（无机化学专业论文）基于纳米材料和介孔材料电化学生物传感器的研究.pdf

西南大学硕士学位论文摘要 基于纳米材料和介孔材料电化学生物 传感器的研究 无机化学专业硕士研究生滕瑛丽 指导老师刘昌华副教授 摘要 近年来，基于直接电子传递的第三代生物传感器由于其制备简单、成本低、选择性好、 灵敏度高、易于微型化等特点，在临床诊断、环境监测、以及食品工业等领域具有广泛的应 用前景，从而引起了广泛的关注和研究。但是由于氧化还原蛋白和酶的反应活性中心深埋在 分子内部，并且在电极表面容易失活，使得其在电极表面难以进行直接电子传递。因此，采 用新技术和应用新材料以制备性能优良的第三代生物传感器成为目前研究的热点之一。其中， 应用纳米材料和介孔材料构建的第三代传感器得到了广泛的研究。由于纳米材料的物理、化 学以及电化学性能优良，并且还具有良好的生物兼容性，将其应用于生物传感器能够较大的 改善传感器的性能。介孔材料具有大的比表面积、独特的孔容结构以及单一的孔径，可以成 为理想的固酶载体。本学位论文将纳米铂、介孔二氧化锆以及二氧化钛空心球和血红蛋白组 装到电极表面构建了传感器。构建的传感器实现了直接电化学行为，并实现了在低电位下对 过氧化氢灵敏快速的检测。本论文主要做了以下几方面的研究工作： 1 、将血红蛋白和季铵化聚乙烯吡啶按一定比例混合，滴涂在表面修饰了纳米铂的玻碳电极 上，成功制备了性能良好的过氧化氢传感器。通过循环伏安法( c v ) 和计时电流法考察 了该传感器的电化学性质。最佳实验条件下，其峰电流值与h 2 0 2 浓度在3 5 1 0 西3 1 5 x 1 0 - 3 m o l l 成良好的线性关系，检测下限为1 5 1 旷m o l r t ( s n = 3 ) ，相关系数为0 9 9 9 2 。实验证 明该电极对过氧化氢具有响应快，灵敏度高、线性范围宽和稳定性好的性能。 2 、选用介孔二氧化锆作为固酶基质。在电解质溶液中，采用共电沉积法将血红蛋白和介孔二 氧化锆固定到金电极表面，制备了性能良好的生物传感器。采用红外分光光度法和紫外分 光光度法证明了介：j ：l - - 氧化锆对酶的活性没有影响。通过透射电镜和比表面测定表征了介 孔二氧化锆的孔状结构。研究7 p h 和工作电位对于传感器性能的影响，以及电极表面的直 接电化学行为。结果表明，电极表面存在良好的直接电化学行为，电子转移常数和电子传 递速率分别为0 6 4 和1 4 7s 。线性范围为1 7 5 x 1 0 - 7 - - 4 9 x l 旷3m o l l ，检测下限为1 0 x 1 0 - 。7 m o l l 。该传感器还具有较高的灵敏度，良好的稳定性和选择性。 西南大学硕士学位论文摘要 3 、将二氧化钛空心球和血红蛋白用共电沉积法固定在金电极表面制得了传感器，并对过氧化 氢进行了测定。采用红外分光光度法和紫外分光光度法证明了二氧化钛空心球对酶的活性 没有影响。通过透射电镜表征了二氧化钛空心球的空心结构。采用循环伏安法( c v ) 和 计时电流法考察了该传感器的电化学性质。传感器对过氧化氢有明显的催化作用。在 1 4 x 1 0 6 6 1 4 x 1 0 - 4 m o l l 范围内，电流和过氧化氢的浓度成线性关系，检出限为5 o x l 0 - 7 m o l l 。 关键诃：纳米铂；季铵化聚乙烯吡啶；介孔二氧化锆；二氧化钛空心球 n 西南大学硕士学位论文a b s t r a c t s t u d yo fe l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r sb a s e d o i l n a n o m a t e r i a l sa n dm e s o p o r o u sm a t e t i a l s i n o r g a n i cc h e m i s t r ym a s t e rp o s t g r a d u a t e ：y i n g l it e n g s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o f e s s o rc h a n g h u al i u a b s t r a c t t h i r d - g e n e t a t i o na m p e r o m e t r i cb i o s e n s o r s ，w h i c ha r eb a s e do nt h ed i r e c te l e c t r o n t r a n s f e r , a r eg a i n i n gm o r ea t t e n t i o ni nr e c e n ty e a r ss i n c ei th a st h ea d v a n t a g e si n c l u d i n g l o wc o a t , n i c e s e l e c t i v i t y , h i g hs e n s i t i v i t y , a s w e l la s e a s yp r e p a r a t i o n a n d m i n i a t u r i z a t i o n t h e yh a v ep o t e n t i a la p p l i c a t i o n si nc l i n i c a ld i a g n o s i s ，e n v i r o n m e n t a l ， m o n i t o r i n ga n df o o di n d u s t r y d u et ot h ee l e c t r o a c t i v ec e n t e r so ft h ep r o t e i n sa n d 锄_ z y m e se m b e d e dd e e p l yi nt h ep r o t e i ns t r u c t u r e ，a n dp r o t e i n sa n de n z y m e se a s y d e n a t u r a t e di nt h es u f a c eo fe l e c t r o d e ，i ti sd i f f u c u tt oc a r r yo u tad i r e c te l e c t r o c h e m i c a l r e a c t i o n t h e r e f o r e ，m u c ha t t e n t i o nh a sb e e np a i dt od e v e l o pn e wt e c h n o l o g i e sa n d m a t e r i a l sf o rt h ed e s i g na n df a b r i c a t i o no fe l e c t r o c h e m i c a lb i o s e n s o r s n a n o m a t e r i a l s a n dm e s o p o r o u sm a t e r i a l sh a v eb e e nu e s d w i d e l yt o c o n s t r u c tb i o s e n s o rw i t h o u t s t a n d i n gp e r f o r m a n c e t h ep e r f o r m a n c eo f b i o s e n s o rc o u l db ei m p r o v e dg r e a t l yb y t h ei n t r o d u c eo fn a n o m a t e r i a l s ，w h i c hi sd u et ot h e i rn o v e lp h y s i c a l ，c h e m i c a l ，c a t a l y t i c p r o p e r t i s ea n df a v o r a b l eb i o c o m p a t i b i l i t y t h em e s o p o r o u sm a t e r i a l sc o u l da sa ni d e a l m a t r i xd u et ot h e i rl a r g es p e c i f i cs u r f a c ea r e a , h i 曲s p e c i f i cp o r ev o l u m e ，a n do p e np o r e s t r u c t u r ew i t hp o r es i z ea d j u s t a b l ef r o m2t o5 0 衄i nt h i sp a p e r , w ef a b f i c m e ds o m e b i o s e n s o r sw i mp l a t i n u mn a n o p a r t i c l e ，m e r o p o r o u sz 而2a n dt i t a n i ah o l l o ws p h e r e s t h er e s u l t i n gb i o s e n s o r se x h i b i td i r e c te k e c t r o c h e m i c a lr e a c t i o na n dc a nb eu s e dt o d e t e r m i n eh y d r o g e np e r o x i d ei nl o wp o t e n t i a lw i t hh i 曲s e n s i t i v i t y t h ed e t a i l sa r e s u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 、ah i g h l ye f f i c i e n th 2 0 2b i o s e n s o rw a sf a b r i c a t e db a s e do nt h em i x t u r eo f h e m o g l o b i n ( h b ) a n dq u a t e m i z e dp o l y ( 4 一v i n y lp y r i d i n e ) ( q p v p ) a n dn a n o p tm o d i f i e d g l a s s yc a r b o n e l e c t r o d e t h ee l e c t r o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c so ft h eb i o s e n s o rw e r e s t u d i e db yc y c l i cv o l t a m m e t r ya n dc h r o n o a m p e r o m e t r y u n d e ro p t i m i z e dc o n d i t i o n s ， t h eb i o s e n s o re x h i b i t e dad y n a m i cr a n g eo f 3 5 x 1 0 。6t o3 1 5 1 0 一m o l lt oh 2 0 2w i t ha i i l 两南大学硕士学位论文 a b s t r a c t d e t e c t i o nl i m i to f1 5x10 6m o l la n dac o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n to f0 9 9 9 2 m o r e o v e r , t h e b i o s e n s o re x h i b i t e dh i g hs 锄_ s i t i v i t y , g o o dr e p e a t a b i l i t y , s e l e c t i v i t ya n ds t a b i l i t y 2 an o v e lh y d r o g e np e r o x i d eb i o s e n s o rh a sb e e np r e s e n t e dt h r o u g hf a b r i c a t i n g m e s o z r 0 2 一h bf i l mo n t og o l de l e c t r o d es u r f a c eb a s e do no n e - s t e pe o e l e c t r o d e p o s i t i o n f t i ra n di 嗍s s p e c t r o s c o p yd e m o n s t r a t e dt h a th e m o g l o b i n ( h b ) i nt h em e s o p o r o u s z r 0 2 ( m e s o z r 0 2 ) m a t r i xc o u l dr e t a i ni t sn a t i v es e c o n d a r ys t r u c t u r e t r a n s m i s s i o n e l e c t r o nm i c r o s c o p y ( t e m ) i m a g ea n dn 2a d s o r p t i o n d e s o r p t i o ni s o t h e r ms h o wt h a tt h e o b t a i n e dm e s o z r 0 2m a t e r i a lp r e s e n t sd i s o r d e r e dp o r o u ss t m c t u r ea n da p p r o p r i a t ep o r e s i z es u i t a b l ef o rt h ei m m o b i l i z a t i o no fh b t h ep e r f o r m a n c ea n df a c t o r si n f l u e n c i n gt h e r e s u l t i n gb i o s e n s o rw e r es t u d i e di nd e t a i lb ym e a n so fc y c l i cv o l t a m m e t r y ( c v ) a n d c h r o n o a m p e r o m e t r y a n a l y t i c a lp a r a m e t e r ss u c ha sp ha n da p p l i e dp o t e n t i a lw e r ea l s o s t u d i e d t h ee l e c t r o c h e m i c a lp a r a m e t e r so fh bi nt h em e s o z r 0 2m a t r i xw a sc a l c u l a t e d 丽t l lt h er e s u l t so ft h ee l e c t r o nt r a n s f e rc o c 伍c i e n t ( 口) a n dt h ea p p a r e n th e t e r o g e n e o u s e l e c t r o nt r a n s f e rr a t ec o n s t a n t ( 七i ) a so 6 4a n d1 4 7s 1 r e s p e c t i v e l y , i n d i c a t i n gg o o d f a c i l i t a t i o no ft h ee l e c t r o nt r a n s f e rb e t w e e nh ba n dt h em o d i f i e de l e c t r o d e t h e i m m o b i l i z e dh br e t a i n si t sb i o l o g i c a la c t i v i t yw e l la n ds h o w sh i g hc a t a l y t i ca c t i v i t yt o t h er e d u c t i o no fh y d r o g e np e r o x i d e ( i 1 2 0 2 ) a n dt h el i n e a rr a n g et oh 2 0 2w a sf r o m 1 7 5 x 1 0 - 7t o4 9 x 1 0 。3m o l lw i t had e t e c t i o nl i m i to f1 0 x 1 0 - 7m o g l ( s i n = 3 ) i n a d d i t i o n , t h es t u d i e db i o s e n s o re x h i b i t e dh i g hs e n s i t i v i t y , g o o dr e p r o d u c i b i l i t ya n d s t a b i l i t y 3 an o v e lt i t a n i ah o l l o ws p h e r e s ( t h s ) w e r ec h o s e na sa ni m m o b i l i z a t i o nm a t r i x ， t oc o n s t r u c tam e d i a t o r - f r e et h i r d g e n e r a t i o nb i o s e n s o r u v _ 1 皈sa n df o u r i e rt r a n s f o r m i n f i ：a r e df l a - m ) s p e c t r aa n a l y s i sd i s p l a y e dt h a tn os i g n i f i c a n td e n a t u r a t i o no c c u r r e dt o t h ei m m o b i l i z e dp r o t e i n t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y ( t e m ) i m a g es h o w st h e o b t a i n e dt h sp r e s e n t sh o l l o w s p h e r i c a ls t r u c t u r e t h ep e r f o r m a n c ea n df a c t o r s i n f l u e n c i n gt h er e s u l t i n gb i o s e n s o r w e r es t u d i e di nd e t a i l b ym e a n so fc y c l i c v o l t a m m e t r y ( c a n dc h r o n o a m p e r o m e t r y t h ei m m o b i l i z e dh br e t a i n si t sb i o l o g i c a l a c t i v i t yw e l la n ds h o w sh i g hc a t a l y t i ca c t i v i t yt ot h er e d u c t i o no fh y d r o g e np e r o x i d e ( h 2 0 2 ) a n dt h el i n e a rr a n g et oh 2 0 2w a sf r o m1 4 xl0 - 6t o6 1 4 xl0 - 4m o l lw i t ha d e t e c t i o nl i m i to f5 0 1 0 - 7m o l l ( s n = 3 ) i na d d i t i o n , t h es t u d i e db i o s e n s o re x h i b i t e d h i g hs e n s i t i v i t y , g o o dr e p r o d u c i b i l i t ya n ds t a b i l i t y k e y w o r d s ：p l a t i n u mn a n o p a r t i c l e ；q u a t e r n i z e dp o l y ( 4 - v i n y lp y r i d i n e ) ( q p v p ) ； m e s o p o r o n sz r 0 2 ；t i t a n i ah o l l o ws p h e r e s i v 独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了 标注。 学位论文作者：嫌磋溺 签字日期：y 口年q 月巩日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生部可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：国不保密， 口保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：雅姨：i 雨导师签名：韧1 澎湃 j i 签字日期： p 年牛月以日 签字日期： 脚年甲月河徊 、 f 西南大学硕士学位论文 第1 章 第1 章绪论 1 1 电化学生物传感器 生物传感器是一门涉及化学、生物学、物理学、医学、电子技术等诸多领域 的交叉学科，是电化学分析和生物技术研究最为活跃的领域之一。自2 0 世纪8 0 年代以来，生物传感器得到了广泛的探索和研究，并在环境保护、工农业生产、 临床疾病诊断等领域有着广阔的应用前景。在这些研究领域，生物传感器已经应 用于过氧化氢、抗原抗体、d n a 、有机酸、氨基酸的检测，但是真正商品化的生 物传感器为数不多。因此，生物传感器仍然需要进一步的研究和开发。 1 1 1 生物传感器的概念和原理 国际纯粹与应用化学联合会( 砌p a c ) 规定生物传感器的定义为：生物传感 器是一类以生物分子为分子识别元件结合换能器件构造而成的分析装置，能够和 生物识别成分( 与换能器元件保持有直接接触) 产生特定的定量的或半定量的分 析信息【l 】。1 9 6 2 年，c l a r k 首次提出将酶和电极组装起来用以检测酶底物的设想【2 1 。 自此，生物传感器得到了一系列的研究并获得了广泛的关注。生物传感器是一种 利用生物分子探测生物反应信息的装置。它将生物识别分子与变换器相结合，将 生物反应所引起的化学、物理变化变换成相关的电信号输出，通过电子系统进行 处理和显示。因此，任何一个生物传感器都具有三种功能：分子识别功能、信号 转换功能和信号处理功能。在传感器中，起到分子识别功能作用的是分子识别元 件( 感受器、感应器) ，它是由具有分子识别能力的生物活性物质或某些具有模 仿生物分子识别功能的化学分子构成( 酶、d n a 、激素、抗原、抗体和动植物组 织等) ，对被测定的物质具有高的选择性；起到信号转换功能的是信号转换元件 ( 变化器、转换器) ，通常是一个独立的化学或物理敏感元件，将生物反应中消 耗或产生的化学物质、光、热等转变为电信号；第三部分是信号处理器，将所得 的电信号经过处理后在仪器上显示或记录下来。其机理如f i g u r e l 1 所示： 1 1 2 生物传感器的发展历程 第一代传感器：1 9 6 7 年，u p d i k e f f l 】h i c k s 3 】利用酶的天然介体氧，将葡萄糖酶在 聚丙烯酰胺凝胶中固定化，覆盖在电极表面制成了世界上第一支葡萄糖酶电极， 这也是第一代生物传感器。但是由于对底物的测定是通过氧的减少量或h 2 0 2 的生 成量进行的，因此测定过程受氧气的影响较大，这对传感器的稳定性和灵敏度都 有一定限制。并且，酶电极的工作电位通常是在0 7v 左右，较高的工作电位会引 起抗坏血酸、尿酸、谷胱甘肽等干扰物质的干扰【4 】，影响了传感器的选择性。但是， 窒室耋耋墨老兰竺篁耋茎：茎 尽管第一代传感器具有不少的缺点它的诞生还是引起了人们对生物传感器技术 的研究的热情。 待测物质识别部位 干扰物质v 感应器+转化器+ 信号处理器 分子识别信号转换+信号显示、记录 图1 - 1 生物传感器的原理 f i g 1 - 1 t h e p r i n c i p l eo f b l o s e n s o r 第二代传感器：从十九世纪7 0 年代起，人们开始关注第二代生物传感器的研究。 1 9 8 4 年，a n t h o n yc a s s 博士首次发表了关于电子媒介体电极的研究报告 s l ，第二代 生物传感器是以二茂铁等小分子化合物做为电子媒介体，和酶一起固定在电极表 面制成的生物传感器【6 l 。媒介体的引入，取代了氧在酶和电极之间进行电子传递， 促进了电子传递的速率，克服了第一代传感器在高电位下可能带来的影响。相比 较第一代生物传感器，一定程度上改普了传感嚣的分析性能。对于第二代生物传 感器，选择合适的电子媒介体尤为重要。理想的媒介体有如下要求：1 工作电位不 能高于氧的还原电位。2 、还原性的媒介体不易和氧发生反应。3 、媒介体和酶之 间的电子传递速率要快。3 、媒介体不受p h 的影响。4 、媒介体应该是无毒的。但 常见的媒介体如二茂铁及其衍生物、铁氰化物以及一些有机染料( 如甲基蓝、甲 基紫) 和邻对苯二胺等【4 】一般都具有毒性，对p h 感应灵敏，并且易于氧化。因此 在传感器中引入媒介体，可能存在着污染电极、制作复杂、电活性物质干扰以及 测量电位较正等问题。 第三代传感器第三代传感器是将生物活性物质直接固定到电极表面，在无电 子媒介体存在下，生物分子和电极之间进行直接电子传递。与第一代和第二代生 物传感器相比，此类传感器不需要氧或其他电子媒介体作为电子传递体，固定化 西南大学硕士学位论文第1 章 相对简单，并且无外加毒性物质，是最理想的生物传感器。根据电子传递理论【7 8 1 ， 接、受体之间直接电极传递受酶的氧化还原活性中心与电极之间的电势差以及电 子传递过程中的能量转化影响，但是主要是由酶的活性中心和电极表面的距离决 定的。由于酶蛋白质的活性中心深埋在分子内部，很难和电极表面发生直接电子 传递，并且固定在电极表面后易发生变形，因此选择合适的固定生物活性物质的 基质在电极表面进行修饰形成良好的微环境，有利于蛋白质的固定、活性的保持 以及直接电子传递的实现。近年来，已研究了多种材料用于生物成分在电极表面 的固定，以实现电极上的直接电子传递。这些材料包括：有机导电聚合物【9 1 、凝胶 溶胶【1 0 1 、天然高分子材料【l l 】、金属纳米颗粒和非金属纳米颗粒【1 2 1 、插层复合物【13 1 、 介孔材料【1 4 】等。这些材料在完善蛋白质在电极表面的固定，使所制得的传感器的 稳定性、选择性、灵敏性都得到了较好的改善，使传感器得到了很好的发展。尽 管如此，第三代传感器还有很多方面值得研究完善，如何使其得到广泛的应用是 今后研究的主要方向。 1 1 3 生物传感器的分类 1 、根据分子识别元件所用生物功能材料不同，可将生物传感器分为酶传感器 【1 5 】、d n a 传感器【16 1 、微生物传感裂1 7 1 、免疫传感裂18 1 、组织传感器【1 9 】。其中电化 学酶传感器研究得较多，酶传感器是由固定化酶膜和各种电化学电极组合而成得 生物传感器，因而可以选择识别被检测物质，并且选择催化膜上的化学物质。酶 传感器可分为电流型传感器、电位型传感器和电导型生物传感器【2 0 1 。 2 、根据传感器的输出信号的产生方式不同，可将生物传感器分为亲和型【2 1 】和 催化型【2 2 1 。亲和型生物传感器利用生物活性物质对底物的亲和或键合作用，如抗 原和抗体间专一性识别及结合的性质来对抗原、半抗原或抗体进行检测。催化型 生物传感器是利用生物催化剂的专一性和催化性或底物对它的抑制作用，对其作 用的底物进行检测。 3 、根据生物传感器的信号转化器可以分为电化学生物传感器【2 3 】、压电生物传 感器【2 4 】、测热型生物传感器【2 5 1 、测光型生物传感器等。 1 1 4 生物传感器的制备方法 将生物功能物质固定在电极表面并保持生物功能物质的活性和所制备传感器 的稳定性，是制作生物传感器的最为关键的部分。为了研制灵敏度高、选择性好、 廉价和寿命长的生物传感器，固定化技术已成为科研工作者们研究和探索的目标。 经过多年的研究，已发展了多种固定化方法，大致有如下几种：包埋法、电化学 西南大学硕十学位论文第1 章 聚合法、电化学沉积法、直接吸附法及层层自组装法等。下面就几种在研究中常 用的方法进行介绍。 包埋固定法是把生物功能物质包埋于聚合材料的网络结构或微胶囊结构中。 包埋法的特点是一般不产生化学修饰，对生物分子活性影响较小，膜的孔径和几 何形状可任意控制，被包埋物不易渗漏，底物分子可以在膜中任意扩散，缺点是 分子量大的底物在凝胶网格内扩散较困难，因此不适合大分子底物的测定。 电化学聚合法是在电解液中，聚合单体和生物功能物质同时存在，通过恒电 位或电位循环伏安法使单体电氧化或还原聚合在基础电极表面，同时由于吸附或 静电作用可以将生物分子及其相关物质包埋于高分子膜内，直接固定于电极表面 构成生物传感器【2 7 】。采用电化学聚合法制备生物传感器，方法简单易行，并且易 于控制聚合物厚度和酶的固定量，有效防止蛋白质泄露。近年来，关于电化学聚 合法制备传感器的研究不仅停留在聚合高分子上，也逐步应用到无机化合物上，并 且制备了不少性能良好的传感器，如t o n g t 2 8 】等人在2 0 0 7 年利用此方法将辣根过氧 化酶固定在金电极表面。 电化学沉积法是基于某些化学物质在电化学氧化还原时，因溶解度变小而沉积 到电极表面产生难溶性薄膜的性质发展而来的。这种膜在进行电化学及其它测试 时，中心离子和外界离子的价态变化不会导致膜的破坏。目前关于电沉积的研究 多集中于金属及其氧化物、金属合金等。于此有关的研究有电沉积纳米金修饰电 极、电沉积纳米铂修饰电极、电沉积p a m a m h a 修饰电极等。 1 2 介孑l 材料和纳米材料在生物传感器上的应用 1 2 1 介孔材料在生物传感器上的应用 根据国际纯粹与应用化学协会( 刑p a c ) 的定义，孔径小于21 1 1 1 3 的多孔材料 为微孔材料，孔径大于5 0 衄的多孔材料为大孔材料，孔径在2 5 0m 范围内的多孔 材料为介孔材料。1 9 9 2 年，美国m o b i l e 公司的科学家k r e s g e 2 9 1 和b e c k t 3 0 1 等先后 以表面活性剂为模板，在碱性条件下合成了孔径在2 1 0a m 范围内连续可调的m 4 1 s 系列介孔分子筛。自介孔材料诞生之日起，因其具有独特的孔径结构、大的比表 面积和孔容、良好的吸附能力等性能，在吸附分离、纳米分子器件、天然气和氢 气的储存、计算机、药物递送、传感器、生物医学等领域等领域有着广泛的应用 前景【3 1 1 。 介孔材料按照其化学成份分类，可分为硅基和非硅基介孔材料两大类。硅基 介孔材料主要包括硅酸盐和硅铝酸盐等，在催化剂的载体、吸附和有机大分子的 4 西南大学硕士学位论文第1 章 分离有着重要的应用：非硅基介孔材料主要包括过渡金属氧化物、磷酸盐和硫酸 盐等，它们一般存在可变价态，具有硅基介孔材料所不能及的应用前景，所以除 了可以用作催化剂的载体、吸附和分离以外，还在光、电、磁等方面具有独特的 应用前景。 近年来已有不少介孔材料应用于传感器的研究。2 0 0 4 年x u 等【3 2 】利用介孔 n b 2 0 5 固定细胞色素c 和辣根过氧化酶制成第三代生物传感器，研究了电极表面的 直接电子传递。2 0 0 7 年f e n g 等【3 3 】采用层层自组装法将介孔碳和血红蛋白固定在电 极表面构成传感器，研究了直接电子传递和对过氧化氢的催化还原。2 0 0 5 年f e n g 等【3 4 】采用电沉积法将介孔氧化钨沉积在电极表面，然后吸附血红蛋白组装成电化 学传感器，研究了传感器对过氧化氢、亚硝酸盐、三氯乙酸的检测，展现了良好 的催化响应。2 0 0 8 年，j i a 等【3 5 】利用二氧化钛固定血红蛋白制备第三代传感器，y u 等【3 6 】利用二氧化锰固定葡萄糖氧化酶制备了电流型葡萄糖传感器。这些都体现了 介孔材料在固定生物活性分子上的良好性能，显示了其在生物传感器上的应用潜 能。 介孔材料在生物传感器上得到了广泛的应用是因为以下原因：一方面，一些 具有氧化还原活性的蛋白质和酶，如大分子的葡萄糖氧化物酶和血红蛋白，其三 维尺寸分别为5 2 x 6 0 x 7 7 姗和5 0 x 5 5 x 6 5n m 了7 1 ，介孔材料的孔径在2 5 0l i r a 范围 内，因而介孔材料对蛋白质在尺寸上有良好的匹配性。另一方面，介孔材料有良 好的吸附性能，可以增大酶的固定量，从而增强反应信号。在应用介孔材料固定 蛋白质时，主要的作用力是物理吸附，相比较共价键和法【3 8 】等其它固定方法，对 酶的活性影响最小。除以上两方面外，有些金属氧化物( 如二氧化钛) 本身也具 有良好的催化活性，对于放大电流信号有着良好的促进作用，将其制备成介孔形貌 后改善了二氧化钛制备传感器的性能【3 5 1 。因而，介孔材料在生物传感器和实现酶 直接电化学上有较大的应用潜力。 1 2 2 纳米材料在生物传感器上的应用 从2 0 世纪8 0 年代开始，纳米科技逐渐发展起来。这是一门新兴的交叉学科。 纳米科技是研究由尺寸在1 1 0 0n l t l 之间的物质组成的体系的科学技术，并探索该体 系的运动规律和相互作用以及可能的实际应用。纳米材料是纳米科技的基础。指 的是在三维空间中至少有一维处于纳米尺度的超细材料。纳米材料由于具有小尺 寸效应、表面界面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应等性质，因而其物理、 化学以及电化学性能优良，并且还具有良好的生物兼容性，将其应用于生物传感 器能够较大的改善传感器的性能。 西南大学硕士学位论文第1 章 材料的结构对材料的性能有着重要影响，因此对于纳米材料的结构控制和性 能研究已成为物理、化学、材料等领域的研究热点之一。纳米空心球是近年来新 发展起来的一类纳米材料，其特殊的结构和形貌引起了广泛的关注。纳米空心球 最主要的特征是具有大的内部空间和厚度在纳米尺度内的壳层。另外，纳米空心 球还具有密度小、比表面积大、机械和热稳定性好、表面渗透性等性质，因此纳 米空心球在药物释放【3 9 1 、催化剂载体【枷、填充材料【4 1 】等领域有着潜在的应用。近 年来，纳米空心材料也逐步应用到传感器的制备上来，2 0 0 8 年d a i 4 2 】等利用空心纳 米c d s 球固定血红蛋白制备了亚硝酸盐传感器，研究了血红蛋白在电极表面的直接 电子传递和对亚硝酸盐催化性能。同年，c a o 4 3 】等利用空心二氧化硅球固定辣根过 氧化物酶，研究了酶在电极表面的直接电子传递和对过氧化氢的催化效果。结果 表明，空心球独特的形貌使所制备的传感器具有良好的性能，空心球在生物传感 器上有较大的应用前景。 1 3 本论文的立题思想 生物传感器是一门涉及诸多领域的新型学科。近年来，随着材料学的发展， 生物传感器也得到了新的发展机遇。将一些具有特殊性能的材料应用到传感器的 制备上得到了广泛的研究。在广泛查阅关于传感器文献的基础上，本学位论文针 对当前传感器发展中存在的难点和焦点问题，即如何选择固酶材料和简单有效的 固酶方法，如何放大电流信号，从而制备出性能良好的电流型生物传感器。具体 开展工作如下： ( 1 ) 铂纳米粒子因为有较大的比表面积和特殊的表面性质，具有良好的催化特性。 季铵化聚乙烯吡啶( q p v p ) 是一种导电离子聚合物，结构中含有偶极离子对( 季 铵基团和羧基) ，具有良好的生物兼容性、亲水性和易成膜性，是很好的固酶基 质。拟通过在玻碳电极表面电沉积纳米铂以提高其灵敏度，利用季铵化聚 乙烯吡啶凝胶包埋血红蛋白制备过氧化氢传感器，并外加一层n a t i o n 膜以期 望增强电极的选择性和稳定性。 ( 2 ) 介孔二氧化锆不仅具备独特的孔状结构和单一的孔径，还具备好的化学稳定 性和热稳定性，易于和含氧基团产生作用力，以及良好的生物兼容性。由于介孔 二氧化锆具有卓越的性能，可以作为固定蛋白质的理想基质。拟在电解质溶液中， 采用共电沉积法将介孔二氧化锆和血红蛋白固定在金电极表面制备成传感器，利 用循环伏安法和计时电流法考察传感器的催化性能，同时考察血红蛋白在电极表 面的直接电子传递。 ( 3 ) 二氧化钛空心球不仅具备空心纳米材料所有的密度小、比表面积大、机械和 6 西南大学硕士学位论文 第1 章 热稳定性好，还具有一定的催化效果，可作为固定蛋白质的理想基质。拟采用共 电沉积法将二氧化钛空心球和血红蛋白固定在金电极表面制成第三代生物传感 器，考察传感器的催化性能，同时考察传感器的稳定性和选择性。 7 两南大学硕士学位论文第2 章 第2 章基于季铵化聚乙烯吡啶和纳米铂固定血红蛋白的过氧 化氢生物传感器的研究 2 1 前言 生物传感器由于其独特的专一性和高效性，在过氧化氢【棚、葡萄糖【4 5 删、胆 固副4 7 1 、抗原抗体【4 8 】等生物物质的检测方面应用前景广泛。对于酶生物传感器， 酶的生物活性是决定传感器性能好坏的关键【4 9 】，而固定酶的方法和载体是影响酶 的生物活性的重要因素【5 0 , 5 1 】。因此，在酶生物传感器的研制中，酶的固定化过程 是影响酶生物传感器分析性能的关键步骤【5 2 】。已报道的固定方法有吸附法、包埋 法、交联、法【5 3 i 、凝胶溶胶法酬、自组装法【5 5 1 、共价键偶联法【5 6 】等。当今，采用简 单、快速、可控的制备方法是制备传感器的主流发展方向；采用生物相容性好的 固酶材料和创新的固酶技术是保持酶活性的关键所在；且增强酶与电极间的电子 传输能力是提高传感器灵敏度的关键技术。季铵化聚乙烯吡啶( q p v p ) 是一种导 电离子聚合物，结构中含有偶极离子对( 季铵基团和羧基) ，具有良好的生物兼容 性、亲水性和易成膜性，是很好的固酶基质5 7 1 。本章节利用季铵化聚乙烯吡啶凝 胶包埋血红蛋白制备过氧化氢传感器，且通过在玻碳电极表面电沉积纳米铂 以提高其灵敏度，并外加一层n a t i o n 膜以增强电极的选择性和稳定性。实验结果 证明，该方法制备的h 2 0 2 生物传感器具有较高的灵敏度，较宽的检测范围和较低 的检出限。 2 2 实验部分 2 2 1 仪器与试剂 c h i6 6 0 a 电化学工作站( 上海辰华仪器公司) ；u v - 2 5 5 0 紫外分光光度计( 日 本岛津公司) ；扫描电子显微镜( 日本日立公司s 3 0 0 0 n ) ；a b 2 0 4 s 电子天平( 瑞 士m e r l e r & t o l e d o 公司) ；p h s 4 c 酸度计( 雷磁公司) ；b ra n s o m c 2 0 0 超声清 洗仪( 德国b r a n s o m 棚a s c h a l l 公司) ；血红蛋白( h b ，s i g m a 公司) ； 氯铂酸( h 2 p t c l 6 ，s i g m a 公司) ；4 乙烯基吡啶( s i g m a 公司) ；过氧化苯甲酰；氯 仿( 成都科龙公司) ；4 一羟基一2 ，2 ，6 ，6 四甲基1 氧自由基哌啶( 北京y a n g c u n 化学试剂公司) ；过氧化氢( 重庆化学试剂公司，3 0 ) ；过氧化氢消毒剂( 重庆昌 野药业有限公司) o 1m o l l 的磷酸缓冲溶液( p b s ) 由n a 2 h p 0 4 - n a h 2 p 0 4 配制， 其他试剂均为分析纯试剂。实验用水为二次蒸馏水，标准储备过氧化氢溶液放置 后过夜使用，保存于4o c 冰箱中。 西南大学硕士学位论文第2 章 2 2 2 季铵化聚乙烯吡啶的制备 根据文献【5 8 】制各聚乙烯基吡啶( p v p ) 。首先，年乙烯基吡啶和过氧化苯甲酰、 4 羟基2 ，2 ，6 ，6 四甲基一1 一氧自由基哌啶在1 2 5o c 条件下反应2 9 个小时。然后将 制得的产物溶于甲醇中，使用乙醚沉淀、过滤，真空干燥，得到亮红色固体p v p 。 将适量的p v p 和氯乙酸加入到d m f 中，在9 0o c 恒温条件下搅拌三个小时。最后， 将产物季铵化聚乙烯吡啶( q p v p ) 沉淀、过滤，真空干燥后得到白色固体。其结 构如图2 1 。 r + c h 2 【 c h 2 c o o h 图2 1q p v p 的结构图 f i g 2 - 1s t r u c t u r eo fq p v p 2 2 3 酶修饰电极的制备 玻碳电极依次用0 3 岬、o 0 5 删2 0 3 粉末进行抛光，抛光后电极依次用二次 蒸馏水、1 ：lh n 0 3 、丙酮超声清洗。将清洗后的电极在氮气氛围中晾干，备用。 将处理过的玻碳电极( g c e ) 浸入h 2 s 0 4 ( 0 5m o l l ) + k 2 p t c l 6 ( 2 5r e t o o l l ) 溶液中， 先通n 21m i n 除氧，实验中维持n 2 气氛，s t e pf u n c t i o n s ( s f