（微生物学专业论文）三株放线菌次级代谢产物的初步研究.pdf

摘要 摘要 放线菌( a c t i n o m y c e t e s ) 在产生抗生素方面具有独特的优势，大约7 5 的抗生 素都是由放线菌产生，而其中的7 5 是由放线菌中的链霉菌属( s t r e p t o m y c e s ) 产生。从土壤链霉菌中分离到的大部分抗生素至今仍然被广泛使用；但由于微生 物耐药性的产生，急需发现新的抗生素。除了从土壤链霉菌中分离新化合物，还 应积极寻找其他来源的微生物，植物内生菌由于生境特殊，有可能产生更多类型、 结构新颖的化合物，成为微生物次级代谢产物的重要来源。 本论文以云南西双版纳热带雨林中的乔木滑桃树为研究对象，从滑桃树种子 中分离到7 株内( 共) 生放线菌a 2 、a 3 、a 4 、a 5 、a 6 ，a 7 、a 9 。对抗橙色青霉 活性较好的菌株a 2 进行了1 6 sr d n a 序列分析及形态鉴定，确定为 s t r e p t o m y c e ss p ，对其进行2 升平板发酵和化学成分分析，经液相色谱质谱 ( l c m s ) 检测到含氯特征峰，保留时间与美登木素一致；经大量发酵1 8 升，分 离纯化、鉴定了5 个化合物，分别鉴定为( + ) n o n a c t i ca c i d ，h o m o n o n a c t i ca c i d ， m a c r o t e t r o l i d e ，1 - a c e t a t e 一4 - h y d r o x y - b e n z e n e e t h a n o l ， 5 - m e t h y l 6 a c e t y r i r e s o r c i n o l ；但未分离和检测到含氯的特征峰。 本论文还对一株土壤链霉菌s t r e p t o m y c e ss p x m 2 0 1 和产南昌霉素吸水链霉 菌突变体m 的次级代谢产物进行研究。从s t r e p t o m y c e ss p x m 2 0 1 的y e m e 平板发酵物中分离5 个聚醚类化合物，分别鉴定为n i g e r i c i n ，3 0 一a c e t y ln i g e r i c i n ， 1 - o - m e t h y l 一3 0 - a c e t y ln i g e r i c i n ，1 ，2 9 一o d i m e t h y l 一3 0 一a c e t y in i g e r i c i n ( 新化合物) ， 2 9 - o m e t h y la b i e r i x i n ( 新化合物) ；从p j t u 8 13 厶a s m 2 5s t r e p t o m y c e s s p x m 2 0 1 突变株y e m e 液体发酵产物中分离鉴定了2 个化合物：l e b s t a t i n ， 1 7 o d e m e t h y l 1 e b s t a t i n 。从产南昌霉素吸水链霉菌突变体厶m 的发酵产物中分 离鉴定了1 个化合物：4 - o - d e m e t h y ln a n c h a n g m y c i n 。 对n i g e r i c i n 及其系列化合物分别进行了生物活性测试。对金黄色葡萄球菌 ( s a u r e u sa t c c 2 5 9 2 3 ) 、大肠杆菌c m c c 4 4 10 3 ( e c o i lc m c c 4 4 10 3 ) 、腊质芽 孢杆菌( 8 c e r e u s1 1 2 6 ) 、白色假丝酵母a s 2 5 3 8 ( c a l b i c a n s a s 2 5 3 8 ) 的活性测 定表明，n i g e r i c i n 和3 0 - a c e t y l n i g e r i c i n 二者有强的抗金黄色葡萄球菌的活性， m l c 均为0 1 2 5 p g m l ，并且对大肠杆菌和腊质芽孢杆菌原生质体的再生都有极 摘要 大的影响，当n i g e r i c i n 和3 0 一a c e t y ln i g e r i d n 浓度为li n g m l 时，大肠杆菌和腊 质芽孢杆菌的再生克隆数均小于2 0 ；但他们对革兰氏阴性细菌和真菌都没有活 性。同时，m t t 法测定了n i g e r i c i n 对人肝癌细胞h e p g 一2 的活性， i c 5 0 为 0 3 6 p g m l 。活性测定结果提示：c 3 0 位的羟基可能与离子转运无明显相关； n i g e r i c i n 的c 1 位羧基是离子转运所必需的。 通过对滑桃树共生菌s t r e p t o m y c e ss p a 2 的两次发酵产物的分离结果表明， 尽管在大量发酵产物中并未分离到美登木素类化合物，l c m s 检测结果不排除 s t r e p t o m y c e ss p a 2 有产生美登木素类化合物的潜能，有待通过进一步的实验 来验证。 从土壤链霉菌s t r e p t o m y c e ss p x m 2 0 1 的发酵产物分离到一系列n i g e r i c i n 及其系列化合物，生物活性测定的研究提供了抗生素结构活性关系的有关信息， 有助于进一步了解抗生素的结构对活性的影响。 关键词：放线菌；植物内生菌；土壤链霉菌；次级代谢产物 4 a b s t r a c t a b s t r a c t a c t i n o m y c e t e sh a v ead i s t i n g u i s h e da d v a n t a g ei nt h ef i e l do fa n t i b i o t i c s ： a b o u t7 5 o fa n t i b i o t i c sa r ep r o d u c e db ya c t i n o m y c e t e so fw h i c h7 5 a r e p r o d u c e db ys t r e p t o m y c e ss p m o s ta n t i b i o t i c sf r o ms o i ls t r e p t o m y c e sa r e s t i l lu s e dw i d e l y t os o l v et h ep r o b l e mo fm i c r o b e s r e s i s t a n c e ，i ti su r g e n tt o d i s c o v e rn e wa n t i b i o t i c sf 沁mm i c r o b e s b e s i d e ss o i ls t r e p t o m y c e s ，o t h e r s o u r c e so fm i c r o b e ss h o u l db et a k e ni n t oa c c o u n t b e c a u s eo ft h e i rp a r t i c u l a r l i v i n ge n v i r o n m e n t ，e n d o p h y t e sh a v ep r o d u c e ds p e c i a l m e t a b o l i t e sw i t h u n u s u a lc h e m i c a ls t r u c t u r ea n dh a v eb e e nt h ei m p o r t a n ts o u r c eo fm i c r o b e s e c o n d a r ym e t a b o l i t e i nt h i ss t u d y , t r e w i an u d i f l o r a ，a na r b o r e a lf o u n di nt h et r o p i c a lr a i nf o r e s to f y u n n a np r o v i n c e ，w a sc h o s e n a s e x p e d m e n t a l m a t e r i a l s e v e n a c t i n o m y c e t e sw e r ei s o l a t e df r o mt h es e e d so f 丁n u d i f l o r a a 2w a s i d e n t i f i e d a ss t r e p t o m y c e ss p a c c o r d i n gt om o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e ra n d16 sr d n a a n a l y s e s t h es t r a i nw a sc u l t u r e do np l a t e su pt o2l i t e r s ，t h ee x t r a c t sw e r e a n a l y z e db yl c m sa n dt h ec h l o r i d e - c o n t a i n i n gp e a k sw e r eo b s e r v e dw i t ht h e c h a r a c t e r i s t i co f【m 】+ ：【m + 11 + ：【m + 2 1 + = 3 ：1 ：1 i th a dt h es a m er e t e n t i o nt i m e w i t hm a y t a n s i n f o rf u r t h e rr e s e a r c h ，t h es t r a i nw a sc u l t u r e do np l a t e su pt o1 8 l i t e r s ，f i v ec o m p o u n d sw e r ei s o l a t e d ，a n dt h e i rs t r u c t u r e sw e r ee l u c i d a t e da s ( + ) n o n a c t i ca c i d ，h o m o n o n a c t i ca c i da n dm a c r o t e t r o l i d e ，1 - a c e t a t e - 4 - h y d r o x y - b e n z e n e e t h a n o l ，5 - m e t h y l - 6 - a c e t y l r e s o r c i n o l ，b u tn oc h l o r i d e - c o n t a i n i n gp e a k s w e r ed e t e c t e d s t r e p t o m y c e ss p x m 2 0 1w e r ec u l t u r e do ny e m em e d i a t h ee x t r a c tw a s i s o l a t e da n d5c o m p o u n d sw e r ep u r i f i e d ，a n dt h e i rs t r u c t u r e sw e r ei d e n t i f i e da s n i g e r i c i n ，3 0 一a c e t y ln i g e r i c i n ，1 一o m e t h y l - 3 0 - a c e t y l n i g e r i c i n ， 1 。2 9 一o - d i m e t h y l - 3 0 - a c e t y ln i g e r i c i n 2 9 - o - m e t h y la b i e r i x i n l e b s t a t i n a n d 17 - o - d e m e t h y l - l e b s t a t i nw e r ei s o l a t e df r o mp j t u 8 13 z 3 a s m 2 5s t r e p t o m y c e s s p x m 2 0 1 4 - o - d e m e t h y ln a n c h a n g m y c i nw a si s o l a t e df r o ms t r e p t o m y c e s n a n c h a n g e n s i sn s p y a ne to u y a n gz lm t h eb i o a c t i v i t i e so fn i g e r i c i na n di t sd e d v a t i v e sw e r ea l s os t u d i e d i nt h e s e r i a ld i l u t i o na s s a y , n i g e r i c i na n d3 0 - a c e t y ln i g e r i c i ns h o w e ds t r o n ga c t i v i t i e s a g a i n s ts t a p h y l o c o c c u sa u r e u sa 1 c c 2 5 9 2 3a n db a c i l l u sc e r e u s112 6 a n d t h e i rm i cw e r e0 12 5 p g m la n d0 12 5 p g m 1 r e s p e c t i v e l y n oi n h i b i t o r y a c t i v i t i e sw e r eo b s e r v e d a g a i n s t c a n d i d a a b i c a n sa s 2 5 3 8a n d e s c h e r i c h i a c o l ic m c c 4 4 10 3a tt h ec o n c e n t r a t i o no f2 5 旧m 1 n i g e r i c i na n d 3 0 - a c e t y ln i g e r i c i ns h o w e dd i s t i n g u i s h e de f f e c t so nt h er e g e n e r a t i o nd o n e so f b c e r e u s112 6a n de c o l ic m c c 4 4 10 3a tc o n c e n t r a t i o no flp g m l ，w h e r e a s 1 - o - m e t h y l 一3 0 一a c e t y ln i g e r i c i n ，1 ，2 9 - o - d i m e t h y l - 3 0 - a c e t y l n i g e r i c i n a n d 2 9 - o - m e t h y la b i e r i x i nd i dn o t t h ec y t o t o x i ca c t i v i t yo fn i g e r i c i nw a st e s t e dw i t h h e p g 2c e l ll i n ew i t ht h ei c s 0v a l u ea s0 3 6 p g r n l t h er e s u l t so fa c t i v i t i e s s u g g e s t e dt h a tc 3 0 - h y d r o x y lh a sn oo b v i o u sc o r r e l a t i o nw i t ha c t i v i t y , b u t c 1 c a r b o x y l a t ei sn e c e s s a r yf o rn i g e r i c i n f r o mt h ee n d o p h y t es t r e p t o m y c e ss p a 2 ，f o u rp r o d u c t sw e r ei s o l a t e df r o m t h es e c o n do ft w of e r m e n t a t i o n s h o w e v e r , m a y t a n s i n o i d sw e r en o td e t e c t e di n t h es e c o n df e r m e n t a t i o n ；i ti sn o tc e r t a i nw h e t h e rs t r e p t o m y c e ss p a 2 p r o d u c e sm a y t a n s i n o i d s f u r t h e rs t u d ym a ya n s w e rt h i sq u e s t i o n n i g e r i c i na n di t sd e r i v a t i v e sh a v e b e e ni s o l a t e df r o my e m em e d i a f e r m e n t a t i o no fs t r e p t o m y c e ss p x m 2 01 ，a n dt h eb i o a s s a y sf o rt h e i r s t r u c t u r e a c t i v i t i e sr e l a t i o n s h i p sw i l lg i v em o r ei n f o r m a t i o nt ou n d e r s t a n dt h e c o m p l e xs t r u c t u r ea n dp h y s i c o - c h e m i c a lr e q u i r e m e n t sf o ra n t i b i o t i ca c t i v i t i e s a c t i n o m y c e t e s ；e n d o p h y t e ；s o i ls t r e p t o m y c e s ；s e c o n d a r y m e t a b o l i t e s 2 常用英文缩写 常用英文缩写 缉三塞全整 2 。4 d2 , 4 二氯苯氧乙酸 k t激动素 n a a萘乙酸 闪 m i c r o g r a m m e m g m i l l i g r a m 山 m i c r o l i t r e r p 18 r e v e r s e d - p h a s eo c t a d e c y ls i l i c ag e l h m b c h e t e r o n u c l e u sm u f f i p l e - b o n dc o r r e l a t i o n h m q c h e t e r o n u c l e u sm u l t i p l e - q u a n t u mc o r e h e n c e d e p t d i s t o r t i o n l e s se n h a n c e m e n tb yp o l a r i z a t i o nt r a n s f e r r p m r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e t l c t h i nl a i y e rc h r o m a t o g r a p h y l c m s l i q u i dc h r o m a t o g r a p h ym a s ss p e c t r o m e t r y e s i m s e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o nm a s ss p e c t r o m e t r y s s i n g l e t d d o u b l e t t t n p l e t d d d o u b l e to fd o u b l e t m m u l t i p l e t n m rn u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e hh o u r m i n m i n u t e r f迁移率 8c h e m i c a is h 讯 m m o l l g 几 克，升 m g l 毫克，升 e d t a乙二胺四乙酸钠 d t t二硫苏糖醇 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究 成果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果， 均在文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论文而产 生的权利和责任。 景牝贤 如叼7 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦f - l , 学有 权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电子版，有权 将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查 阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的 标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 本学位论文属于 l 、保密() ，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密( 嵋 ( 请在以上相应括号内打“4 ”) 作者签名： 导师签名： 关北1 灸 日期：印d 7 年7 月- 多日 日期：e 。7 年7 月，3 日 第一章前言 1 1 研究背景 第一章前言 天然产物在药物的发现和发展的过程中发挥了重要的作用1 1 】。据美国调查机 构( 如美国的f d a ) 自1 9 8 3 1 9 9 4 年对每年新应用的新药的调查报告显示，6 0 7 5 的抗癌药和抗感染药最初都来源于天然产物【2 l 。 微生物起源久远、生境丰富，次级代谢产物的多样性，使其成为天然产物的 主要来源。所谓微生物的次级代谢产物，主要是指不同于初级代谢产物的，非微 生物的生长繁殖所必须的代谢产物，在自然界中可能对微生物的进化和生态系统 起着非常重要的作用。它的特点剧3 l ：1 、常常产生于微生物生长后期，即在微 生物的繁殖期后；2 、在特定的种属中产生；3 、化学结构丰富多变。微生物的次 级代谢产物的主要作用可能有以下几个方面：1 、生存的竞争武器，可以抵抗其 他的细菌、真菌、寄生虫等；2 、作为金属离子的转运载体；3 、促进微生物与植 物、昆虫、线虫类和高等动物共生；4 、作为细胞分化因子。 微生物数量之巨大，令人瞠目结舌，据估计，地球上只有不到1 的细菌和不 到5 的真菌被人们发现，其余大部分的微生物在实验室常规的培养条件下不能 生长，属于不可培养的微生物：可以通过模拟微生物的自然生长环境，如在培养 植物内生茵的培养基中添加植物提取液卜5 j ，以提供微生物生长所需的刺激性信 号，或使用半渗透性滤膜，使微生物间的生长信号得以传递【6 】，增加可培养微生 物的数量。 微生物次级代谢产物是生物农药的重要来源，和化学合成的杀虫剂相比，有 低毒和不易引起耐药性的特剧7 1 。微生物的次级代谢产物中赫赫有名的就是抗生 素了，迄今为止已经有超过5 0 0 0 种抗生素被发现，但大部分的抗生素都是无用 的，或者因为毒性太大而不能使用。令人称奇的是，放线菌( a c t i n o m y c e t e s ) 在 产生抗生素方面具有独特的优势，大约7 5 的抗生素是由放线菌产生，而其中 的7 5 又是由链霉菌属( s f 旭p f o m y c e s ) 产生【3 l 。 放线菌属于需氧的革兰氏阳性细菌，在形态、生理和生化上都有别于其他的 革兰氏阳性细菌，其g c 含量占整个碱基总数的6 9 7 8 m 0 1 ，培养时产生大量 第一章前言 的基内菌丝和气生菌丝。 19 4 3 年，美国科学家w a k s m a n 从放线菌中发现链霉素，给当时被视为不治 之症的结核病人带来了福音，造就了放线菌的研究和抗生素的蓬勃发展。后来又 陆续从放线菌中发现了新霉素( 19 4 9 年) 、土霉素( 19 5 0 年) 、红霉素( 19 5 2 年) 、 四环素( 19 5 3 年) 等嘲。对放线菌研究使得更多的有用的天然产物不断被发现和报 道，从诺卡氏菌属中分离到的b r a s i l i d i n ea ，属于吲哚生物碱，带有独特的共 轭三烯和乙氰单元，在体外表现出抗多种肿瘤细胞的活性，该化合物还具有抗革 兰氏阳性茵和多种真菌的活性，尤其是对曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 和分枝菌属 ( m y c o b a c t e r i u ms m e g m a t i s ) 表现出强抗菌活性，其m i c 分别是0 3 9 1 - l g m l 和 0 7 8 1 i g m p l o l 。 h h 3 c 图1 - 1 化合物b r a s l i d i n ea 的结构 资料来源：j u 6 1 c h ik o b a y a s h i 。m a s a s h it s u d a ，a k i 懵n e m o t oe ta 1 b r a s i l l d i n ea an e wc y t o t o x i c i s m i 争c o n b m i 叼i m l o l ea l k a l o i df r o m 价ea 甜m y 嘲en o c a r d i ab r a s i l l e n s i s m j n a t p r o d 1 9 9 7 6 0 ：7 1 9 k 7 加 从放线茵a c t i n o m y c e t es p y 8 5 2 1 0 5 0 中分离得到寡霉素族的m a c l a f u n g i n ， 该化合物对丝状真菌如镰刀菌的活性强于酵母菌如白色假丝酵母i ”】；从放线菌 h i l y - 8 6 2 0 9 5 9 中分离得到的m a t h e m y c i nb 对多种植物病原真菌有一定的抗菌 活性【1 刁；从一株不产孢的链霉菌s t r e p t o m y c e ss p n o 1 2 3 9 6 中分离得到的 5 ，8 - d i h y d r o x y - 2 ，7 - d i m e t h o x y - 1 ，4 - n a p h t h o q u i n o n e ，是一种具有一定抗革兰氏阳 性细菌和真菌活性的葸醌类化合物【1 川。 第一章前言 m a c l a f u n g i n a h 3 c o o ho o ho o c h 3 5 。8 - d i h y d r o x y - 2 ，7 - d i m e t h o x y 一 1 , 4 - n a p h t h o q u i n o n e b a r = h ：b 。r = h h m a t h e m y c i na b 。 图1 - 2 放线菌产生的具有抗菌活性的化合物结构 资料来源：a ：t d p i k u m a rm u k h o p a d h y a y ，s r n a d k a n i m v p a t e le ta 1 m a c l a f u n g i n an e wa n t i f u n g a l m a c r o c y c l i cl a c t o n ef m ma c t i n o m y c e t es p y - 8 5 2 1 0 5 0 明t e t r a h e d r o n 。1 9 9 8 5 4 ：1 3 6 2 1 - 1 3 6 2 8 ：b ： n a n c yn i c h o l sa n db o n i f a c y t h es t r u c t u r e s o ft w on a p h t h o q u i n o n e p i g m e n t sf r o ma n a c u n o m y c e t e 。m w i e c l a w e k g e r b e ra n d w i e c l a w e k , 1 9 6 5 3 1 ：1 4 9 6 - 1 4 9 8 ：c ：t r i p t i k u m a r m u k h o p a d h y a y s r n a d k a m i ，r g b h a te ta 1 m a t h e m y c i nb an e wa n t i f u n g a lm a c r o l a c t o n ef r o m a c t i n o m y c e t es p e c i e sh i ly - 8 6 2 0 9 5 9 m j n a t p r o d 19 9 9 。6 2 ：8 8 9 - 8 9 0 放线菌除了能够产生具有抗菌和抗肿瘤活性的物质外，还可以产生一些非抗 生素物质( n o n a n t i b i o t i c ) 。从放线菌埒招s a 幻s p o 庙k i f u n e n s en o 9 4 8 2 中分离得 3 第一章前言 到的k i f u n e n s i n e ，能抑制a 甘露糖苷酶，可能具有免疫调节的功能【1 4 】；p t e r i d i c a c i da 和p t e r i d i ca c i db ，则有类似植物生长因子的功能f 倔。 h 瓴 m 矿 _ m e m e k i f u n e n s i n e a h 瓯 m 日 日 p t e r i d i ca b p t e d d i cb b 图1 - 3 来自放线菌的一些其他活性化合物的结构 资料来源：a ：h i r o s h ik a y a l d r i ，s h 嘧e h w ot a k a s e t o s h i h i r os h i b a t a e ta 1 s t r u c t u r eo fk i f u n e n s l n e a n e wi m m u n o m o d u l a t o ri s o l a t e df r o ma na c c l n o m y c e t e 叻j o r g c h e m 1 9 8 9 5 4 ：4 0 1 5 - 4 0 1 6 ：b ： l g a s h l y 。l i d a t ，y o s h i d a r ，f u r u m a i t p t e r k ，j ca d d saa n db n 酬p l a n tg r o w mp r o m o t e r sw i t h a m d n - u k ea c 时v i t yf r o ms t r e p t o m y c e sh y g r o s c o p i c u st p - a 0 4 5 1 明j a n t i b i o t , 2 0 0 2 , 5 5 ：7 6 4 - 7 6 7 充分挖掘化合物的活性依赖多种药物筛选方法，这样有助于提高活性菌株或 活性物质的检出率，可能会发现同一种( 类) 化合物的多种活性，从而检出更多的 候选菌株以及实现老药新用。如用筛选蛋白酶抑制剂和抗病毒的筛选系统，检出 了某些产生蛋白酶抑制剂的放线菌【1 叼；最近lb r a n d i 【1 7 l 等用新的筛选系统，发 现新的四肽类化合物g e 8 1 1 1 2f a c t o r a 。b ，b 1 c ，可在体外稳定结合细菌3 0 s 核糖 体小亚基，影响细菌蛋白质合成：自s t r e p t o m y c e sa l b u sa 2 8 2 中分离得到的 p y r r o l o s i n e ，在1 0 1 上g m l 时，即能抑制在囊胚形成时海星( a s r e r i n ap e c t i n i f e m ) 的r n a = 厶成，或使囊胚形成后生长发育停止【1 明。 4 第一章前言 r = or 1 = hf a c t o r a a m w6 4 3 r = or 1 = n h 2f a c t o rb a m w6 5 8 r = n h r 1 = n h 2 f a c t o rb 1 am w 6 5 7 o h o h p y r r o l o s i n eb 图1 _ 4 化合物g e 8 1 1 1 2f a c t o ra ，b ，b 1 ，c 和p y r r o l o s i n e 的结构 资料来源：a ：l e t i z i ab r a n d i a m e r i g al a z z a d n i 。l i n d ac a v a l e t t i n o v e lt e b a p e p t i d ei n h i b i t o r so fb a d e r j 甜 p r o t e i ns y n t h e s i sp r o d u c e db yas t r e p t o m y c e ss pm b i o c h e m i s t r y ，2 0 0 6 4 5 ：3 6 9 2 - 3 7 0 2 ；b ：s u s u m u i k e g a m i 。h a r u h i k oi s o m u m 。a n dn o b o r ut s u c h i m o r s t r u c t u r eo fp y r r o l o s i n e ：an o v e li n h i b i t o ro fr n a s y n t h e s i s 。f r o mt h ea c i i n o m y c e t e s t r e p t o m y c e sa l b u s 【j 】j a m c h e m s o c ，1 9 9 0 ，1 1 2 ：9 6 6 8 9 6 6 9 1 2 土壤放线菌次级代谢产物研究概况 1 2 1 土壤放线菌的分离 土壤是放线菌生长的良好场所。在干燥，微碱性，有机质丰富的土壤中放线菌 较为丰富。在分离过程中放线菌易受到其他微生物的影响，应尽可能排除其他微 生物如细菌、真菌的干扰，创造有利于放线菌生长的条件，从而分离到更多的放 线菌。 土壤放线菌的分离要点主要包括土壤预处理、分离方法、分离培养基、培养 基中加入不同的抑制剂等。 分离中预处理的常用方法是风干和加热处理，通常能够达到减少细菌的目的； 也有文献报道将风干的土样在分离前先制成悬浮液，加入一定量的酵母膏( 或蛋 白胨) ，4 0 0 c ( 或5 0 0 c ) 振荡培养1 0 2 0 m i n 1 9 1 ，有利于放线菌休眠孢子萌发。 分离时一般采用稀释法，将一定量的土样，用无菌生理盐水先制成悬浮液， 然后以百倍稀释后，各取o 1 m i 加入培养皿，再加入分离培养基混匀即可。 放线菌分离的培养基通常采用高氏一号培养基，为了分离到一些稀有放线菌 第一章前言 可以采用其他的分离培养基，如腐殖酸培养基，y m 刚培养基等。 为了防止土样中的细菌、真菌生长过快，影响放线菌的分离，可以在培养基 中加入一定量的抗生素，如放线菌酮( 4 0 闪，m i ) 仁1 1 或重铬酸钾( 5 0 p g ，m 咿2 2 l 。培养 时可以选择多种温度，如y e d i ro u h d o u c h 在分离时就采用了2 5 0 c ，3 0 0 c ，3 7 0 c ， 4 0 0 c 四种温度【2 1 1 。培养时间一般需要大于两周。 1 2 2 土壤链霉菌的次级代谢产物的研究概况 1 2 2 1 抗菌活性物质 土壤链霉菌是天然活性物质的重要来源，从中分离到的大部分的抗生素至今 仍被广泛使用。 s e l m a na b r a h a mw a k s m a n 发现了一系列的抗生素，其中包括链霉素和新霉 素；他因发现了链霉素获得t 1 9 5 2 年的生理学和医学诺贝尔奖网。1 9 4 3 年他发 现链霉素( s t r e p t o m y c i n ) 是由来自土壤的链霉菌s g r i s e 惦产生的氨基糖苷类化 合物，这是第一个被发现的对结核分支杆菌有强活性的药物，具有广谱的抗菌活 性，现在仍被广泛应用于革兰氏阳性和阴性细菌感染疾病的治疗。另一个广泛使 用的抗生素新霉素( n e o m y c i n ) 是19 4 9 年从s f r a d i a e 中发现。 n 心 j 卜n h 2 h 2 n 图1 - 5 链霉素和新霉素的结构 资料来源：h t 巾珊w w 眦甜i 列怕隋c o m t o p j c n e o m y d n 6 第一章前言 由土壤链霉菌产生的g o p a l a m i c i n ，具有广谱的抗真菌的活性，包括对曲霉属、 白色假丝酵母和镰刀菌属等，其m i c 值在1 2 1 6 # g m l 之间【2 4 1 ；1 9 9 9 生f 自土壤链 菌s t r e p t o m y c e ss p g k 9 2 4 4 中得到的t e t r l nc ，属于二十六元多烯大环内酯， 对真菌( m o 所e 厂e a 厂a m a 门门a 门，s ) 表现出较好的活性，其m l c 值为5 p g m i 2 5 1 。 h g o p a l a m i c i n a h 3 c h o h n h 2 t e t r i nc b 1 - 6 化合物g o p a l a m i c i n 和t e t r i nc 的结构 资料来源：a - m u r a l e e d h a r a ng n a i r 。a m i t a b hc h a n d r a 。d e b o r a hl t h o r o g o o d g o p a l a m i c i n 。a n a n t i f u n g a lm a c r o d i o l i d ep r o d u c e db ys o i la c t i n o m y c e t e s 【j 】j a g r i c f o o dc h e m 1 9 9 4 。4 2 ：2 3 0 8 - 2 3 1 0 ： b ：g e o n s e e kr y u ，w o n - c h a n gc h o i ，s e u n g j i nh w a n g ，w o o n - h y u n gy e o ，c h o n g - s a ml e e a n ds i - k w a n k i m t e t r i nc an e wg l y c o s y l a t e dp o l y e n em a c r o l i d ea n t i b i o t i cp r o d u c e db ys t r e p t o m y c e ss p g k 9 2 4 4 【j 】j n a lp r o d 19 9 9 6 2 ：9 17 - 9 19 另一类由土壤链霉菌列契瓦尼而氏菌属( l e c h e v a f i e r i aa e r o c o l o n i g e n e s v k - a 9 ) 产生的抗真菌的化合物t h i o b u t a c i n ，属于异丁酸的衍生物，该类化合物 有良好的抗植物病原菌和抗肿瘤等活性，同时对啤酒酵母( s a c c h a r o m y c e s 第一章前言 厂e 派妇e ) 也有抑制效果，其m i c 值为3 0 灼，m l 阑。另外，对植物病原真菌有活 性的还有生物碱类s t a u r o s p o r i n e l 2 删。 oc o o h t h i o b u t a c i n a a ，c h 3 h h n c h 3 s t a u r o s p o d n e b 图1 - 7 化合物t h i b u t a c i n 和s t a u r o s p o r i n e 的结构 资料来源la lj u n gy e o pl e e 。s u r ks i km o o n s o n gs i ky u n 。e ta 1 t h i o b u t a c i n an o v e la n t i f u n g a ia n d a n f m o m y c e t ea n t j b i o u cf r o ml e c h e v a l i e d aa e r o c o l o n 留e n e c p j n a lp r o d 2 0 0 4 6 7 ：2 0 7 6 - 2 0 7 8 ，b i h e ej i np a r k j u n gy e o pl e e i ns u nh w a n g i s o l a t i o na n d ；s z m f u n g a la n da n t l o o m y c e t e 删o f s t a u r o s p o r i n ef r o ms t r e p t o m