s a t i o no fd n ab yu n i v a l e n ta n dd i v a