（海洋生物学专业论文）大猿叶甲不同地理种群滞育及其遗传多样性的比较研究.pdf

大猿叶甲不同地理种群滞育与其遗传多样性的比较研究 摘要 大猿叶甲为重要的十字花科蔬菜害虫，从成虫在土中滞育。本研究以江西龙 南、江西修水、山东泰、哈尔滨4 个地理种群的大猿叶甲为对象，探索了不同群 体的滞育变异，并采用几种分子标记技术对其群体遗传多样性和遗传结构进行了 研究，同时比较了与其滞育变异之间的相关性。 光周期和温度对大猿叶甲不同地理种群滞育诱导的影响 在不同的恒温( 1 8 - 3 0 c ) 条件下，测试经历了越冬滞育的大猿叶甲四个地 理种群 江西龙南种群( j x l ) 、江西修水种群( j x x ) 、山东泰安种群( s d t ) 、黑 龙江哈尔滨种群( h e b ) 后代在光照8 1 6h 下滞育诱导的光周期反应。结果表 明，随纬度的增高，光照时间缩短，温度降低，大猿叶甲从南到北呈现明显的地 理变异。龙南种群对光周期和温度的反应与山东和哈尔滨种群不同，与修水种群 相似。 温度在大猿叶甲的滞育诱导中起决定性作用：无论光周期如何，当温度s 1 8 时，龙南种群成虫均进入滞育；修水种群在温度q o 时，成虫均进入滞育；山 东泰安种群在温度 2 0 0 c 时，不同短光照条件 下诱导的滞育率随温度的升高而明显降低；当温度 2 2 0 c 时，不同长光照诱导 的滞育率随温度的升高而明显降低；山东泰安种群在2 8 c 时，滞育率在6 9 2 3 9 0 9 1 之间；在3 0 c 时，反应曲线呈不规则波浪状，没有呈现典型的光周期反 应。哈尔滨种群没有光周期反应，滞育的诱导完全取决于温度。不同的滞育特性， 导致大猿叶甲的生活史不同。 遗传多样性研究 采用了线粒体d n a c o i 基因序列、r a p d 和p c r r f l p 三种分子标记研究 大猿叶甲4 个地理种群的遗传结构和群体遗传多样性。 1 、对长约3 3 5 b p 的m t d n a c o i 片段进行序列分析，在4 个群体6 4 个个体 中，共发现3 7 个单倍型，总变异位点3 5 个，多态位点2 9 个，( a + t ) 含量( 6 3 6 8 ) 大于( g + c ) 含量( 3 6 3 2 ) 。4 个地理种群的核苷酸多样性指数分别为， o 0 8 2 ( j x l ) 、0 0 3 5 ( j x x ) 、0 0 9 9 ( s d t ) 、0 18 6 ( h e b ) 。f s t 分析和中性检验结果显 著，显示大猿叶甲群体存在显著的种群遗传结构，m t d n ac o i 基因不是按照中 性理论进化。遗传距离分析表明，哈尔滨种群与江西龙南种群的遗传距离最远， 其次是与江西修水种群；山东泰安种群与江西龙南种群的遗传距离最近，江西修 水与江西龙南种群的遗传距离大于其与山东泰安种群间的距离。群体遗传距离与 其相对地理距离的远近不吻合。 2 、从8 0 个引物组合中筛选出的1 1 个引物对大猿叶甲4 个地理种群进行r a p d 分析，共得到6 5 个扩增位点，多态位点5 3 个。多态位点、遗传相似性指数和遗 传距离分析表明：4 个种群的多态位点的百分率为3 6 9 2 6 7 6 9 ，n e i 遗传多 样性指数为o 1 0 4 9 - - 0 2 0 6 1 1 ，s h a n n o n 多样性指数为0 1 6 4 1 0 3 1 6 7 ，江西龙南群 体内的遗传变异最低，山东泰安群体内遗传变异最高。遗传距离分析表明，江西 龙南种群和江西修水种群间的遗传距离最小，山东泰安种群与哈尔滨种群间的遗 传距离次小，哈尔滨种群与江西龙南种群问的遗传距离最大。群体遗传距离与其 相对地理距离吻合，与群体的滞育变异及生物学特征相符。 3 、利用7 种限制性内切酶对大猿叶甲c o i 基因进行p c r r f l p 分析，结果 表明，利用a s e i 、m b o i 、n l a l i i 、r s a l ，在大猿叶甲4 个地理群体中均没检 测到多态性；利用么，以和d r a l 只检测到群体间的多态性；利用h a e l i i 既检测到 了群体间的多态性，又在山东群体中检测到群体内多态性。根据酶切图谱，共发 现4 种酶切类型，酶切型的特异性可以作为种群鉴别的标志。根据限制性片段共 享度，利用p o p g e n 3 2 计算4 个群体的遗似距离，并利用m e g a 3 1 进行聚类 分析，结果表明其遗传变异与其滞育变异的特征不相符。 关键词：大猿叶甲、滞育诱导、遗传多样性、线粒体d n a 、c 0 l 基因、p c r - r f l p 、 r a p d t h e s t u d i n g o nr e l a t i v i t yo fd i a p a u s ea n dp o p u l a t i o ng e n e t i c d i v e r s i t yo fc o l a p h e l l u sb o w r i n g ib a l y a b s t r a c t ml e a fb e e t l e ，c o l a p h e l l u s b o w r i n g i b a l yi sas e r i o u sp e s to fc r u c i f e r s ， a e s t i v a t i n ga n dh i b e r n a t i n ga sa d u l t si nt h es o i l f o u rp o p u l a t i o n so fcb o w r i n g if r o m l o n g n a r t , x i u s h u io fj i a n g x ip r o v e n c e ，t a i a no fs h a n d o n gp r o v e n c e ，h a e r b i no f h e i l o n g j i a n gp r o v e n c e ，w e r es t u d i e dt oe x p l o r et h ed i a p a u s ed i v e r s i 够b yd i f f e r e n t t e m p r a t u r ea n dp h o t o p e r i o d ，a n de s t i m a t et h eg e n e t i cs t r u c t u r ea n dg e n e t i cd i v e r s i t y b yd i f f e r e n td n a m a r k e rt e c h n o l o g i e s ，a n dc o m p a i r e dt h e mw i t l ld i a p a u s ed i v e r s i t y t e m p e r a t u r ea n dp h o t o p e r i o d i ca d j u s t m e n to fd i a p a u s ei np o p u l a t i o n so fc b o w r i n g i a td i f f e r e n t ec o n s t a n tt e m p e r a t u r e ( 18 3 0 c ) ，t h ep h o t o p e r i o d i cr e s p o n s eo f d i a p a u s ei n d u c t i o no ft h ef o u rp o p u l a t i o n so fcb o w r i n g i f r o ml o n g n a no fj i a n g x i p r o v e n c e ( j x l ) ，x i u s h u io fj i a n g x ip r o v e n c e ( j x x ) ，t a i a no fs h a n d o n gp r o v e n c e ( s d t ) ，h a e r b i no fh e i l o n g j i a n gp r o v e n c e ( h e b ) ，u n d e r g o i n gw i n t e rd i a p a u s ew e r e t e s t e d 、析md a y l i g h to f8 - 16h n l er e s u l ts u g g e s tt h a tg e o g r a p h i c a ld i v e r s i t yw a s o c c u r r e d 、析t ht h ei n c r e a s i n go fl a t i t u d ea n dd e p r e s s i n go f t e m p e r a t u r e t h er e s p o n s e o np h o t o p r e i o da n dt e m p e r a t u r ei sd i f f e r e n t eb e t w e e nt h ej x la n ds d to rh e b ，b u ti t i ss i m i l a rt ot h a to fj x x t e m p e r a t u r ep l a yac r u c i a lr o l ei nd i a p a u s ei n d u c t i o nf o rc b o w r i n g i w h a t e v e r p h o t o p e f i o d ，10 0 d i a p a u s eo c c u r r e da t s 18 i nj x l ，a t 受0 i n 臌，a t5 2 5 i ns d t , a t 旦8 i n h e b t h ee f f e c to fp h o t o p e r i o do nd i a p a u s ei n d u c t i o ni sa d j u s t e db yt e m p e r a t u r e j x l o fc b o w r i n g ii s t y p i c a ls h o r t d a y l i g h ti n s e c t s t h ee f f e c to fd i a p a u s ec o n t r o lo f s h o r t - d a y l e n g t h se n h a n c e 谢t l lt h ei n c r e a s i n gt e m p e r a t u r ea t 18 。c ；t h ep o p u l a t i o no f x i u s h u ia r ea s os h o r t d a y l i g h ti n s e c t s t h ed i a p a u s er a t ei n d u c e du n d e rd i f f e r e n t e s h o r t - l i g h td e c r e a s e sw i t hi n c r e a s i n gt e m p e r a t u r ea t 2 0 。c ，a n dd e c r e a s e su n d e r d i f f e r e n tl o n g d a y l e n g t h sw i t hi n c r e a s i n gt e m p e r a t u r ed i s t i n c t l ya t 2 2 0 c ；f o rs d t , t h ed i a p a u s er a t ei s6 9 2 3 - - 。9 0 9 1 a t2 8 c b u ti t sp h o t o p e r i o d i cr e s p o n s e sc u r v ei s a n o m a l o u sw a v i l n e s sa t3 0 c ，s h o w i n gt h e p h o t o p e r i o d i cr e s p o n s e sd i d n to c c u r e d h e bd o n t r e s p o n c e o np h o t o p e r i o d ，t h ed i a p a u s ei n d u c t i o nw a sd e c i d e db y t e m p e r a t u r ec o m p l e t e l y m o r e ，t h ee x a m i n a t i o ns h o w e d t h ed i f f e r e n td i a p a u s e c h a r a c t e r sr e s u l t si nt h ed i f f e r e n tl i f e - c y c l e si nt h ef o u rp o p u l a t i o no fc b o w r i n g i g e n e t i cd i v e r s i t ya n a l y s eo ff o u rp o p u l a t i o n so fc b o w r i n g ib ym t d n ac o i s e q u e n c e ，r a p da n dp c r r f l p 1 at o t a lo f3 0m u t a t i o nl o c i ，2 5p o l y m o r p h i cl o c i ，3 7h a p l o t y p e s ，w e r e d e t e c t e da m o n gf o u rp o p u l a t i o n s ，6 4i n d i v i d u a l sb ya n a l y z i n gt h es e q u e n c e sd a t a f r o mm t d n ac o ig e n ea b o u t335 b p t h ec o n t e n to fa + t ( 6 3 6 8 ) i so b v i o u s l y h i g h e rt h a nt h a to fg + c ( 3 6 3 2 ) t h en u c l e o t i d ed i v e r s i t yi n d e xw e r e0 0 0 5 6 ( j x l ) 、0 0 0 2 3 ( j x x ) 、0 0 0 9 3 ( s d t ) 、0 0151 ( h e b ) ，r e s p e c t i v e l y t h er e s u l to f p a i r w i s ef s ta n dn e u t r a l i t yt e s t sr e v e a l e ds i g n i f i c a n tg e n e t i cd i f f e r e n t i a t i o na m o n g f o u rp o p u l a t i o n s ，a n de v o l u t i o no fm t d n ac o ig e n ei n c o m p l i a n c ew i t ht h en e u t r a l i t y t h e o r y 。t h eg e n e t i cd i s t a n c ew a st h eb i g g e s tb e t w e e nh e ba n dj x l ，a n dw a st h e s m a l l e s tb e t w e e ns d ta n dj x la m o n gt h e4p o p u l a t i o n s w h i l et h eg e n e t i cd i s t a n c e b e t w e e nj x la n dj x xi s b i g g e rt h a nt h a tb e t w e e ns d t a n dj x x t h eg e n e t i c d i s t a n c eo fp o p u l a i o n sd i s m a t c h 、航t l lt h e i rg e o g r a p h i cd i s t a n c e 2 f o u rg e o g r a p h i c a lp o p u a t i o so fcb o w r i n g iw e r ea m p l i f i e du s i n g11p r i m e r s s e l e c t e df r o m8 0r a n d o mp r i m e r s t h e r ew e r e5 3p o l y m o r p h i cl o c ib a s e do n6 5 a m p l i f i c a t i o nl o c io b t a i n e db yr a p da n a l y s i s p o l y m o r p h i s m s ，g e n e t i cs i m i l a r i t y i n d i c e sa n dg e n e t i cd i a t a n c ew e r ec a l c u l a t e d t h er e s u l t ss u g g e s t i n g ：t h ep e r c e n to f p o l y m o r p h i s m sw a sr a n g i n g3 6 9 2 - - 6 7 6 9 n e ig e n e t i cd i v e r s i t yw a sr a n g i n gf r o m o 1 0 4 9 - - 0 2 0 6 1 1 a n ds h a n n o nd i v e r s i t yw a sr a n g i n gf r o m0 1 6 4 1 0 3 1 6 7 t t h e g e n e t i cv a r i a t i o nw i t h i ns d t w a st h eh i g h e s t ，w h i l et h a tw i t h i nj x li st h el o w e s t t h e g e n e t i cd i s t a n c eb e t w e e nj x l a n dj x xw a st h es m a l l e s t ，t h a tb e t w e e nj x la n dh e b w a st h eb i g g e s t w h i l et h eg e n e t i cd i s t a n c eb e t w e e nh e ba n ds d tw a ss m a l l e rt h a n t h a tb e t w e e nh e ba n dj x x t h eg e n e t i cd i s t a n c e so fcb o w r i n g ip o p u l a t i o n sm a t c h t h e i r g e o g r a p h i cd i s t a n c e sb e t w e e nt h es o u r c e so fe a c hp o p u l a t i o n ，a n dw e r e c o r r e l a t e dw i 廿lt h e i rb i o l o g i cc o m p a r a b i l i t y 3 s e v e ne n d o n u c l e a s e sw e r eu s e dt oa n a l y z et h ea m p l i f i e dp r o d u c t so fc o i g e n e t h er e s u l t s h o w e dt h a ta s e l , m b o i , n l a l i i , r s a id i d n tp r o d u c er e s t r i c t i o n f r a g m e n t 1 e n g t hp o l y m o r p h i s ma m o n gcb o w r i n g ip o p u l a t i o n s t h ep o l y m o r p h i s m w a sd e t e c t e da m o n gt h e4p o p u l a t i o n sw i t ht h ee n z y m e sa l u la n dd r a i w h e r e a s ， t h er e s t r i c t i o nf r a g m e n t 1 e n g t hp o l y m o r p h i s mw a sf o u n de i h t e ra m o n g4p o p u l a t i o n s o rw i t h i ns d t 、 ，i t hh a e l l l f o u rr e s t r i c t i o nt y p e sw e r ef o u n di na l li n d i v i d u a l s o b v i o u s l y , t h ep o p u l a t i o n sc o u l d b ed i s t i n g u i s h e dw i t hu n i q u er e s t r i c t i o nt y p e a c c o r d i n gt ot h ep o r p o r t i o no fr e s t r i c t i o nf r a g m e n t ss h a r e d ，t h eg e n e t i cd i s t a n c e s a m o n gt h e4p o p u l a t i o n sw e r ec a l c u l a t e dw i t hp o p g e n e 3 2 ，a n da c l a d o g r a mw a s p r o d u c e dw i t hm e g a 3 1 t h e r e s u l ts h o w e dt h a tt h eg e n e t i cv a r i a n c ed i s m a t c hw i t h t h e i rd i a p a u s ev a r i a n c e k e yw o r d ： c o l a p h e l l u sb o w r i n g ib a l y ；d i a p a u s ei n d u c t i o n ；g e n e t i c d i v e r s i t y ；m t d n a ；c o ig e n e ；p c r - r f l p ；r a p d 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 洼! 麴遗查墓丝霞要挂别直明鲍：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位敝储签名撇签字隰撕净。猬厂日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库迸行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 一虢意k 据， 新擗纷慨 签字日期：滩猬f 日签字日期：脚年，调出目 大猿叶甲不同地理种群滞育及其遗传多样性的比较研究 1 昆虫滞育的简述 第一章文献综述 昆虫属变温动物，其生命活动受环境条件的制约，极端的环境条件( 低温、高温、 干旱、食物缺乏等) 会影响其正常生活，也威胁昆虫种群和个体生命的维持。为渡过 不良环境条件，许多昆虫具有滞育的特性。所谓滞育是指昆虫为了逃避不利条件而 中止生长发育、繁殖的一种生理适应，也是昆虫生活周期与季节变化保持一致的一 种基本手段，常在不利来临之前就接受了各种环境的刺激，发生在由遗传决定的特 定发育阶段，具有遗传特性，同时也受其环境影响：滞育一旦发生，通常会持续一 段时间，并不因为不利条件的解除而立即结束。其意义在于使昆虫渡过不良环境， 维持种群和个体生存；保持群体发育齐一，保证种的繁衍( d a n k se ta l ，1 9 8 7 ；t a u b e r e ta l ，1 9 8 6 ；m o u s s e a ue ta l ，1 9 9 8 ； y a m a s h i t a ，1 9 8 5 ) 。 引起昆虫滞育的重要生态因素有光照、温度、湿度、密度、食料等，而内在因 素则是激素。昆虫对光周期的反应十分敏感，日照长度的轻微变化即可触发它们的 季节反应，导致反应个体从滞育的发育方向转向非滞育的发育方向。如苹果蠹蛾 c a r p o c a p s a p o m o n e l l s ，1 4 5 h 的光照可使其正常发育，而1 3 5 h 的光照则诱导其滞育。 ( p e t e r s o na n dh a m m n e r ，19 6 8 ) 根据滞育与光周期的关系，可将昆虫分为以下4 种滞育类型，即长日照型( 即 短日照滞育型) 、短日照型( 即长日照滞育型) 、中间型、无光周期反应型。在长 日照下发育而在短日照下进入滞育的昆虫种类通常称为长日照型，反之称为短日照 型。大多数的昆虫种类分属于这两种类型：有些昆虫的种群则同时存在长日照和短 日照的关系，如黑纹粉蝶( p i e r i sm e l e t e ) 蛹滞育，夏滞育和冬滞育分别被较长日照 ( l d l 3 ：1 1 左右) 和短日照( l d l l ：1 3 ) 诱导，而非滞育仅出现在一段较短的中 性光周期( l d l 2 ：1 2 ) ( x u ee ta l ，1 9 9 8 ) ；中间型是光周期过短或过长均可引起滞 育，只有在相当窄的光周期范围内才不滞育。如桃小食心虫在2 5 c 时，光照短于1 3 h ， 大猿叶甲不同地理种群滞育与其遗传多样性的比较研究 老熟幼虫全部滞育；光照长于1 7 h ，半数以上滞育；而光照为1 5 h 时，则大部分不 滞育；无光周期反应型，即光周期变化对滞育没有影响，如苹果舞毒蛾l y m a n t r i a d i s p a r 、丁香天蛾p s i l o g r a m m ai n c r e t a 等。 一种昆虫的光周期反应主要由两种“临界值”决定，一种是导致5 0 个体进 入滞育或发育所需光处理的天数( r e q u i r e dd a yn u m b e r ) ；y 3 一种是“临界光周期 ( c r i t i c a ld a yl e n g t h ) ，即导致昆虫个体5 0 进入滞育或发育的光周期界限。昆虫滞 育的发生与它们的化性有关。有些一化性昆虫发育到一定的阶段即进入滞育，称为 专性滞育( o b l i g a t o r yd i a p a u s e ) 。多化性昆虫发生滞育的世代和个体百分率等可以不 同，这种情况称为兼性滞育( f a c u i t a t i v ed i a p a u s e ) 。 温度是影响昆虫滞育的另一重要因素。如家蝇( c h o r t o p h i l ab r a s s i c a e ) 幼虫在 低于1 5 的环境中发育时，蛹进入滞育。对于一些幼虫阶段发育跨度比较大的昆虫 类群，温度则决定昆虫进入滞育时的发育阶段。如日本弧丽金龟( p o p i l l i a j a p o n i a ) 在 2 5 c 饲养时，滞育发生在3 龄幼虫；饲养于2 0 c 的环境时，滞育发生在二龄或三龄幼 虫；而在1 5 的环境条件下，滞育发生在一龄幼虫( t a u b e re ta 1 1 9 8 6 ) 。温度常与 光周期相互作用起着诱导昆虫滞育的作用。在大多数的昆虫种类中，光周期与温度之 间的关系表现为随着温度的改变，昆虫的临界光周期发生变化，如烟青虫在2 4 c 时的 临界光周期为7 9 1 m i n ，而2 6 。c 时为7 2 4 m i n ( 谢立群等， 1 9 9 7 ) 。一般来讲，在冬季 进入滞育的昆虫中，日照逐渐缩短，温度逐渐降低是诱导其滞育的主要因素，而在夏 季滞育的昆虫则相反。 食物与虫口密度对昆虫的滞育也有一定的影响，特别是当温度和光周期都变化 不明显时，它们对滞育的发生也会起主要的作用。 2 遗传多样性的研究方法 在经典遗传学中，遗传变异是指等位基因的变异，是生物个体或群体间遗传差 异的客观表征；在现代遗传学中，由变异引起的遗传多样性是指基因组中任何座位 上的相对差异，它是研究遗传学、育种学、生物分类学、物种起源与进化的重要技 术手段。遗传多样性研究通常从形态、细胞、分子三个水平上进行。随着生物技术 2 大猿叶甲不同地理种群滞育及其遗传多样性的比较研究 不断发展进步，遗传多样性研究方法也经历了从表及里，由现象到本质的过程。遗 传多样性研究主要依靠遗传标记( g e n e t i cm a r k e r s ) ，而遗传标记是生物分类学、育种 学、遗传学和物种起源与进化的主要技术指标之一。有效的遗传标记是探测生物遗 传变异、研究生物遗传多样性的关键。遗传标记是生物体特有的性状或物质，指与 目标性状紧密连锁，同该性状共分离且易于识别的可遗传的等位基因的变异，可以 明确反映生物的个体或群体的特征，是生物个体或群体间遗传差异的客观表征( 贾 继增，1 9 9 6 ) 理想的遗传标记应具有以下几条标准：( 1 ) 具有高度多态性；( 2 ) 共显性遗传；( 3 ) 能明确鉴别等位基因；( 4 ) 除特殊分子标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组； ( 5 ) 选择中性；( 6 ) 检测手段简单、快速：( 7 ) 开发和使用成本低廉；( 8 ) 实验室内和实 验室间重复性好，便于数据交流( p a r ke ta 1 ，1 9 9 5 ) 。遗传标记经历了四个发展阶段： 形态学水平；细胞学和染色体水平；蛋白质和同工酶标记水平； d n a 分子 水平。前三种水平都是基因表达型的标记，可利用的多态位点较少，易受环境影响， ) 不能满足遗传分析的需要。分子遗传标记从广义上讲是指可遗传的并可检测的d n a 序列或蛋白质；狭义的分子标记概念只是指d n a 标记，而这个界定现在被广泛采 纳。d n a 标记是基因的直接反应，没有上位性效应，不受环境和其它因素的影响； 多态性几乎遍布整个基因组；能对各发育时期的生物个体、组织、器官甚至细胞进 行检测，不受基因表达与否的影响，具有数量丰富、多态性强及操作简便等特点。 这些分辨率好，信息量大的分子遗传标记目前己广泛应用于生物基因组研究、生物 的遗传育种、进化起源、分类等诸多方面，成为遗传多样性研究与应用的主流。 2 1 形态学标记 从形态学或表型性状上来检测遗传变异是最古老也是最简便易行的方法，动植 物分类学上属、种的划分，亚种、变种和地理群的界定多数建立在形态学水平上。 通常所利用的表型性状主要有两类，一是符合孟德尔遗传规律的单基因性状( 如质 量性状、稀有突变等) ，另一类是由多基因决定的数量性状( 如大多数形态性状、生 活史性状) 。形态性状是分类学的主要研究手段，但是形态标记方法有着数量少、多 态性差、遗传表达不稳定、易受环境因素和基因显隐性的影响等缺点，所以得到的 信息和结论通常不够准确，很难在全球范围内获得广泛分布遗传多样性，所以它的 大猿叶甲不同地理种群滞育与其遗传多样性的比较研究 应用受到了限制。尽管表型和基因型之间存在着基因表达、调控、个体发育等复杂 的中间环节，确定某一表型性状与基因型的联系尚有难度，但是，多数学者认为， 利用性状来研究遗传变异，特别是需要在短时间内对遗传变异有所了解是，形态学 方法仍不失为一种既简单易行又经济快速的方法( s c h a a le ta 1 ，1 9 9 1 ) 。 2 2 细胞学标记 细胞学标记( c y t o l o g i c a lm a r k e r s ) 是指能明确显示遗传多态性的细胞学特征。 染色体的结构特征和数量特征是常见的细胞学标记，它们分别反映了染色体结构上 和数量上的遗传多态性。染色体结构的变异包括染色体的倒位、易位、缺失和重复 等；染色体数目的变异包括整倍染色体和非整倍染色体的变异。许多新种的产生是 染色体结构和数目变异的结果。因而，染色体水平的变异对物种的应用及其进化具 有重要的意义。染色体的检测方法除了常规的核型、带型分析外，9 0 年代发展起来 的荧光原位杂交技术，使得染色体变异的研究有了重大的突破。细胞学标记克服了 形态学标记易受环境条件影响的缺点，但这种标记材料的产生需要花费大量的人力 物力进行培养选择。有些物种对染色体结构和数目的变异的耐受性较差，难以获得 相应的标记材料。某些物种虽然已有细胞学标记材料，但这些标记常常伴有对生物 有害的表型效应，有时观察和鉴定比较困难，从而限制了细胞学标记的应用。 2 3 生化标记 生化标记( b i o c h e m i c a lm a r k e r s ) 是指蛋白质和同工酶的标记。同工酶电泳技术 是遗传多样性研究的主要手段之一，凝胶电泳技术结合酶的特异性染色用于遗传变 异的研究可以说是遗传多样性研究乃至进化研究史上重要转折点。3 0 多年来，利用 同工酶技术已对大量生物群体的遗传变异进行了广泛研究，同工酶技术目前仍是遗 传多样性研究的主要方法之一。 1 9 4 1 年b e a d l e 和t a t u m 研究链抱酶的生化突变型后，提出“一基因一酶”学说， 把基因与蛋白质的功能结合起来，创立了生化遗传学( b e a d l ee t a l ，1 9 4 1 ) 。1 9 5 5 年 s m i t h i e s 用淀粉凝胶电泳分离人的血清蛋白，发现不同人群的蛋白电泳图谱不同 ( s m i t h i e s ，1 9 5 5 ) ：1 9 5 9 年m a r k e r t 和m o i l e r 报道了乳酸脱氢酶在不同组织、不同 个体以及不同种里的不同存在形式( m a r k e r te ta 1 ，1 9 5 9 ) ，由此导致了“同工酶 4 大猿叶甲不同地理种群滞育及其遗传多样性的比较研究 ( i s o z y m e ) ”概念的产生。同工酶是催化同一化学反应、功能相同但其酶蛋白本身 的一级结构有所不同、生理和理化性质相异( 如免疫学性质和电泳行为等不同) 、具 有种属、发育和组织特异性的一组酶类。其结构的差异来源于基因类型的差异，因 此并不一定是同一基因的产物。到今天为止用于分析的同工酶己有1 0 0 多种，而常 用的只有几十种：如醇脱氢酶( a d h ) ，乳酸脱氢酶( l d h ) 、苹果酸脱氢酶( m d h ) 、 异柠檬酸脱氢酶( i d h p ) 、甘油3 磷酸脱氢酶( g 3 p d h ) 、甘露糖磷酸异构酶( m p i ) 、 过氧化氢酶( c a t ) 、超氧化物岐化酶( s o d ) 、己糖激酶( h k ) 、酸性磷酸酶( a c p ) 、 醛缩酶( a l d ) 、酯酶( e s t ) 、肽酶( p e p ) 和洳淀粉酶( a m y ) 等。不同的同工 酶在不同的缓冲系统中组化染液的配方是不同的( h a r r i s 。1 9 7 6 ：p a s t e u r , 1 9 8 9 ) 。每 一个酶的不同电泳酶谱表现型可能是由于不同的基因座位引起的，也可能是同一基 因座位上的不同的等位基因引起的，后一类同工酶称为等位酶( a l l o z y m e ) 。它们可 以表现特定的差异，从而鉴别不同的基因型，间接地研究基因的变异。 电泳技术是指带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的方向移动，称为 电泳( e l e c t r o p h o r e s i s ) 。电泳的现象早在1 8 0 8 年就被发现，但是作为一项生物化学 研究的方法，直到1 9 3 7 年t i e e l i u e 在电泳仪器方面取得重大成就后，才得到较大的进 展。1 9 5 5 年s m i t h i e s 开始使用淀粉凝胶来电泳蛋白质，1 9 5 7 年h u n t e r 和m a r k e r t 采用组 织化学的染色方法使得特定酶的位置在凝胶上能够被发现，从而发现了在同一个体 内各种酶的多种分子形式。1 9 6 6 年，h u b b y 和l e w o n t i n 报道了利用凝胶电泳技术结 合酶的特异性染色对果蝇的遗传变异的定量研究，发现自然群体存在出乎意料的高 度同工酶多样性。蛋白质电泳的原理是利用淀粉凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳及特异 性染色反应，通过检测d n a 表达产物电泳谱带的不同来显示蛋白质( 同工酶) 在遗 传学上的多态性。从上世纪六十年代开始，同工酶电泳的应用掀起了群体遗传学的 一场革命，因为基因流、等位基因频率等对于群体生物学至关重要的参数均可由若 干个同工酶座位信息的组合得到。同工酶电泳技术广泛应用于鱼类群体遗传学研究 ( r y m a na n du t t e r , 1 9 8 7 ；h i l l i se ta 1 ，1 9 9 6 ) ，但同工酶电泳技术也有其自身的不足， 首先同工酶反映的是基因表达的产物而非基因本身，因此其状态常受环境和发育时 期的影响；其次，同工酶所能分析的座位是有限的( 3 0 , - - 一5 0 个) ，大约可以鉴定1 0 0 个左右的基因座位( m u r p h ye ta 1 ，1 9 9 6 ) ，但是这样的数目还远不能满足构建较高密 度连锁图谱的需要( p a s d a r e t a l ，1 9 8 4 ；m a ya n dj o h n s o n ，1 9 9 3 ) 。它只能分析那些编 大猿叶甲不同地理种群滞育与其遗传多样性的比较研究 码可溶性同工酶的基因，而且还要求其产物易于提取并能通过凝胶电泳进行检测， 通常只能检测d n a 中1 1 3 的碱基替换；还有，它只能检测出可导致蛋白产物中氨基酸 组成发生变化的核苷酸突变，检测的范围只限于那些导致产物分子净电荷改变的氨 基酸组成的变异。再者，同工酶电泳对样品的要求比较高，必须保证样品新鲜。此 外，由于同工酶的稳定性很难保持，为保持酶的活力，其储存和运输都可能遇到一 定的困难。 2 4d n a 分子标记 2 4 1 基于d n a - d i n a 杂交的分子标记 2 4 1 - 1 限制性片段长度多态性 限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 为 g r o d z i c k e r 等1 9 7 4 年所创( g r o d z i c k e re t a l ，1 9 7 4 ) ，是最早的分子标记，1 9 8 0 年b o s t e i n 首先提出了利用r f l p 作为标记构建遗传图谱( b o t s t e i ne ta 1 ，1 9 8 0 ) 。r f l p 作为第 一代d n a 分子标记开创了直接应用d n a 多态性发展遗传标记的新阶段。r f l p 主要 是由于不同个体的等位基因之间碱基的替换，插入、缺失，重排等引起的，r f l p 基本原理是：不同材料的d n a 用己知的限制性内切酶消化后，产生许多大小不等的 d n a 片段，电泳分离、s o u t h e r n 印迹转移到硝酸纤维膜上( s o u t h e r n ，1 9 7 6 ) ，用放射 性标记的探针与膜上变性的酶切d n a 进行杂交，放射自显影，即可显示出不同材料 的多态性图谱( 图1 1 ) 。r f l p 的探针来源主要是基因组d n a ( g d n a ) 克隆和e d n a 克隆两种。e d n a 探针的保守性较强，故许多同科物种可以通用，是研究物种起源 演化的较好探针，但是这类探针检测多态性频率较低。r f l p 在渔业上的应用研究仅 次于同工酶，是在以d n a 为基础的分子生物技术学中研究最早，应用最广，文献资 料最多的技术。 它的主要优点有：( 1 ) r f l p 标记呈孟德尔式遗传，l 讧l p 座位上的等位基因之间 呈共显性。检测不受年龄和性别的限制，也不受表达组织，发育阶段或外界环境影 响，能区分群体中的纯合子与杂合子。( 2 ) r f l p 标记无表型效应，不存在对生物体 的有害或次级效应。( 3 ) 标记数目可以是无限的，可获得放映遗传物质种类特征的大 量多态性，可用于构建高密度的遗传图谱；( 4 ) r f l p 可以与基因连锁，可进行相关 基因的分子分析。 6 大猿叶甲不同地理种群滞育及其遗传多样性的比较研究 近年来常