（预防兽医学专业论文）网状内皮组织增生症病毒的分子流行病学调查及其在宿主免疫选择压下的分子变异.pdf

r e v 的分子流行病学调查及其在宿主免疫选择压下的分子变异 本文由国家自然科学基金项目资助 ( 批准号：3 0 2 7 0 0 6 0 ) s u p p o r t e db yn a t i o n a ln a t u r a ls c i e n c ef o u n d a t i o no fc h i n a ( n o 3 0 2 7 0 0 6 0 ) 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所 取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个 人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同 意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 做作者姥勘 铷躲袒节 导师签名：矬叮 日期：、& f 7 山东农业大学博士学位论文 英文缩写 l p t g l t r m m a b m d v m m m g m i n n f o r f p c r r e v r n a r n a s e a r d m s e c s d s s d s ，p a g e s p f u i x 弼 i f a g s t k b k d n r d n a d n t p 符号说明 英文全称 i s o p r o p y l t h i o b - d g a l a c t o s i d e l o n g t e r m i n a lr e p e a t m o l e l i t e r m o n o c l o n a la n t i b o d y m a r e k sd i s e a s ev i r u s m i l l i m o l e l i t e r m i l l i g r a m m i n u t e m i l l i l i t e r n u c l e o t i d e o p e nr e a d i n gf r a m e p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n r e t i c u l o e n e n d o t h e l i o s i sv i r u s r i b o n u c l e i ca c i d r i b o n u d e a s ea r o u n d sp e rm i n u t e s o l o n d s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s d s p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s s p e c i f i cp a t h o g e n f l e e m i c r o l h e r 5 - b r o m o - 4 一c h l o r o - 3 i n d o l y l b d - g a l a c t o s i d e i n d i r e c ti m m u n o f l u o r e s c e n c ea s s a y g l u t a t h i o n es - t r a n s f e r a s e k i l o b a s e k i l o d a l t o n h o u r d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e 中文垒称 异丙基硫代b - d 半乳糖营 哎末端重复区 簿碌曙 单克隆抗体 马立克氏瘸病毒 毫摩尔，升 毫克 分钟 毫升 核苷酸 开放阅读框架 聚台酶链式反应 网状内皮细胞增生病病毒 核糖棱酸 核糖援酸酶a 转分 秒 十二烷基硫酸钠 s d s ，聚冈烯酰胺凝胶咀泳 无特定病原体 微升 5 溴4 氯3 。碍l 哚b d 半乳糖营 间接免疫荧光试验 谷胱甘肽硫转移酶 一千个碱基 千道尔顿 小时 脱氧核糖核酸 脱氧核糖核苻二磷酸 r e v 的分子流行病学调查及其在宿主免疫选择压下的分子变异 d i t h i o t h m i t o l e s c h e r i c h i ac o l i b a c t e r e r b a s e p a j r c o m p l e m e n t a r yd n a c h i c k e ne m b r y of i b r o b l a s t s a m i n oa c i d a m p i c i l l i n l - a r g i n i n e l - a s p a r a g i n e l - a s p a r t a t e t r a n s m e m b r a n e p r o t e i n m e d j a nt i s s u ec u l t u r ei n f e e t i v ed o s e m e s s a g e r r i b o n u c l e i ca c i d l a u r i ab r o t h g l y c o p r o t e i n e n v e l o p eg e n e g r o u pa n t i g e n p r o t e a s e j p o l y m e r a s e l o n g t e r m i n a lr e p e a t f o w lp o xv i r u s 4 二硫苏糖醇 人肠埃希氏杆菌 碱基对 互补d n a 鸡胚成纤维细胞 氨基酸 氨苄青霉素 l 精氨酸 l ，天冬酰胺 l 天冬氨酸 穿膜蛋白 半数组织培养感染量 信使核糖核酸 l b 肉汤培养基 糖蛋白 囊膜蛋白基因 群抗原 蛋白酶t 核酸聚合酶 长末端重复序列 禽瘦病毒 晰一印一四 脚州删郴一一璩 印 辫叫m 觥 山东农业大学博士学位论文 本文所构建用于克隆和表达的质粒一览表 | 序号质粒名称载体 插入片段人小( b p ) h j 途 i p m d s n v e n vp m d l 8 - t 1 7 6 1 克隆测序 2 p m d s d 0 3 0 3 e n vp m d l 8 - t 1 7 5 5 克隆测序 3 p m d i f v 5 e n vp m d l 8 - t 1 7 6 1 克隆测序 4 p m d a m 9 6 0 6 e n v p m d l 8 t 1 7 5 5 克隆测申 5 p m d h a 9 9 0 1 e n vp m d l 8 - t1 7 5 5 克隆测序 6 p m d s d 9 9 0 1 e n yp m d l 8 - t1 7 5 5 壳隆测序 7 p m d j n 0 0 0 1 e n vp m d l 8 - t1 7 6 l 克隆测市 8 p m d x t 0 0 1 3 e n vp m d l 8 - t1 7 6 1 克隆测序 9 p m d g d 0 2 0 3 e n vp m d l 8 - t 1 7 6 1 克隆测序 l o p m d r z 0 4 0 6 e n vp m d 】8 - t 1 7 6 l 克隆测序 1 i p m d 5 l g p m d l 8 - t1 5 2 0 克隆测宁 1 2 p m d g l lp m d l 8 - t 2 9 5 5 克隆测宁 1 3 p m d p ip m d l 8 - t 1 1 0 2 克隆测序 1 4 p m d ，p l ip m d l 8 - t 1 1 1 i 克隆测序 1 5 p m d e h v o m d l 8 - t1 8 2 5 克隆测序 1 6n m d 3 l t r p m d l 8 - t 6 2 8 克隆测宁 1 7 p m d l t r c lp m d l 8 - t 1 1 7 0 克隆测序 1 8 p m d s g p 3 0p m d 1 8 - ts i m p l e8 6 1 克隆 1 9 p g e x 6 p l g p 3 0p g e x6 p 1 8 6 l 原核表达 2 0 p m d s e n vp m d 1 8 - ts i m p l e1 7 5 5克隆 2 1 p c d n a e n vp c d n a 3 1 z e o ( + ) 1 7 5 5 真核表达 2 2 p m d s m c h a i p m d1 8 - 1 s i m p l e 2 3 3 2 弧克隆 2 3 p m d s m c h a i i p m d 1 8 - ts i m p l e 3 4 8 3 亚克隆 2 4 p m d s m c h a i l l p m d 1 8 - ts i m p l e2 2 6 3 弧克隆 2 5 p m d s e , e n v m c h a i f f p m d 18 - i s i m p l e】8 6 5砸克隆 2 6 p c d n a h a 9 9 0 1 p c d n a 3 1 z e o ( + ) 8 0 7 8转染 2 7 p c d n a e n v h a 9 9 0 1 p c d n a 3i z e o ( + ) 7 6 8 0 转染 2 8 p m d 2 a 1 0 e n v p m d l 8 t 1 7 6 1 克隆洲序 2 9 p m d 2 a l5 e n v p m d l 8 - t 1 7 6 l 克隆洲序 5 ! 望墅坌王巫! 主堕兰塑查壁墨壅堕圭叁堕垄堡堡i 塑坌至变量 续表： 序号质粒名称 载体 插入片段大小( b p )川途 3 0口m d 2 c 1 0 e n v p m d l 8 - t1 7 6 l 克隆测序 3 1 f ) m d 2 c 1 5 e n v d m d l 8 - t1 7 6 t 克隆测序 3 2 p m d c a l o e n v p m d 1 8 - i 1 7 6 1 克隆测序 3 3 ；) m d c a1 5 e n v p m d l 8 t 1 7 62 克隆测序 3 4 f ) m d c a 5 e n vp m d l 8 - t1 7 6 l 克隆测序 3 5 i ) m d c b l o e n vp m d l 8 - t 1 7 6 l 克隆测序 3 6 d m d c b l 5 e n v p m d l 8 - t 1 7 6 l 克隆测序 3 7 f ) m d c b 5 e n v p m d l 8 - t 1 7 6 i 克隆测序 3 8 i ) m d c c l o e n vp m d 1 8 - i 1 7 6 1 克隆测序 3 9 p m d c c l 5 e n v p m d l 8 - t 1 7 6 1 克隆测序 4 0 p m d t d a 1 0 e n v p m d l 8 - t 】7 6 1 克隆测序 4 l p m d d a 5 e n vp m d l 8 - t 1 7 6 l 克隆测序 4 2 p m d d b l o e n vl j m d1 8 - t 1 7 6 l 克隆测序 4 3 p m d d b l 5 e n v 1 ) m d1 8 t 1 7 6 l 克隆测序 4 4 p m d d b 5 e n v l j m d1 8 - t 1 7 6 1 克隆测序 4 5 p m d d c l 5 e n vp m d l 8 - t 1 7 6 1 克隆测序 4 6 p m d d c 5 e n v 1 ) m d1 8 - t 1 7 6 1 克隆测序 4 7 p m d s n v f o e i v i ) m d1 8 - t 1 7 6 1 克隆测序 4 8 f ) m d c a l 0 3 l t r i ) i v l d1 8 - t 6 9 8 克隆测序 4 9 f , m d i c a l 5 3 l t rp m d 1 8 - 1 6 4 8 克隆测序 5 0 f ) m d c b 10 - 3 l t r p m d 2 8 - t6 5 l 克隆测序 5 1 f ) m d t c b 15 - 3 l t r i ) m d1 8 - t 7 0 0 克隆测序 5 2 f ) m d c b 5 - 3 l t r d m d l 8 - t7 4 5 克隆测序 5 3 f ) m d c c l 0 3 l t rf ) m d1 8 - t 6 5 l 克隆测序 5 4 p m d c c 15 - 3 l t r f ) m d1 8 - t 6 4 8 克隆测序 5 5 p m d c c 5 3 l t rf ) m di8 - t 6 4 5 克隆测序 5 6 p m d d a l 0 3 l t r) m d1 8 一t 1 6 7 克隆测序 5 7 p m d d a 5 - 3 l t rp m d l 8 t 4 5 6 克隆测序 5 8 p m d d b l0 - 3 l t r p m d l 8 - t 6 9 6 克隆测序 5 9 p m d d b l 5 - 3 l t rp m d l 8 - t 6 9 6 克隆测序 6 0 p m d d b 5 3 l t rp m d l 8 - t6 9 6 克隆测序 6 山东农业大学博士学位论文 续表 i 序号质粒名称载体 插入片段人小( b p ) 用途 6 l p m d d c i 5 - 3 l t r p m d l 8 t 6 5 l 克隆测序 6 2 p m d d c 5 3 l t rp m d l 8 - t6 9 6 克隆测序 6 3 p m d s n v f o - 3 l t rp m d l 8 - t 6 9 9 克隆测序 6 4 p m d i a e n v d m d l 8 - t 】7 6 1 克隆测序 6 5 p m d c s v e n vp m d l 8 t 1 7 6 l 克隆测序 7 r e v 的分子流行病学调查及其在宿主免疫选择压下的分子变异 中文摘要 为了解网状内皮箍织增生症病毒( r e t i c u l o e n d o t h e l i o s i sv i r u s ，r e v ) 流行野毒株 囊膜糖蛋白基因 e n v ) 的变异情况，利用经细胞培养、删接荧光抗体试验和p c r 扩增 的方法从我国1 9 9 9 - - 2 0 0 4 年问不同省份的鸡场所采集样品中分离和鉴定的r e v 野毒 株及国外分离株，以一对特异性引物对其朗v 基因进行p c r 扩增后再克隆、测序，并 用d n a s m r 软件与己发表e n v 基因的序列进行同源性比较分析。结果表明除缺陷致瘤t 株的增殖辅助病毒a 株可能由于历史的原因而与其它株相差较大外，参与比较的其它 各g n v 基因序列相对比较保守，在核苷酸水平或氨基酸水平的同源性都在9 2 以上， 其间仅有6 个碱基或2 个氨基酸的差异。这种差异在e n v 基因的局部则更加明显，且在 不同毒株间呈现一定的规律性，但与各毒株的分离年代、分离地域没有明显的相关 性。另外，在e 月v 基因序列上发生变异的集中区段，经计算其各自的n s s 值，都明显 高于用以判断瘸原在某种选择压作用下相应基因发生变异的公认值2 0 。这表明参与比 较的r e v 各毒株由最初原始毒分支进化过程中，即在与宿主长期的适应性斗争中，其 p n v 基因明显地受到宿主免疫系统的优势筛选作用，从而表现出变异的一致性。 鉴于自然分离野毒株在痛原学上仍属于一庞杂的群体，这将影响到对其继后研究 分析的严谨性和精确性。而要达此效果，只有将最初分离病毒群中占优势的瘸毒粒子 纯化出来，构建遗传背景清楚的病毒模型，从而使继后的研究排除偶然性的干扰，便 于研究结果的分析、推理。在此意义上，本文以r e v 中国分离株h a 9 9 0 1 为样本，以 6 对相互连续且部分重叠的引物对其前病毒c d n a 进行p c r 扩增克隆和测序，从而完 成了其前病毒c d n a 全基因组核苷酸序列，这也是第一个以鸡源游离的感染性完整病 毒粒子完成的r e v 全基因组序列。将此序列与已知的其它r e v 毒株全基因组序列相比 较的结果表明，r e v 的整个基因组相当保守，不同毒株相间的同源性都较高，尤其编 码功能蛋白的p o ，基因序列更是完全相同。但在r e v 增殖过程中发挥重要作用的l t r 序列，则因分离宿主的不同而有两处显著的差异，只是这一差异的意义还有待进一步 求证。 为验证h a 9 9 0 1 全基因组序列的正确性，在其编码g p 3 0 和e l q - d 基因的相应序列上 选取引物，经p c r 扩增及继后的定向克隆，将二者分别克隆入表达载体p g e x - 6 p - 1 或 d c d n a 3 1 z e o ( + ) 中。各克隆质粒分别经转化表达宿主菌e c o i l b l 2 1 或经 山东农业大学博士学位论文 l i p o f e c t a r n i n e t mr e a g e n t 介导转染s p f 源c e f 后，再经相应的s d s p a g e 或i f a 检 测，结果显示其皆为r e v 源阳性。 在h a 9 9 0 1 前病毒e d n a 全基因组序列已知的基础上，用三对引物经p c r 分三段 将h a 9 9 0 1 株前病毒e d n a 全部扩增出来，并分别克隆后再进行分步一次性亚克隆， 将此三个片段一起连入真核表达载体p c d n a 3 1 z e o ( + ) ，完成了r e vh a 9 9 0 1 株前病毒 e d n a 全基因组的重组质粒克隆p c d n a h a 9 9 0 1 。同时以引物缺失法随机将e n v 基因序 列上继p o l 终止密码子之后3 5 7 个碱基缺失掉，同法构建了r e vh a 9 9 0 1 株前病毒 e d n a 全基因组的缺失突变重组质粒克隆p e d n a ae n v h a 9 9 0 1 。将该两个克隆质粒分 别扩增、纯化后，经脂质体( l i p o f e e t a r n i n e t mr e a g e n t ) 介导转染c e f 以验证其具有感 染性的试验还在优化过程中。 为了解r e v 病毒粒子在长期反复感染、传播及与宿主机体作斗争的过程中，尤其 是在宿主免疫系统的适应性筛选作用下所发生和得以保留下来的优势遗传变异，即病 毒可借以逃避宿主免疫监视的优势变异，本文将分子克隆化r e vs n v 株0 代种毒分三 种处理：一种是在不含抗血清培养的c e f 上传代；一种是在1 日龄s p f 雏鸡体内传 代；一种是在1 4 习龄s p f 雏鸡体内传代。每种处理组内又分成三个平行：以此进行连 续传至第1 5 代。以上传代期间，收集各处理第5 、1 0 、1 5 代的病毒及其感染的c e f ， 常规消化提取基因组d n a 作为模板，以两对分别覆盖s n ve r l v 基因和3 l t r 序列的特 异性引物进行p c r 扩增。将各扩增产物克隆入载体p m d l 8 t 中进行核营酸序列测定， 结果用d n a s t a r 软件进行分析。所完成的e n v 基因和3 l t r 序列的比较结果显示：虽 然有几个组内或组间毒株的序列有6 处发生一致的变异或缺失，但对照其所在的处理 组别及传代代次，这些变异是跳跃式的、偶然的、随机的和不稳定的。所以也就无从 计算其相互间碱基变异的n s s 值，即目前此种变异不足以表明和揭示本实验中s n v 在s p f 鸡体中受到了免疫选择压的作用。这或许是对s n v 传代的方式或时机有待进 步优化，如在c e f 上的传代可在含有适宜浓度的抗r e v 单因子血清或单克隆抗体的培 基中进行；或在2 周龄s p f 雏鸡体内传的代次尚少，s n v 与宿主机体免疫系统间的相 互作用时间太短，还不足以使病毒在短期斗争中发生和累积出明显、有序的变异。 虽然上述结果与先期设计相差甚远，但在此过程中攻毒雏鸡实质脏器产生的源于 s n v 诱导转化的肿瘤和自然肿瘤患鸡一起为尝试筛选、建立致瘤病毒诱导转化的天然 瘤细胞系提供了素材。经从肿瘤患鸡全血和实质脏器中分离的淋巴细胞群长达1 2 个月 的传代培养，初步拟定以核型分析和抗r e v 、a l v 和m d v 的单克隆抗体介导的i f a 9 r e v 的分子流行病学调查及其在宿主免疫选择压下的分子变异 对培养淋巴细胞进行检测，并希望能够筛选到分别由a l v 、r e v 和m d v 诱导转化的 肿瘤细胞系后备细胞株，以便为继后的探求该三种病毒的致瘤、致免疫抑制的机理构 筑良好的基础和技术平台。 山东农业大学博士学位论文 m o l e c u l a r e p i d e m i o l o g y a n de v o l u t i o no fr e t i c u l o e n d o t h e l i o s i s v i r u su n d e rt h eh o s ti m m u n es e l e c t i v ep r e s s u r e a b s t r a c t i no r d e rt oi n v e s t i g a t et h em o l e c u l a re p i d e m yo f t h ee n v e l o p eg l y c o p r o t e i ng e n e ( e l i v ) o f c h i n e s ed o m e s t i cf i e l dr e t i c u l o e n d o t h e l i o s i sv i r u s e s ( r e v ) i nt h ep a s tf e w y e a r sa n d t om a k e s u r et h e i re v o l u t i o n p r i n c i p l eo v e r as p a no f t i m e ，s e v e r a lo v e r s e a ss t r a i n sa n ds e v e nc h i n e s e f i e l di s o l a t e si d e n t i f i e d u s i n gt i s s u e - c u l t u r i n g ，i n d i r e c t f l u o r e s c e n t a s s a y ( i f a ) a n d p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ( p c r ) f r o mt h es a m p l e so f1 9 9 9 - - - 2 0 0 4w e r eu s e dt ob e a m p l i f i e d f o rt h ee n v f r a g m e n tb yp c r ，a n d t h ep r o d u c t sw e r ec l o n e da n ds e q u e n c e ds e p a r a t e l y t h e n t h es e q u e n c e sw e r ec o m p a r e dw i mt h er e p o r t e do n e su s i n gas o f t w a r eo fd n a s t a r t h er e s u l t i n d i c a t e dt h a te x c e p tt h eo b v i o u sd i f f e r e n c eo f t u m e r - c a u s i n gm u t a n tt sa s s o c i a t es t r a i na f r o mt h eo t h e r s ，t h ee n v g e n ew a ss p e c u l a t e d t ob ev e r yc o n s e r v a t i v e ，i e w h e t h e ri nt h el e v e l o fn u c l e o t i d eo ra m i n oa c i d t h eh o m o l o g yw a so v e r9 2 b u tt h ed i f f e r e n c ew o u l db em o r e r e m a r k a b l ei fs e v e r a ls e g m e n t a lr e g i o n sw e r ef o c u s e do n ，a n di ts e e m e dt ob ear u l ea l t h o u g h t h e yw e r eo r i g i n a l l yi s o l a t e df r o md i f f e r e n tt i m e si nd i f f e r e n tr e g i o n sa n db i r d s i na n o t h e r a s p e c t ，t h ec h a n g e sf o c u s e do ns e v e r a lr e g i o n si nt h es e q u e n c eo fe n v ，w h i l et h er a t i oo f n o n s y n o n y m o u s t os y n o n y m o u s ( n s s ) w a sc a l c u l a t e d ，t h er e s u l tw a so b v i o u s l yh i g h e rt h a n 2 5w h i c hi sp o p u l a r l ya c c e p e da st h em a r k e rt og i v eac o n c l u s i o nw h e t h e rt h ec h a n g e si n s o m eg e n eo fap a t h o g e na r eu n d e rt h ei n f l u e n c eo fac e r t a i ns e l e c t i v ep r e s s u r e t h u si t w o u l db es p e c u l a t e dt h a tt h ea n t i g e ne p i t o p e si ne n vo ft h ea n a l y z e ds t r a i n sh a do v e r t a k e na l o n gp e r i o do fd o m i n a n t a ls e l e c t i o nf r o mt h eh o s ti m m u n es y s t e ma n dg o n et ot h en e a r l y s a m ee v o l u t i o nf r o mt h e i ra n c i e n t o r i g i n a lp a r e n tv i r u s e s a saf i e l di s o l a t ei sac o m p l e xm i x t u r eo fd i f f e r e n tv i r i o n si np a t h o g e n i c i t y ，t h ea n a l y s i s m d et oi tw i l ln o tb ee x p e r t i s ee n o u g h ，a n di no r d e rt od os o ，i ti sn e c e s s a r yt oe s t a b l i s ha m o d l e i e 。t og e to n ei n f e c t i o u sv i r i o n 、v i t hk n o w ng e n e t i cb a c k g r o u n do ft h ed o m i n a n tv i r u s p a r t i c l e sp u r i f i e df r o m t h eo r i g i n a li s o l a t e t h e r e f o r e ，t h ei n t e r f e r e n c ef r o mt h ec h a n c i n e s so f r a n d o mm u t a t i o n sw i l lb en e g a l e c t e di nf o r t h c o m i n ga n a l y s i s ，a n dh e r e i nt h er e vc h i n e s e f i e l di s o l a t eh a 9 9 01w a sc h o s e na st h es a m p l e ，a n d6c o n t i n u o u s l yo v e r l a p p i n gp a i r so f p r i m e r sw e r es y n t h y s i z e dt oa m p l i f yt h ep r o v i r a le d n a o ft h ev i r u s a f t e rt h ep c r p r o d u c t s w e r ec l o n e da n ds e q u e n c e d ，as o f t w a r eo fd n a s t a rw a su s e dt os p l i c ea n da n a l y z et h ed a t a ， r e v 的分子流行病学调查及其在宿主免疫选择压下的分子变异 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