（作物遗传育种专业论文）球孢白僵菌几丁质酶基因Bbchit1抗病作用研究.pdf

中文摘要 球孢白僵菌几丁质酶基因b b c h i t l 抗病作用研究 作物遗传育种专业硕士研究生郭绍辉 指导教师裴炎教授 中文摘要 几丁质酶( c b i t i n a s e ) 是一类催化水解n 乙酰葡萄糖氨聚合物中b 1 4 糖苷键的酶。几丁 质酶能有效降解大多数真菌细胞壁的重要组分之一的几丁质，因此，几丁质酶的抗菌作用备 受人们关注，前人的研究也表明超量表达几丁质酶基因能提高植物对病原菌的抗性。本研究 以毕赤酵母为表达系统，制备丝状真菌球孢白僵菌( b e a u v e r i ab a s s i a n a ) 几丁质酶b b c h i t i ， 研究了b b c h i t l 对部分植物病原真菌孢子萌发和菌丝生长的抑制作用。同时通过根癌农杆菌介 导将b b c h i t l 基因转入受体植物烟草( n i e o t i a n at a b a c u m ) 中，研究了转基因烟草的抗病性。 主要结果如下： l 、检测了毕赤酵母表达获得的几丁质酶b b e h i t l 对部分植物病原真菌孢子萌发和菌丝生 长的抑制作用。结果表明：b b e h i t l 能抑制黄瓜灰霉病菌( b o t r y t i sc i n e m a ) 、油菜菌核病菌 ( s c l e r o t i n i as e l e r o t i o r u m ) 、玉米小斑病菌( b i p o l a r i sm a y d i s ) 、白菜黑斑病菌( a l t e r n a r i a b r a s s i c a e ) 、柑橘绿霉( p e n i c i l l i u md i g i t a t u m ) 菌丝的生长，同时对烟草赤星病菌( a l t e r n a r i a a l t e r n a t a ) 、白菜黑斑病菌( a l t e n a r i ab r a s s i e a e ) 、黑曲霉( a s p e r g i l l u s n i g e r ) 、棉花黄萎病菌 ( v e r l i c i l l i u md a h l i a e ) 、柑橘绿霉菌( p e n i c i l l i u md i g i t a t u m ) 孢子的萌发有抑制作用， 2 、将几丁质酶基因b b e h i t l 转入烟草中，g u s 组织化学染色和s o u t h e r n 杂交结果表明： b b c h i t l 基因已整合到烟草基因组中，并稳定遗传。几丁质酶活性测定结果表明：5 个t 2 代烟 草纯合株系( b b 3 5 、b b 4 9 、b b 5 7 、b b 6 3 、b b 7 1 ) 的几丁质酶活性均高于野生型对照。w e s t e r n b l o t 分析也表明，b b c h i t l 基因在转基因烟草中能稳定表达目标蛋白。 3 、对5 个t 2 代烟草纯合株系进行了抗病性检测，结果表明：5 个t 2 代烟草纯合株系( b b 3 5 、 b b 4 9 、b b 5 7 、b b 6 3 、b b t l ) 与野生型对照相比，在对细菌性病害烟草青桔病的抗性上，病情 指数分别降低了8 7 5 、5 3 7 5 、3 7 5 、3 3 7 5 、2 3 7 5 ；在对真菌性病害烟草赤星病的抗 性上，病斑面积分别减少了3 9 1 1 、3 5 6 3 、4 3 6 2 、5 7 2 2 、6 1 3 6 。转b b c h i t l 烟草对 烟草赤星病、烟草青枯病的抗性均有不同程度的提高。 关键词：球孢白僵菌几丁质酶烟草赤星病烟草青枯病抗病性 a b s t r a c t t h e p h y t o p a t h g o nr e s i s t a n c eo f a ne n d o c h i t i n a s e g e n e ( b b c h i t l ) f r o m t h ee n t o m o p a t h o g e n i c f u n g i ，b e a u v e r i ab a s s i a n a c a n d i d a t e ：g u os h a o h u i a d v i s o r ：p r o f p e iy a n a b s t r a c t c h i t i a a s ei sag r o u po fe , l l g y n l e sw h i c hc a t a l y z et h eh y d r o l y s i so f i ，# , - g l y c o s i d i cb o n d so f c b i t i n , a ni m p o r t a n tc o m p o n e n to fm a n yf u n g a lc e l lw a l l w i 恤t h e 6 f h n g a la c t i v i t y , e h i t i n a s eh a s a t t r a c t e dal o to fe f f o r t st oe n h a n c ep l a n tr e s i s t a n c et op a t h o g e n sb yo v e r e x p r e s s i n gt h i sk i n do f g e n e si np l a n t s i nt h i ss t u d y , w ep r e p a r e dab e a u v e r i ab a s s i a n ac h i t i n a s eb b e h i t lu s i n gp i c h i a p a s t o r i se x p r e s s i o ns y s t e m , a n dd e t e r m i n e dt h ei n h i b i t i o ne f f e c t so fb b e h i t lo ns p o r eg e r m i n a t i o n a n dm y c e l i a lg r o w t ho fs e v e r a lp l a n tp a t h o g e n i cf l m g i t h e n , t h eb b c h i t lg e n ew a st r a n s f e r r e di n t o t o b a c c o s ( n i e o t i a n at a b a c u m ) ，a n d5h o m o z y g o u st 2l i n e sw ms e l e c t e dt os t u d yt h ep a t h o g e n r e s i s t a n c e nv i v o t h em a i nr e s u l t sa a sf o l l o w i n g s ： 1 i n h i b i t i o ne f f e c t so f c h i t i n e s eb b c h i t lo ns p o r eg e r m i n a t i o na n d m y e e l i a lg r o w t ho f s e v e r a l p h y t o p a t h o g e n i cf u n g iw e r et e s t e d b b e h i t lc a l li n h i b i tt h em y c e l i a lg r o w t ho fb o t r y a sc i n e r e a , s c l e m n h i 。s c l e r o t i o r u m b i p o l a r i sm a y d i s , a l t e n a r i ab r a s s i e a ea n dp e n i c i l l i u md i g i t a t u m a n dt h e s p o r eg e r m i n a t i o no fa l t e r n a r i aa l t e r n a t a , a l t e n a r i ab r a s s i c a e , a s p e r g i l l u sn i g e r , v e r t i e i l l i u m d a h l i a ea n dp e n i e i l l i u md i g i t a t w n 2 g u sh i s t o c h e m i c a ls t a i n i n ga n ds o u t h e r nb l o ta n a l y s i ss h o w e dt h a tb b c h i t lg e n eh a sb e e n i n t e g r a t e di n t ot h et o b a c c og e n o m e c h i t i n a s ea c t i v i t ym e a s u r e m e n ti n d i c a t e dt h a tt h er e p r e s e n t a t i v e t r a n s g e n i cl i n e sh a dh i g h e re h i t i n a s ea c t i v i t yt h a nw i l dt y p e w e s t e r nb l o ta n a l y s i ss h o w e dt h a t b b c h i t lg e n ee x p r e s s e ds t a b l yi nt r a n s g e n i ct o b a c c o 3 f i v eh o m o z ) 譬o i 珥l i n e 窖w e 辩s e l e c t e dt oa s s a yd i s e a s er e s i s t a n c e w h e nc h a l l e n g e db ya b a c t e r i a lp a t h o g e nr a l s t o n i as o l a n a c e a r u m ，t h ed i s e a s ei n d e xo f5t 2h o m o z y g o u sl i n e s ( b b 3 5 ， b b 4 9 ，b b 5 7 ，b b 6 3 ，a n db b 7 1 ) d e c r e a s e db y8 7 5 ，5 3 7 5 3 7 5 ，3 3 7 5 ，a n d2 3 7 5 ， r e s p e c t i v e l y w l mi n o c u l a t e dw i t hf u n g a lp a t h o g e na l t e r n a r i aa l t e r n a t a t h el e s i o na l e a so ft h e5 t r a n s g e n i cl i n e sr e d u c e db y3 9 1 1 ，3 5 6 3 ，4 3 6 2 ，5 7 2 2 ，a n d6 1 3 6 r e s p e c t i v e l y t h e s e o b s e r v a t i o ns u g g e s t e dt h a tt h eb b c h i t lm i g h tb ep o t e n t i a lf o ri m p r o v e m e n to fp l a n t sr e s i s t a n c e 两南大学硕l - 学位论文 a g a i n s taw i d er a n g eo f p h y t o p a t h o g e n i cf u n g ia n db a c t e r i ab yg e n ee n g i n e e r i n g k e y w o r d s ：b e a u v e r i ab a s s i a n a ，c h i t i n a s e ，a l t e r n a r i aa l t e r n a t a ，r a l s t o n i a s o l a n a c e a r u m ，d i s e a s er e s i s t a n c e 文献综述 第一章文献综述 植物是人类衣食住行的重要来源，可以说植物与人类生活息息相关，植物病 害能导致植物减产以及产品品质下降，严重影响着人类生活，甚至影响到人类生 存。据统计，每年全球因植物病害造成的作物减产达1 5 以上( 李润植等，2 0 0 1 ； o s u s k y e t a l ，2 0 0 0 ) 。在某些年份，植物病害甚至会导致作物绝收，如1 8 4 5 1 8 4 6 年在苏格兰爆发的马铃薯晚疫病导致苏格兰大饥荒，几百万人因此流离失所。此 外，病原菌的侵害还导致作物品质下降；病菌所产生的有毒物质( 如黄曲霉素、 镰刀菌素等) 对人体健康带来危害。如果能控制植物病害，不仅能有效地缓解粮 食短缺问题，而且对提高人们的生活质量也有重要意义。 早在1 6 世纪中叶，人类就开始研究如何防治植物病害，人们开始有意识的选 择性状好的作物以及在病害发生后存活作物的种子进行栽种。另外，人们也通过 改进栽培措施，以及施用化学农药等方法来防治植物病害( c o m e l i s s e n e t a l 1 9 9 3 ) ， 但是改进栽培措施并不能从根本上防治植物病害，施用化学农药更会造成环境污 染，且病原菌也易产生抗药性。培育抗病作物品种，则是控制作物病害最有效的 办法。 然而，植物自身的抗性资源有限，许多抗病基因存在于野生种或近缘野生种 中，利用起来难度大。而且病原菌变异频繁，可导致抗病品种迅速失去抗病性， 常规育种往往难以控制这些病害的危害，此外常规育种手段育种周期长，要获得 多个目标性状均基本纯合稳定的品系，一般要近十年甚至几十年时间，育种进度 难以满足生产要求。 上个世纪八十年代以来，随着生物技术的兴起，利用现代生物技术分离、克 隆和转化抗性基因，对单一性状进行根本改良成为可行。该途径的优点是定向性 强、基因型来源丰富、不会受植物不良农艺性状的影响、不受抗源亲缘关系限制、 育种周期短、理论上不存在性状负相关连锁，一次克隆可用于多次转化等。因此， 采用基因工程改良植物的抗病性是植物病害防治的一条重要途径( r o m m e n sa n d k i s h o r e ，2 0 0 0 ) 。到目前为止，随着对植物与病原菌相互作用以及抗病和致病基因 本质研究的不断深入，一系列专化抗性和广谱抗性的抗病基因陆续被克隆，转基 因改良植物抗病性已取得初步成效。 1 1 抗病基因工程策略 目前，在利用基因工程手段创造抗病植物种质中，抗病基因的选择通常有两种 两南大学硕七学位论文 策略：一是利用植物的r ( r e s i s t a n c e ) 基因；二是利用具有广谱与持久抗性的基因， 即利用抗菌蛋白基因策略。 1 1 1 利用植物的r 基因( r e s i s t a n c eg e n e ) 该策略的理论依据是“基因对基因”模型( g e n e - f o r - g e n e m o d e l ) ，该模型是 2 0 世纪4 0 年代，哈罗德h 福洛( h a r o l dh f l o r ) 在对亚麻和亚麻锈病病原菌进行遗 传学研究时提出的，阐明了植物抗病遗传和病原体毒性遗传的联系。这个模型认 为，只有当植物有显性抗性基因( r e s i s t a n c eg e n e ，r ) ，病原体表达互补的显性无 毒基因( a v i r u l e n c eg e m e , a v r ) 时，植物才会表现抗性，即如要植物对病原体产生 抗性( 不相容性) ，在宿主和病原体中分别需要互补的显性基因对。植物抗性基 因或病原体无毒基因发生改变或丢失，即在植物中r 变为r ；或者在病原体中a w 变 为a v r ，植物对病原体不产生抗性( 相容性) ，这个模型可适用于大多数活体型植 物和病原体的相互作用( b u c h a n a ne ta 。2 0 0 0 ) 。 图1 - 1 福洛的。基因对基因”模型( 摘b u c h a n a n 等，2 0 0 0 ) 飚u r e l 一1g e n e - f o r - g e n em o d e lr l i l n b yf i o r ( a d o p t e df r o mb u c h a n a n 甜a 1 ，2 0 0 0 ) r 基因一般表现为植物抗病品种对病原菌生理小种的专化性抗性，所以其抗病 性具有很强的专一性，且容易因病原菌群体生理小种的变化而被克服( z h a n ge ta l 。 2 0 0 3 ；c a l d oe t 以，2 0 0 4 ) 。但某些r 基因也能赋予寄主植物持久和广谱的抗病性。 例如，s o n g 等( 1 9 9 7 ) 克隆的水稻抗白叶枯病基因妇2 具有广谱抗病性。转基因水 稻实验表明，转基因植株能够抗来源于8 个国家的白叶枯病原细菌( x a n t h o m o n a s 2 文献综述 o r y z a e ) 的2 9 个菌系，只有3 个菌系能克服其抗性，另外已克隆的甜菜基因胁j ”o ( c a i e la ，1 9 9 7 ) 和从辣椒基因组中分离到的抗细菌性斑点病基因b s 2 ( k e a m e ye la l ， 1 9 9 0 ) 也具有广谱抗性。因此，筛选具有广谱抗性的r 基因也是种可行的抗病基因 工程策略。 1 1 2 利用抗菌蛋白基因的策略 在植物与病原菌相互识别后的反应中，植物表现了多种多样的生理生化抗菌 途径，抗真菌蛋白( a n t i f t m g a lp r o t e i n s ) 的产生及积累是一种主要防卫反应，因此抗 菌蛋白基因可作为植物抗病基因工程的目的基因，用于抗病品种的培育。目前转 抗真菌蛋白基因改良植物抗病性已取得明显成效( g a oe ta l ，2 0 0 0 ；s c h a e f e re ta 1 ， 2 0 0 5 ；y a n g 甜a l 2 0 0 7 ) 。 通过转入抗病蛋白基因获得的转基因植物，具备能抗多种病害、抗病性不易 丧失等优点( o s u s k ye t 以2 0 0 0 ) ，因此这一策略受到广泛的重视。到目前为止，己 报道的抗真菌蛋白有：p r 蛋白( p a t h o g e n e s i s - r e l a t e d p r o t e i n ) 、核糖体失活蛋白 ( r i b o s o m e i n a c t i v e p r o t e i n , r i p ) 、非专一性脂转移蛋白( n o n - s p e c i f i c l i p i d t r a n s f e r p r o t o n , n s l t p ) 、防御素( p l a n td e f e n s i n s ) 、硫堇( t h i o n i n s ) 、植物凝集素( 1 e c t i n s ) 和橡胶素( h e v e i n ) 等类。 1 1 2 1p r 蛋白 p r 蛋白( p a t h o g e n e s i w r e l m e d p r o t e i n ) 是病程相关蛋白的简称。p r 蛋白是由植 物寄主基因编码，在植物受到病原菌侵染时产生的一类蛋白。植物病原细菌、真 菌、病毒和类病毒都可以诱导p r 蛋白生成，己发现的病程相关蛋白归类为1 1 个属， h p p r - 1 至p r - 1 1 。其中，p r - 1 、p r - 4 、p r 5 具抗真菌功能；p r - 2 具b 1 ，3 葡聚糖酶 活性；p r 3 、p r 8 、p r - 1 1 具有几丁酶活性；p r - 6 为蛋白酶抑制剂；p r 7 为内源 蛋白酶；p r 9 具有过氧化物酶活性；p r - 1 0 具有类核糖核酸酶活性( v a nl o o ne t a 1 ，1 9 9 0 ；1 9 9 4 ) 。 1 1 2 2 核糖体失活蛋白 核糖体失活蛋( r i b o s o m e i n a c t i v e p r o t e i n , r i p ) ，是一种r n a n 糖苷酶( r r n a n g l y c o s i d a s e s ) 。r i p 的作用机制大体上说，都是因其具备特异的r n an - 糖苷酶 活性，通过水解核糖体r n a 上特异位点结合的碱基，抑制靶细胞的蛋白质合成， 从而使核糖体失活。r i p 不失活自身的核糖体，却能特异作用于亲缘关系较远的种 类( v a nd a m m ee ta 1 ，2 0 0 1 ；n i e l s e ne ta 1 ，2 0 0 1 ) 。因此，r i p 具有提高植物抗病性 的作用。l o g e m a n n 等( 1 9 9 2 ) 利用从大麦中分离的脚基因与诱导启动子连接后转 两南大学硕十学位论文 化烟草，结果发现该r i p 基因可提高再生植株对立枯丝核菌的抗性。 1 1 2 3 非专一脂转移性蛋白 非专一脂转移性蛋白( n o n - s p e c i f i cl i p i dt r a n s f e rp r o t e i n , n s l t p ) 广泛存在于植 物中，因其能在膜间转移而没有脂专一性，即不仅仅只有转移脂的功能，因而命 名为非专一脂转移性蛋白。 m l l 甲s 在抗病防御中主要包括两个主要的基本过程：( 1 ) 形成疏水保护层 ( c u t i na n ds u b e r i n ) ；( 2 ) 抑制真菌生长。在一种植物中，上述两种功能可能由一 种n s l t p s 完成，也可能由几种n s l t p s 完成( b l e i n e l a l ，2 0 0 2 ) 。y a n g 等( 2 0 0 6 ) 从 益母草种子中纯化出的非专一性脂转移蛋白i a a m p 2 能有效抑制植物病原菌菌丝 的生长。 1 1 2 4 其他抗真菌多肽 植物防御素( p l a n td e f e n s i n s ) 是一类富含半胱氨酸的蛋白质和肽类。植物防 御素一般都在4 5 5 4 个氨基酸左右大小，带正电荷，大部分含有4 个二硫键。植物 防御素在真菌细胞上可诱导一系列相关反应，包括提高k + 流出、c 矿吸收、膜结构 改变和膜通透作用等，破坏细胞膜的正常结构和改变膜的穿透性，从而达到抑制 病原菌的效果( t h o m m a e t a ，2 0 0 2 ；t h e v i s s e n e t a l ，1 9 9 6 ) 。 硫堇( t h i o n i n s ) 是一种从植物中提取的分子量为5 日) a 左右的碱性蛋白，氨 基酸残基数约为4 5 4 7 ( 陈艳等，2 0 0 3 ) 。研究表明，硫堇能抑制多种病原细菌( 包 括革兰氏阳性和阴性菌) 和真菌的生长，其抗菌机制可能是造成细胞内含质的泄漏 ( b r o e k a e r t e l a l ，1 9 9 7 ) 。 植物凝集素( 1 e e t i n s ) 是自身不具有催化功能，但可与几丁质特异结合的蛋白 或者糖蛋白。植物凝集素蛋白基因产生的凝集素具有识别功能，并在抵抗植物真 菌性病害中发挥作用。已经从多种植物，例如大蒜中获得了凝集素基因( v a nd a m m e a l 1 9 9 1 ) 。 橡胶素( h e v e i n ) 和橡胶素类( h e v e i n - l i k e ) 小分子量的抗菌蛋白是类含有 几丁质结合域的植物抗菌蛋白，它们含有4 0 - 4 3 个氨基酸残基，能够抑制多种真菌 和革兰氏阳性细菌的生长( b r o e k a e r te ta 1 。1 9 9 7 ) 。 1 2 几丁质酶及其在植物抗病基因工程中的应用 几丁质( c h i t i n ) 又称甲壳素或甲壳质，是由n 乙酰b d 葡萄糖氨 ( n - a c e t y l p d g l u e o s a m i n e , g l u n a c ) 以p 1 ，4 糖苷键连接而成的直链多聚物。几丁质 是多数真菌细胞壁的主要成分之一，而几丁质酶能够催化几丁质水解为几丁寡糖 4 文献综述 和n 乙酰氨基葡萄糖( n a g ) ，因此几丁质酶在真菌病害防治上具有重要的意义( 陈 松等，1 9 9 7 ：k o b y e ta ，1 9 9 4 ) 。 几丁质酶属于p r 蛋白，在正常情况下，植物自身存在的几丁质酶基因表达水 平很低或不表达，但在受到病原菌侵染、真菌激发子、外源几丁质、乙烯、水杨 酸、重金属、机械损伤、臭氧、紫外线辐射等许多因素诱导时，其表达活性明显 提高( c o l l i n g e e t a l ，1 9 9 3 ) ，因此几丁质酶可用于植物抗病育种。 关于几丁质酶最早的研究可追溯到1 9 0 5 年，当时b e n e e k e 分离出能够利用几丁 质作为营养物质的微生物，并将其命名为几丁芽孢杆菌( b a c i l l u sc h i t i n o v r o u s ) ，现 分类为蚀几丁质贝内克氏菌。此后，人们又相继从多种微生物( 包括细菌、放线菌、 真菌) 、植物及动物中分离到几丁质酶，并对几丁质酶的理化特性、生物学性状和 拮抗特性进行了大量研究。进入2 0 世纪8 0 年代以来，随着分子生物学技术的迅速 发展，人们逐渐把研究的重点转移到几丁质酶对真菌生长的抑制上，并希望通过 基因工程手段培育出抗真菌的转基因植物。随着研究的深入，以及关于转几丁质 酶基因提高植物抗病性的报道，几丁质酶及其在植物病害控制方面的作用，已经 受到人们的关注。 1 2 1 几丁质酶的分类 几丁质酶分类一般有三种标准： 一是根据反应的最适p h 值的不同，可将其分为酸性、中性和碱性几丁质酶。 微生物中的几丁质酶多为酸性酶；而植物中的几丁质酶大多为碱性酶，也有酸性 酶。一般认为，植物中的碱性几丁质酶与植物对真菌的抗性有关。 二是根据与底物的作用部位的不同可分为外切和内切几丁质酶，其中外切几 丁质酶水解位点为寡糖链末端1 3 1 4 糖苷键，切下几丁质二糖，同时沿寡糖链前移 准备进行下一次水解i 而内切几丁质酶水解位点为寡糖链内部1 3 1 , 4 糖苷键，并切 开相应的糖苷键，然后再进行随机的结合和水解。 三是按照糖苷酶的分类标准进行分类。根据氨基酸序列的同源性，糖苷水解 酶可以划分为5 8 个家族( h c n r i s s a t b ，1 9 9 6 ) ，根据该分类方法几丁质酶属于家族 1 8 和家族1 9 。大多数细菌、真菌、线虫和昆虫的几丁质酶属于1 8 家族，植物几丁 质酶则分布于两个家族中。其中，c l a s s a n dv 属于1 8 家族；i ，a n d 属于1 9 家族( k a s p r z c w s k a , 2 0 0 3 ) 。 酶需要形成一定的高级结构才能发挥其功能，两个家族在三级结构、催化机 理及其他特性上均不同( 欧阳石文等，2 0 0 1 ) 。从三维结构上看，家族1 8 几丁质 酶和家族1 9 几丁质酶存在很大的差异。家族1 9 几丁质酶的三维结构是由两个弘 螺旋形成的裂片构成，底物结合位点位于两个裂片形成的裂口；而家族1 8 几丁质 5 两南大学硕十学位论文 酶，如粘质沙雷氏菌的几丁质酶a 的三维结构是由8 条f t 螺旋和8 条b 折叠形成 的( “p ) 8 桶状结构，在桶状结构的表面形成了一个底物结合部位。其它家族1 8 几丁质酶也展示了相同的桶状结构，这些几丁质酶在氨基酸序列上的相似导致了 结构上的相近，进而使得它们具有相似的功能( f u k a m i z o 。2 0 0 0 ) 。 图1 _ 2 凡丁质酶的三维结构图 a 爱玉几丁质酶的三维结构图；b ，大麦种子凡丁质酶的三维结构图，红色示壤旋，黄色示b 折( 摘自“ a l ，2 0 0 5f u k a m i z o , 2 0 0 0 ) 。 f i g n r e l - 2t h r e ed i m e n s i o n a l $ t r l l l e t l l l r eo f c h i t i n a s e s a ，j e l l y f i ge h i t i n a s c ；b ，b a r l e yc h i t i n a s e a - h e l i c e sa ms h o w n b yr e d , a n d h r a n d s b y y e l l o w ( a d o p t e d f r o m l ic t a l 。 2 0 0 5 ：f l l k a m i , 2 0 0 0 ) 催化机理上，b r a m e l d 等( 1 9 9 8 ) 提出了1 8 家族催化机制是双替换构型保持 机制，而1 9 家族的为单替换构型倒位机制，另外，两个家族在抑制物，催化产物 等方面也不相同( 见t a b l 1 ) 。由于两个家族几丁质酶催化机理不同，因而其抗 病性也可能存在差异，有研究表明：来源于木霉的几丁质酶无论在提高植物的抗 病水平还是抗病谱上都优于植物来源的几丁质酶( l o r i t oe t a l 1 9 9 8 ) 。 表1 - 1 塘苷水解酶1 8 家族和1 9 家族几丁质酶的差异( 引自k a s p r z e w s k a , 2 0 0 3 ) t a b l - 1d i f f e r e n c e sb e t w e e nt h ee h i f l n a s eo f g l y c o s i d eh y d r o l a s ef a m i l y1 8a n d1 9 ( a d o p t e df r o m k a s p r z e w s k a ，2 0 0 3 ) 6 a n o m e n c g l y c o s i d a s e c a 诅l y t i c i i 咖n c d i a l e 咖丘娜鲥 i n h i b i t o r s t a m l l y m e c h a n i s m ， 。ol p r o d u c t s u b s 廿a l e o x a z o l l n l u m 1 88 a l l o s a m i d i n a g s i s t 即 1 0 l l 1 9 o x a z o l i n i u m a c i d i c 1 0 n a m i d i n e s a m i d r a z o n e s 文献综述 1 2 2 微生物几丁质酶 几丁质酶在动物、植物、微生物中都有分布。很多微生物都能够产生几丁质 酶，而且即便是同一种微生物有时也能产生几种不同的几丁质酶，如粘质沙雷氏 菌产生相对分子质量为2 1 ，0 0 0 d a 5 7 ，0 0 0 d a 不等的5 种几丁质酶( b e n h a m o ue l a 1 9 9 8 ) 。 微生物几丁质酶的分子大小差异很大，一般为1 0 ，0 0 0 1 0 0 ，0 0 0d a ，目前研究 的相对分子质量最大的是m i c r o b u l b i f e rd e g r a d a n s 的几丁质酶，达到了1 4 0 ，0 0 0d a ( h o w a r de ta 1 ，2 0 0 3 ) 。微生物几丁质酶反应的最适p n 值的变动范围也很大，一 般认为是3 1 1 ，但绝大多数微生物几丁质酶最适p n 值为4 6 的偏酸性环境。 微生物几丁质酶的等电点一般为3 6 8 6 。微生物几丁质酶往往对热都比较稳定， 在4 6 0 时都具有酶活性，而像激烈热球菌的几丁质酶在9 8 1 0 0 时仍然能 正常进行水解反应( j a q u e se ta 1 ，2 0 0 3 ) ，但大多数微生物几丁质酶的最适反应温度 为4 0 5 0 。 微生物几丁质酶具有可诱导性，譬如微生物几丁质酶的产生往往需要几丁质 和壳聚糖及其水解产物作为底物存在；而葡萄糖和几丁质等的降解产物则对微生 物的几丁质酶的表达起抑制作用。微生物几丁质酶的活性还受到环境中金属离子 的影响，如f e 2 + 、f e ”、勐”对酶的活性有较大的抑制作用，而m 矿和m n 2 + 贝l j 有 一定的激活作用( h e n r i s s a t e t a l ，1 9 9 1 ) 。 1 2 3 几丁质酶对植物病原真菌的作用及机制 几丁质酶的抗菌作用是首先在微生物实验中发现的。h o r i k o s h i ( 1 9 5 9 ) 发现环 状芽孢杆菌能裂解黄曲霉菌，而且加入几丁质酶后，裂解效率会提高。在国内。 陈三风、李季伦等( 1 9 9 2 ) 对自主分离和已报道的1 5 种微生物产生几丁质酶的情况 进行了研究，并且研究了产生的几丁质酶酶活性与对病原真菌的抑制作用间的相 互关系。结果表明：在几丁质酶活性上，真菌和细菌的较高，在对真菌的抑制作 用上，细菌的拮抗作用最强，其次是放线菌。杨合同等人( 2 0 0 3 ) 报道：木霉菌 ( t r i c h o d e r m a ) 的几丁质酶是其防治植物真菌性病原菌的主要机制之一，它能降解 真菌的细胞壁，达到防治病害的目的。 大量的研究结果表明，几丁质酶能抑制病原物菌丝的生长，能有效裂解真菌 菌丝体，并释放出细胞内可溶性物质。m i k k e l s e n 等( 1 9 9 2 ) 的研究表明：几丁质 酶只对幼嫩的菌丝端部作用敏感，而成熟菌丝细胞壁的几丁质层不易被降解，这 是因为成熟细胞的细胞壁中( 远离菌丝顶端) 形成交错的几丁质一葡聚糖纤丝，且外 面包被有其他多糖及蛋白。 同时，几丁质酶对真菌孢子萌发有一定的抑制作用。刘爱新、董汉松等( 1 9 9 9 1 7 西南大学硕十学位论文 的研究表明：烟草几丁质酶能抑制赤星病菌的菌落生长和孢子萌发；l i 等( 2 0 0 5 ) 从爱玉中分离出一个3 0 k d a 的几丁质酶，该蛋白对炭疽病菌( cg l o e o s p o r i o i d e s ) 孢子萌发有抑制作用。 目前认为，几丁质酶是通过降解菌丝生长端区域新合成的几丁质，破坏菌丝 的生长，同时也能抑制孢子的萌发，从而达到抑制真菌的效果，另外几丁质酶水 解真菌细胞壁几丁质，产生中间产物几丁寡糖等，几丁寡糖作为植物功能调节剂， 可以调解植物细胞代谢活动、刺激植物生长，诱导植物产生防御反应，如芳香族 化合物的积累和木质化的形成，从而阻止病原菌进一步侵入和扩散，起到防御病 害的作用。 另外，大多数几丁质酶的抑制作用具有特异性，某种几丁质酶在对各种病原 真菌的抗病性中所起的作用必然有差异，同一病原真菌受各种几丁质酶的抑制和 水解也不同，这些不同不仅在于酶活性的大小，而且也存在一定的位置效应。 1 2 4 几丁质酶在植物抗病研究中的应用 目前，作为植物抗病基因工程研究的目的基因之一，几丁质酶基因的应用主 要有三个方面：把其它来源的几丁质酶基因导入植物中，以提高植物几丁质酶 的表达水平；改造植物原有的几丁质酶基因，改换强启动子、导入增强子等， 以增加几丁质酶基因的表达量；一改造野生生防菌株，通过转基因，使生防菌株 获得新的抗病机制( 马汇泉等，2 0 0 4 ) 。三个方面的应用各有千秋，都对防治植 物病害有一定作用。 在转基因抗病研究领域，自1 9 9 1 年，b r o g l i e 等首次报道转几丁质酶基因植物 能抗真菌病害以来，几丁质酶基因一直受到人们关注。到目前为止，已经有大量 的几丁质酶基因被克隆，部分几丁质酶基因被导入植物中用以研究其对植物抗病 性的影响并取得了一定成效，仅在棉花中就已育成抗或耐棉花黄萎病的转基因棉 花株系( 吴家和等，2 0 0 4 ；程红梅等，2 0 0 5 ) 。 前人的研究表明，同一种几丁质酶对不同的真菌抑制效果不同，同时，不同 来源的几丁质酶在抑制病原菌的效果上也有差异。也有研究表明，来源于木霉的 几丁质酶在提高植物的抗病水平和抗病谱上都优于植物来源的几丁质酶( l o r i t oe t a 1 ，1 9 9 8 ) 。表1 屯例举了部分来源于微生物的几丁质酶基因用于植物抗病基因工 程的例子。到目前为止，已有许多来源于植物和微生物的几丁质酶基因转入植物 并提高植物抗病性的报道，因此，虽然不能武断的确定所有来源于微生物的几丁 质酶在抗病性上都优于来源于植物的几丁质酶，但也在我们选择几丁质酶基因的 来源时拓宽了思路。 文献综述 表l - 2 微生物几丁质酶基因提高植物抗病性的实例 t a b l - 2m i c r o b i a lc h i t i n a s eg e n ee n g i n e e r e d c r o p sw i t hi n c r e a s e dd i s e a s em l s 咖o e 随着人类社会的快速发展，传统植物抗病育种已不能满足人类的需要。植物 抗病基因工程技术的发展，为植物抗病育种注入新的活力，在抗病育种策略上开 辟出一条新的途径。在抗病基因工程中，不管是导入针对性强的抗性基因还是转 入具有广谱抗性的抗病基因，都能大大提高育种的速度，而且具有很强的目的性。 特别是在广谱抗病策略方面，直接导入广谱的抗病基因( 如抗菌蛋白基因) 或诱 导植物本身的防御机制，没有种属专一性，能取得长久高效的效果。植物抗病基 因工程的关键是相关基因的克隆。令人欣慰的是，大量相关基因已经被克隆出来， 转基因研究也筛选出许多有应用价值的基因，使植物广谱抗病基因工程逐渐成为 可能，相信随着基因组学和蛋白质组学研究的发展，更多的抗病相关基因会被克 隆出来，假以时日必定能筛选出能够满足人类需要的基因，植物广谱抗病基因工 程策略将得到更多更广泛的应用。 9 第二章引言 2 1 研究的背景与意义 第二章引言 人类栽培作物以来，真菌病害就是造成作物减产的主要原因之一。以棉花为 例，我国有4 3 0 0 多万农户以种植棉花作为主要经济来源，同时纺织工业年需原棉 约6 5 0 多万吨。但是棉花病害对我国棉花生产的危害逐年加重，仅棉花黄萎病在 重病年份就能造成皮棉损失超过4 0 万吨，直接经济损失达6 0 多亿元( 陈捷胤等， 2 0 0 5 ) 。此外，病原菌还破坏作物产品的质量、产生的毒素严重危害人体健康。 在作物病害综合控制策略中，培育和推广应用抗病品种是最为有效的措施。 但由于植物抗性资源有限、病原菌变异迅速，而常规育种手段育种周期长，所培 育的抗病品种远不能满足生产上的需要。上个世纪八十年代以来，随着基因工程 的发展，越来越多与抗病相关的基因成功转入受体植物中，并且提高了植物对病 原菌的抵抗能力。通过这种方法获得的植物对真菌的抗性，具有抗性来源广且不 易丧失、抗性基因容易转育等优点( c o m e l i s s e ne t 口，1 9 9 3 ) 。因此，基因工程 技术已成为植物抗病育种的重要途径。 目前研究的抗性基因中有一大类是几丁质酶基因。几丁质酶( c h i t i n a s e ) 是一 类催化水解n - 7 , 酰葡萄糖氨聚合物中b l ，4 糖苷键的酶( k a s p r z e w s k a , 2 0 0 3 ) ，能 有效降解大多数真菌细胞壁的重要组分之一的几丁质，因此，几丁质酶的抗真菌 作用受到人们广泛关注。到目前为止，已在多种生物中发现了几丁质酶，部分几 丁质酶基因被克隆，并导入受体植物中，其中不乏提高植物对一种甚至多种病原 菌抗性的成功例子( l o r i t oe ta 1 ，1 9 9 8 ；c a r s t e n se ta 1 ，2 0 0 3 ；e m a n ie ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 有研究表明，微生物来源的几丁质酶基因在对植物病害的抗病性上优于植物 来源的几丁质酶基因( l o r i t oe ta l ，1 9 9 8 ；t e r a k a w ae t 耐，1 9 9 7 ) ，虽然这一观点并 未成定论，但在抗病基因的选择上有一定的参考价值。丝状真菌球孢白僵菌是目 前昆虫病害防治的重要生防菌，本实验室从球孢白僵菌中克隆出几丁酶基因 b b c h i t l 并转入球孢白僵菌野生型菌株中，得到了对桃蚜( m y z u s p e r s i c a e ) 毒力显著 提高的重组菌株( f a n ge ta 1 ，2 0 0 5 ) 。几丁质酶在昆虫病原真菌( b e a u v e r i ab a s s i a n a ) 穿透寄主体壁的过程中起到重要作用，而利用来自昆虫病原真菌的几丁质酶来提 高植物的抗病性目前尚无报道。因此，为了分析b b c h t 在植物抗病基因工程中的 应用，弄清勖如f f ，的抗菌特征十分必要，本研究利用实验室已构建的球孢白僵菌 几丁质酶基因肋曲打，毕赤酵母表达载体，表达出有几丁质酶活性的b b c h i t i 蛋白， 并研究了该蛋白对部分植物病原菌孢子萌发和菌丝生长的影响；同时构建了 西南大学硕十学位论文 b b c h i t l 基因的植物表达载体，并将其转入受体植物烟草中，分析了转基因烟草对 烟草赤星病、烟草青枯病菌的抗性。该研究为肋砌以基因的进一步应用奠定基础， 并为植物抗病基因工程提供新的候选基因。 1 2 2 2 研究的技术路线 寻 第三章材料与方法 第三章：材料与方法 3 1 材料 3 1 1 植物病原菌菌株 烟草赤星病菌( a l t e r n a r i aa l t e r n a