（海洋化学专业论文）遗传算法提取荧光指纹特征的浮游植物分析方法研究.pdf

遗传算法提取荧光指纹特征的浮游植物分析方法研究 摘要 鉴于浮游植物在海洋生态环境中所起到的重要作用，其种类和数量的监测是海洋 科学研究中一项例行的基础性工作；随着赤潮的频繁发生，迫切需要研究种能够快 速进行浮游植物定性定量分析的技术。三维荧光技术灵敏度高，能给出全部的荧光指 纹信息。本文对2 6 种分属于5 个门类的活体浮游植物赤潮种或优势种( 包括甲藻8 种， 硅藻9 种，着色鞭毛藻5 种，绿藻2 种和蓝藻2 种) 在2 0 、不同光照( 1 5 0 0 0 l u x 、 1 0 0 0 0l u x 、7 0 0 0l i l x ) 、不同生长期的三维荧光光谱进行了研究，运用遗传算法提取特 征，建立了新的基于荧光指纹特征的海洋浮游植物快速分析方法。本文的主要研究成 果如下： ( 1 ) 提出活体浮游植物三维荧光光谱的逐层分类法。逐层分类基于分步骤分类的思想， 运用主成分分析提取浮游植物的三维荧光光谱特征，建立第特征谱库，第二特征谱库。 用非负最小二乘法( m 叮s ) 对单谱和混合样品谱进行逐层识别，结果表明此方法可以识 别浮游植物样品的门类和光谱类别。因近海及湖泊赤潮均以单一藻种为主，此方法可满 足现场应用的实际需要。此方法具有直观，利于目视定性分类；各个特征谱库光谱数量 少，拆分速度快；可根据实际要求选择分类层次等优点。 ： ( 2 ) 提出活体浮游植物三维荧光光谱的遗传算法组合特征分类法。应用遗传算法对活 体浮游植物三维荧光光谱分别从横向( 激发光谱) 、纵向( 发射光谱) 、斜向( 同步光 谱) 三个角度去提取组合特征。发现得到的激发光谱组合特征谱，不但能有效的区分 门类，还有效的增强了甲藻内部和硅藻内部藻种差异，可以作为浮游植物的荧光指纹 特征。根据活体浮游植物该荧光指纹特征的相似性，本文的2 6 种分属5 个门类的浮游 植物可分为1 8 个光谱类别，比前人分类更细化。采用非负最小二乘法，以该荧光指纹 特征对实验设计的2 2 8 个单种浮游植物样品和4 0 5 个混合样品光谱进行识别分析。单 种识别正确率非常理想，种、光谱类别和门层次上的识别正确率分别为9 8 5 ，9 9 6 和1 0 0 。比单独应用6 8 0i 】i i l 发射波长处的激发光谱作为特征谱识别正确率提高了约 1 0 个百分点。对于混合光谱的识别，光谱类别和门类层次上的识别正确率分别为8 6 4 和9 r 7 8 。比单独应用6 8 0 姗发射波长处的激发光谱作为光谱特征识别正确率分别提 高了约3 0 个百分点和1 0 个百分点。证明了该荧光指纹特征蕴涵分类有效的信息，能 够在有效的将浮游植物的活体荧光光谱分类细化的同时，提高识别正确率。另外，也 验证了遗传算法在提取浮游植物三维荧光光谱特征上的有效性。 ( 3 ) 在定量分析方面，建立了以叶绿素为标准的浮游植物活体定量分析方法。为了估 算浮游植物丰度，研究了活体浮游植物荧光光谱强度与叶绿素浓度的关系，结果表明 两者呈现线性相关关系( r = o 9 1 4 6m 9 9 3 5 ) ；利用线性关系方程和浮游植物活体荧光 光谱即可获得已分类浮游植物样品的叶绿素含量。对所有定性正确的混合样品进行验 证计算，其“活体法”计算值与“萃取法”测量值的相对误差落在旬6 旬2 之间的占 9 0 。不同的浮游植物检测限不同，为o 0 8 声呵卜4 3 8 酽。 综上所述，本论文首次运用遗传算法提取浮游植物三维荧光光谱的多组信息作为 指纹特征，细化浮游植物光谱分类，在浮游植物指纹特征分类基础上，建立了浮游植 物快速荧光分析方法，具有应用价值。 关键词：浮游植物；三维荧光光谱；荧光指纹特征；遗传算法；非负最小二乘 n u o r e s c e n ta m a l y t i c a lm e t h o do fp h y t o p l a n k t o n b yg 毛n e t i c 舢g o t l u 璐 a b s t i a c t 觚0 fm ei i n p o n a i ：傥0 f 蜘灿i n 也e 砌曲e 咖吼m 0 幽衄 p h y c o p l 龇c i a s s e s 卸n dm e i ra b 衄d a n c e si sa 触t a 呔i n m a r i n es c i e n cr e s 伽曲 w 曲山e 丘e q u e n t 咖c e0 f 硎省d e ，吐1 e r ei s 龃蝣e n tn e e df o rm p i da i l a l 灿m e m o d s t 1 1 a tc 觚p 删d eq u a h t a d v e 锄dq u a n t i 洳v ej 1 1 f o r m a d o n0 fp h 删a 玎k 咖j l l 口a 加r ea q 咖c s y s t e i 】【1 s t k e e 也n e n s i o r 谢m l o r 鼯o e n c e 印e c 姐c 锄p 州d ea um en l l o r e s o e n c e 石i 脚血t w i t hh i g hs e i l s 呐k 吐l i sp a p e r ，t 1 1 r e e d i m e n s i i a ln l 埘瞅泊e n o es p - e c 妇o f2 6s p e c 斌切 访阳p h y t 叩l a i 越o nw e r es t u d i e dt h e s ep h y t o p h 呔c o na r eb e l o n g i l l gt o 丘v em v i s i o n s ， i 1 1 c l u d i l l ge i g h td l i l l o p h y t as p e c i e s ，i l i n eb a c i u a r i o p h y t as p e c i e s ，丘v e ( o p h y t as p e c i 鸽 t w i oa 如婶h y t as p e c i e sa i l dt 、怕q 啪p h y t as p e c i e s 锄dt i l e ya r ec l l l t i v a t e di i li a bu n d e ra t e i i 】p e r a t u r el e 、，e lo f2 0 卸d t i 】i 优m l 埘i n a l i o ni n i c i 璐i t i e s ( 1 5 0 0 0l u ) 【，1 0 0 0 0h 1 】【，7 0 0 0l u x ) n m l l 曲e x 扛加g an l l m b e ro f 丘1 1 9 e i i 埔n t 蝴e 凼d 岱埘t l lg e n 面c 砧g 舐t 1 1 1 1 1 s ( g a ) ，m e d a s s i 丘c a t i o no f p h y t 叩l a l l l 渤i sr e 丘n e d 觚dan e 、) l ，m e 吐媳砌c hi sb a s e do n 触0 r e s 。e i l c e 缅蓼删n td l 锄d e r i s t i c s ，f o rm p i dd 躐湎c 撕o n 锄di d e n f i f i c a t i 0 1 10 fp h y k ) p l a n k 衄li s e s t a b i i s b e d t h em a i i i lr e s e a i e hr e 双】i t sa r ea sf 0 u o w s ： 1 1 m ei 且y e r b y 一1 a y e rc 1 恋s i 丘c a t o nm e t h o do ft h r e e d j m e n s i o n a lf h l o r e 叼e n c es p l 蜘o f 胁 咖p h 弘叩l 幽i s p r e s e m e d l a y * b y l a y e r d a s s i f i 例o nm 地o d i s b a s e d o n t l l e 渤0 f d a s s 吗曲g 螂y - s t e p a l a r a c 喇c s 0 f 1 r e e 面m e r l s i 伽mn u o r 髓o e i l c es p 啪a r ee x t r a 砒e d 谢t l l 唧e 蛳e 鹏a n a l y s i s ，a n d m e 觚l a y e r s p e ：咖血删搬谢c s 哪p h m e s 姗dl a y 盯s p e 咖c b a r a c t e ：姚l i t 髓巧a r ee s 蛐h e d s i n 百es p e c i e s 锄dm i ) 【e d 删e s a r e i d 础e d 州t 1 1 n o n 一嘲e l e a s t 嘲1 l a r e s r 咖m e m o d ( m 吣) u s 吨嘧 h y e r b y l a y e rd a s s i f i c a t i o nm e t h o d 飚1 1 1 l ss h o w t 1 1 a tt 王l i sm e t i l o dc 锄i d e n t 姆 p h y t o p l 棚s a i l l p l e s i i l m e l e v e l o f d 酶i o i l s 锄d s p e 州c a t e g o d e s s i l l c e o o a s t a l 悯 a n d l a k e su s u a u y i l a v e d 0 i i 血a t i i 毽s p e c i 瞩t h i s m e m i d d c a n b e a p f d i e d t o m e e t t i l e 删n e e d s 隘m 础0 d h 弱m a l l y a d n t a g c s ，s u c h 蕊s i l n p l e ，晰l h s i n a l l s p e c i r a l 曲面e s ，b e ：m g a b l e t o i d 呻f 奴a i l dd 妇t l l ed a s s i 丘洳h e l sa 。i n g t 0 也ea m j a lr e i q u 溉咄 2 1 1 1 eg ad a s s i 丘c 撕0 i lm e t l l o do ft 1 1 i 优- d i 嘞s i o n a ln u 0 联煳s p e c 呖o f 切v 毗， p h y t o p l a i 】k b d ni sp r e s e n t e dg ai su s e dt 0 翩：召暖m b i n e dc 量】甜a c 喇圆自o m l r e c 删o n s0 f 岫t 1 1 i 洮e n s i o n a ln u 册燃s 】p e c 呱i n c l u d i n gt h eh o 泗1 t a ld 溉晚0 n ( e x d 锄o ns p e c 昀) ，v c ：r 血a ld i r e 蜘o n ( e 心i o ns p | e c 昀) ，0 t j l i q u ed i r o 嘶伽( s y n 妇卿 1 0 吣 s p 咖) 酬t ss h a wt h a tt h e0 0 m 1 咖e dc h 越l c t 蒯岱0 f e x c i 僦o ns p e a 吨a f e 血i g c 咖 d i l a m d e 姚o ft i l 脱怕e n s 蛔 1 a ln u o r 陷啾s p o 咖0 f 说v 咖p h y t o m a i 】k c | o 玛w l l i c hc a n n o to i l l ye 丘酬v e l yd 枷n g l l i s hp h 州a n k t o n0 f d i 、，i s i o 璐，眦a l s op r e 湖tm d i 能r e n c e sa m o n gs p e c i e s a o 。o 幽gt 0m es 砌a 埘e so ft h e 丘1 1 9 e 巾血tc h a m d 萌s 缸，l e 2 6p h y t o p l a n k b ms p e c i e sb e l 0 ：n g i l l gt 0 丘v ed e v i s i o i l si i lt 1 1 i sp a p e rc a nb ed i 讥d e di i l _ c o1 8 s p 洲c a t e g o r i e s ，w l l i c hi sm u c h b e t t e rm a i lf o 册e rs t u d i e s 2 ，猖s p e 嘞o fs i i l 舀es p e c i e sa i l d 4 0 5s p e c 吼o fn l i ) 【e ds 锄p l e sa r ei d e n 曲e du s i n gm e 丘i l 萨唧n td 1 越i c t e i i s t i c sa i l dl 、烈l s f o r 豳舀e 一即e c i e s ，删o n 删e s a r el l i g l l 州c hr e s 脚l ya r e9 8 5 ，9 9 6 a n d 1 0 0 t l l el e v e lo f s p e c i 瞩s p 啪l 洌e g 耐e s 锄d 弥槲0 i l s f o r 咖o f i l l i 】【e d 鲫n p l e s ， 1 e 唧i t i ( ma o 侧e sh a v e 珊k 础y 缸删b o t h o nt h el e v e lo f s p e c t r a lc a t e g 晡路 趾d ( 1 i v i s i o l l sw h e nu s i n gt l l e 丘1 1 9 e q p r 缸d l 越l d 甜s 廿c s ，w m c ha r e8 6 4 a i l d9 7 8 1 k 似d 鲥t i o na 0 咖硒e sh a v er e s p e d i v e l yi i l 僳邪e d3 0 脚切l g ep o i l l t sa n d1 0p e r c c l n 拓l g e p o i l l t sm a i lp r 咖s t 删e s t h e ya r ea l s om u c h 瞅e rt h a i lu s i l l gt 1 1 el a y e r b y - l a y e rm e t h 以 1 b e r f 0 码i t 锄b e n d u d e dt 1 1 a tt h e 丘i 】【g e 甲血tc h 硪蛐d c s0 b t a i l 砌b yu s i n g ( 认 c 0 n t a i l le 妇陆曲ed 锻湎c a 垃o n 撕a t i o n n ne 彘c t i v c l yr e 丘i l e dn l ed a s s 诟酬0 i la i l d i r n p m v et h ei d e n 蚯c a t 硫a 咖r a c y m e a i 】w 艋e ，m er u s u l t sa 1 s 0 、树6 e s 恤e 鼢出e i l e s so f g ai ne x 昀d i n g e r i s c i c so f 曲e e 幽e i l s i o l l a ln u 咪燃s p l 哪硇lo fp h ) r c 叩l a r 岫0 n 3am 础o df o rq u a i l d 蛐e 锄a l y s i so f 切访阳p ：h y t o p l a n i 【c o n mi sb a s e0 nt l l e d 帅h y u 口0 0 似瑚血撕。坞i ss e tu p h lo r d e rt 0 弱s 麟p h 删卸l ( t o nd a s sa b ( ) u d a 麟，t h e r e l a 的1 1 s l l i pb e t 、v e e n 丑u o 礤髓n c es p e c 眈i 1 1 t e l l s i t i e so f 讥协砌p h 如p 1 幽na n dc i l l o r i d p h y u 口0 0 n c l e i l 仃撕o no fc o m 跚d i i 冯s a n 叩i ea r es t u d i e da 9 0 0 du i l e a ro o 耐a d o nb e 翱，e e nm 锄 i s 幽d w e d ( r = o 9 1 4 6 0 9 9 3 5 ) a ( j c 0 觚n g t o m e o b t a i n e d u n e 龃c o 积撕0 n e q 岫虹o n s 锄d 拥 惋，dp h 扣叩l 棚n u o r e s 优n c es p e c 缸a ，c h 呻y u 口n 0 删o n so fa l l l ec 0 n 嘲 i d l 疵五e ds a i l l p l e sc a nb e0 b 僦r e l 撕v ee r 娜0 ft h cc h l o l 删口c 0 n c e i l 昀矗叩s b c 帆e nm e 翻叫a t i 甜v a l u e sb y l e 胁订mm e t l o d 锄dm e a s l l r e dv a l u 髓b yt h e 玩诚彻i m e m o da r ec a l a l l a t e d9 0 o f t t 蹴r e l a t i v ee m 瞒f e ub e t w e e n 旬6 0 2 州c l lp 帕v et i l a tt h i s m e m o dc 趾b eu s e df b rq ) i dq 咖d t a 6 v ea i l a l ) ，s i s0 fp h 卿i a n l 【c ( 冯w i 也a 五x e dr 锄萨o f r e l 撕v e 锄r s d d 蛐h m i t0 f 蛳1 a i 船o n 呻b y 岫垃l d0 f 觑咖m e 也0 di s 0 鹏腭1 4 3 8 腭l ，d l 峨如n g md 证e 删p h ) r t o p l 幽s p e c i e s h l s u r l l ，t l l i sw o r k 丘i 杖血n eu s e s ( 王a t o e x t r a 蛾丘r l g e 巾面t c h 觚a a e r i s t 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发录到中同学位论文全文数据霄并通过网络向牢十会公俞提供信息眠务。( 保密 的学位论文在解密后适用本授权书) 学位做作糍：奇鹏羽 导师签字：私自响 签字日期：加1 年6 月，o 日签字日期：砷年月o 日 遗传算法提取荧光指纹特征的浮游植物分析方法研究 1 文献综述 1 1 浮游植物荧光分析技术研究进展 浮游植物占海洋初级生产力的4 0 5 0 ，并对海洋生态环境起重要作用【l 2 1 ，因此其种类和数量的监测是海洋科学研究中一项例行的基础性工作。在近 3 0 年中，有害赤潮频发【孓6 l ，给环境以及人类的生活生产带来严重危害，促使 人们研究开发能够直接快速进行浮游植物种群结构监测，以及定性定量分析的 方法。现有的浮游植物分析方法分为三类【7 一】：一是基于浮游植物的外观形态 的方法，包括传统的使用显微镜计数法、标准的沉淀计数法和图像法；二是基 于浮游植物的基因结构和有关生化反应的方法，包括化学发光流动注射法、 d n a 分子探针法，流式细胞仪法；三是基于浮游植物色素组成的方法，包括高 效液相色谱法、吸收光谱法和荧光光谱法。作为测定浮游植物色素最常用的方 法之一，荧光法操作简便、快速、灵敏度高，可以实现连续观测，目前已广泛 地应用于海洋和淡水环境浮游植物群落状态的特征研究。不同种类的浮游植物 具有不同的色素种类和特征色素比值f 9 1 ，因此，也为荧光分析技术鉴定浮游 植物种类，鉴定和估测浮游植物群落组成打下基础。 利用荧光光谱鉴定浮游植物色素种类的研究开始于2 0 世纪7 0 年代。美国研 究者y e n t s c h 等【1 2 1 根据叶绿素辅助色素比率( c l l l o r o p h y l la c c e s s o r ) rp i g m e m r a t i o ，c a p - r a t i o = f ( 5 3 0 ，6 8 5 ) f ( 4 5 0 ，6 8 5 ) ，其中f ( 入吧x ，k m ) 等于激发荧光强 度与发射荧光强度之比) 识别硅藻甲瓣石藻，绿藻，隐藻和蓝藻四个门类， 研究者预言应该能够从荧光光谱指纹得到更多的信息。在基于一维荧光光谱， 即激发荧光光谱和发射荧光光谱的分析中，这种以一定波长f 二者荧光强度之 比作为样品荧光特性的描述值进行物种鉴别的方法，稳定可靠，适于现场测量 1 1 3 】，提取的特征值数目可以有多个，对荧光光谱分布曲线的描述可以更加准确。 1 9 8 9 年研究者h i l t o n 等研究了淡水浮游植物的活体荧光光谱及利用其进行 浮游植物自动分析识别的可能性【1 4 l 。 美国的研究者通过现场测量藻红蛋白荧光发射光谱波长的位移推断了海 水中含藻红蛋白的浮游植物种类和数量的变化【1 5 1 7 1 。欧洲研究者p o 叩k i n a 等利 用荧光光谱特征研究了浮游植物群落组成【1 8 】。 k a i t a l a 等【1 9 瑚】发现辅助色素与叶绿素的荧光比值不随生长期变化，可以可 中日海洋太学硕 ：论文 通过“选择激发浮游植物色素”米分析浮游植物群落的色素组成。这方法首 先要在实验室建立重要浮游植物单一物种的光谱特征分类，然后通过天然水体 光谱与单一物种光谱基本特征的比较分析，得要0 浮游植物色素组成。 k e 等口”根据蓝藻的藻蛋白发出的特征荧光谱，建立了现场活体监测蓝藻 含量的荧光分析技术。芬兰的研究者利用三维荧光光谱，检测了浮游植物群落 结构的变化；研究了春、夏季节r i g a 海湾浮游植物的分布以及溶解有机物的 分布情况”。 k o i b o w s h 等陋1 利用发光二极管阵列作为激发光源得到的活体叶绿素荧光 激发光谱实现了三个主要的浮游植物种群的识别测定并得到了广泛的实际应 用。b e u t l e r 等【衢l 利用浮游植物活体叶绿素荧光激发光谱将浮游植物分为四大 类( 绿藻、蓝藻、隐藻、褐藻( 甲藻和硅藻) ) 进行识别测定，这就是目前已经商 品化的b b e 藻类分析技术。2 0 0 3 年，b e u t l e r 等l 卅又报道了一种简易的荧光模 型，用于在线检测一种蓝藻c 如 d 妇c 舯另外，根据c h e k a l y u k 等人的相关 研究结果唧j ，浮游植物的檄发荧光谱可以用1 0 个高斯函数进行拟合。图1 1 是 现场测量的硅藻的激发荧光光谱，如图1 2 是高斯函数拟台后的结果。1 0 个高 斯函数分别代表激发荧光谱中的叶绿囊a 、叶绿素b 、叶绿素c 等贡献。由于各 藻种中的叶绿索含量不同因此拟合得到的高斯函数系数也就不同，以此可以 建立浮游植物荧光谱的特征库，进行浮游植物的定性定量分析。 j 际_ t 叫隧剜 图1 1 现场测量的硅藻的激发荧光光谱】 r l - 1 & c i m t i o na u o m s d c es 哗t m o f m 咖d i a 啪b 1 2 剐 遗n 算浩n 荧光* 敌特* * # 析i 法”e 图1 2 硅藻的激发荧光谱高斯拟合后的结果【冽 尉1 2r e c 帅s 咖d i o n o f p l 目n e n 【s p e 。i n 呷e n b 如r d l a t o m s b y g 獬a n a 】y s l s 【2 8 】 国内研究者注意到浮游植物荧光分析这一研究的重要性。2 0 0 0 年以来王修林 等承担的十五8 6 3 项目课题组开始针对中国东海赤潮多发区浮游植物赤潮种及优 势种的激发荧光光谱、发射荧光光谱、同步荧光光谱和三维荧光光谱进行系统研 究。考察了不同温度、光照、生长期条件下海洋浮游植物的荧光特征，发现同种 浮游植物的荧光光谱具有很好的重现性，随温度光照和生 毛期的变化很小：而 异种浮游植物荧光光谱具有较大的差异性。为了能够鉴别浮游植物种类，对荧光 特征提取技术进行了深入系统研究，寻找有利于分类的有效信息，建立了不同类 型的浮游植物荧光特征谱库，以特征光谱对混合藻中主要的浮游植物“类别”进 行快速定性、定量分析。张前前等【”。3 1 】用奇异值分解方法提取三维荧光光谱特征， 成功的区分了实验所用甲藻、硅藻，运用n n l s ( 非负最小二乘法) 方法进行定 性定量，定性准确率达7 6 。陈坤对光谱特征的提取方法进行改进，用原始瑞 利散射谱、组合谱和重构瑞利散射谱进行浮游植物光谱的分类和识别。定量分析 方面，寻找浮游植物数量与瑞利散射谱的最高峰的定量关系，实验发现，细胞密 度与其各自的最高散射峰m a x 强度和括体叶绿素荧光强度均呈较好的线性关 系，根据拆分系数、混合样品瑞利散射峰x m a x 的强度，以及不同培养条件下细 胞密度与散射峰x m a x 强度的线性方程，估计混合样品中不同浮游植物的细胞密 度。卢露【”荆用四阶导数法和高斯分解法研究不同门类浮游植物荧光光谱特 征。利用色素荧光峰的特征可实现对色素的初步定性定最，井对不同门类的浮游 植物进行区分。通过色素组成和特征可反映浮游植物群落的组成。同时特征谱凸 中国海洋大学硕士论文 显了硅藻和甲藻之间的差异，增强了光谱识别硅藻和甲藻的能力，同时也提高了 光谱的稳定性和重现性。张芳1 3 5 3 6 】利用小波分析对浮游植物三维光谱进行了特 征提取。以c o i n e t 2 小波函数( c o i f 2 ) 为基函数对浮游植物的三维荧光光谱进行分 解，选取了第三层尺度分量作为浮游植物识别特征谱，不同门类和属( 种) 的浮 游植物的特征谱具有较明显的特征差异。并以此为基础，利用线性回归法( 非负 最小二乘法解析) 建立浮游植物荧光识别测定技术。刘娜f 3 7 】以基于色素荧光特征 的比值分析法对活体浮游植物的分类进行了研究，发现比值分析结果可以直观的 反映活体浮游植物荧光光谱的差异，比值44o 47onm 较好地区别甲藻、硅 藻。另外，同步荧光光谱也能提供浮游植物定性定量的有用信息【3 8 】，研究发现同 步荧光光谱( 入= 1 0i 皿) 5 7 0 咖处荧光强度与样品所含叶绿素的线性关系良好， 可用于定量分析【3 9 】。总之，在持续多年的浮游植物荧光分析技术的研究中，对浮 游植物在门的层次上的分类和识别取得了较为理想的结果，甲藻和硅藻能够被分 开，但在细分时，结果不甚理想，归结原因为对三维荧光光谱的特征提取不够， 有些利于分类的信息没有被利用。其次，在方法的定量分析方面，尚需进一步研 究，以形成一个完整的具操作性的活体浮游植物荧光分析方法。 国内越来越多的研究者开始运用荧光技术研究浮游植物的分类以及监测。 2 0 0 5 年，金海龙等【4 0 奶】对绿藻门的扁藻、小球藻、盐藻，硅藻门的角毛藻、小 新月藻，金藻门的叉鞭金藻等六种海藻的荧光光谱进行分析，提出基于海藻色素 含量的荧光光谱的比值分析法、荧光总量法；基于海藻超微结构差异的二阶导数 法、模糊聚类分析法；根据单一海藻和混合海藻的二阶导数的统计特性，提出混 合海藻荧光的多元线性回归模型。2 0 0 6 年马伟华等【4 5 】将小波变换与神经网络 相结合，对浮游植物活体的三维荧光光谱进行分类首先利用小波变换对数据进行 压缩，然后利用径向基函数( r a d i a l b a s i s f u n c t i o n ，r b f ) 神经网络对光谱曲线进行逼 近，从而进行物种的识别。 另外，利用荧光分析技术对淡水浮游植物的分类和识别也同样受到国内研究 者的关注。吕洪刚等【蚓采用三维荧光技术分析了淡水藻栅藻、微囊藻和小环藻的 色素组成。2 0 0 8 年，王志刚等【铌钙】测量了富营养化水体中1 3 种浮游植物的活体 三维荧光光谱和激发荧光光谱，通过光谱相似性原则将浮游植物分成3 种光谱 组，分析了光合色素组成与各光谱组三维荧光光谱特征的关系，并对利用三维荧 4 遗传算法提取荧光指纹特征的浮游植物分析方法研究 光光谱和p a c 模型分类测量浮游植物浓度的可行性进行了初步研究。 1 2 遗传算法及其在光谱解析上的应用 遗传算法( g e n e t i c 舢g o r i t h m s ，g a ) 最早由美国j h o l l a n d 于1 9 7 5 年提出【4 9 1 ，j o n g 和d a v i s 等对其进行了完善和发展。g a 算法是一种自适应的全局的概率搜索算 法，借鉴生物界自然选择和遗传机制，它利用选择、交换和变异等算子的操作， 随着不断的遗传迭代，使目标函数值较优的变量被保留，较差的变量被剔除，最 终达到最优的结果。 遗传算法的基本过程包括群体的初始化、评价、选择、遗传( 基因交换) 和 变异等操作【5 晒2 1 。整个过程可用图1 3 的框图来表示。遗传变异循环过程的终 止条件有两种：一种是最优解已是问题的最佳解或满意解，另一种是控制遗传代 数。 图1 3 遗传算法的基本过程 f i g 1 3p r o c e s so fg e n e t i ca l g o r i t h m s ( 1 ) 群体的初始化 遗传算法首先随机产生一个给定大小的初始群体( p o p u i a t i o n ) 。群体中的每一 个染色体长度为表示每个问题参数所需要的位数之和。每个参数的表示方法由具 体问题确定。对于某些问题，也可以不采用随机产生的方法，根据一定的限制条 件来产生初始群体。群体的大小( p o p u l a t i o ns i z e ) 一般采用3 0 一1 0 0 ，根据参数的 5 中国海洋大学硕士论文 多少及染色体的长度选定。 ( 2 ) 评价适应度或评价值( f i t n e s s ) 的计算 评价过程主要包括两个内容，即首先对染色体进行解码( d e c o d i n g ) ，把二进 制数串表示的参数集转换成十进制的参数值。然后将个参数值代入评价函数中， 计算每个串的适应度。在遗传算法的整个过程中，只有这个步骤与具体的问题有 关，其他步骤都“感觉不到”它要解决的问题。所以，评价函数的确定是非常关 键，也是非常困难的一个问题。评价函数的好坏直接影响解决问题的成功和失败。 另外，在遗传算法的计算过程中这一步骤也是最费机时的步骤，评价函数的优劣 也是解决问题速度的关键。 ( 3 ) 选择 选择步骤又称为利用( e x p l o i t a t i o n ) ，所谓利用是指遗传过程中“父辈”信息 的保留，具体的说就是根据目前的群体中每个个体的评价值( f i t n e s s ) 进行选择， 选择那些被保留的对象。评价值越高者被选中的概率就高，而评价越低者被淘汰 的概率高。例如，对于优化问题，当前群体中的每一个个体均表示问题的一个侯 选解，而每个个体接近问题真实解的程度不同。接近真实解的程度高者被选为产 生下一代群体的“父辈 的概率就高。 ( 4 ) 基因交换( r e c o m b i n a t i o n 或c r o s s o v e r ) 基因交换过程也就是遗传过程，该过程将从已被选择为“父辈 的群体中随 机选择两个个体，按照一定的规则和概率进行串的位交换。基因交换的目的是在 继承“父辈 有用信息的基础上开发更好的个体。当然，也可能产生更差的个体。 基因交换的方式主要有四种方式：( 1 ) 单点交换( s i n 百ec r o s s o v e r ，1 x ) ；( 2 ) 两点 交换( 俩o p o i n t sc r o s s 0 v e r 2 x ) ；( 3 ) 均匀多点交换( u n i f o 肋m u l t i p o _ i n t s c r o s s o v e r ， u x ) ；( 4 ) 环形交换( c 硫u l a rc r o s s o v e r ) 。一般来说，对于参数较少、基因串较短 的情况，选择单点交换就足够了，当参数较多，基因串较长时，可选择两点交换 或多点交换。环行只有非常特殊的情况下才被使用。基因交换的百分数由基因交 换概率参数( p x ) 控制，p x 一般在o 5 加9 5 之间选择。 ( 5 ) 变异( m u t a t i o n ) 变异操作是随机地对参数串的位进行强制变化，对于二进制数串的位即 为n o t 操作。其目的主要是改变搜索方向、扩大搜索空间。 6 遗传算法提取荧光指纹特征的浮游植物分析方法研究 目前，遗传算法已成功地用于多组分分析中的波长选择；发射光谱的实验条 件选择；校准数据的优化；在】王中的脉冲波形选择；有机分子的最小化学间 距的确定；热解质谱仪中的定量分析；生物大分子如d n a ，r n a 和蛋白质的构 象分析；化学反应路径的随机构建；动力学参数和模型的确定；有机磷杀虫剂设 计中参量的选择；化学工业中尼龙2 6 半间歇反应系统的多元优化；分子群的预测； 从粉末x 射线衍射数据中解决结晶结构等许多化学领域。下面主要介绍其在光谱 分析领域的研究进展。 遗传算法在红外光谱解析中的应用十分广泛，1 9 9 6 年s h a 虢r 等1 5 3 j 使用近红外 傅里叶变换光谱仪对牛血清白蛋白、人血清、牛血中的葡萄糖进行检测时，利用 遗传算法对带通滤波位置、带宽、光谱范围和偏最小二乘法( p l s ) 因子数目进行 了联合优化，他们提出，为了能够成功地使用遗传算法，必须构造一个好的适应 度函数，采用此法不但减少了校正模型中的p l s 因子数目，甚至比基于格栅法的 校正模型的能力强得多，由于遗传算法具有广阔的搜索空间，使得其结果是无偏 的。b a n g a l o r e 等【5 4 l 对存在严重光谱干扰的且分析信号在检测线附近的光谱数据， 用遗传算法对信号和噪声进行了特征化处理，通过实验设计技术用遗传算法对 p l s 校正模型进行结构优化，结果认为不需要全光谱数据，只要选择适当的波数 点就可得到非常好的结果。2 0 0 1 年刘芳、王俊德等【5 5 】直接使用遗传算法对混叠的 傅里叶变换红外光谱图进行了定量的解析，文中分析了最多包含十个组分的大气 有毒有机物的混合谱图，建立了适当的目标函数，使用了自适应变异技术，讨论 了交换和变异概率对结果的影响，结果证明遗传算法有着极好的非线性特征和求 解能力，在适当的条件下，结果误差小于1 。王国庆等【5 6 】用遗传算法( g a ) 与交 互检验( c 相结合建立了一种用于对近红外光谱( n 承) 数据及其离散小波变换 ( d w t ) 系数进行变量筛选的方法，并应用于烟草样品中总挥发碱和总氮的同时测 定。结果表明：n 佩数据经d w t 压缩为原始大小的3 3 时基本没有光谱信息的 丢失：有效的变量筛选可以极大地减少模型中的变量个数，降低模型的复杂程度， 改善预测的准确度。2 0 0 7 年刘辉军等【5 7 】利用遗传算法( g a ) 提取茶叶的近红外 吸收特征波长的方法，研究建立了绿茶水分和氨基酸的近红外分析模型，并对波 长选择前后两种成分的模型进行了比较分析。结果表明，经遗传算法波长选择后 简化了分析模型，同时模型的稳健性增强。遗传算法在红外光谱上的应用已经成 7 中国海洋大学硕七论文 熟，广泛，这里不赘述。 遗传算法在紫外可见光谱解析中也有重要应用，1 9 9 7 年舡c o s 等【5 8 】采用了遗 传算法对p l s 校正模型进行波长的选择，他们对1 1 1 d o m e t h a c i n 和a c e m e t h a d n 的混 合物的紫外可见光谱图进行了研究，结果发现，对于校准样品来说，经过波长选 择的模型所得到的浓度，与全光谱模型所得到的浓度基本上一致，证明了遗传算 法有着良好的分析敏感性。 在原子发射光谱的应用上，1 9 9 2 年w i e n k e 等【5 9 l 应用遗传算法对6 个痕迹元素 的原子发射谱线的强度同时进行了优化，证实了遗传算法能够处理非常复杂的结 构化的多元响应表面，具有全球搜索特性，并且是一个典型的大尺度的优化技术， 文中也将此法与分析化学中常用的方法，如格栅法( g r i d es e a r c h ) 、模式搜索 ( p a t t e ms e a r c h ) 、模拟退火( s i m u l a t e da m l e a l i n 曲、最速上升下降法( s t e e p e s t 赴c e n t d e s c e n t ) 和改进的单纯形法( m o d i f i e ds i i l l p l e x ) 等，在计算速度、寻优能力、 分析仪器上的在线应用及所需实验次数上进行了比较。 在荧光光谱解析上，1 9 9 6 年d o d s 等【删利用遗传算法研究漂移激发态电子的 表面位置，把实验和理论的荧光吸收谱图的差异减小化。该法依赖于非常敏感的 多原子的f c 因子进行几何漂移，使得分子经历电子激发，并在遗传算法的参与 下迅速地设置所需的初始漂移，他们使用了一系列的烷基苯f c 谱图证实该方法 的可行性。2 0 0 8 年罗立强等【6 1 l 将遗传算法应用于永磁材料偏振x 射线荧光中的 重叠谱分解，研究了进化策略对谱峰分解质量的影响，比较了遗传算法与传统算 法的拟合结果。研究表明遗传算法在谱线严重重叠情况下仍具有较强的谱峰分解 能力；群体初始化和进化策略的正确选择是该算法成功应用的关键；遗传算法具 有全局搜索能力，对重叠谱峰的分辨能力优于标m a r q u a r d t l e v e n b e 玛算法。 综上所述，遗传算法在分析化学的光谱特征的提取、优化求解研究中占很大 比例，被广泛证明其有效性。目前，尚未见将遗传算法用于活体浮游植物荧光光 谱特征的提取。 1 3 本文的研究目标和内容 本文的研究目标旨在提取浮游植物三维荧光光谱的指纹信息，建立新的基于 荧光指纹特征的海洋浮游植物快速分析方法。 8 遗传算法提取荧光指纹特征的浮游植物分析方法研究 主要研究内容包括： ( 1 ) 定性分析方面，应用遗传算法提取三维荧光光谱特征，利用组合特征进行 分类研究，确定最优的利于浮游植物分类的指纹特征，划分光谱类别。 ( 2 ) 定量分析方面，确定以叶绿素为标准的定量分析方法，包括定量正确率的 定义、检测限，以及“活体法 与“萃取法”定量分析结果的相关关系分析。 2 实验部分 2 1 实验用仪器及试剂 ( 1 ) f - 4 5 0 0 荧光分光光度计( h i t a c l l i ，j a p a l l ) ( 2 ) n i k o n 舢p h 印h o ty s 显微镜( n i l 【o n ，j a p a n ) ( 3 ) u m 2 5 0 一g 光照培养箱( 广东医疗器械厂) ( 4 ) l d z x 4 0 8 1 型立式自动电热压力蒸汽灭菌器( 上海申安医疗器械厂) ( 5 )y x q g 0 2 型电热式蒸汽消毒器( 山东新华医疗器械厂) ( 6 ) d z 一8 8 电热恒温真空干燥箱( 上海跃进医疗器械厂) ( 7 ) 0 4 5 岬1 醋酸纤维滤膜( 杭州海洋局二所) ( 8 )舵营养液，根据眈营养液配方，依次取氮、磷、硅营养元素储