（微生物学专业论文）光合产氢细菌pba的分离鉴定、产氢特性和产氢系统群落分析.pdf

中文摘要 中文摘要 本文以光合细菌产氢为研究对象，对其在实验室规模上作了初步的理论研究，主要结 论如下： 1 从猪粪发酵活性污泥中分离得到1 株高效产氢菌株p b a 。参照伯杰氏系统细菌学手 册第9 版，经形态学、生理生化特征分析，与红假单胞菌相符合。基于1 6 sr d n a 构建的系 统发育树显示，菌株p b - a c - 和r h o d o p s e u d o m o n a s p a l u s t r i s $ 5 5 聚为一个分支，两者遗传距离非 常近。通过同源性序列多重比对和进化树分析结果确定该菌株归于沼泽红假单胞菌 ( r h o d o p s e u d o m o n a sp a l u s t r i s ) 。 2 以筛选得到的高效产氢菌p b a ( 沼泽红假单胞菌) 为研究对象，较系统地探讨了p h 、 温度以及光照强度等环境条件、微量元素、氮源、碳源以及其它矿质元素对p b a 菌株的生 长、产氢过程的影响，并运用正交实验方法对p b a 的产氢培养基进行了优化，得出了最适 宜其生长和产氢的培养条件。培养基各元素单因子实验结果方差分析显示，除c a c l 2 外，其 它所有成分均对实验结果产生显著性影响。正交实验得出，最适宜p b a 菌株产氢的培养基 组成为( 玑) ：乙酸钠4 0m m o l l ，谷氨酸钠1 5m m o l l ，m g s 0 40 3 ，n a c l0 4 ，k h 2 p 0 40 2 ， k 2 h p 0 40 6 ，n a h c 0 30 7 5 6 ，微量元素溶液lm l 。微量元素影响的正交试验结果表明，f e 、 m o 、m n 和n i4 种元素对p b a 菌株光合产氢的效果有显著影响，依次为f e m o m n n i 。 其他元素在所设范围内对产氢都有一定的促进作用，因此微量元素溶液配方仍为( g l ) - f e s 0 4 7 h 2 02 ，z n c l 20 1 ，m n c l 2 4 h 2 00 1 ，h 3 8 0 40 1 ，c o c l 2 6 h 2 00 1 ，n i c l 2 6 h 2 00 0 2 ， n a 2 m 0 0 4 2 h 2 0o 7 5 ，c u c l 2 2 h 2 0o 0 1 。对影响p b a 生长以及产氢环境条件的实验结果 表明，光强4 0 0 0l u x 、初始p h7 、温度3 0 c 最适宜该菌株的产氢。综合各个因素的最佳条 件，p b a 菌株在1 0 0m l 培养体积中，最高可产氢总量为1 4 0 3 3m l ，最大平均产氢速率达 2 0 9m l h g ( c d w ) ，最高产氢速率为3 0m l h g ( c d w ) ，底物最大转化率为3 8 9 。 3 研究了菌株p b - a 在产氢过程中固氮酶、吸氢酶活性和放氢活性的变化。结果表明， 固氮酶活性和菌株放氢活性变化趋势相一致，在第3 至4d 的快速产氢期，活性骤然升高， 之后开始缓慢下降，维持一段时间后，固氮酶活性保持在很低水平，而放氢活性基本消失。 中文摘要 而氢酶的吸氢活性表现为随着时间推移，慢慢呈上升趋势。综合这三者的活性变化，基本与 整个反应体系中总产氢历程和产氢量的变化相符合。 对菌株p b a 产氢过程中的细胞全蛋白作了s d s p a g e 分析，展示了其在时序上的表达 情况，结果显示其在组成和量的表达差异上变化不大。微量元素f e 、m o 和n i 是固氮酶和 氢酶的组成元素，因此对菌株的产氢影响较大。通过对不同元素缺乏情况下细胞全蛋白分析 表明，蛋白在不同培养条件下，表达组分和表达量都有明显差异，为以后研究产氢工程菌提 供了一定的基础。 4 利用d g g e 技术监测混合光合产氢反应器中群落结构的动态变化。v 3 1 6 sr d n a 的 d g g e 图谱反映了产氢系统中总体群落结构不同时段的多样性变化。从图谱分析可见，总体 菌群在数量上变化不大，但是在组成上却发生了很大的变化，图谱中始终存在、并保持相当 强度的条带代表了产氢主体光合细菌。p u f m 基因的d g g e 图谱反应了产氢系统中无氧 光合细菌多样性的动态变化。两者的图谱比较分析显示，后者较前者显示的群落多样性更为 复杂，表现为条带数目的增加和结构的复杂化。其中对典型克隆的割胶同收和测序分析表明， r h o d o p s e u d o m o n a sp a l u s t r i s 是产氢系统中主要的1 种优势产氢光合菌，在数量上始终保持 着一定的优势。对总的菌群结构和关键的无氧光合细菌多样性变化分析表明，在生物制氢反 应器中不同微生物种群具有协同和制约的复杂生态学关系，在制氢反应器不同状态运行下具 有时间和空间的组合效应，在特定生态位条件下具有种群功能综合特征效应。 关键词：光合细菌；沼泽红假单胞菌p b a ；培养基优化；酶活变化；光合制氢；p c r - d g g e i i 英文摘要 i s o l a t i o n ，h 2 一p r o d u c i n gc h a r a c t e r i z a t i o no fap h o t o s y n t h e t i c a l b a c t e r i u mp b aa n ds t u d yo nm i c r o b i a lp o p u l a t i o no fh 2p r o d u c i n g s y s t e m y i n gy a n l i n g ( z h e j i a n gu n i v e r s i t y , h a n g z h o u , 31 0 0 5 8 ) a bs t r a c t t h i st h e s i sd e a l sw i t ht h ep r e l i m i n a r yt h e o r e t i c a ls t u d i e so nt h ep h o t o s y n t h e t i ch y d r o g e n p r o d u c t i o ni nt h el a b o r a t o r ys c a l e t h em a i nr e s u l t so b t a i n e df r o mt h i ss t u d y a l ea sf o l l o w s ： 1 ah i g h l ye f f i c i e n th y d r o g e np r o d u c i n gp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i u m ，n a m e dp b - a ，w a si s o l a t e d f r o mt h ef e r m e n t a t i o ns u l l a g ew i t hp i gd u n g a c c o r d i n gt ot h e b e r g e y sm a n u a lo fs y s t e m a i c b a c t e r i o l o g y ) ) ，s t r a i np b - aw a si d e n t i f i e dt ob er h o d o p s e u d o m o n a sb a s e do nm o r p h o l o g y , p h y s i o - b i o c h e m i c i a la n da l m o s tc o m p l e t e 16 sr d n as e q u e n c e s t h e16 sr d n as e q u e n c e so f p b - aw e r e9 9 s i m i l a rw i t hr e p r e s e n t a t i v e so fg e n u sr h o d o p s e u d o m o n a sp a l u s t r i s p h y l o g e n e t i c a n a l y s i su s i n gn e i g h b o u r - j i o n i n gt r e e i n ga l g o r i t h m sa n db o o t s t r a pe v a l u a t i o nw i t ht h es o f t w a r eo f c l u s t a l xl 1 8 3s h o w e dp b aw a sm o s tc l o s e l yr e l a t e dt ot h et y p es t r a i no fr h o d o p s e u d o m o n a s p a u s t r ss 5 5 2 t h em e d i u mc o m p o n e n t s ( t r a c ee l e m e n t ，c a r b o ns o b r c e ，n i t r o g e ns o u r c ea n dt h eo t h e r m i n e r a le l e m e n t s ) a n dt h ec u l t u r i n gc o n d i t i o n s ( 1 i g h ti n t e n s i t y , p ha n dt e m p e r a t u r e ) w e r e o p t i m i z e df o rt h eb e s tg r o w t ha n dh y d r o g e np r o d u c t i o no fs t r a i np b - a - t h eo p t i m i z e dm e d i u m w a sc o m p o s e do f ( g l ) ：s o d i u ma c e t a t e4 0m m o l l ，s o d i u mg l u t a m a t e15m m o l l ，m g s 0 40 3 ， n a c l0 4 ，k h 2 p 0 40 2 ，k 2 h p 0 40 6 ，n a i - i c 0 30 7 5 6 ，a n d1m lt r a c ee l e m e n t ss o l u t i o n t h et r a c e e l e m e n ts o l u t i o nc o n t a i n e dc 吕l ) ：f e s 0 4 7 h 2 02 ，z n c l z0 1 ，m n c l 2 4 h 2 0o 1 ，h 3 8 0 40 i ， c o c l 2 6 h 2 00 1 ，n i c l 2 6 h 2 00 0 2 ，n a 2 m 0 0 4 2 h 2 00 7 5 ，c u c l 2 。2 h 2 00 0 1 t h e r e s u l t ss h o w e dt h a t ，f o u rt r a c ee l e m e n t s ( f e ，m o ，n ia n dm n ) h a das i g n i f i c a n ti m p a c to n p h o t o s y n t h e t i ch y d r o g e np r o d u c t i o n , w i t ho r d e ro ff e m o m n n i t h eo p t i m u mc o n d i t i o n s i i i 英文摘要 w e r el i g h ti n t e n s i t y4 0 0 0l u x , p h7a n dt e m p e r a t u r ea t3 0 ( 2 u n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n s ， s t r a i np b ac o u l da c c u m u l a t et h em a x i m u mh y d r o g e np r o d u c t i o ng a so f14 0 3 3m l ，r e a c ht h e m a x i m u ma v e r a g e2 0 9m l h g ( c d w ) a n dt h em a x i m u ms p e c i a lr a t eo fh y d r o g e np r o d u c t i o no f 3 0 m i h g ( c d w ) i nt h e1 0 0m lv o l u m e 3 t h er e i a t i o no fn i t r o g e n a s e ，u p t a k e h y d e o g e n a s ea n dh y d r o g e nr e l e a s ea c t i v i t yi nt h e h y d r o g e np r o d u c i n gp r o c e s sw a sa n a l y z e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tn i t r o g e n a s ea c t i v i t ya n d h y d r o g e nr e l e a s ea c t i v i t yh a dac o n s i s t e n tt r e n d ，b o t hi n c r e a s e dr a p i d l yi nt h e 3 - 4 t hd a y t h e n ，t h e a c t i v i t yd e c l i n e ds l o w l y m e a n w h i l e ，t h ea c t i v i t yo fu p t a k e - h y d r o g e nh a db e e nr a i s e dw i t ht h e t i m e i n t e g r a t i n go ft h ec h a n g eo ft h e i ra c t i v i t i e s ，i tw a sc o n s i s t e n tw i t ht h ec h a n g eo ft o t a l h y d r o g e ng a s t h ew h o l e c e l lp r o t e i ns d s - p a g em a po fp b - ai nt h eh y d r o g e np r o d u c i n gp r o c e s s d i s p l a y e dt h a ti t sc o m p o s i t i o na n dq u a n t i t yi nt h ee x p r e s s i o nh a dn os i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t t h e c h a r a c t e ro fw h o l ec e l lp r o t e i nc h a n g ei nt h ec u l t u r em e d i u ml a c k i n gd i f f e r e n tt r a c ee l e m e n t sw a s a n a l y z e dd u et ot h ei m p o r t a n c eo f t h et r a c ee l e m e n t sf e ，m oa n dn i t h er e s u l tr e v e a l e dt h a tt h e r e e x i s t e ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c e si np r o t e i nc o m p o n e n t sa n dq u a n t i t ye x p r e s s e du n d e rt h ed i f f e r e n t c u l t u r ec o n d i t i o n s a l lo ft h ec o n c l u s i o n sp r o v i d e dab a s i cf o u n d a t i o nf o rt h ef u t u r es t u d yo f h y d r o g e np r o d u c t i o n 4 ap c r - d g g e ( d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i so fp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) p r o t o c o lw a su s e df o rm o n i t o r i n gt h ed y n a m i cc h a n g e so ft h em i c r o b i a lp o p u l a t i o nd u r i n g p h o t o h y d r o g e np r o d u c i n gp e r i o d t o t a ld n aw a se x t r a c t e dd i r e c t l yf r o mt h em i x e db a c t e r i a l c o m m u n i t yi nt h er e a c t o ra n ds u b j e c t e dt op e rw i t hv 3 - 16 sr d n aa n dp u f mg e n ep r i m e r s ，a n d t h e nt h ea m p l i f i c a t i o n sw e r ea n a l y z e db yd g g e t h ed g g e p r o f i l e sd e m o n s t r a t e dt h ed y n a m i c s o fc o m m u n i t ys t r u c t u r ea n dt h es h i f to fm i c r o b i a ld i v e r s i t y , w h i c hc o r r e s p o n d e dt od i f f e r e n t r u n n i n gp e r i o d so ft h er e a c t o r t h eo p t i m a lh y d r o g e np r o d u c i n gc o m m u n i t yf o r m e do nt h e10 t h d a y u s i n gd g g ea n a l y s i sw i t ht h ep m 甜g e n ef r a g m e n t sw a ss u p e r i o rt ov 3 - 16 sr d n ar e g i o n g e n e sf o rd e t e c t i n gt h ed y n a m i cv a r i a t i o n so fp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i ap o p u l a t i o nd u r i n gh y d r o g e n p r o d u c t i o n t h ed g g ep r o f i l ew i t hp u f mg e n ef r a g m e n t sd i s p l a y e dm o r em u l t i p l ec l o n e st h a nt h e d g g e p r o f i l ew i t hv 3 - 16 sr d n ar e g i o n t h ec o m p a r a t i v es e q u e n c ea n a l y s i so fe x c i s e dd g g e b a n d ss h o w e dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ns p e c i f i cp o p u l a t i o ns t r u c t u r e sa n ds y s t e mp e r f o r m a n c e i t c o u l db ep r e s u m e dt h a tr h o d o p s e u d o m o n a sp a l u s t r i sw a so n eo ft h ed o m i n a n tc o m m u n i t y m e m b e r sf o rh y d r o g e np r o d u c t i o ni nt h er e a c t o r f r o mt h et w od g g ep r o f i l e s ，w ef o u n dt h a t i v 英文摘要 d i f f e r e n tp e r i o d so fh y d r o g e np r o d u c t i o nr e s u l t e du n d e rd i f f e r e n tn i c h ec o n d i t i o n s ，a n df o r m e d d i f f e r e n tm i c r o b i a lc o m m u n i t ys t r u c t u r e s m o r e o v e r t h e s e q u e n c ea n a l y s i sp r o v i d e d t h e i n f o r m a t i o nf o re n r i c h i n ga n ds e l e c t i n gt h et a r g e td o m i n a n tp o p u l a t i o n s w ec o u l dd e s i g na l l u p d a t e dr e a c t o rw i t ht h eh i g h l ye f f i c i e n th y d r o g e np r o d u c i n gp h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i at oe n h a n c e p h o t o - h y d r o g e np r o d u c i n ge f f i c i e n c ya n ds u b s t r a t ec o n v e r s i o ni nf u r t h e rs t u d y k e yw o r d s ：p h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a ；r h o d o p s e u d o m o n a sp a l u s t r i sp b - a ；m e d i u mo p t i m i z a t i o n ； c h a n g eo fe n z y m ea c t i v i t y ；p h o t o - h y d r o g e np r o d u c t i o n ；p c r - d g g e v 第一章文献综述 第一章文献综述 能源是人类社会赖以生存与发展的物质基础，一直受到全世界的广泛关注，它的需求与 利用直接关系到一个国家的经济和政治利益，可以说，“能源已经成为政治和经济力量的通 货，是国家之间力量等级体系的决定因素，甚至是成功和物质进步的一个新筹码，获得能源 成为2 l 世纪压倒一切的首要任务”。伴随中国经济持续高速的发展，能源问题已成为国内关 注的热点。由于经济发展、入口增长、环境保护、化石能源枯竭等方面的原因，发展洁净型 可再生能源已成为迫在眉睫的任务，而氢能是洁净型可再生能源中最引人注目的重要能源之 一 生物制氢的研究意义 1 1 我国的能源现状 能源和人类活动有非常紧密的关系，随着1 8 世纪工业革命人口数量的迅速增长，导致能 源快速消耗。据国际权威机构预测( h i r s c he ta 1 ，2 0 0 5 ；b e n t l e y , 2 0 0 2 ；a l e k l e t te ta 1 ，2 0 0 3 ) ， 以目前的开采速度计算，全球石油储量只能维持生产约4 0 年，天然气和煤炭分别只能供应 6 5 年和1 6 2 年左右。而我国面临着更为严重的能源短缺问题。 第一，我国是能源消耗大国，能源供需严重不平衡。2 0 0 6 年我国一次能源生产总量2 2 1 亿t 标准煤，同比增长7 2 ，生产原煤2 3 8 亿t ，原油1 8 4 亿t ，天然气5 8 5 亿m 3 ，成为仅 次子美国的世界第二大能源消费国。但我国石油的可采储备年限只有1 5 年，相对丰富的煤 炭资源也仅能维持8 1 年。据国务院发展研究中心预测，蛩j 2 0 1 0 年，我国石油供需缺口l 亿t ， 天然气缺口4 0 0 亿m 3 ( 柏镇等，2 0 0 7 ) 。能源已经成为制约我国经济和社会发展的决定性因 素。 第二，我国人均能源资源严重不足。我国人均石油储量不到世界平均水平的1 1 0 ，人均 煤炭储量仅为世界平均值的l 2 ，人均一次能源的消费量不到美国的1 1 8 ，仅为世界平均水 平的1 3 ( 郑明，2 0 0 7 ) 。 第三，我国不仅缺少化石能源，而且能源结构特殊，呈“富煤、缺油、少气”的格局， 与世界能源结构基本相反。其中煤占一次能源的比例为6 7 ，而石油、天然气比重则只占 第一章文献综述 3 0 0 旷2 0 ( 柏镇等，2 0 0 7 ) 。由于煤的高效、洁净利用难度大，因此，这种传统的能源结构 决定了能源消费活动要排放大量污染物，既造成城市环境质量恶化，又造成经济运行成本增 加。以煤为主的能源消费结构所带来的环境严重污染、煤炭燃烧的低效率和煤炭使用防污染 设施的缺乏，加大了环境保护的难度。我国的大气环境是典型的煤烟型污染。目前，我国已 是二氧化硫世界第一大排放国、二氧化碳第二大排放国。由燃煤排放的s 0 2 等所造成的酸 雨已危及2 4 个省、市、自治区，超过国土面积的4 0 ，给生态环境和国民经济带来了严重 的危害( 严陆光，2 0 0 6 ) 。在国际国内环境成本越来越显性化的趋势下，如果不尽快改变目 前的一次能源消费方式，我国将付出更多的环保代价。作为发展中国家，目前我国在京都议 定书框架下的权利多于义务，但作为世界第一大s 0 2 和第二大c 0 2 排放国，未来需要承担 更多的义务。 为了促进社会和谐与实现经济的可持续发展，开发化石燃料的替代能源特别是清 洁、高效、可再生的新能源是我国能源发展的总体趋势。2 0 0 6 年，国务院出台了“国 家中长期科学和技术发展规划纲要( 2 0 0 6 - - 2 0 2 0 年) ”，明确将太阳能、生物质能和氢能等 先进能源的开发和利用列为国家“十一五”及中长期科技优先发展主题，同时，相继启动了 “氢能的规模制备、储运及相关燃料电池的基础研究( 9 7 3 ) 等一系列项目。 1 2 氢能的研究进展 氢能是1 种理想的清洁能源，具有以下几个优势( d a s & v e z i r o g l u ，2 0 0 1 ；b e n e m a n n ，1 9 9 6 ； j o h n & t u r n e r , 2 0 0 4 ；傅秀梅等，2 0 0 7 ) ：单位重量燃料所含能量以氢气为最高，燃烧1g 氢放出1 2 2k 1 的热量，是乙醇的2 7 2 倍，甲烷的2 4 2 倍，甲醇的3 0 倍，并且燃烧效率 也最高( 比汽油高5 0 ) ；氢气在燃烧过程中只产生水，不产生烟尘、n o , 、s o 。、c 0 2 等 有害废物，是最清洁的燃料；易储存性，与难储存的电相比，具有显著的优越性；来 源多样性，并且是可再生能源。氢能利用形式多，即可燃烧产生热能，也可作为能源材 料用于燃料电池，或转换成固态氢用作结构材料。基于以上这些优点，氢作为能源载体将逐 渐替代石油，进入人们提出的“后石油时代”。但是要利用氢能必须制备氢能，所以氢的规 模制备是氢能应用的基础，因此，世界各国也相继推出氢经济发展规划和推动氢经济发展的 措施( 邵玉艳，2 0 0 7 ) 。 目前，氢的制备方法主要包括化学制氢技术、电解水制氢和生物制氢3 种方式( j o h n & t u m e r ，2 0 0 4 ) 。工业上获取氢气的方法主要是热解化石燃料或电解水。前者往往以消耗天然 2 第一章文献综述 气、煤和石油等不可再生资源为代价，同时伴随着大量的二氧化碳、硫化物、难降解有机废 水等污染物的产生，而后者虽然工艺过程简单无污染，获得的氢气含量较高，但因电耗大而 受到一定限制( 杨素萍等，2 0 0 2 ) 。因此，这些较成熟的传统制氢方法没有从根本上消除对 环境的污染，生产成本也普遍较高。 生物制氢是利用微生物在常温常压下对可再生能源，如太阳能、生物质能等的转化作用 来制取氢气的工程技术。生物制氢方法大致可以分为四类：厌氧发酵细菌分解有机质产氢、 生物光解水产氢、光合细菌光解有机质产氢和光合细菌和厌氧细菌的混合系统产氢( 杨艳等， 2 0 0 2 ；l e v i ne ta 1 ，2 0 0 4 ) 。生物制氢具有传统制氢技术所没有的独特优势：工艺条件温 和，通常在常温常压下进行；不产生硫化物、烟尘以及难降解有机废水；产生的气体 只包括氢气、二氧化碳、水蒸气，不需要脱硫、除尘，氢气分离纯化工艺简单；能利用 可再生能源，并可进行废物利用，如利用农林废物、市政污泥、垃圾、禽畜养殖粪便、过期 食品、食品厂废水等生物质产氢，在生产氢能的同时达到环境治理与废物利用的目的 ( b e n e m a n n ，1 9 9 7 ；樊耀亭等，2 0 0 3 ) 。由此可见，生物制氢是一种环境友好的氢能生产技术。 目前已有利用碳水化合物发酵取氢的专利，并利用所产生的氢气作为发电的能源。国外已设 计一些应用光合细菌产氢的优化生物反应器( u y a re ta 1 ，2 0 0 7 ) 。 2 微生物制氢的种类及其机制 1 9 3 7 年n a k a m u r a 最早报道了生物产氢的现象。已研究的常见产氢微生物见表1 1 ( p i n t oe la 1 ，2 0 0 2 ；g u a n ，e ta 1 ，2 0 0 4 ；y o k o ie ta ，2 0 0 1 ；l i ue ta l ，2 0 0 4 ；w a n ge ta 1 ，2 0 0 3 ； z h a n ge la 1 ，2 0 0 3 ；f a n ge ta 1 ，2 0 0 5 ；h ee ta 1 ，2 0 0 5 ；s h ie la 1 ，2 0 0 4 ) 。 表1 - i 常见产氢微生物列表 t a b l e l 1h y d r o g e np r o d u c i n gm i c m o r g a n i s m s 3 第一章文献综述 2 1 厌氧发酵细菌分解有机质产氢 厌氧细菌产氢是受氢酶催化，氢酶作为在发酵中所产生还原物的最终电子受体而起作 用，而在该类细菌内不存在固氮酶。厌氧细菌主要是通过丙酮酸脱羧途径和辅酶i 的氧化与 还原平衡调节途径产氢。前者是某些微生物为解决氧化还原中产生的多余电子( e 一) 所采取 的一种调节机制，其中产氢与氢化酶中的电子载体铁氧还蛋白( f d ) 存在着密切关系( 任 南琪等，2 0 0 2 1 洪天求等，2 0 0 3 ) 。 厌氧细菌的直接产氢过程均发生于丙酮酸脱羧作用中，可分为2 种方式：梭状芽孢 杆菌型；肠道杆菌型。厌氧细菌在产酸过程中通过不同发酵类型的偶联，存在n a d h 和 矿的再生和消耗，从而保证n a d h 和h + 与n a d 的平衡。发酵细菌可以通过释放h 2 的 方式将过量的n a d h 和一氧化： n a d h + 旷一h 2 + n a d + 其中n a d h 由厌氧菌经糖酵解途径产生： c 6 h 1 2 0 6 + 2 n a d + 2 c h 3 c o c o o h + 2 n a d h + 2 h + 该类群中以梭菌属( c l o s t r i d i u m ) 的产氢最为典型( m o i l m o t oe ta 1 ，2 0 0 5 ) 。有机物氧化产 生的n a d h 和h + 一般可通过与乙酸、丁酸和乙醇发酵等过程相连而使n a d 再生，但当 n a d h 和旷的氧化过程慢于形成过程时，为避免n a d h 和h + 的积累，细胞则以释放h 2 的形式保持体内氧化还原的平衡，包括甲酸产氢途径和葡萄糖产氢途径( 康铸慧等，2 0 0 5 ) 。 发酵产氢方法在工业制氢中的优势有( 李建政等，2 0 0 2 ；林明等，2 0 0 2 ) ： ( 1 ) 产氢速率高； ( 2 ) 可持续日夜产氢： ( 3 ) 其产氢系统具有适当的微生物生长速度。 4 第一章文献综述 2 2 生物光解水产氢 该产氢方法利用了植物和藻类的光合作用相同的反应过程，只是以氢气的生成代替了有 机物的合成，主要有绿藻和蓝细菌。二者均可光裂解水产生氢气，但放氢机制却不相同。蓝 细菌的产氢过程分为两类，一类是固氮酶催化的产氢，另一类是氢酶催化的产氢。两者的产 氢机制见图1 1 ( 杨素萍等，2 0 0 2 ) ： 图1 1 蓝细菌的固氮产氢与氢酶产氢 f i g 1 - lh y d r o g e np r o d u c t i o nb yn i t m g e n a s ea n dh y d m g e n a s ei nc y a n o b a c t e r 绿藻在光照和厌氧条件下的产氢是由氢酶介导。藻类产氢的最大缺陷是在产氢的同时也 产生氧气，而氧气除了能与氢气反应生成水外，还是氢酶活性的抑制剂，从而影响到产氢速 率，故该方法产氢效率极低( s m i t he ta 1 ，1 9 9 2 ) 。日本m i y a m o t o 曾利用c l o s t r i d i u m p a r a p u t r i f i c u m 的氮饥饿细胞在不断提供氩气的条件下进行户外产氢研究，但平均转化效率 仅为0 1 2 ( m i y a m o t oe ta 1 ，1 9 7 9 ) 。美国m e l i s 等通过“剥夺”莱因绿藻( c h l a m y d o m o n a s r e i n h a r d t i i ) 培养物中的硫以使这种藻类的c 0 2 固定和放氧过程与碳消耗和产氢过程分离开 来，这样细胞在光下就可以进行光呼吸好氧造成厌氧环境以使氢酶产氢顺利进行，但改造后 的这种绿藻产氢量只达到理论值的1 5 ( m e l i se ta 1 2 0 0 0 ) 。 2 3 光合细菌光解有机质产氢 自从g e s t ( g e s t & k a m e n ，1 9 4 9 ) 1 9 4 9 首次证明光合细菌可利用有机物光合放氢以来， 大量的生理生化研究主要用于揭示这种光合放氢机制，其主要的反应过程如下( d a s & v e z i r o g l u , 2 0 0 1 ) ； 5 第一章文献综述 ( c h 2 0 ) n - f e r r e d o x i n 专固氮酶今h 2 石刀左卯 光合细菌光合机构的核心是色素蛋白复合体，它包括捕光色素蛋白复合体( l hi 和l h i i ) 以及反应中心蛋白复合体( r c ) 。l hi 和l hi i 主要进行光能的吸收和传递，而r c 是 光能转化的最重要反应场所，它包括直接参与电荷分离和电子传递的组分。通过一系列的电 子传递与质子转位耦联建立起跨膜的质子梯度或质子驱动力，从而驱动了a t p 的合成，使 光能转变成化学能。 在限氮或提供产氢条件下，有机物光氧化产生的电子传递给铁氧还蛋白( f d ) 使之还原， 固氮酶的铁蛋白( 固氮酶还原酶) 在接受还原型f d 传来电子的同时将之氧化再生。在a t p 和镁离子的作用下，铁蛋白活化形成还原型的固氮酶还原酶a t p m 9 2 + 复合物。该复合物再 将电子转移给固氮酶的铁钼蛋白使之成为有活性的固氮酶，这时，固氮酶在没有合适底物时， 将旷作为最终电子受体使其还原产生分子h 2 ( 杨素萍等，2 0 0 2 ) 。 光合细菌的这种光合放氢( 图1 2 ) 几乎存在于所有被研究的紫色非硫细菌中，该过程 由固氮酶催化，依赖光照，需要有机物作为电子供体，提供能量和还原力( 朱核光& 史家 粱，2 0 0 2 ) 。尽管氢酶也存在于这类细菌中，但主要在吸氢方向上起作用。目前，利用光合 细菌光降解有机物产氢是目前最具发展前景的生物产氢方法，其主要优点如下( 康铸慧等， 2 0 0 5 ) ： ( 1 ) 理论底物转化效率高： ( 2 ) 反应不产氧，避免了氧对固氮酶活性的抑制作用； ( 3 ) 能利用较宽频谱的太阳光； ( 4 ) 能利用废水废弃物中的有机物为底物产氢，从而将产氢与废水处理相联系。 6 第一章文献综述 图l - 2 光合细菌的光合放氢途径 p s i 示光反应中心r c ；l h 示天线色素复合体i 和i i ；b c h l 示细菌叶绿素： b p h e 示细菌脱镁叶绿素；c o q 示泛醌；c y t b ，c 分别示细胞色素b 和c f i g 1 - 2t h ep h o t o - h y d r o g e np r o d u c t i o nb yt h ep h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i a p s i ：p h o t o s y n t h e t i cr e a c tc e n t e r ；l h ：a n t e n n ap i g m e n t sc o m p l e xia n d1 1 ；b c h l ：b a c t e r i a lc h l o r o p h y l l ； b p h e ：b a c t e r i a lc h l o r o p h y l lw i t h o u tm g ；c o q ：u b i q u i n o n e ；c y t b ，c ：c e l lp i g m e n t sba n dc 2 4 光合细菌和厌氧细菌的混合系统产氢 镪皤 粥麟 图l 3 光合细菌和厌氧细菌的混合生物产氢系统中葡萄糖的生化降解途径 f i g 1 - 3t h eg l u c o s eb i o c h e m i c a ld e g r a d a t i o np a t h w a yi nt h es y s t e mo f p h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i aa n da n a e r o b i cb a e t e f i a 混合系统由非光合细菌和光合细菌组成，它能有效提高产氢的速率和产率。非光合细 菌可利用各种形式的大分子有机物来发酵产氢，并且不需要光照。发酵生成的有机酸可被光 合细菌作为电子供体利用来产氢( s i n g he ta 1 ，1 9 9 4 ) 。厌氧细菌和光合细菌混合产氢的过程 如图1 3 所示( 康铸慧等，2 0 0 5 ) 。这两类细菌的组合不但减少了光合细菌的光能需求，同 时也提高了氢气的产量，因此该方法是最理想的微生物产氢模式，但有关两类菌在系统中的 7 第一章文献综述 平衡及合适的培养条件尚需进一步的研究。 3 光合细菌产氢相关的酶类 光合细菌产氢过程中的涉及到2 类关键酶：固氮酶和氢酶。对这2 类酶的结构功能及催 化机理的研究可为发展高效光合细菌制氢技术提供重要理论基础。 3 1 固氮酶 自从首次报道光合细菌在光照厌氧条件下可产生分子氢( g e s t & k a m e n ，19 4 9 ) 之后， 大量的生理生化研究揭示出，分子氢是光裂解有机酸所致，是与光合磷酸化偶联的固氮酶的 放氢作用，由此可见，放氢是同氮生物固有的一种特性。h i l l m e r 等认为，固氮酶在固氮的 同时伴随放氢作用，是细胞用来调节细胞体内闲置能量和还原力的一种机锘l j ( h i l l m e r & g e s t 1 9 7 7 ) 。当环境中没有任何固氮酶底物时，则通过固氮酶的全部电子都用于h + 的还原。g e s t 正是在以谷氨酸为氮源条件下才观察到光放氢现象的( g e s t & k a m e n 。1 9 4 9 ) 。 表l - 2 三种固氮酶的组分和活性比较 t a b l el - 2c o m p a r i s o no nc o m p o n e n ta n da c t i v i t yo f t h r e ek i n d so f n i t r o g e n a s e s 项目钼铁固氮酶钒铁固氮酶铁铁同氮酶 分子量m r 2 3 0 k2 1 0 k 2 1 6 k 亚基 a 2 1 32 a 2b2 d 2 q 2 1 32 ( d 2 ) 金属一m o 2 0 1 0 1 v 2 o 1 f e3 02 l2 4 比活性 2 0 0 01 4 0 02 3 0 电子流 7 0 n h 34 0 n h 32 0 n h 3 n 23 0 h 26