（植物学专业论文）dna与过氧化物酶催化性质的差异.pdf

摘要 本论文分为实验报告和综述两大部分。实验部分主要是比较了 d n a 和辣根过氧化物酶催化性质的差异。首先底物经催化后的吸收峰 不同，如：以联苯胺与q 一萘酚为底物，d n a 催化产物吸收峰在4 5 0 n m ， 而过氧化物酶催化产物的吸收峰在5 0 1 n m 以联苯胺与邻苯二酚为底 物，d n a 催化后的吸收峰在5 0 3 n m ，过氧化物酶催化后的吸收峰在 6 0 3 n m 。然后对以联苯胺与a 一萘酚为底物，以h 2 0 2 为氧化剂，进行 高效液相色谱分析，分析结果表明d n a 与过氧化物酶作用后的产物 在峰面积和峰高上有不同数值：同时，不同形式的d n a 对该反应都 有催化活性，表明只要是生物来源的d n a ( 非特异性d n a ) 都具有一 定程度的催化活性。接着进行了p h 梯度实验，发现不同p h 条件下， d n a 和辣根过氧化物酶也表现不同之处。最后又以七种底物进行实 验，发现d n a 均无明显活性，而辣根过氧化物酶有不同程度的活性。 上述研究表明：d n a 具有过氧化物酶样的活性，但是又不同于一般的 蛋白质性质的酶，因为它与蛋白质性质的辣根过氧化物酶的催化性 质有明显差异。在综述部分概括了d e o x y r i b o z y m e 研究的发展过程， 并探讨了d e o x y r i b o z y m e 的理论及应用价值。 关键词：催化性质差异非特异性d n a 过氧化物酶样活性 a b s t r a c t t h i st h e s i si sm a d eo ft w o p a r t s ：t h er e p o r t sa n dt h er e v i e w i nt h e f i r s tp a r t ，t h er e s e a r c hi sm a i n l y r e p o r t e da b o u tt h ed i f f e r e n c eo fc a t a l y t i c a c t i v i t yb e t w e e nd n a a n dp o d t oc o m p a r et h ed i f f e r e n c e t h ea n t h o r s e l e c t e ds e v e r a lk i n do fs u b s t r a t e sw h i c hw e r et r e a t e dw , t l ad i f f e r e n t w a y sa n d s o m ed i f f e r e n c e sw e r ef o u n d t h ef i r s to n ew a ss u b s t r a t e s c a t a l y t i c e db yc i n a o rp o dh a dd i f f e r e n ta b s o r t i o n p e a k s u c ha sw h e n t h es u b s t r a t e sw a sb e n z i d i n e a n d 口n a p h t h o l ，t h e a b s o r t i o n p e a kw a s 4 5 0 n ma f t e r c a m l y t i c e db yd n a ，a n d 5 01n ma f t e r c a t a l y t i c e db y p o d ，i fc h a n g i n gs u b s t r a t et ob e n z i d i n ea n d p y r o c a t e c h o l , t h ea b s o r t i o n p e a k w a s5 0 3 n ma f t e rc a t a l y t i c e db vd n aa n d6 0 3 n ma f t e rc a t a l y t i c e d b yp o d t h e s e c o n dd i f f e r e n c ew a st h ed i f f e r e n tr e s u l ta f t e rh p l c ：t h e r e s u l to fh p l cf s u b s t r a t e s ：b e n z i d i n ea n da n a p h t h 0 1 ) s h o w e dt h a tt h e p r o d u c t su n d e rt h ea f f e c to f d n aa n dp o dh a dd i f i e r e n tv a l u eo nt h e p e a ka n dt h ea r e a a tt h es a m et i m e ，o nt h ec o n d i t i o no fd i f f e r e n tv a l u e o fp h ( s u b s t r a t e s ：b e n z i d i n e a n d 口n a p h t h 0 1 ) c a t a l y t i c r e a c t i o n r e v e a ld i s t i n c tr e s u l t sa sw e l l t h e1 a s t t ot h eo t h e rs e v e nk i n d so f s u b s t r a t e s ，d n ad i d n th a v ea n yc a t a l y t i ca c t i v i t y o nt h ec o n t r a s t ， p o dh a da p p a r e n ta c t i v i t yt ot h e s es u b s t r a t e s t h es t u d i e ss h o w e dt h a t d n ah a st h ep e r o x i d a s e 1 i k ea c t i v i t y b u tt h i sa c t i v i t yi su n l i k ep o d w h i c hi s p r o t e i n o n t h es e c o n d p a r t ，t h eh i s t o r y o fr e s e a r c ho n d e o x y f i b o z y m ew a sr e v i e w e da n dt h et h e o r y a n dp r a c t i c ev a l u eo f d e o x y r i b o z y m e w e r ed i s c u s s e d k e y w o r d s ：t h ed i f f e r e n c eo f c a t a l y t i ca c t i v i t y n o n - s p e c i f i cd n a p e r o x i d a s e - l i k ea c t i v i t y i l b c d n t p d a t p d c t p d g t p d t t p d n a f d n a s s d n a d s d n a q n p 1 、r i s p o d l p c t d n a h 2 0 2 h p l c 缩略语表 x6 6 3 6 9 0 空白对照 脱氧核苷三磷酸( d e o x y n u c i e o t i d et r i p h o s p h a t e ) 脱氧腺苷三磷酸( d e o x y a d e n o s i n et r i p h o s p h a t e ) 脱氧胞苷三磷酸( d e o x y c y t i d i n et r i p h o s p h a t e ) 脱氧鸟苷三磷酸( d e o x y g u a n o s i n et r i p h o s p h a t e ) 脱氧胸苷三磷酸( d e o x y t h y m i d i n et r i p h o s p h a t e ) 脱氧核糖核酸( d e o x y 曲o n u c l e i c a c i d ) 复性d n a ( r e n a t u r e dd n a ) 单链d n a ( s i n g l e s t r a n dd n a ) 双链d n a ( d o u b l e s t r a n dd n a ) a 一萘酚( a - n a p h t h 0 1 ) 三羟甲基氨基甲烷( t d h y d r o x y m e t h y la m i n o m e m e t h a n e ) 辣根过氧化物酶( p e r o x i d a s e f r o mh o r s er a d i s h ) 联苯胺( b e n z i d i n e ) 小牛胸腺d n a ( d n a f r o mc a l f t h y m u s ) 过氧化氢( h y d r o g e np e r o x i d e ) 高效液相色谱( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ) 刖旨 近年来，先后有报道给小鼠饲喂d n a 后，血液中过氧化物酶活 性升高，因而认为d n a 有抗衰老作用”1 。我们考虑在体外( 加v i t r o ) 检测d n a 是否具有过氧化物酶活性的问题。 、 将实验转移至体外进行，是基于前人有关的报道。1 9 9 5 年，王 身立等发现d n a 具有酯酶活性”1 ，并于1 9 9 8 年提出非特异性d n a 催化活性的概念。”。2 0 0 0 年，余华发现非特异性d n a 具有细胞色素 氧化酶活性”1 。2 0 0 1 年邓小云发现非特异性d n a 具有催化n a h s 0 3 还原硝基四氮唑蓝( n b t ) 的活性”。因而，在试管中探索d n a 与 过氧化物酶的关系将是可行的。 关于d n a 具有酶活性的报道，最早见于1 9 9 4 年b r e a k e r 和 j o y c e 发现一个人工合成的d n a 分子，能催化一个特定的核糖核苷 酸与脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键的水解1 ，并将具有酶活性的 d n a 称为d e o x y r i b o z y m e ( 酶性d n a ) 。至目前为止，国外发现的酶 性d n a 均为通过体外选择作用获得的人工合成的特异性d n a ，迄 今未见国外关于生物来源的酶性d n a 报道( 见本论文附录) 。而目 前国内报道的酶性d n a 均为生物来源的d n a ，且为非特异性d n a ， 即它们的催化作用不需要特定的脱氧核苷酸排列顺序。 本实验发现，d n a 利用h 2 0 2 催化底物氧化的性质与过氧化物 酶具有某些差异。例如：以联苯胺与萘酚为底物进行 ，l c 分析 发现，d n a 与过氧化物酶各自有自己的催化产物及共同的催化产 物；以联苯胺与邻苯二酚为底物反应后用自动分光光度计进行全波 段扫描，发现产物吸收峰有差异，d n a 催化产物吸收峰在5 0 3 n m ， 而过氧化物酶催化产物吸收峰在6 0 3 n m ；p h 值对d n a 与过氧化物酶 的影响也有明显差异：在以联苯胺与邻苯二酚为底物反应中，某些 p h 值条件下( p h 值为4 、5 、8 、9 时) ，d n a 对反应有抑制作用。 某些p 1 4 条件下( p h 值为6 、7 时) ，d n a 对反应有催化显色作用。 同一反应底物中，过氧化物酶则都有显著的催化显色作用；另外， 对某些底物：如联苯胺、愈创木酚，d n a 没有活性，而过氧化物酶 有活性。 上述差异表明，d n a 利用h 2 0 2 对底物氧化的催化作用，并非 其中混有蛋白质性质的过氧化物酶。此外，由于d n a 与过氧化物酶 催化性质的差异，提示d n a 与过氧化物酶的催化机理存在差异，有 可能为酶学研究提供新的课题，开拓新的领域。 1 、以联苯胺与q 一萘酚为底物。 1 1 紫外可见分光光度计分析： 1 1 1 试剂 ( 1 ) 乙腈t r i s 缓冲液：乙腈( a c g t o n i t f i l e ) 中国上海陆忠化 学试剂厂产品。t f i s ( 三羟甲基氨基甲烷) 中国新兴工业化工试剂研 究所产品。调p h 值至7 o 7 5 。 ( 2 ) 联苯胺( b e n z i d i n e ，l p ) ：上海崇明县裕安西试剂厂产品， 分析纯。o 5 9 联苯胺固体溶于5 0 m l4 8 乙腈中，浓度1 。 ( 3 ) q 萘酚( a n a p h t h o l ，- n p ) ：上海亭新化工厂产品，o 5 9 c 1 萘酚固体溶于5 0 m l4 8 乙腈中，浓度1 。 ( 4 ) 过氧化氢( h y d r o g e np e r o x i d e ，h 2 0 2 ) 广东汕头西陇化工 厂产品，分析纯。浓度3 0 ，用d d i - h o 稀释1 0 0 倍，浓度为o 3 。 ( 5 ) 小牛胸腺d n a ( d n a f r o mc a l f t h y m u s ，c t d n a ) ：上 海市牛奶公司综合厂产品。l m gc t d n a 用l m l 0 0 0 5 m o y ln a c l 液 溶解，配成母液，o 4 冰箱中保存，浓度为l m g m 1 ( 6 ) 辣根过氧化物酶( p e r o x i d a s e f r o mh o r s er a d i s h ，p o d ) ： 中国科学院上海生物化学研究所产品，l m g 辣根过氧化物酶溶于l m l d d i - d o 中，浓度1m g m 1 1 1 2 仪器 h i t a c h i 2 0 0 2 型紫外可见分光光度计 1 1 3 方法 取3 支试管按表1 1 加样，加样完毕，轻轻摇匀，置于3 7 。c 恒温箱 中保温6 小时后取出用分光光度计进行2 0 0 - - 9 0 0 n m 扫描分析 表1 1l p 与q n p 的被催化氧化反应各处理管的 管号缓冲液l p a - n pi - h 0 2d n ap o d a2 7o 10 10 1 b2 60 10 10 10 1 c 2 60 10 10 1 ，0 1 1 1 4 结果与讨论 扫描结果见图1 i 、图i 2 和图1 3 。图1 - i 为a 管( 空白对照) 扫描、图1 2 为b 管( 加d n a 管) 扫描、图1 - 3 为c 管( 加过氧化 物酶管) 扫描。 3 0 0 0 一o 1 0 。 n m 图1 1 底物l p 和a n p 自发氧化后的吸收曲线 ( a 管：空白对照) 3 0 0 0 a b $ - 0 i 0 0 n f n 图1 2 底物l p 和q - n p 被d n a 催化氧化后的吸收曲线 ( b 管：加d n a ) 3 0 0 0 a e s - 0 i 0 0 m 图i - 3 底物l p 和q n p 被p o d ( 过氧化物酶) 催化 氧化后的吸收曲线( c 管：加过氧化物酶) 从图1 2 可见，反应底物联苯胺和q 萘酚在d n a 催化后在 4 5 0 r i m 处有一个吸收峰。从图1 3 可见，反应底物联苯胺和q 萘酚 在p o d ( 过氧化物酶) 催化后在5 0 1 r i m 处有一个吸收峰。 由此可见，反应底物联苯胺和a 一萘酚被d n a 和过氧化物酶 催化后的产物吸收峰有所不同，提示d n a 与过氧化物酶的催化产物 有差异。 1 2 高效液相色谱法( h p l 0 ) 分析： 1 2 1 试剂 同1 1 1 1 2 2 仪器 高效液相色谱系统为：w a t e r sd e l t a6 0 0 型w a t e r s2 4 8 7 紫外 检测器，杭州英谱公司色谱工作站，分离柱为3 0 0 n m x 4 0 n my w g c 1 8 i oum 的反向分析柱 1 2 3 方法 取3 只试管按表1 - 1 加样，加样完毕，轻轻摇匀，置于3 7 c 恒温箱 中保温6 小时后取出进行 珏况c 分析，h p l c 条件为：洗脱液a ：甲醇， 洗脱液b ：z k a ：b ( v v ) = 8 5 ：15 等梯度洗脱，滤速为0 9 m l m i n 1 2 4 结果与讨论 h p l c 结果见下图1 一仁图1 - 6 图1 4h p l c 分析结果( a 管：空白对照) 图1 5h p l c 分析结果( b 管：加d n a ) 图1 - 6h p l c 分析结果 ( c 管：加过氧化物酶) 三图有四组时间对比见表1 - 2 表1 2h p l c 分析结果比较 组别管号保留时间峰高 峰面积 a5 7 2 31 2 5 7 2 2 1 4 8 7 9 一b5 8 0 71 1 6 1 31 9 6 1 7 i c5 6 9 8 3 1 1 5 64 9 5 6 1 2 a3 7 0 72 3 2 9 4 1 9 1 5 ： 二b3 6 4 8 1 0 0 71 3 3 2 0 r c3 7 0 7 1 1 1 81 3 2 3 8 a2 9 6 54 6 72 5 1 3 三b2 9 4 87 0 7 01 2 0 6 4 8 c2 9 3 22 9 7 62 9 8 3 3 a2 6 7 37 5 94 9 5 4 四b2 7 6 57 9 5 19 0 8 1 5 c2 6 9 071 0 36 7 4 5 2 由四组时间对比，a 、b 、c 三管对应的的峰面积和峰高的不同 表明： 组一为酶催化产物，d n a 对此产物的形成有弱抑制作用 组二为反应物减少 组三为d n a 催化产物，此时酶催化作用小于d n a 组四为d n a 与酶共同催化产物，此时d n a 与酶均有催化作用 h p l c 结果分析知d n a 与过氧化物酶对底物联苯胺与a 萘酚 均有催化作用。但是催化作用的性质有差异，d n a 与过氧化物酶各自 催化产生不同的产物并有共同的催化产物 1 3 常见金属离子对d n a 催化活性的影响 1 3 1 试剂 ( 1 h 5 ) 同1 1 1 ( 6 ) c a c l z 母液：分析纯，分子量l1 0 9 9 。湖南望城县坪塘化学 试剂厂，o 0 6 6 9 溶于d d h 2 0 ，定容至3 m l ，c a 2 + 浓度为5 r a m ( 7 ) m g c l 2 母液：优质纯，分子式为m g c l 2 6 1 4 _ 2 0 上海试剂一 厂，0 + 12 2 9 溶于d d i - h o 定容至3 m l ，m 9 2 + 浓度为5 m m ( 8 ) k c l 母液：分子量为7 4 5 5 ，中国沈阳试剂一厂，0 0 4 5 9 溶 于d d i - 1 2 0 定容至3 m l ，k + 浓度为5 m m 、 ( 9 ) n a c | 母液：分子量为5 8 4 4 ，长沙市国营延风化学试剂厂， o 0 3 5g 溶于d d h 2 0 定容至3 m l n a + 浓度为5 m m ( 1 0 ) l i 2 s 0 4 母液：l i 2 s 0 4 1 - 1 2 0 分子量为1 2 7 9 8 ，江苏无锡市民 丰试剂厂o 3 8 4 9l i 2 s 0 4 i - 1 2 0 ，溶于d d i - h o 定容至3 m l ，l i + 浓度为 5 m m ( 11 ) l i c i 母液：化学纯，分子量为4 2 3 9 。上海化学试剂总厂所 属上海试剂二厂，0 1 2 8 9 溶于d d i 也o 定容至3 m l ，l i + 浓度为5 m m ( 1 2 ) z n s 0 4 母液：湖南望城县坪塘化学试剂厂产品0 1 7 3 9 溶于 d d t - 1 2 0 定容至3 m l ，z n 2 + 浓度为5 m m ( 1 3 ) f e s 0 4 母液：广东台山化学试剂厂产品o 1 3 7 9 溶于d d h 2 0 定容至3 m l ，f e 2 + 浓度为5 m m ( 1 4 ) 7 , 酸铅母液：沈阳试剂二厂产品0 2 2 7 9 溶于d d h 2 0 定容至 3 m l ，p b2 + 浓度为5 m m 1 3 2 方法 总反应体积为3 m l ，试管中各底物加样o 1 m l ，离子溶液加样 7 51 t l ( 其中l i c l 母液l i 2 s 0 4 母液加1 5 g t1 ) 设不加d n a 管对 照。3 7 恒温6 小时后取出，测o d 4 5 0 n m 1 3 3 结果与讨论： 反应结果见表1 3 表1 3 金属离子对d n a 催化反应的影响 不加d n a加d n a 对照 0 6 6 50 8 8 8 k +0 3 7 0o 7 3 1 n a +0 3 4 60 6 9 7 c a 2 +0 3 9 70 4 8 7 、 m 9 2 + 0 6 0 70 7 1 4 l i 2 s 0 40 4 7 10 9 6 3 l i c l0 4 1 80 9 1 8 z n 2 +沉淀沉淀 f e 2 +沉淀沉淀 p b 2 +沉淀沉淀 表1 3 所示结果可见，在反应介质乙腈中，p h 值为7 o 一7 5 时 d n a 有明显的催化活性，无论是否存在金属离子，加d n a 组的 o d 4 5 0 值均明显高于不加d n a 组。加d n a 时，k 寸、n a + 、m 9 2 + 、 c a 2 + 等离子抑制d n a 的催化活性，但l i + 贝i j 促进d n a 的催化活性。 不加d n a 时，l i + 抑制联苯胺与q 一萘酚的氧化显色，可见l i + 本身 并无催化作用，仅能促进d n a 的催化显色作用。l i + 有很大的水化 壳层，可破坏d n a 周围的液晶态有序水结构 8 ，这可能与d n a 的催 化活性有关。 1 4 不同形式d n a 和小分子脱氧核苷酸对反应的影响 1 4 1 不同形式d n a 对反应的影响。 1 4 1 1 试剂 ( 1 ) 一( 5 ) 同1 1 1 ( 6 ) 单链d n a ( s i n g l e s t r a n dd n a ，s s d n a ) 取1 0 0 m ld s d n a 放入0 5 m le p p e n d o r f 管中，沸水浴3 0 分钟，然后迅速置于冰水 中冷却，同时做一个对照加样实验。沸水浴后让其缓慢冷却复性， 制各复性d n a ( r e n a t u r e dd n a ，r d n a ) ( 7 ) 质粒d n a 由分子遗传学实验室吴秀山老师提供。 p c a g g 55 2 k b 浓度1 1 2 ug m l ，纯度o d 2 6 0 o d 2 8 0 = 1 9 3 l 。 1 4 1 2 方法 同1 1 3 1 4 1 3 结果与讨论。 结果比较见下表1 4 ( 1 ) 质粒d n a ：质粒d n a 对反应的催化作用很显著，其吸 收值为0 4 8 4 。可见只要是生物来源的d n a ( 非特异性d n a ) 都具 有催化活性，只不过不同来源的d n a 其催化活性的强弱有所差异。 管 abcde 号 质粒 b cd s d n as s d n ar 【) n a d n a 10 3 2 90 3 6 80 3 6 90 3 9 00 4 9 0 20 3 2 60 3 4 70 3 4 00 3 7 80 4 7 8 皿 均 0 3 2 70 3 5 70 3 5 40 3 8 40 。4 8 4 注：b c 为空白对照，d s d n a 为双链d n a ，s s d n a 为单链d n a ， r d n a 为复性d n a ( 2 ) 单链d n a 与复性d n a ：单链d n a 的催化产物吸收值为 o 3 5 4 ，复性d n a 的催化产物吸收值为0 3 8 4 ，空白对照管为0 3 2 7 ， 可见d n a 无论是单链还是双链，均有催化活性。同时单链d n a 与 双链d n a 相比，其促进联苯胺与q 一萘酚反应的能力降低，这个差 异表明d n a 的双螺旋结构对d n a 促进联苯胺与d 萘酚反应有帮 助，可能与底物和d n a 的接近以及中间产物的形成过程有关。 1 4 2 小分子脱氧核苷酸对反应的影晌。 1 4 2 1 试剂 ( 1 ) 一( 5 ) 同1 1 1 ( 6 ) 脱氧核苷三磷酸( d e o x y n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e ，d n t p ) ：脱氧 腺苷三磷酸( d a t p ) 、脱氧鸟苷三磷酸( d g t p ) 、脱氧胞苷三磷酸 ( d c t p ) 、脱氧胸苷三磷酸( d t r p ) 为华美生物工程公司产品浓度1 0 um 1 4 2 2方法 同1 1 3 1 4 2 3结果与讨论 结果比较见下表1 5 管号 abcde b cd a 册d g l 甲d c t pd m l0 3 2 00 3 5 00 3 3 80 3 2 70 3 3 l 20 3 2 40 3 4 60 3 4 l0 3 3 00 3 3 6 平均 0 3 2 20 3 4 80 3 4 00 3 2 90 3 3 4 空白对照管吸收值为0 3 2 2 而四种单核营酸催化产物的吸收值 比空白对照管都要高，其中脱氧腺苷三磷酸( d a v p ) 催化产物的吸收 值为0 3 4 8 ，脱氧鸟苷三磷酸( d g t p ) 催化产物的吸收值为0 3 4 0 ，脱 氧胞苷三磷酸( d c t p ) 催化产物的吸收值为0 3 2 9 ，脱氧胸苷三磷酸 ( d a m p ) 催化产物的吸收值为o 3 3 4 可见单核苷酸都具有一定的催化 能力，其中d a t p 的催化能力最强这提示d n a 对此反应的作用可能 是由几个相关基团共同作用的结果其中脱氧腺昔酸所起的作用可 能最大。 2 、以联苯胺与邻苯二酚为底物。 2 1 紫外可见分光光度计分析： 2 1 1 试剂 ( 1 ) 一( 2 ) 同1 1 1 ( 3 ) 邻苯二酚( p y r o c a t e c h 0 1 ) ：广东台山化工厂产品，o 5 9 邻苯二 酚溶于5 0 m l4 8 乙腈中，浓度为1 。 ( 4 ) 一( 6 ) 同1 1 1 2 , 1 2 方法 取三只试管，按下表2 1 进行加样，加样完毕，将试管轻轻摇 匀置于3 7 。c 恒温箱内保温6 h 后取出，观察各管颜色变化，并在 h i t a c h i - - 2 0 0 2 型紫外可见分光光度计上进行2 0 0 - - - 9 0 0 n m 扫描。 表2 - 1 联苯胺与邻苯二酚为底物时各管的加样方式( 单位：m 1 ) 管号缓冲液联苯胺邻苯二酚l - r l 2 0 2d n ap o d l2 70 10 10 1 22 60 10 1o 10 1， 32 60 10 10 10 1 注：l 号管为空白对照。2 号管为加d n a ，3 号管为加过氧化物酶( p o d ) 2 1 3 结果与讨论： 反应6 小时后，肉眼观察l 、2 号管均显浅红色。2 号管颜色略 深。3 号管为红棕色。 扫描结果见图2 1 一图2 3 。图2 1 为1 号管( 空白对照) 扫描 结果，扫描2 2 为2 号管( 加d n a ) 扫描结果，图2 3 为3 号管( 加 过氧化物酶) 扫描结果。 3 o 。o o 1 0 0 m 翔盟一一一蛐o 一一 6 0 08 0 0 3 o o o - 0 1 0 0 n m 图2 - 1 联苯胺与邻苯二酚自发氧化后扫描结果( 空白对照) 图2 - 2联苯胺与邻苯二酚被d n a 催化氧化后扫描结果( 加d n a ) 1 4 3 q 0 0 ：一 一a b s - 0 i 0 0 n m 图2 3联苯胺与邻苯二酚被过氧化物酶催化氧化后扫描结果( 加过氧化物酶) 1 、2 管吸收曲线在5 0 3 n m 处有一波峰，在此处1 号管的吸收值 为o d 5 0 3 n m = 0 2 7 8 ；2 号管的吸收值o d 5 0 3 n m = 0 3 8 4 ；3 号管吸收曲 线在6 0 3 n m 处有一吸收峰，此处o d 6 0 3 n m = 2 1 6 8 。 可见，d n a 与过氧化物酶对此反应的催化产物有所不同。d n a 催化后的吸收曲线的吸收峰在5 0 3 n m ，而过氧化物酶催化后的吸收曲 线的吸收峰在6 0 3 r i m 2 2p l - i 值对该反应的影响。 2 2 1 试剂 ( 1 ) 一( 6 ) 同1 1 1 2 2 2 方法 将乙腈与t n s 液配成p h 梯度p h 和呻h 9 ，其他方法按2 1 2 ，6 小时后测o d 5 0 3 n m 2 2 3 结果与讨论 结果见下表2 - 2 p h 值管号b cd n a p o d 10 3 9 60 0 9 9 1 8 4 2 42 0 3 7 00 0 8 8i 8 7 0 平均o 3 8 80 0 9 31 8 5 6 10 1 2 0 0 1 2 01 7 0 0 520 1 2 9 0 1 2 2 1 7 0 2 平均o 1 2 4o 1 2 11 7 0 1 10 4 3 3 0 5 0 51 9 7 7 52o 4 4 60 4 8 3 1 9 8 0 平均0 4 3 90 4 9 41 9 7 8 10 4 0 10 4 6 6 1 4 3 2 720 3 8 00 4 7 3 1 4 0 3 平均0 3 9 00 4 6 91 4 1 7 l0 7 6 20 7 3 21 2 3 5 820 7 5 00 7 2 01 2 3 6 平均o 7 5 6 o 7 2 61 2 3 5 l0 7 1 00 7 0 61 0 9 7 920 7 1 20 7 0 21 1 0 2 平均 o 7 1 10 7 0 41 1 0 0 n m ) ( 1 ) p h 值对过氧化物酶和d n a 的催化作用均有影响。 ( 2 ) p h 值的不同，对d n a 和过氧化物酶的催化作用的影响有 差别：p h 4 _ 呻h 9 时，过氧化物酶均有显著催化作用；而d n a 在p h 值为4 、5 、8 、9 时反而有抑制作用，p h 值为6 、7 时，d n a 也有 催化显色的作用。 ( 3 ) 最适p h 值也有差别。( 见图2 4 和图2 5 和表2 3 表2 4 ) 对于过氧化物酶的催化作用，最适p h 值为5 和6 ，此时p o d 的吸 收值一b c 的吸收值( 用4 p - - b 表示) 分n = i 5 7 7 和1 5 3 4 。高于其 他p h 值条件下的, d p b ；而d n a 作用下，最适p h 值为7 。此时 d n a 的吸收值一b c 的吸收值( 用i d b 表示) = 0 0 7 9 ，高于其他 p h 值条件下的z s d - - b 。 o t , 一荫7 j 口 1 -_ 气 ，0 口t 5 - k、 午5 s 1 8 p h 图2 - 4p h 值与刀p b 的关系 ( 注：么p b 表示5 0 3 n m 时p o d 的吸收值- - b e 的吸收值) 表2 - 3 p h 梯度下么p b p h 值 456 789 彳p b 1 4 6 8 1 5 7 71 5 3 4 1 0 2 70 4 7 90 3 8 9 注：么p b 表示5 0 3 n m 时p o d 的吸收值- - b c 的吸收值 1 7 4 一够 1 d g ) “ o 0 6 d o 手， o - o z - , 0 , 0 2 ： y 6 7 y - q o 牛 图2 - 5 p h 值与d d b 的关系 注：么d b 表示5 0 3 n m 时d n a 的吸收值- - b c 的吸收值 p h 值 4 56789 么d b0 2 9 50 0 0 30 d 2 70 0 7 90 0 3 00 0 0 7 注：么d b 表示5 0 3 n m 时p o d 的吸收值- - b c 的吸收值 3 1 、试剂 3 、其他底物 ( 1 ) ( 2 ) 同1 1 1 ( 3 ) 1 3 - 萘酚( 1 3 - n a p h t h o l ，1 3 - n p ) ：湖南娄底湘中地质实验研究所 产品，分析纯。 ( 4 ) ( 6 ) 同1 1 1 ( 7 ) 愈创木酚( o m e t h o x y p h e n o i ，邻甲氧基苯酚) 天津市化学试剂 一厂产品，纯度 9 8 。 ( 8 ) 苯酚( p h e n 0 1 ) 湖南邵阳市化学试剂厂产品，分析纯。 ( 9 ) 8 一羟基喹啉( 8 一h y d r o z y q u i n o l i n e ) ：北京化工厂产品，分析纯。 ( 1 0 ) 对羟基苯甲酸丙酯( h o c 6 h 4 c o o c 3 h 8 ) ：沈阳新西试剂厂 产品。 j ( 1 1 ) 3 、5 - 二羟基甲苯( 3 5 d i h y d r o x y t o l u e n e ) 中国上海试剂一 厂产品。 3 2 方法 分别以联苯胺、愈创木酚、联苯胺和苯酚、联苯胺和j 3 萘酚、 联苯胺和对羟基苯甲酸丙酯、联苯胺和8 羟基喹啉、联苯胺和愈创 木酚、联苯胺和3 、5 - 二羟基甲苯作为底物，各组以p h 值7 o 一7 5 乙腈t r i s 缓冲液、h 2 0 2 作为空白对照( a ) ，以辣根过氧化物酶作为 参照管( c ) 与加d n a 管( b ) 作比较，按下表3 1 加样，3 7 恒 温6 小时后，在h i t a c h i 2 0 0 2 型紫外可见分光光度计上对各管进行 2 0 嘲o o n m 扫描。 表3 1 其他底物条件下各处理管的加样方式( 单位：m 1 ) 管号缓冲液 h 2 0 2 底物 d n a p o d a2 7 ( 2 8 )o 10 2 ( 0 1 )| ， b2 6 ( 2 7 )o 10 2 ( 0 1 )o 1 | c2 6 ( 2 7 )0 10 2 ( o 1 ) lo 1 注：括号内数据为单独以联苯胺或愈创木酚为底物时的加样量 3 3 。结果与讨论 扫描结果比较见图3 1 - 1 一图3 - 7 2 3 0 0 0 0 1 0 0 m l2 图3 1 - 1 联苯胺自发氧化后产物扫描结果 图3 - 1 - 2 联苯胺被d n a 催化氧化后产物扫描结果 图3 1 3 联苯胺被过氧化物酶催化氧化后产物扫描结果 图3 1 1 为联苯胺自发氧化后产物扫描图3 - 1 2 为联苯胺被 d n a 催化氧化后产物扫描图3 - 1 7 3 为联苯胺被过氧化物酶催化氧 化后产物扫描 3 0 0 旷 a b s 一0 1 0 。 n 【l 图3 2 1愈创木酚自发氧化后产物扫描结果 一0 1 0 0 n m 图3 - 2 - 2 愈创木酚被d n a 催化氧化后产物扫描结果 图3 - 2 - 3 愈创木酚被过氧化物酶催化氧化后产物扫描结果 图3 - 2 1 为愈创木酚自发氧化后产物扫描，图3 2 2 为愈刨木酚被 d n a 催化氧化后产物扫描图3 2 3 为愈创木酚被过氧化物酶催化 氧化后产物扫描 3 0 0 0 - 0 1 0 0 n m 图3 - 3 一i b 一萘酚与联苯胺被d n a 催化氧化后产物扫描结果 图3 - 3 - 2 b - 萘酚与联苯胺被过氧化物酶催化氧化后产物扫描结果 图5 - 3 一l 为j 3 一萘酚与联苯胺被d n a 催化氧化后产物扫描图 3 - 3 2 为j 3 - 萘酚与联苯胺被过氧化物酶催化氧化后产物扫描 3 0 0 0 0 1 。 i - l - l l2 图3 - 4 - 1 苯酚与联苯胺被d n a 催化氧化后产物扫描结果 图3 - 4 2 苯酚与联苯胺被过氧化物酶催化氧化后产物扫描结果 图3 - 4 l 为苯酚与联苯胺被d n a 催化氧化后产物扫描图3 4 2 为苯酚与联苯胺被过氧化物酶催化氧化后产物扫描 一o 1 。 f i t i 2 0 04 0 0 ，8 0 08 0 0 图3 - 5 1 对羟基苯甲酸丙酯与唳辜藤被b n a 催化氧化后产物扫描结果 图3 - 5 2 对羟基苯甲酸丙酯与联苯胺被过氧化物酶 催化氧化后产物扫描结果 图3 - 5 - 1 为对羟基苯甲酸丙酯与联苯胺被d n a 催化氧化后产物 扫描，图3 - 5 2 为对羟基苯甲酸丙酯与联苯胺被过氧化物酶催化氧化 后产物扫描 3 0 0 0 一o ： 1 1 1 1 。 ：o 1 0 0 n m 图3 - 6 一l3 、5 二羟基甲苯与联苯胺被d n a 催化氧化后产物扫描结果 图3 - 6 23 、5 二羟基甲苯与联苯胺被过氧化物酶 催化氧化后产物扫描结果 图3 - 6 1 为3 、5 二羟基甲苯与联苯胺被d n a 催化氧化后产物 3 0 0 0 扫描图3 - 6 - 2 为3 、5 - 二羟基甲苯与联苯胺被过氧化物酶僵化氧化 后产物扫描 一o 1 0 0 n m 3 0 0 0 - 0 i 0 0 n m 图3 7 18 - 羟基喹啉与联苯胺被d n a 催化氧化后产物扫描结果 图3 7 2 8 - 羟基喹啉与联苯胺被过氧化物酶 催化氧化后产物扫描结果 图3 7 - l 为8 一羟基喹啉与联苯胺被d n a 催化氧化后产物扫描 图3 7 2 为8 一羟基喹啉与联苯胺被过氧化物酶催化氧化后产物扫描 由比较可见，d n a 对以上底物均无明显催化活性，而辣根过氧 化物酶则有不同程度的产物吸收峰，具有一定的催化活性。 综述 酶性d n a ( d e o x y r ib o z y m e ) 研究进展 1 、d e o x y r i b o z y m e 的提出： 人们对酶的化学本质的认识经过了三次飞跃；1 9 2 6 年美国化学家 j b s u m m e r 结晶了第一个酶( 脲酶) ，证明酶的化学本质为蛋岛质。这是人类对 酶的化学本质认识的第一次飞跃。二十年后( 1 9 4 6 年) j b s u m m e r 荣获诺贝尔 化学奖。2 0 世纪六、七十年代，一些对生命起源问题兴趣颇浓的科学家，推测 生命发展的早期核酸可能也具有酶的活性，如w o e s e ( 1 9 6 7 ) c r i c k ( 1 9 6 8 ) o r g e l ( 1 9 6 8 ) m i l l e r ( 1 9 7 4 ) k l u g ( 1 9 7 4 ) 等。8 0 年代初，c e t l l 和a l t m a n 等人的杰 出工作证实了上述猜测。1 9 8 1 年c c c h 等发现原生动物四膜虫2 6 s r r n a 晶体具 有自我剪切功能【9 j ，并于1 9 8 6 年证明其内含l 1 9 i v s 具有多种催化功能。1 9 8 3 年a l t m a n 等发现大肠杆菌r n a s e p 的酶活性在于它的核酸组分m l r n a ，而该 酶的蛋白质部分c 5 蛋白无酶的活性【1 “。r n a 也具有酶活性，这是科学史上对 酶的化学本质认识的第二次飞跃。t r c e c h 和s a l t m a n 二人因此共同荣获 1 9 8 9 年的诺贝尔化学奖。1 9 9 4 年，美国加州大学l a j o l l a 分校的j o y c e 和b r e a k e r 利用体外选择技术得到了一个3 5 b p 的单链多聚脱氧核糖核苷酸，在p b ”存在 条件下，该d n a 能水解特定位置上插入了腺苷酸( r a ) 的d n a ，即水解r a - g 之间的磷酸二酯键【刀，此发现进一步提示了d n a 也具有酶的活性，是科学史上 对酶的化学本质认识的第三次飞跃。 鉴于具有酶活性的r n a 被称为d b o z y m e ，j o y c c 和b r e a k e r 在他们的论文的 讨论部分首次提出了d e o x y r i b o z y m e 术语。1 7 2 、d e o x y r i b o z y m e 研究的发展 自从1 9 9 4 年d e o x y r i b o z y m e 的概念出现以来，引起了科学晃的普通关注。 1 9 9 5 年u s m a n 等人【l l 】化学合成了一个由1 4 个脱氧核苷酸组成的单链d n a 片 段，它具有类似r i b o z y m e 的锤头结构，能够较弱地水解r n a 磷酸二酯键。同 年c u e n o u n d 屹】从许多随机序列池中筛选到一些具有2 个保守序列的