（微生物学专业论文）乳球菌素生产工艺的研究.pdf

ab s t r a c t t h i s p a p e r m a i n l y s t u d i e d t h e o p t i m i z i n g o f t h e m e d i a u s e d i n t h e p r o d u c t i o n o f n i s i n b y l a c t o c o c c u s l a c t i s s u b s p . l a c t i s a n d t h e m e t h o d s o f r e c o v e ry o f n i s i n . f u r t h e r m o r e , t h e mi d d l e - s c a l e t e s t was c o n d u c e d i n 5 0 l b i o r e a c t o r . o n t h e b as i s o f n o . 5 m e d i a , t h e o r th o g o n a l e x p e r i m e n t s w e r e c o n d u c e d a n d t h e p a r a m e t e r o f o u t p u t - p e r - c o s t w a s p u t f o r w a r d as a c r i t e r i o n i n s e l e c t i n g o p t i m u m c o m p o s i t i o n o f m e d i u m . wi t h t h e o p t i m i z e d m e d i u m , t h e n i s i n p r o d u c t i o n l e v e l i n f e r m e n t a t i o n i n 5 0 l b i o r e a c t o r w a s u p t o 6 0 0 0 1 u / m l . t h e o u t p u t - p e r - c o s t w a s i n c r e a s e d b y 3 9 %. i t s e r v e d as a s t r o n g b as i s o f la r g e - s c a le p r o d u c t i o n . d i ff e r e n t p r o c e d u r e s i n t h e r e c o v e ry o f n i s in w e r e s t u d i e d . t h e r e s u l t s o f t h e s e t e s t s s h o w e d t h a t f i l t r a t i o n c o u l d s a t i s f y a l l t h e r e q u e s t s t o t h e i s o l a t i o n o f c e l l s i n p r o d u c t io n . t h i s m e t h o d a l s o j o i n e d t h e u p s t r e a m a n d d o w n s t r e a m s t e p s m o o t h l y . f u r t h e r i s o l a t i n g o f n i s i n w as c o n d u c e d b y e x t r a c t i o n t h a t p r o v e d t o b e s i m p l e b u t s t e a d y a n d e ff e c t i v e . t h e d e s i c c a t i n g o f n i s i n w a s c o n d u c e d b y n u b i lo s e t h a t w as as e ff e c t i v e as l y o p h i l i z e r . wi t h s u c h p r o c e d u r e s , t h e o v e r a l l r a t i o o f n i s i n r e c o v e ry w as 8 0 % t o 8 3 % . t h e s a m p l e s o b t a i n e d i n e x p e r i m e n t p r o v e d t o s u i t t h e s t a n d a r d o f g b . k e y w o r d s : n i s i n f e r m e n t a t i o n r e c o v e ry 南开大学硕 l 学位毕业论文 前言 在食品工业中， 各类食品的防腐保鲜始终是一个重要问题， 据估计， 全世界每 年约有 1 0 % - 2 0 %的食物损失于各种腐败。为了延长食品的保藏期限，人们在食品 加工过程中，一方面采取消毒处理，另一方面是添加防腐剂。 最初， 人们普遍使用的是化学防腐剂， 无机的如亚硝酸钠， 有机的如苯甲酸钠、 富马酸二甲醋等， 但是这些化学防腐剂都对人体有或多或少的毒害作用， 对自 然界 的 生态 环境也 会产生不利 影响 i 。 随 着人民 生 活水平的 提高以 及环境观念的 不断 增 强， 健康食品、绿色食品的概念已经越来越被大众接受。因此， 对高效、无毒的天 然防腐剂的研究和应用也越来越引起人们的重视。 r球菌素 ( n i s i n )是一种由微生物代谢所产生的具有很强杀菌作用的天然代 谢产物。它的抑菌范围主要是各种g+菌及其芽抱，而一般对g 一 菌和真菌等不起作 用2 1 对食品工业来说， n i s in已 经作为一种非常重要的天然食品防腐剂进行了广泛 的应用，应用领域主要包括奶及奶制品 ( 包括鲜牛奶、奶粉、酸奶、奶酪等等) 、 罐头 食品、 肉 类食品、 鱼类、以 及酒精 饮料等等3 1 。 在牛 奶及其副产品 加工 和罐头 食品的生产中，n i s i n的应用特别有意义，因为在这些食品加工中，往往需要采用 巴氏消毒法进行消毒，由于杀菌温度较低，虽可杀菌，但往往残留有耐热性芽抱， 如果在适宜条件下存放时间过长， 仍然会出 现变质现象3 1 。而n i s i n 则对芽 抱有很 强的杀灭能力，只需把很低浓度的n i s i n i o i u / n il )加入到牛奶及其制品中，使其 经过 较 低的 温 度处理 后就可以 长时间 存放而不变质4 1 。 由 于 用高 温加热的 方 法处 理 鲜牛奶，会破坏其风味，所以使用n i s i n 做为食品防腐剂加入到鲜牛乳中，不但能 够有效延长保质期， 而且不影响其风味。 国外到目 前为止已 经有很多关于乳制品中 添加n i s i n 来延长货架期的报道。另外在酒精饮料生产中， 有时 会被杂菌污染而影 响产品的品质， 也可以通过加入n i s i n 来防止杂菌污染。 在这种情况下，由于n i s i n 对酵母菌不起作用， 可在酒的发酵过程中加入，以抑制天然乳酸菌的生长， 从而使 南开大学硕_ l 学位毕业论文 由 苹果酸转化为乳酸的发酵过程得到控制【 。 n i s i n本身具 有许多 优良 性质ls l ,首 先， 容易 被人体消 化道中的 一些蛋白 酶如 胰蛋白 酶所降解， 不会在体内蓄积而引起不良 反应。 并且对食品的色、 香、 味、口 感等无不良影响。 它的使用还可以降低杀菌温度， 减少热处理时间，因此能改进食 品的营养价值、 风味、 结构、 颜色等性状， 同时还可节省能耗， 增加有效工作时间， 从而可增加产量。n i s i n 本身具有热稳定性，并耐酸、耐低温贮藏。可以说， n i s i n 是一种理想的天然食品防腐剂，可以而且必将获得越来越广泛的应用。 一、 n i s i n 的发现简史和国际标准 1 9 2 8 年， l .a . r o g e r s 等美国 研究人员发现乳链球菌( s t r e p t o c o c c u s l a c t i s ) 代谢物 能抑制乳酸菌生长。1 9 3 3 年w i t e h e a d 提出这种抑制物的本质是一种多肤。1 9 4 7 年 m a t t i c k a .t .r . 等人从乳酸链球菌发酵液中制备出了 这种多肤物质， 并指出它们是由 血 清学n群中的 一些乳酸菌 所产生的 抑菌物质， 他命名其为n i s i n ( 取自n i n h i b i t o ry s u b s t a n c e ) 16 1 . 1 9 5 1 年， h ir s h 等 人 首 先 将n is in 用 于 食品 防 腐， 成 功 地 控 制了 肉 毒 梭菌引 起的 埃氏 奶酪的 膨胀腐败7 l 。 从 此引 起了 世人对n i s i n 做为 食品防 腐剂的 重 视，有关研究也广泛开展起来。到 1 9 5 3 年， n i s in的第一种商业化产品n i s a 内 n 在英国面世。 1 9 6 9 年， 英国 食品防腐剂委员 会( f a o ) 和世界卫生组织联合会食品添 加剂专家委员会( w h o ) 确认n i s i n 为 食品防腐剂， 这也是第一个被批准用于食品中 的细菌素。到 1 9 9 0 年为止，已有包括中国、美国、英国等在内的5 0 多个国家和地 区 批准n i s i n 做为一种天然食品防腐剂使用8 - 1 2 1 1 9 6 4 年t a m e r j . 建 议使用1 r u ( r e a d i n g u n i t ) 表示每 微克纯乳酸 链球菌素 制备 物中存在活性的量。1 9 7 0年世界卫生组织微生物标准委员会制订乳酸链球菌素的 国际标准计量单位为fu, i i u为n i s i n 对敏感菌株可产生抑制作用的最小量，并规 定1 r u = 4 0 i u 。 在研究中， 还有一些单位也同时使用， 如a u等， 其中l i u = l 0 0 a u s 0 二、 n i s i n 的分子生物学研究现状 ( 一) n i s i n的分子结构 n i s i n是一种多肚类细菌素，成熟分子仅含有 3 4个氨基酸残基，其分子量为 南开大学硕士学位毕业论文 3 5 1 0 d a ，另外，其二聚体和四聚体分子也有报道，分子量分别为7 0 0 0和 1 4 0 0 0 . 对于n i s i n 单体，含有5 种稀有氨基酸，分别是a b a( 氨基丁酸) 、d h a( 脱氢丙 氨酸) 、 d h b( 0 一 甲基脱氢丙氨酸) 、 a l a - s - a l a( 羊毛硫氨酸) 、 a l a - s - a b a( 0 一 甲 基羊毛 硫氨酸) 。 通过硫醚键形成5 个环( 图1 ) a d h b : b - m e t h y ld e h y d r o a l a n in e b 一 甲 基脱 氢丙 氨酸 a l a - s - a l a : l a n t h io n i n e羊毛硫氨酸 a l a - s - a b a : b - m e t h y l la n t h io n in e b 一 甲 基 羊 毛 硫氨酸 其他的符号为氨基酸简写符 图1 n i s i n 的分子结构图 f i g . l s t r u c t u r e o f n i s i n mo l e c u l a r 在转译水平上，n i s in前体分子含5 7 个氨基酸，其中2 3 个残基位于引导区， 3 4个残基在结构区，通过一系列的转译后修饰作用，去掉引导区部分，结构区的 丝氨酸和苏氨酸在特殊位点脱水， 形成d h a和 d h b ， 脱水氨基酸和半胧氨酸间通 过硫醚键形成羊毛硫氨酸和0 一 甲 基羊毛硫氨酸 13 1 n i s i n 天然状态下主要有两种形式，分别为n i s i n a和n i s i n z ，它们之间的差别 在于氨基酸顺序中第2 7 位氨基酸不同， 在n i s i n a中是组氨酸， 在n i s i n z中是天 冬氨酸， 在其基因结构上的第1 4 8 位脱氧核昔酸不同是造成差别的根本原因。 一般 而言， 在同 样浓度 下， n i s i n z 的 溶解度和 抑菌能力比n i s i n a要强 2 ,1 4 , 1 5 1 ( 二) n i s i n 抑菌作用的分子基础 南开大学硕士学位毕业论文 n i s i n抑菌作用的分子基础是近年来的研究热点之一，并不断取得突破。很长 一段时间以来，人们便注意到，n i s i n被微生物吸附是其杀菌作用所必需的。如果 在体系中 加入炭等 吸附 剂， 可以 使杀 菌时 间 显著延长。 r a m s e i e r 2 2 1报道n i s i n 对敏 感菌 有 强 烈 吸附 作 用， 并 受p h的 影响 很 大， 在p h 6 .5 时 吸 附率 达1 0 0 % ， 在p h 4 .5 时仅为4 3 %。 研究表明， n i s i n 可以引 起敏感菌细胞质的释放， 从而造成细胞裂解。 由于n i s i n 带有正电荷，经它处理后的细菌细胞紫外吸收物质有泄露现象。因此有 人提出n i s i n 对于敏感菌细胞膜的作用类似于阳离子表面活性剂。又因为n i s i n中 的d h a和d h b可以 与敏感菌细胞膜中某些酶的疏基发生作用，因此也有人认为 n i s i n的作用机制与这两个脱水氨基酸有关 1 6 1 。另外， 还有人提出n i s i n的作用机 制主 要 是消 耗 敏感 细 胞的 质 子 驱 动 力( p m f , p r o t o n m o t i v e f o r c e ) 1 17 . “ 】 ， n is i n 对 营 养细胞的作用主要是在细胞膜上，它可以抑制细菌细胞壁中肤聚糖等的生物合成， 使细胞膜和磷脂化合物的合成受阻， 导致细胞内 物质外泄，引 起细胞裂解(2 0 1 近年来， 一 些 研究人员 提出了 一 种孔 道形成 ( p o r e f o r m a t i o n ) ” 理论， 指出 : 由于n i s i n 是一个疏水的带正电荷的小肤，在一定的膜电位存在下，吸附于敏感菌 的细胞膜上，并可通过其 c末端的作用侵入膜内而形成通透孔道 ( 因此有人认为 n i s i n 也属于孔道形成蛋白) ， 由于其分子的特殊的三级结构( 图2 ) ( p r o t e i n b a n k ) , 可允许分子量小于0 . 5 k d a 的亲水分子通过， 而导致k 从胞质中流出， 细胞膜去极 a t p的泄漏，细胞外水分子流入，造成细胞膜内外能差消失，细胞自溶而死 2 1 . 2 2 . 2 3 1 图2 n i s i n 分子的三维结构 f i g 2 . t h e t r i - d i m e n s i o n c o n s t r u c t i o n o f n i s i n 南开大学硕 i s 学位毕业论文 为进一步研究n i s i n 分子机理， 有人利用了 脂单分子层体系研究， 发现n i s i n z 的n末端 ( 1 - 2 2 ) 进入到脂相中， 而c末端或许与n i s i n 的单体或寡聚体与阴离子 脂 类的 离 子 相 互 作 用有 关 2 4 1 通过对n i s i n 抑菌谱的研究，发现n i s i n 主要杀灭或抑制g , 菌及其芽抱，而对 g 一 菌基本无影响。对比 g + 菌和 g 一 菌的细胞壁， 可以发现 g 菌的肤聚糖层明显比 g 一 菌厚得多，而g 一 的细胞壁组成比较复杂，主要包括磷脂、蛋白和脂多糖 ( l p s ) 等，十分致密，仅能允许分子量在 6 0 0 d a以下的分子通过，而 n i s i n分子量约为 3 5 1 0 d a ，所以根本无法通过，因此， n i s in就无法到达细胞膜而发挥作用。同时， s t e v e n 等报道说经过处理而改变g 一 菌的外壁的透过性质之后， g 一 菌也对n i s i n 敏感， 同 样可以 被抑制或杀死 2 3 1 。 这也 证明了g 一 菌 对n i s i n 不 敏感是由 于 细胞壁的 作用。 在n i s i n 杀菌过程中， 其分子中所含的稀有氨基酸对n i s i n 作用方式影响很大， 对这一问题的研究进行的相当活跃， 主要是通过蛋白质工程的手段， 定向改变n i s in 分 子中 一 个 或 一 段 氨 基 酸的 组 成， 以 对其 功能 进行 研究 2 5 。 对 这 一 领 域的 研 究 将使 人们进一步了 解n i s i n 的作用机制，以 便扩大应用范围或增强作用效果。 综上所述，n i s i n 对微生物的作用首先是n i s i n 对细胞膜的吸附，在此过程中， n i s i n 能 否 通 过 细 菌 细 胞 壁 是 一 个 关 键 因 素。 同 时 ， 其 它 如p h , m g t 浓 度 、 乳 酸 浓 度、 氮源种类等均可影响n i s i n 对细胞的吸附作用2 6 1 。 带有正电 荷的n i s i n 吸附在 膜上后， 利用离子间相互作用， 及其分子的c末端、 n末端对膜结构产生作用， 形 成 穿 膜 ” 孔 道 ， 从 而 引 起胞内 物 质 泄 漏， 细 胞 解 体 死 亡 2 7 , 2 8 1 ( 三)n i s i n 合成的遗传学研究 编码n i s i n 的遗传密码的确切位置有两种理论，一种认为它与质粒连锁，另一 种则认为是在染色体上。 支持前一观点的主要证据有:1 9 4 7 年， k o z a k 研究产n i s i n 菌株的突变现象时 发现，若先以原黄素或澳乙锭诱变并进行高温处理，再以n t g进行诱变，未检测 到回复 突 变株。 并据此推测n i s i n 基因可能 位于 质粒上 (2 9 。 进一步 研究发 现， n i s i n 的 产生与一个1 7 . 5 m d a 的质粒有关13 0 0 1 9 9 1 年， k a l e t t a 和e n t i a n 从乳酸链球菌6 f 3 南开大学硕士学位毕业论文 的质粒中成功克隆到了 编码n i s i n 的结构基因 3 1 1 近十几年来，通过对质粒消除和接合转移实验的研究也证实n i s i n 基因位于质 粒上， 并 认为n is i n 产生 基因( n ip ,n is in - p r o d u c in g a b i l it y ) 、 蔗 糖发 酵 基因( s u e , s u c r o s e - f e r m e n t in g a b i l i t y ) 和n i s i n 抗性基因 ( n i s , n i s i n r e s i s t a n c e ) 是紧密连锁的 3 2 . 3 3 . 3 4 . 3 5 . 3 6 . 3 7 1 但是，另一些研究者认为n i s i n 基因位于染色体上，并有一些实验证据证明一 些 产n is in 的 菌 株中 并 不 存 在 质 粒 3 8 . 3 9 . 4 0 1 。 在 接 合 转 移 实 验中 ， 虽 然 供 体 菌 的n ip . n i s , s u e 的性状可以向受体菌转移， 但在接合子中并未分离到质粒， 分离供体菌、 受体菌和转移接合子染色体d n a和质粒d n a ，分别与和n i s i n 基因互补的1 4 寡 核昔酸探针杂交，结果显示该探针与供体菌和转移接合子染色体d n a片段有杂交 带， 而与 质粒d n a没 有杂交 带4 1 1 ， 从以 上实 验可以 看出n i s i n 的 产生与菌 株是否 带有质粒无必然联系。 对n i s i n 基因定位的研究最近取得了一些突破性进展，一些研究者根据对染色 体的缺失与杂交实验提出n i s i n 结构基因与染色体上的一个可接合转移的转座子有 关14 2 1 o h o rn等人则提出n i s i n 基因存在于一个7 0 k b 大小的转座子t n 5 3 0 1 中4 3 1 同时另一些研究者的工作也证实了这个转座子的存在，且发现n i s i n 基因座是不稳 定的4 4 . 4 5 . 4 6 1 。 这些发现可能提示我们n i s i n 基因位于一个可转座于质粒和染色体上 的转座子中，在不同的菌株中，n i s i n基因的位置不一定相同。这样，由于位于质 粒和染色体上的基因的表达效率的差异， 使得菌种选育工作显得十分重要。 1 9 8 8 年， n i s i n 基因首次被克隆出来 4 7 1 不同于大部分的多肤类抗生素， n i s i n前体蛋白是由核糖体合成，经过一系列 包括脱水、 硫环形成等一系列复杂的翻译后加工过程， 最终形成有活性的成熟n i s i n 分 子。 e n g e l k e 等则进一步 研究了 有关于 翻译 后 修饰和 加工的 基因， 提出 这些基因 与 n is in 结 构 基 因 是 紧 密 连 锁 的 4 2 ,4 9 ,50 1 对n i s i n遗传学研究的深入，将使我们有可能定向改变n i s i n 的溶解度、稳定 性、抑菌范围等，对于n i s i n的应用前景有着重大而深远的意义。 三、 n i s i n 生产工艺的 研究现状 南开大学硕士学位毕业论文 ( 一) n i s i n 生产菌株的筛选 目 前主要是利用n i s i n 产生菌中n ip n i s s u c + 紧密连锁的原理， 在添加乳链菌 肤、 蔗糖及滨甲酚紫的选择培养基上，从牛奶样品中定向筛选n i s i n 产生菌。也有通过 检测在b c p - c a c 0 3 培养基中 溶钙圈 大小而间接选择n i s i n 生产菌方法的报道6 5 ( 二) n i s i n 的发酵生产 在n i s i n的生产中，主要是以乳链球菌 ( s t r e p t o c o c c u s l a c t i s ) 和乳酸乳球菌 ( l a c t o c o c c u s l a c t i s ) 作为生产菌， 通过诱变方法获得高 产菌株，并通过改变培养 基配方以 进一步提高产量。 其中， 对培养基配方的研究进行的较为活跃。1 9 4 7 年， ma tt i c k等人首先描述了大规模生产乳球菌素的方法，所用的培养基中含有葡萄糖 和酵母膏1 . h u r s t 等人 进一 步 研究了 不同 无机盐和有机盐在有葡萄糖和酵母膏组 成 的 培 养 及 对 于 乳 球 菌 素 产 量 的 影 响 12 1 。 在 工 业 化 方 面 ， l i p i n s k a 研究 了 有 关 工 业 废弃物， 包括牛乳和生产胰岛素的胰酶水解物培养乳酸乳球菌的实验， 取得了较好 的效果3 。 这样的研究一方面可以 扩大n i s i n 应用，另一方面，对营养要求与 产量 关系的研究有助于了解n i s i n 生物合成的途径和调控方式。 许多 研究小组己 经研究了 通气量，菌龄， 接种量大小， p h值等培养条件对于 乳球菌素产量的影响。 比 较典型的发酵条件为2 8 到3 0 0 c , 培养时间为1 2 到2 4 小时， p h值 控制在5 .0 到6 . 8 的 范围内 . 采用静止发酵或恒温低速震荡 培养已 获得足 够的 细胞数量。 乳球菌素的 工业化生产是利用控制p h的分批发酵的方式，以 全乳， 脱脂乳， 复合乳或者经木瓜蛋白酶，胰蛋白酶，胃蛋白酶水解牛乳蛋白质为原料生产的。 ( 三)发酵产物的后提取工艺 n i s i n作为一种食品添加剂必需要从发酵液中提取出来才能用于食品工业。自 从本世纪6 0 年代以来，有关的方法和手段不断被建立起来，目前主要的方法有: 1 .有机溶剂法:主要利用正丙醇作为主要的溶剂，因此也称正丙醇法。 它利用 正丙醇、丙酮、乙酸等有机溶剂沉淀n i s i n ，利用k h 2 p 0 4 等进行盐析，反复沉淀、 溶解的 过程，是一种经典方法， 但是其缺点是回收率低，回收产物活性低5 2 2 . 不断有报道说 n i s i n在一些固体颗粒表面的吸附。吸附剂包括硅酸、二氧化 _南 开 大 学 硕 士 学 位 毕 业 论 文 钦、 硅化合物 ( 硅酸钙、 二氧 化硅、 硅藻土 等) 5 3 1 。 近几年 还有关于n i s in 在生 产 菌表面的吸附的 报道。 通过吸附 性质提取n i s i n 主要通过改变体系的p h值， 当p h 在6 .5 - 7 .0 之 间 时 为 最 大 吸 附 ， 当 p h 在2 .5 - 3 .0 之 间 时 解 吸 附 5 4 ,5 5 ,5 6 ,5 7 1 3 . 近几年，一些利用新技术进行的提纯工艺也发展起来，如利用 x a d层析、 阳离子交换层析法二步提纯n i s i n 。 和利用免疫亲和层析法提纯n i s i 沪8 ,5 9 1 ( 四) 发酵产物的效价检测系统 n i s i n 可以 抑制g 十 菌的生长， 可用微球菌作检测菌， 测量其抑菌圈直径。 n i s i n 在中性溶液中的溶解度远小于其在酸性溶液中的溶解度， 这样使得它在琼脂平板中 扩散受影响。虽有一些方法，如用还原酶活性抑制剂、测定牛奶中酸产物的量、 或 测定o d值 ( 比浊法)等可以作为衡量n i s i n 量的标准。但扩散仍是一个十分重要 的技术， 特别是当琼脂中加入了1 %的t w e e n 2 0 后， 有利于扩散， 且t w e e n 2 0 的效 果比t w e e n 8 0 好。在0 .5 1 u / m l 到 l o i u / m l 的范围内，浓度的对数和抑菌圈直径呈 直线关系。 依之可作出标准曲线，再将待测样品与之比较，即可求出效价。 测定食 品中的效价要去除对照的影响。 近年来， 检测培养基又有一些改进， 如加入n a 2 h p 认 可消除降低p h造成的假抑菌圈现象， 提高 检测灵敏度。另外，还有一些如反相平 测 o d 2 1。 吸 收 等 一 些 用 于 相 关 目 的 的 方 法 的 报 道 6 0 ,6 1,6 2 ,6 3 ,6 4 1 总之，检测系统的发展趋势是:简化检测方法和提高检测灵敏度。 n i s l n 的应用前景 n i s i n能抑制大部分 g + 菌的生长，包括产芽抱杆菌 ( 如肉毒芽抱杆菌) 、 板四 腐败菌 ( 如嗜热脂肪芽抱杆菌) 、产胞梭菌等，而对酵母菌和霉菌等无作用。 耐热 ni s i n 还可和某些络合剂 ( 如 e d t a或柠檬酸)等一起作用，可使部分 g 菌对之敏感。 n i s i n 也可与现有的化学防腐剂结合使用，可以降低化学防腐剂的用量。 n i s i n也可以作为发酵副产物存在于奶酪、酸奶、腊肠、泡菜等食品中。许多 研究表明， 具有产细菌素能力的发酵剂在发酵过程中可以防止和控制不良 菌丝引起 的污染， 因此， 一般认为添加产细菌素的乳酸菌到食品中比直接添加细菌素更可取。 近些年的研究表明， n i s i n 的应用更加广泛，1 9 9 9 年， g a r c i a g r a e l l s等人报道 南开大学硕 : 学位毕业论文 在高的静水压力下n i s i n 可很好的抑制牛奶中的大肠杆菌16 1 1 ， c a l d e r o n - m i r r a n d m l 等人报道在交变电 场下n i s i n 可以 抑制脱脂牛奶和蛋类中李斯特菌生长16 6 ,6 7 1 . p o l i e 等人报道在香芹酚的协同 作用下n i s i n 可以 抑制杆菌b a c i l l u s c r e u s 的生长16 8 1 , t e r s t e e g p f 报 道 在亚 致 死 温度下n is i n 可以 抑制 酵 母菌的 生 长 6 9 1 ， p a s t e r n等人 报 道 在丙酸的协调作用下n i s i n 可以 抑制曲 霉， 镰刀菌等真菌的生长7 0 1 。 从以 上的报道 可以看出在其它条件协助下n i s i n 的抑菌谱有了广泛的扩展，已 经不只限于单纯的 g 菌，对g 一 菌，酵母菌和真菌大多数的微生物都有了一定的抑制作用。 我国是一个乳酸菌资源丰富的国家， 但对乳酸菌素的研究起步较晚， 所以要大 力进行乳酸菌素的基础研究和开发应用研究。 相信， 在二十一世纪， 作为一类具有 潜在广阔开发应用前景的天然食品防腐剂和饲料添加剂，n i s i n将对人类健康发挥 巨大作用。 南开大学硕 七 学位毕业论文 材料与方法 一、材料 1 .实验菌株 l a c t o c o c c u s l a c t i s s u b s p . l a c t is( 乳酸乳球菌 乳亚 种) ，乳球菌素的生产菌株 m i c r o c o c c u s l u t u e s( 藤黄微球菌) ，乳球菌素检测指示菌 2 .试剂 乳 球 菌素 标 准品( 1 0 0 0 i u / m g ) s i g m a 公司 t w e e n - 2 0天津天大化学实验厂 t w e e n - 8 0天津天大化学实验厂 葱酮北京化工厂 浓硫酸天津文达稀贵化学试剂厂 0 - 甘油磷酸二钠瑞士进口 琼脂粉日本进口分装 抗坏血酸天津化学试剂三厂 聚丙 烯酞胺天津大学试剂厂 c a c l :天津化学试剂三厂 a 1 2 ( s o 4 ) 3天 津化学试剂一厂 发酵培养基成分均为国产试剂 3 .仪器 n b s温控自 动发酵罐 b r o wn全自 动发酵罐 s g d - 5 0自 动发酵罐 p h s - 3 b型精密p h计 7 3 1 2 - i 型搅拌器 美国n b s 公司 德国b r o wn公司 浙江发酵设备厂 上海雷磁仪器厂 上海标本模型厂 南开大学硕 i. 学位毕业论文 l g j 0 . 5 型冷冻干燥机 c n f - 4 c型喷雾干燥机 t ms - 1 多层过滤器 2 0 p r - 5 2 d冷冻高速离心机 北京四环科学仪器厂 沈阳发酵研究所 海宁市天水滤材公司 日立公司 4 培养基配方( w / w ) l b 18 i : p e p t o n e 1 % ; b e e f e x tr a c t 0 .5 % ; y e as t e x t r a c t 0 . 1 % ; n a c l 0 .5 % ; p h 7 .2 c m l9 1 : s u c r o s e 1 % ; p e p to n e l % ; y e a s t e x tr a c t 1 % ; k h 2 p o 4 1 % ; n a c l 0 .2 % ; mg s 0 4 0 .0 2 % p h 6 . 9 m 1 7 1 1 : p h y t o n e 1 % ; b e e f e x t r a c t 0 .5 % ; y e a s t e x t r a c t 0 .2 5 % ; v c 0 .0 5 % ; mg s 0 4 0 .0 2 5 %; n - p - g - p 1 .9 % ; p h 6 .9 m 1 7 g s l6 l : p e p t o n e 1 % ; b e e f e x t r a c t 0 .5 % ; y e a s t e x t r a c t 0 .2 5 % ; v c 0 .0 5 % ; m g s 0 4 0 . 0 2 5 % ; n - 0 - g - p 1 .9 % ; s u c r o s e 1 7 . 1 6 % ; g l u c o s e 0 .5 % ; p h 6 .9 l t b 19 l : m e a t e x tr a c t 1 % ; y e as t e x t r a c t 1 % ; t ry p t o n e 1 % ; g lu c o s e 1 % ; n a c l 0 . 5 %; k h 2 p o 4 0 . 2 %; p h 6 . 8 二、方法 1 .菌株的保存和活化 1 . 1 培养基的配制 l b培养基用于mi c r o c o c c u s l u t u e s 的保存与活化。 m 1 7 g s 培 养 基用 于l a c t o c o c c u s l a c tis s u b s p .la c t is 的 保存。 c m培 养基用于l a c t o c o c c u s l a c t i s s u b s p .l a c t is 的 活化。 1 .2菌株的保存 取l m l 的细菌培养物， 加入0 .2 5 m 1 无菌甘油 ( 于1 .0 3 4 x 1 0 5 p a 高压下蒸汽 灭菌2 0 分钟) ，振荡使培养物与甘油充分混匀，于一 3 0 长期保存。 1 3菌株的活化 取一管保存的菌株，待其融化后， 用无菌的接种针取一环，在 m 1 7 g s 南开大学硕 上 学位毕业论文 的斜面上画线。 菌株管重新放置于一 3 0 保存， 平板放置于培养箱过夜培养。 l a c t o c o c c u s l a c t is s u b s p . l a c t is的培养温度为3 0 0c , m i c r o c o c c u s l u t u e s 的培 养温度为3 7 0c o 2 .乳球菌素的发酵及检测 2 . 1发酵菌株的再活化 将已活化的菌株斜面用无菌的接种针接于5 m l 无菌的c m液体培养基中， 静止放置于 3 0 培养箱中培养 2 4小时。然后按 3 % 的接种量转接于 c m液体培 养基中培养 1 8 小时作为发酵的种子液。 2 .2培养基的配制 按设计配方准确称取各组分， 溶于蒸馏水中， 用i o n的n a o h调整p h值， 于 1 .0 3 4 x 1 0 5 p a 蒸汽灭菌 2 0 分钟。 2 .3乳 球菌素的活性测定 2 .3 . 1检测培养基的配置 培养基配方 为 优化的 检测配方( g / 1 ) : 蛋白 陈 1 0 ， 牛肉 膏 3 ， 酵母粉 1 .5 , 葡萄糖 1 ,氯化钠 3 ，琼脂粉 7 .5 , 磷酸氢二钠1 0 . 2 . 3 .2乳球菌素标准溶液的配置 准确称取l o m g 乳球菌素标准品( i o o o i u / m g , s i g m a ) ，溶于5 m l 的0 .0 2 n 的h c l 中， 放置待其完全溶解后， 用0 .0 2 n的h c i 稀释至合适的浓度， 绘制标 准曲线。 2 .3 . 3乳球菌素的活性测定方法 乳球菌素 活性测定 采用琼 脂孔 扩散 法( a g a r w e l l d i ff u s i o n m e t h o d ) ， 方 法 见参考文献1 5 3 1 ， 并稍加改变: 先加入 0 .2 % ( v / v )已 灭菌 ( 1 .0 3 4 x l o sp a高 压 下蒸汽灭菌2 0 分钟)的t w e e n 2 o : 水 ( 1 : 1 , v / v ) ，待固体分析培养基融化并冷 却至4 2 0c ，再加入2 % ( v / v )的m i c r o c o c c u s l u t u e ， 菌液，混合均匀后铺平板， 每个平板中要加入2 5 m 1 的培养基。 凝固后， 倒置4 保存。 用6 - 7 ，的无菌的 打孔器打孔，每孔加入 5 0 u 1 的待测溶液，待溶液扩散后，3 0 培养 2 4 小时。 南开大学硕 l 学位毕业论文 用卡尺测量抑菌圈的直径，根据标准曲线得出待测溶液的乳球菌素含量。 3 .乳球菌素发酵生长曲线的测定 3 . 1效价的测定 参考2 .3 . 3 3 .2菌体生长的测定 取0 .5 m l 的发酵液， 加入3 . 5 m l 的蒸馏水， 用7 2 1 分光光度计测定其在6 0 0 n m 波长处的光吸收。 3 .3氮的测定 精确吸取去除菌体的发酵液 l o m l ，放入 2 5 0 m l的消化瓶中，加入硫酸钾 0 .6 g . 1 0 % 的 硫酸铜4 m l 和浓硫酸6 m l ， 先微火加热，待反 应稳定后加热使溶 液变澄清，转移至5 0 0 m l 圆底烧瓶中， 加入氧化镁 1 g以 及饱和n a o h溶液 6 0 m l ， 再加入蒸馏水 2 0 0 m 1 ， 安装好装置. 在三角瓶中加入4 % 硼酸溶液3 5 m 1 , 加入甲基红一 澳甲酚绿指示剂 1 - 2 滴。 加热蒸馏当流出l 0 0 m l 即可。 最后用0 .2 n 的h c l 标准溶液滴定至兰色消失，呈灰红色为终点。 氮含量公式: 氮 含 量 ( g / m l ) 二 ( v ,- v 2 ) x n x 1 . 4 / w v 1 : 样品滴定消耗的h c 1 的m l 数 v 2 :空白滴定消耗的h c 1 的m l 数 n : h c 1 标准液的当量浓度 w :吸取的样品的量 3 .4糖的测定 称取葱酮0 .2 g 于l 0 0 m l 浓硫酸中作为葱酮试剂， 取蕙酮试剂4 m 1 和蔗糖标 准液 ( 0 .0 5 m g / m l ) i m l ， 迅速放置与冰浴中， 然 后沸 水浴 1 0分 钟， 用水 代替 蔗糖作为对照，冷却后测定在6 2 0 n m的光吸收 ( a值) 。 发酵样品的测定: 将发酵液稀释5 0 0 倍，取l m l 测定方法与蔗糖标准液的测定相同。 南开大学硕 l 学位毕业论文 糖浓度的计算: 样品的糖浓度 =样品的a值x标准液的糖浓度令标准液的a 值 4 .乳球菌素发酵液发酵后预处理 将发酵液用i o n的h c i 在搅拌下调整p h值为2 .5 ， 然后在9 0 加热一定的 时间。 5 .孚 l 球菌素发酵液的菌体分离 5 . l 离心法 发酵液经过预处理之后，利用管式离心机在 5 0 0 呢 下 离心 1 2分钟，去除 菌体收集上清。 5 2板框压滤法 经预处理的发酵液， 在一定的p h 及温度条件下，分别加入不同的阳离子， 以及聚丙烯酞胺，静置一小时待絮凝充分后，利用板框压滤。 5 3过滤法分离菌体 经预处理的发酵液， 利用过滤装置进行过滤分离菌体。过滤条件在适宜条 件下，按说明书进行。 乳酸菌素的提取 1吸附一 解吸附法 除菌后的发酵上清液 1 加入吸附剂， 1 调节p h 至6 . 5 ， 常温搅拌2 小时 1 5 , o o o g 离心2 0 分钟 沉淀( 留少量上清液待测) 南开大学硕士学位毕业论文 4 溶于水中， 用5 % 盐 酸调至p h 2 . 5 1 搅拌 2 5 分钟， 1 5 , o o o g 离 心2 0 分钟 上清液 ( 留样待测) 6 . 2溶剂提取法 除菌后的发酵上清液 1 用i o n n a o h 调节p h 至一定值 4 加入溶剂，并使之混匀， 4 静置 1 5 , o o o g 离心1 2 分钟 沉淀( 留少量上清液待测) 1 溶于用 1 m h c 1 调酸的水中 乳球菌素浓缩液 7 . 乳球菌素5 0 升自 控罐的中试发酵 7 . 1 菌种的制备 将己活化的保存菌株接种于c m 液体培养基， 放于3 0 0c 温箱静止培养2 4 h 。以 3 % 的接种量经二级放大至9 0 0 m 1 , 静止培养 1 8 小时。 7 . 2发酵 将菌种接种于发酵培养基中，接种后调节 p h = 7 . 5开始发酵，搅拌转数 1 0 0 r / m i n ， 培养温度3 0 0c 。同时打开p h 自 控装置， 用1 . 5 m o 1 / l 的氢氧化钠将 发酵液的p h 控制在6 . 2 左右，并随时用分光光度计于o d 6 0 0 处检测菌体浓度， 当菌浓达到最大并且在一小时内不再增长时，结束发酵。发酵条件如下: 发酵罐容积:5 0 l 培养基体积:3 0 l 培养基配方:因配方保密，故省略 接种量:3 % ( w / v ) 培养温度:3 0 c p h 控制:适宜p h 值 流加氢氧化钠浓度: 1 . 5 m o l / l 南开大学硕 卜 学位毕业论文 搅拌转数:1 0 0 r / m i n 8 .乳球菌素成品的制备 将提 取的 乳 球菌素 浓缩液测定效价 后， 按 1 0 0 0 i u / m g的 标准加入呈一定比 例的脱脂奶粉和 n a c l 。将制备的样品放置于一 3 0 c，冻实后放入冷冻干燥机中 进行冷冻干燥。或浓缩液直接在喷雾干燥塔内喷雾干燥。 一 一一 一一 一 一一 一一 -一 一一 一 _ _南 开 大 学 硕 士 学 位 毕 业 论 文 讨论 、培养基的优化: 本试验的生产菌一乳酸乳球菌 ( l a c t o c o c c u s l a c t i s )是一种需要复杂营养 物质中才能生长的微生物。从 6 0年代起，对于乳球菌素发酵培养基简化的研 究在不断地进行中。其中，b a r a n o v a 等人，使用一种从酶水解微生物菌体 ( 主 要是酵母菌)获得的蛋白质和维生素，和丰富的含氮物质代替昂贵的酪蛋白水 解物作为培养基，以及k a l r a 等人对于牛乳培养基的研究，都取得了良好的效 果。 通过大量实 验而筛选出的5 号培养基具有产量高 ( 最高为 7 3 4 0 1 u / m d的 优点， 但同时营养成份复杂， 成本较高的缺点也制约了其在工业生产中的应用。 因此， 我们需要一种成本低但产量不能下降过多的培养基进行今后的工业化规 模的生产。 在控制p h发酵的条件下， 通过