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固定化有益微生物技术在水产养殖中应用的初步研究 固定化有益微生物技术在水产养殖中应用的初步研究 摘要 近2 0 年来，随着海水养殖业的发展，高密度的海水养殖导致高浓度的营养盐 废水超标准排放，使得近海水域富营养化加剧，赤潮频繁发生。海水养殖废水处 理问题已经受到各个国家的关注。本文就微生物的固定化技术在处理水产养殖废 水中的应用做了初步研究。 选取4 种廉价、易得的材料活性炭、硅藻土、麦饭石、石英砂对1 株有 益菌坚强芽孢杆菌y 5 进行固定化，结果表明，y 5 与活性炭吸附1 5 小时后的结 合率最高。在实验室条件下，用坚强芽孢杆菌y 5 以吸附的固定化方式与活性炭、 硅藻土、石英砂、麦饭石等4 种载体结合处理养殖废水，于4 8 小时内测定载体 对菌体的吸附率、c o d 、氨氮、亚硝态氮、硝态氮等指标。结果表明，活性炭是 用于吸附细菌处理养殖废水的最好载体。 选用活性炭为载体吸附光合细菌( p s b ) 和y 5 处理养殖废水，处理4 8 小时 后c o d 、氨氨、亚硝态氮及硝态氮的含量都有明显的降低。将已处理4 8 小时后 的废水倒出后加入新的废水，观察混合菌固定化体系的后续处理效果，结果表明 依然有较好的处理效果，因此该固定化体系在实际应用中可以循环使用。 在养殖稚贝过程中，应用固定化闭合养殖系统发现，固定化p s b + y 5 试验组 的溶解氧高于其他组，而氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐和c o d 的含量均低于其他组， 达到了国家渔业标准。通过测定固定化p s b + y 5 试验组稚贝的体长增长和成活率， 发现经过固定化p s b + y 5 处理的闭合养殖系统，稚贝平均每天生k f l 8 9 m m ，平均成 活率达到9 9 。以a r d a r 和生理生化鉴定相结合的方法，对养殖水体的细菌进行 了分析，结果表明，固定化有益菌在水处理装置中部分菌会进入养殖水体。 关键词：固定化，有益微生物，坚强芽孢杆菌，光合细菌，水产养殖 固定化有益微生物技术在水产养殖中应用的初步研究 t h ep r e ii m j n a r ys t u d yo nt h ea p p ii c a t i o no fi m m o b | i z e d p r o b i o t i c st e c h n i q u eina q u a c u i t u r e a b s t r a c t i nt h er e c e n t2 0y e a r s ，w i t ht h ed e v e l o p m e n to fm a r i c u l t u r e ，i n t e n s i v e m a r i c u l t u r eg i v e so f fe x c e s s i v ea m o u n t so fw a s t ew a t e rw i t hh i g hc o n t e n t o fn u t r i e n t si n t oe n v i r o n m e n t ，t h u se n c o u r a g e se u t r o p h i c a t i t i o na n dr e d t i d ei nt h ec o a s t a lr e g i o n t h e r e f o r e ，p e o p l ea l lo v e rt h ew o r l dp a y a t t e n t i o nt ot h eb i o r e m e d i a t i o no fm a r i c u l t u r a lw a s t e w a t e r i nt h i sp a p e r ， t h ea p p l i c a t i o no fi m m o b i l i z e dp r o b i o t i c st e c h n i q u ei na q u a c u l t u r ew a s s t u d i e d i nt h i ss t u d y ，w ec h o o s e df o u rc h e a pa n de a s i l ya v a i l a b l em a t e r i a l sa s as o r b e n t ，i n c l u d i n ga c t i v a t e dc a r b o n ，d i a t o m i t e ，“m a i f a n ”r o c ka n d q u a r t z i t et oi m m o b i l i z eap r o b i o t i c sb a c i l l u sf i r m ss t r a i ny 5 t h er e s u l t s h o w e dt h a ta f t e ra b s o r b i n gf o r1 5h ，t h ea b s o r b e n tr a t eo fa c t i v e dc a r b o n t ot h es t r a i no fy 5w a st h eh i g h e s t i nt h ee x p e r i m e n t ，t h r o u g ha b s o r b e n ti r m m o b i l i z a t i o n ，y 5w a sc o m b i n e d w i t hf o u rc a r r i e r si n c l u d i n ga c t i v a t e dc a r b o n ，d i a t o m i t e ，“m a i f a n ” r o c ka n dq u a r t z i t et oa r t i f i c i a lm a r i c u l t u r a lw a s t e w a t e r a f t e rb e i n g t r e a t e df o r4 8h ，t h ea b s o r b e n tr a t eo ft h ec a r r i e r st ot h es t r a i ny 5 ， t h ec o n t e n t so fc o d ，n h 3 ，n 0 2a n dn 0 3 _ w e r em e a s u r e d t h er e s u l t ss h o w e d t h a ta c t i v e dc a r b o nw a st h eb e s tc a r r i e ri nc o m b i n i n gw i t ht h es t r a i ny 5 t or e m e d ym a r i c u l t u r a lw a s t ew a t e r t h ea c t i v e dc a r b o nw a sc h o s e nt oa b s o r bt h es t r a i n sp s ba n dy 5 ，a n dt o r e m e d yt h em a r i c u l t u r a lw a s t e rw a t e r a f t e rb e i n gt r e a t e df o r4 8 h ，t h e c o n t e n t so fc o d ，n h , ，n 0 2 一，n o , 一o b v i o u s l yd e c l i n e d a f t e rb e i n gt r e a t e df o r 4 8h ，t h er e m e d i e dw a s t ew a t e rw a sm i x e dw i t hu n r e m e d i e dw a s t e rw a t e ra n d w eo b s e r v e dt h ef o l l o w u pr e m e d ye f f e c to ft h em i x e ds y s t e m w eg o ta n i d e a lr e s u l ta n ds ot h em i x e ds y s t e mc a nb er e c y c l e di nt h ea p p l i c a t i o n 2 固定化有益微生物技术在水产养殖中应用的初步研究 t h ei m m o b i l i z e da n dc l o s e dc u l t u r a s y s t e mw a su s e di nt h ec u l t u r eo f y o u n gs h e l l f i s h t h ec o n t e n to fs o l u b l e0 2i nt h eg r o u po fp s ba n dy 5w a s h i g h e rt h a nt h a to fo t h e rg r o u p s ，w h i l et h ec o n t e n t so fc o d ，n h 3 ，n 0 2 - ， n 0 3 一i nt h eg r o u po fp s ba n dy 5w e r el o w e rt h a nt h o s eo fo t h e rg r o u p s t h ei n d e x e sh a v ea c h i e v e dt h en a t i o n a lf i s h e r ys t a n d a r d i nt h ec l o s e dc u l t u r es y s t e mr e m e d i e db yi m m o b i l i z e dp s ba n dy 5 ，t h e g r o w t hr a t ea n ds u r v i v a lr a t eo fy o u n gs h e l l f i s hw e r em e a s u r e d t h e r e s u l ts h o w e dt h a tt h ey o u n gs h e l l f i s hg r e w f l 8 9m mad a yo na na v e r a g ea n d t h ea v e r a g es u r v i v a lr a t ew a s9 9 t h r o u g ht h ec o m b i n a t i o no fa r d a ra n dp h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s i d e n t i f i c a t i o n ，t h eb a c t e r i a lo ft h em a r i c u l t u r a lw a t e rw a sa n a l y z e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a ti nt h ec l o s e dc u l t u r es y s t e m ，s o m eo ft h e i 衄o b i l i z e dp r o b i o t i c se n t e r e dt h em a r i c u l t u r a lw a t e r 。 k e y w o r d s ：i m m o b iii z a t i o n p r o b i o t i c s b a c i i u s 疗r m u s , p s b ，a q u a c u l t u r e 3 固定化有益微生物技术在水产养殖中应用的初步研究 第一章前言 近2 0 年来，随着水产养殖业迅速发展，集约式工业化养殖规模日益扩大，未经 处理的养殖废水和工业废水、生活污水的任意排放，使天然水域受到污染的程度 日益加剧，养殖生态环境日益恶化。人们发现，近年来水产养殖动物病害的频繁 发生与水质的恶化关系密切。面对水产养殖中的病害问题，目前人们普遍采的是 用广谱抗菌药物来进行控制。抗菌药物的过度使用，不仅使病菌的耐药性增强， 而且还干扰了养殖环境中有益生物群的生长繁殖，引起微生态平衡失调，产生二 次污染和内源性感染，这一事实已经被越来越多的业内人士所认同。鉴于此，近 年来人们已经开始尝试在养殖水体中使用微生态制剂来改善养殖生态环境。 微生态制剂是从自然环境中筛选出来的微生物菌体，经培养繁殖后制成含有 大量有益微生物的活菌制剂。它具有成本低、无毒副作用、不污染环境的特点。 微生态制剂可分两类：一类是饲料微生态添加剂，以内服方式施加给养殖动物， 以提高鱼虾等养殖动物免疫力的；另一类是水体微生态调控剂，用以改良水质。 1 有益菌在水产养殖中的应用 随着近年来水产养殖病害的频繁发生，药物防治效果的不断减弱，国际 社会对水产品中抗生素含量的限制，保护环境的意识的不断加强，人们开始尝试 在养殖水体中使用微生态制剂( m i c r o b i a le c o l o g i c a la g e n t ) 来改善目前的水 产养殖现状。与抗菌药物相比，微生态制剂有其优越性，如无毒、无副作用、无 残留和二次污染、不产生抗药性，能够有效地改善养殖生态环境，维持生态平衡 并且能增强养殖对象的免疫力，减少疾病的发生。因而研究、开发与应用微生态 制剂对新时代的水产业具有重要的现实意义。在欧美、日本、印度尼西亚和泰国 等国家的水产养殖业中，微生态制剂得到广泛的应用，已经开始产生了巨大的经 济效益，我国虽然研究较晚，但发展迅速，广东、浙江等地的不少养殖户已经在 水产养殖中应用，并取得了较好的效果，有望成为未来水产养殖动物病害防治的 一个重要方向u ，。 1 1 微生态制剂的定义 固定化有益微生物技术在水产养殖中应用的初步研究 微生态制剂，又称微生态调节剂( m c r o e c o l o g i c a lm o d u l a t o r ) 、益生素 ( p r o b i o t i c s ) 、活菌制剂( l i v i n gb a c t e r i aa g e n t ) 、e m 菌制剂( e f f i c i e n t m i c r o b e a g e n t ) 等。它是根据微生物原理，对动物体及其生活的环境中正常的有 益微生物菌种或菌株经过鉴别、选种、大量培养、干燥等一系列加工手段制成后， 重新介入其体内或环境中形成优势菌群以发挥作用的活菌制剂，因此能达到调整 微生态平衡，提高宿主健康水平或增进健康状态的效果。1 9 7 4 年，p a r k e r 等0 1 首次将微生态制剂定义为“有助于肠道菌群平衡的微生物和物质( 可能含有抗生 素) ”。而f u l l e r ( 1 9 8 9 ) “1 则认为微生态制剂是一种活的微生物饲料添加剂， 通过改善肠道内菌群平衡而对动物产生有利的影响。但t a n n o c k ( 1 9 9 7 ) “1 发现 在许多情况下并不能证明微生态制剂可以改善肠道菌群平衡，他又把微生态制剂 定义为“有助于增进动物健康的活微生物饲料添加剂”。k o z a s a ( 1 9 9 6 ) 嗍 首次将微生态制剂应用于水产养殖，用株从土壤中分离的芽孢杆菌( b a c i l l u s t o y o i ) 处理日本鳗鲡( a n g u i l l aj a p o n i c a ) 降低了由爱德华氏菌( e d w a r d s i e l l a i c t a l u r i ) 引起的死亡后，微生态制剂的研究得到了迅速发展。由于水生生物与 水环境密切相关，许多情况下可直接添加有益微生物于养殖水体中，通过拮抗病 原，降解多余有机质等而对养殖动物产生有益的影响，对此m o r i a r t y ( 1 9 9 8 ) 0 3 将微生态制剂的定义扩展为“一类添加到水体中的有益微生物”。1 9 9 9 年， s a l m i n e n 咖把微生态制剂定义为“任何使得宿主获益的微生物制剂( 不一定是活 的) 或细胞组分”。与此同时，g r a m 等( 1 9 9 9 ) 。1 则提出了微生态制剂应该是 “任何活的微生物制剂，通过改善宿主的微生态平衡而使其受益”。当前，之所 以对微生态制剂的概念有不同的提法，主要是因为在一些国家，对微生态制剂和 免疫疫苗的使用有不同的法规，当然也就影响到它的安全性评价问题。在水产中， 有些有益菌既被用作饲料添加剂，又被用作控制和改善养殖水体微生态菌群的生 物制剂。对此，g a t e s o u p e ( 1 9 9 9 ) n 0 1 认为严格的微生态制剂的概念应该是指“这 样的群微生物，它们进入到宿主的消化道，并生活在那里，以求得改善宿主的 健康”。 综上所述，在水产养殖业中，目前常用的微生态制剂，是指天加大养殖动 物体内外环境中，能对养殖动物产生有益影响的活的微生物制剂。 固定化有益微生物技术在水产养殖中应用的初步研究 1 2 微生态制剂在水产养殖中的应用 对微生物生态学的研究使人们认识到水体中存在着大量的有益菌群，这些微 生物可直接影响水质和水产养殖动物，因而人们开始研究利用环境中的有益菌群 来改善养殖生态环境，防治鱼虾疾病以提高养殖动物健康，提高养殖产量。如研 究利用藻类病毒“嗜藻体”、粘细菌、蛭弧菌和芽孢杆菌等来防治有害藻类形成 赤潮；利用光合细菌处理有机废水等。在众多的研究中，以光合细菌在集约式养 殖中的应用研究进行得最早，研究得较多。1 9 6 5 年，日本开始光合细菌 ( p h o t o s y n t h e t i cb a c t r i a ，简称p s b ) 在水产养殖中的应用研究；与此同时，我 国台湾也开展了微生物在水产业应用的研究。7 0 年代，微生态制剂开始应用于 水产养殖，微生态制剂在集约式水产养殖中主要用于水体环境改良、疾病防治、 水产免疫佐剂以及作饲料添加剂等。 1 2 1 微生态制剂在改善水质方面的作用和应用研究 微生态学的一些基本理论已经开始影响养殖业者，人们逐渐认识到水环境中 不仅存在有害微生物，而且还存在有益微生物，有益微生物可以在不同程度上控 制有害微生物的繁殖，而减少病害发生的机率；抗菌药物的使用，一方面杀死或 抑制了有害微生物，另一方面也杀死或抑制了有益微生物，反而不利于病害的控 制。因此人们开始研究利用水中的有益微生物来改善水质，防治水产动物疾病， 提高产量“。 长时间养殖常使养殖水域底部积累大量的残余饵料、排泄废物、动植物残体 以及有害气体( 氨、硫化氢等) ，这些物质往往导致水质败坏，使水产动物受到毒 害。研究发现，养殖水体中的某些有益微生物的代谢具有氧化、氢化、硝化、反 硝化、解磷、硫化及固氮等作用，能将上述有机物质分解为二氧化碳、硝酸盐、 硫酸盐等。这样既能在不中断养殖过程中及时有效地清除有害物质、净化水质， 又能为单细胞藻类的繁殖提供营养物质，促进藻类繁殖。这些藻类的光合作用， 又为池内养殖动物的呼吸、有机物的分解提供氧气，从而形成一个良性的生态循 环，有利于水产养殖动物的生长。同时由于这些有益微生物的大量繁殖，在池内 形成优势种群，可抑制病原微生物的繁殖，减少病害发生“。 微生态制剂中的细菌、真菌是生物降解的主要成员，可清除有机废物，改善 水体环境。其中，研究最多、应用最广的是光合细菌。光合细菌具有独特的光合 6 固定化有益微生物技术在水产养殖中应用的初步研究 作用，它比藻类能更广泛地利用光能，能直接消耗利用水中有机物、氨态氮，还 可以利用硫化氢，并可通过反硝化作用去除水中的亚硝酸氮等污染物，它虽然不 产生氧气，但可以通过降低水中的c o d 间接提高水中溶解氧水平。此外，光合细 菌还能直接或间接作为饵料生物和防治水产动物疾病“”“1 。郑耀通等“”在固定化 光合细菌净化养鱼水质试验中得出，固定化光合细菌在除去水环境中的氨氮、有 机质、降低c o d 和增加溶解氧等方面有明显的优越性。丁爱中等“”对于光合细菌 调控水产养殖水质的研究时发现，光合细菌在水产养殖中具有良好的水质调节作 用，既能调节水体的p h 值在适宜的范围内，提高水中的溶解氧水平，又能降低 水中对鱼虾有害的氨氮等物质。但p s b 也存在生长速度慢等缺点，为了能够更加 有效地通过投菌去除水中的氨氮和亚硝酸盐氮，必须在各种不同微生物菌剂的研 制和应用方面进行研究与探索，使高密度和工业化水产养殖业能够达到可持续发 展的目的。芽孢杆菌，革兰氏染色阳性，是普遍存在的一类好气性细菌。在其生 命过程中又能以抗性较强的芽孢形式存在，易于生产、保存。该类菌无毒性，能 分泌出活性强的蛋白酶等多种酶类，能有效地改善水体各项水化学指标，起到改 善水质的作用，作为水体微生态调控剂具有广阔前景o ”。张庆等“”在试验中每隔 2 5 d 向罗非鱼养殖水体中添加以芽抱杆菌为主的微生物复合菌剂能明显改善水 质条件，有效降低氨氮与亚硝酸盐，营造良好的水质，促进罗非鱼的生长。李健 “”等向幼虾养殖池添加微生态制剂，能显著降低养殖池的c o d ，增加水体透明度。 薛恒平洲等( 1 9 9 6 ) 将用芽抱杆菌、光合细菌、蛭弧菌等制成的“益生菌王”，按 l m g k g 投入养虾池内，每星期1 次，共计3 次，结果试验池对虾病毒病发病时 间较对照组延迟1 0 天，产量提高4 0 ，用于文蛤的3 个池塘均未发病，而对照 组的3 个池塘发病率为3 0 一5 0 。白维东。”报道，在成鱼养殖池中施用e m 活 性微生物水产专用肥，溶氧量比对照池提高1 1 2 ，氨态氮和亚硝酸盐含量分 别降低5 4 和5 5 ，饵料系数低8 2 ，单位面积净产量提高1 4 4 。 1 2 2 微生态制剂在抑制病原菌、刺激免疫系统、提高免疫力方面的应用研究 微生态制剂在动物消化道内作为有益菌群，与致病菌问就生存和繁殖的空 间、时间、定居部位以及营养素等展开竞争，抑制致病菌的生存、繁殖、定居以 及附着。有些有益菌与宿主粘膜上皮紧密结合生成致密性菌膜，形成生物屏障： 固定化有益微生物技术在水产养殖中应用的初步研究 有些有益菌则附着于动物的消化道、呼吸道及皮肤上，在代谢过程中产生脂肪酸 和乳酸，降低生境内的p h ，抑制病原菌；还有些有益菌能产生抗生素和细菌素， 杀死病原菌。有益细菌还是良好的免疫激活剂，能有效提高干扰素和巨噬细胞的 活性，通过产生非特异性免疫调节因子等激发机体免疫功能，增强机体免疫力”“。 1 2 2 1 微生态制剂对虾、蟹等水产动物的影响 孟凡伦。”抑菌试验表明，微生态制剂对对虾致病菌弧菌，有较强的抑制 作用。李健“”用微生态制剂g m a 抑制养殖水体的有害微生物，显著提高了虾蟹幼 体成活率，促进生长。 a u s t i n 。”等将溶藻胶弧菌( v i b r i oa 拈j h o l y t i c u s ) 用于大西洋鲑鱼 ( at l a n t i cs a l m o n ) 养殖中，发现可减少由杀鲑气单胞菌( a e f o 忉o d a s s a l m o n i c i d a ) 、鳗弧菌( 旷a n g u i l l a r u m ) 和病海鱼弧菌( 旷o r d a l i i ) 引起 的病害。r e n g p i p a t 。5 1 等用加有芽孢杆菌( b a c i l l u s ) $ 1 1 的饵科投喂斑节对虾 ( p e n a e u sm o n o d o n ) ，促进了对虾生长，并提高了对虾存活率。g i b s o n 。”等发现 中间气单胞菌( 月，m e d i a ) 可增强太平洋牡蛎幼体对塔氏弧菌( 矿t u b i a s h i i ) 病害的抵抗力。 吴垠1 等对于微生态制剂提高中国对虾抗病力的研究表明，微生态制剂能明 显提高中国对虾感染后的成活率，使死亡高峰时间延迟，投喂微生态制剂的试验 组与对照组经感染致病后，其血液指标与健康虾比较，试验组虾血液指标变化幅 度小于对照组。 田景波口8 1 等用光合细菌改善微生态环境培育健康虾苗的研究表明，光合细菌 能建立有益微生态环境，增强幼体的抗病力，提高幼体的变态率，使幼体成活率 显著提高。 1 2 2 2 微生态制剂对鱼的影响 桂远明汹1 等从正常鲤鱼肠道中分离出j y l o ( 节杆菌) 和j y l 3 ( 乳杆菌) ， 制成微生态制剂添加到饲料中，用该饲料投喂鲢鱼，其白细胞吞噬率和吞噬指数、 巨噬细胞吞噬率和e 玫瑰花环形成率均高于对照组。用致病菌感染后，实验组成 活率和特异性抗体效价等均明显高于对照组。 周定化有益微生物技术在水产养殖中应用的初步研究 吴垠等研究了微生态制剂对杂交鲤鱼越冬能力的影响，结果使杂交鲤鱼在 低温条件下死亡率明显低于对照组，血清总蛋白、y 一球蛋白、血糖量、血脂量、 红细胞脆性、脑胆碱酯酶活性及白细胞吞噬功能均高于对照组。 1 2 3 微生态制剂为水产养殖动物提供营养、改善机体代谢、促进动物生长 很多微生态制剂中的细菌、真菌、微藻及其产物含有丰富的蛋白质和氨基酸、 维生素，是动物幼体和活饵料必需的营养。动物消化道的微生物菌群主要有乳酸 杆菌、双歧杆菌、芽抱杆菌、拟杆菌等，这些菌群的存在及它们与宿主之间的平 衡，保证了宿主正常的代谢，为机体的生长发育提供了丰富的维生素等营养物质， 也促进了消化道内多种氨基酸、维生素等一系列营养成分的有效合成和吸收利 用，从而促进生长。具有代表性的如光合细菌( p s b ) ，富含蛋白质、多种维生素、 钙、磷和多种微量元素等：芽抱杆菌能产生淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶等消化酶类， 协助动物消化饵料等：酵母菌细胞壁表面有一种磷酯酸，是鱼类消化道粘膜的特 异性受体，能大量定植于消化道，同时酵母菌还能产生乙醇和酸，使p h 下降， 抑制杀鲑气单胞菌“。以添加从鱼肠道中分离出节杆菌、乳杆菌的饲料投喂鲤鱼 1 ，不仅提高了生长速率，而且增加了抗病能力。王斌m 3 等用微生态制剂( 乳酸 杆菌和节杆菌复合制剂) 投喂鲤鱼，结果试验组鲤鱼生长状态明显优于对照组， 增重率比对照组高了3 1 7 l ；该微生态制剂提高了鲤鱼的消化能力，促进了营 养物质的吸收，改善了鲤鱼的整个生理状态。王祥红。2 1 在研究中国对虾肠道菌时， 发现其中含有许多能降解饵料的蛋白酶、淀粉酶、脂酶、纤维素酶的菌体，这些 菌也能增加不同发育阶段的对虾幼体的变态率和成活率，抗病力和低盐耐受力有 所提高，体重和体长显著增加。 1 3 微生态制剂的使用方法“” 1 3 1 注射或浸浴生物体 将微生态制剂直接与动物接触，能在较短时间内刺激动物免疫系统产生反 应。这种方法适合于大的动物，而对体型小的动物剂量不好掌握，同时注射造成 的损伤会使病原菌有机可乘。此法应注意使用剂量和浓度。剂量适宜才能最大限 度的刺激动物的免疫机制。 固定化有益微生物技术在水产养殖中应用的初步研究 1 3 2 作为饲料添加剂 作为饲料添加剂，随同饲料一起进入机体内发生作用。这一方法目前应用较 多，其优点是操作简单、劳动强度小、效果显著。但作为添加剂的微生态制剂， 其成分必须具有较好的稳定性和耐受性，要求在饲料制粒过程中不使其生理活性 丧失。 1 3 3 直接加入水环境 将微生态制剂直接添加到人工养殖环境中，要注意该环境是否适合有益微生 物的生存和繁殖。如水体加人了抗生素等化学物质，就会降低微生态制剂的作用 效果。微生态制剂的加入剂量要能保证有益微生物成为环境中的优势类群，使其 在养殖水体发挥最大的作用，因此如果中间换水和使用消毒剂，应在换水后或使 用消毒剂几天后补加首次使用的剂量。 2 水质微生态调控剂的种类 2 1 光合细菌 光合细菌在集约化养殖中的应用研究进行得最早、研究成果最多。光合细菌 ( p s b ) 属螺菌属，广泛分布在湖泊、海洋、水田、温泉、极地、土壤中。其依靠 光能产生能量的营养类型包括光能自养型和光能异养型。其中的光能异养菌，细 胞内含有类似于植物叶绿体的细菌叶绿素，能以光为能源，在厌氧条件下，以水 中鱼虾残饵及排泄物为碳源，进行不产氧的光合作用，转化成新的菌体。光合细 菌并不能通过光合作用产生氧气，其增氧机制是间接的，是通过同化水中有机物、 减少有机耗氧，改善溶解氧水平。它能有效地将氨氮、硫化氢等有害物质吸收， 长成有效力的生物细胞。因此光合细菌在水产养殖中具有良好的水质调控作用， 既能改善溶解氧水平，又能有效地减少水体中对鱼虾有害的物质的含量，还能调 节水体p h 值在适宜的范围。 有关p s b 改善水质的研究有许多报道。李秀珠将紫色非硫光合细菌投放到对 虾池中，1 0 1 5 天施用一次，结果底泥中h 。s 含量平均减少6 0 。马述法嘲1 在对虾养 殖池中按0 7 5 9 m 2 剂量的p s b 与沙均匀搅拌后投放，结果试验池的n h 4 + 一n 比对照池 平均下降0 0 8 m g l ，溶解氧比对照高1 6 4 m g l 。叶奕佐“5 1 等每天向无沙养鳖池中 泼洒2 m g l 的p s b ，可使n h 。* - n k l 对照组降低2 1 3 3 m g l ，c o d 降f k 1 2 2 m g l ，溶解 氧比对照组高1 0 2 m g l 。韩梅8 ”等研究光合细菌对河蟹养殖水质的净化效果，结 1 0 固定化有益微生物技术在水产养殖中应用的初步研究 果表明，施用了光合细菌的处理池比对照池水体的透明度增加了4 9 2 ，d o 值比 对照组高5 6 4 0 ，c o d 下降了4 1 8 0 ，n h 。n 下降了4 7 3 0 ，溶解性总磷下降了 2 1 9 8 。丁爱中等利用静态试验和现象试验对p s b 调节水质的功能进行研究， 结果表明，与对照组相比，p s b 能调节p h ，改善水中溶解氧水平，降低n h 。l n 。 2 2 芽孢杆菌 芽孢杆菌，革兰氏阳性菌，好氧，能产生孢子。是一类具产生多种高活性的消 化酶、耐高温、抗应激性的异养菌。芽孢杆菌可以降低水体中硝酸盐、亚硝酸盐 的含量，从而起到改善水质的作用。枯草芽孢杆菌在代谢过程中还产生一种具有 抑制或杀死它种微生物的枯草杆菌素，从而来改善水质。另外，芽孢杆菌与其它细 菌竞争营养并且抑制其快速生长。丁雷等发现芽孢杆菌不能分解水体中小分子 有机物同化氨氮，但能明显降低亚硝酸盐水平。王彦波“”也发现，芽孢杆菌能大 大降低水中亚硝酸盐的含量，在试验过程中，亚硝酸含量从0 2 8 m g l 下降到 0 1 4 m g l ，下降幅度为5 0 ；与此相比对照组亚硝酸含量从0 2 6 m g l 增n o 5 6 m g l ， 增幅为1 1 5 3 8 。 2 3 硝化细菌 硝化细菌是一类化能自养型细菌，有亚硝酸细菌和硝酸细菌两类生理亚群组 成。亚硝酸细菌完成n 1 4 + - n 到n 0 2 - - n 的转化；而硝酸细菌完成i 0 2 一到n 0 3 - 的转化，从 而使对水生动物有毒的氨态氮和亚硝酸盐转化为对水生动物无毒的硝酸盐。它能 克服光合细菌对亚硝酸盐转化效率较低和芽孢杆菌对氨氮转化效率低的缺点，因 此近年来硝化细菌在水产养殖的应用比较广泛。邢华”在对虾池中施用纯化的硝 化细菌制剂发现在未换水的情况下，亚硝酸盐下降9 8 ，对虾生长良好：韩士群“” 在对虾池中投加硝化细菌后，水体氨氮浓度仅为对照池的4 0 。但由于硝化细菌是 自养型细菌，不能直接利用外界有机物，因此生长缓慢，易受外界环境条件的影 响。硝化细菌适宜的温度范围是2 0 3 0 。c ，若温度高于3 5 ，对硝化细菌酶系有破 坏作用，若低于i o 。c 以下，硝化细菌的生长及硝化作用缓慢。硝化细菌适宜生活在 偏碱的环境，合适的p h 值是7 6 9 0 ，低于6 o 则受抑制。因此，现在对硝化细菌 的使用倾向于固定化。谢冰。2 1 在研究固定化硝化细菌时发现，温度对固定化硝化 细菌硝化能力的影响较小：3 0 时固定化硝化细菌的回收率为9 1 6 ，而1 5 时 回收率达1 0 6 9 ，且随温度下降固定化硝化细菌的氨氮降解能力下降的幅度小于 固定化有益微生物技术在水产养殖中应用的初步研究 游离的硝化细菌，从而验证固定化硝化细菌有抗低温的能力。黄正“”在用固定化 硝化细菌处理废水时n 卜k + _ n 去除率达9 9 o ，对养殖废水中氨氮去除率达8 2 5 。光 对硝化细菌有抑制作用，因此在使用硝化细菌时应注意水中的p h 值、温度、溶解 氧、及光照强度等因素的影响。 2 4 蛭弧菌 噬菌蛭弧菌简称蛭弧菌，是一类普遍存在于天然水体中的专门以捕食细菌为 生的寄生性细菌。广泛分布在自然水域、污水、及土壤中，是环境致病菌自然净 化的重要生物因子之一。蛭弧菌具有一般细菌的特性，革兰氏染色阴性、短杆状、 具有极长的鞭毛、个体很小，蛭弧菌对细菌形成噬菌斑的适宜p h 为7 8 ，在水体中 生长繁殖的适宜温度为2 0 3 0 。 许多研究结果表明，蛭弧菌对沙门氏菌、志贺氏菌属、变形杆菌属、埃希氏 菌属、假单胞菌属、欧文氏菌属、弧菌属的很多菌株有很强的裂解能力。其作用 机制：蛭弧菌首先与宿主细胞激烈碰撞，没有鞭毛的一端吸附到宿主细胞表面， 菌体高速转动，并释放各种酶，使宿主细胞壁形成d q ：l ，蛭弧菌由此进入宿主细胞 内，接着蛭弧菌失去鞭毛，迅速复 6 i j d n a ，然后菌体延伸，以复分裂形成子代细胞， 生出鞭毛，最终导致宿主细胞解体，将子代蛭弧菌从宿主细胞体内释放出来，整个 裂解增殖过程在几小时内完成。 蛭弧菌在水体形成优势种群后，可以通过裂解有害的细菌，消除某些病原菌， 起到改善养殖水体生态环境的作用，防治虾蟹等水产那动物病害的发生。邵桂元 ”发现蛭弧菌对点状产气单胞菌有较强的裂解活性，并且对引起鱼类疾病的荧光 极毛杆菌、肠炎型点状产气单胞菌也有不同程度的裂解作用。杨莉”5 1 研究了蛭弧 菌对感染嗜水气单胞菌的预防效果表明：蛭弧菌对嗜水气单胞菌有较强的裂解和 净化作用，对鲤感染嗜水气单胞菌所致爆发性出血病有明显的预防作用。 蛭弧菌的使用也存在一些局限性：( 1 ) 当宿主菌低于一定浓度时蛭弧菌裂解 能力将下降，这样蛭弧菌与宿主菌形成一种动态平衡，无法达到最终清除所有病 原菌的目的。( 2 ) 由于蛭弧菌生长繁殖的速度缓慢，对宿主菌衰减作用的速度也 慢，难以用于爆发性鱼病的治疗。( 3 ) 不同的蛭弧菌有不同的宿主菌裂解谱，如何 扩大蛭弧菌的裂解范围，使得其裂解效力增强，从而成为一种具有广泛应用价值 的水质调控剂，这也是一个有待解决的问题。 固定化有益微生物技术在水产养殖中应用的初步研究 另外，还有其它微生物作为养殖水体的水质调控剂如：乳酸菌、酵母菌等。 2 5 复合微生态制剂 单一使用某一微生物都存在一些缺点，现在许多学者和生产厂家试图利用不 同菌株的不同特性，将多种微生物培育后复合为复合微生态制剂，以期发挥它们 的综合作用。 薛恒平旧3 等使用芽孢杆菌、光合细菌、蛭弧菌组成的复合菌剂按l g m 3 的剂 量投入对虾池中，结果试验池病毒病发时间较对照组晚1 0 天，产量增2 n 4 0 _ j 6 。王彦 波”1 在单独加光合细菌时降解水体氨氮的能力显著，但水体中亚硝酸盐反而升高， 单独加芽孢 杆菌可降低亚硝酸盐的含量，但水体中氨氮含量却是逐渐升高。然而，添加复合微生态制剂f 光 合细菌与芽孢杆菌组成) 的实验组对氨氮和亚硝酸盐的同化效果都是理想的，c o d 的降低幅 度大于单独使用光合细菌和芽孢杆菌。任保振 6 7 1 应e f l p s b 、硝化细菌、放线茵、蜡状芽孢杆 菌组成有益微生物菌群投放鳖池中，c o d 与多次换水的对照组保持同等水平，氨氮低于多次 换水的对照组。表明高效有益的微生物的联合使用对水中有机物、含氮废物的降解效果明显， 且能够改善鳖池底沙的环境。但由于不同微生物的生长、繁殖条件不同，同一水质条件能否 同时满足所有复合菌株发挥作用，值得进一步研究。 3 固定化微生物技术改善水质的概述 固定化微生物技术起始于1 9 5 9 年，f l j h a t t o r i 等人首次实现了大肠杆菌的固 定化，此后发展迅速。该技术最初主要用于工业发酵，2 0 世纪7 0 年代以后，由于水 污染严重，迫切需要一种高效、快速且能连续处理的废水处理技术，微生物固定化 技术从而在污水处理中得到广泛应用，效果较好，至今已经形成了较为完备的理 论和方法。 固定化微生物技术是指利用化学的或物理的手段将游离的微生物定位于限 定的空间区域，并使之成为不悬浮于水仍保持生物活性、可反复利用的方法1 。 被固定化的微生物主要是人为选定的特效降解菌的优势菌种，应满足以下3 个基 本条件：投加的菌体活性高；菌体可快速降解目标污染物；在系统中不仅 能竞争生存，而且可维持相当数量。固定化载体为微生物创造了更不易解体的 生存环境，所以，一个理想的固定化载体的选择也很重要。适合于废水处理的固定 化载体应具有以下性能：对微生物无毒，生物滞留量高；传质性能好；性 固定化有益微生物技术在水产养殖中应用的初步研究 质稳定，不易被生物降解；机械强度高，使用寿命长；固定化操作简单；对 其他生物的吸附小；价格低廉1 。 常用的载体可分为无机载体、有机高分子载体和复合载体3 大类型。无机载 体如多孔玻璃、硅藻土、活性炭、石英砂等。有机载体还可分为2 类：一类是高分 子凝胶载体，如琼脂、角叉莱胶和海藻酸钙等：另一类是有机合成高分子凝胶载体， 如聚丙烯酰胺凝胶、聚乙烯醇凝胶、光硬化树脂、聚丙烯酸凝胶等。复合载体是 由无机载体和有机载体材料结合而成，使2 类材料的性能互补，从而显示复合载 体材料的优越性”。 31 固定化微生物的制备方法 固定化微生物的制备方法多种多样，国内外没有统一的分类标准，根据对各 种方法的分析，可将其分为物理固定法和化学固定法2 大类。物理固定法主要有 包埋法、吸附法( 载体结合法) 和包络法，化学固定法包括共价结合法和交联法 ( 架桥法) 等。 3 1 1 包埋法 包埋法是将微生物菌体包埋在半透性的聚合物凝胶或膜内，小分子的底物和 产物可以自由出入，而微生物却不会漏出。包埋法可分为高分子合成包埋、离子 网络包埋及沉淀包埋，是目前研究最广泛的固定化方法。常用的包埋法固定微生 物的载体材料有天然高分子多糖类的海藻酸钙凝胶和卡拉胶、聚乙烯醇( p v a ) 、 聚丙烯酰胺( a c a m ) 等。其中，天然高分子凝胶对微生物无毒，传质阻力小，但结合 强度小：有机合成高分子凝胶强度高，影响微生物生物活性，同时传质阻力大。 3 1 2 吸附法 吸附法是利用微生物所具有的可吸附到固体物质表面或其他细胞表面的能 力，将微生物吸附在附加剂表面的方法，这是一种比较常用、非常廉价和有效的微 生物固定化方法。吸附法可分为物理吸附和离子吸附。物理吸附是使用具有高吸 附能力的物质，如硅胶、活性炭、多孔玻璃、碎石、卵石、铅炭、硅藻土、多孔 砖等吸附剂，将微生物吸附在表面使其固定化。离子吸附是利用微生物在解离状 态下离子键合作用而固定于带有相反电荷的离子交换剂上，常见的离子交换剂有 d e a e 一纤维素、c m 一纤维素等。 3 1 3 包络法 固定化有益微生物技术在水产养殖中应用的初步研究 2 0 世纪9 0 年代初期，为克服吸附法和包埋法固定微生物的缺点，又提出用包 络法固定微生物的新技术。包络法以人工合成生物相容性好的聚丙烯酸酯共聚物 基体型多孔颗粒为载体。郑邦乾等。”的研究表明，微生物既可在该多孔载体外表 面生成机械强度高的生物膜，又可在载体内孔中聚集大量的微生物，增大了微生 物的聚集密度，而且提高了生物粒子承受水力负荷的能力。 3 1 4 共价结合法 共价结合法是细胞表面上官能团和固相支持物表面的反应基团形成化学共 价键连接，从而固定微生物。该方法固定化微生物稳定性好，不易脱落，但限制了 微生物的活性，同时反应激烈，操作与控制复杂，条件苛刻。 3 1 5 交联法 交联法是通过微生物与具有2 个或2 个以上官能基团的试剂反应，使微生物 菌体相互连接成网状结构而达到固定化微生物的目的。聚集一交联固定法是使用 凝聚剂将茵体细胞形成细胞聚集体，再利用双功能或多功能交联剂与细胞表面的 活性基团发生反应，使细胞彼此交联形成稳定的立体网状结构。这样，高效菌体不 易流失，生物浓度高，而使处理效果提高。最为常见的交联剂是戊二醛。 3 2 固定化微生物技术在养殖水体中的应用 我国淡水湖泊富营养化情况日趋严重。为了对富营养化水体进行原位脱氮处 理，有人采用固定化微生物技术，将反硝化菌制成固定化小球，投加到富营养化模 拟水环境中，在无外加碳源的条件下，研究模拟水环境中含氮化合物的变化规律， 以及固定化反硝化菌利用水体中有机物、降解硝酸盐氮的情况。研究结果表明， 固定化反硝化菌能有效地去除富营养化模拟水环境中的硝酸盐氮，并部分降解水 样中的有机物。固定化反硝化菌的脱氮率受有机物种类和硝酸盐氮浓度等因素的 影响。但是长期应用时的脱氮效果以及对原水生态系统的影响有待进一步研究 。”。b a l d e r s t o n 等“”在高密度、闭合式鲑鱼养殖池中，利用固定化反硝化细菌， 有效地去除了养殖废水中的n 0 3 - - n 。 光合细菌在养殖水体中的应用较多，但是游离光合细菌流水条件下易流失， 不稳定，因此固定化光合细菌“”逐渐得到重视。郑耀通“。应用固定化光合细菌 净化养鱼水质试验，也发现固定化光合细菌可显著提高氨氮和c o d 的去除率，并能 增加溶解氧。经1 个月的鱼种饲养试验，固定化光合细菌组鱼体质量显著高于对照 固定化有益微生物技术在水产养殖中应用的初步研究 组，成活率也高于对照组。不仅鱼体质好，活泼，个体较大又整齐，而且体色鲜艳。 王立华等“5 1 在密闭鱼篓和敞开鱼篓中投放固定化光合细菌、游离光合细菌，以不 加光合细菌作对照运输鲤鱼种，结果发现，在密闭鱼篓和敞开鱼篓中，施放固定光 合细菌组在运输途中水质一直保持良好，鱼种的成活率也是最高的，到达运输地 后，鱼的状态也是最好的。固定化光合细菌在中华绒螫蟹人工育苗中也有重要的 作用1 。 h i s a s h i 等“”比较t p v a 和海藻酸2 种材料固定化光合细菌对鱼池水质净化与 反硝化的效果，结果表明固定化p v a 球比海藻酸盐固定化球的水质净化能力强。由 于硝化细菌生长缓慢( 在低温