（分析化学专业论文）非水毛细管电泳基础与应用研究.pdf

郑州大学硕士学位论文 中文摘要 毛细管电泳是近二十年来迅速发展起来的一种微分离分析方法，并被认为是2 0 世纪 8 0 年代这一领域中最有影响的分支学科之一，是分离学科中继高效液相色谱( h p l c ) 之后的又一重大进展。但在传统的毛细管电泳方法中，大多数在水性的溶剂中进行的， 这就要求被分析物具有良好的水溶性，即分析物有一定的亲水性。为了解决强疏水性样 品在毛细管电泳中的分离分析问题，1 9 8 4 年w i l b m h e l 等人首次提出采用非水毛细管电 泳( n a c e ) 方法。本文对非水毛细管电泳技术的基础应用进行了以下三方面的研究： 1 通过对电解质体系、非水介质、缓冲溶液p h 值等电泳条件进行系统的考察，建 立了简单、快速、准确、重现性好、成本低的分离分析核菅类( 单磷酸腺苷) 的非水毛 细管电泳分离分析方法，在此方法中不加表面活性剂就能成功的分离三种单磷酸腺苷。 并用此方法分别对6 种n - 磷酰化氨基酸和腺苷反应液中的产物a m p 进行了跟踪测定。 2 基于正交实验设计，非水毛细管电泳中非水介质、电解质、缓冲溶液的表观d h ( p h + ) 以及分离电压等影响分离因素被优化，实现了三种酸性除草剂快速、有效、准 确的非水毛细管电泳的分离与测定，并成功对3 0 0 个实际烟草样品中三种除草荆残留进 行了测定和评价。 3 以不同内径的毛细管，在同一的电泳条件下对碱金属( l i + 、n a 上、k + 、r b + 、 c s + ) 、碱土金属( m 9 2 十、c a 2 + 、b a 2 + 、s r 2 t ) 和n h 4 + 等1 0 种阳离子用间接紫外法进 行了n a c e 分离研究。缓冲溶液体系中，甲醇为非水溶剂，乙酸为配位调节剂，缓冲溶 液中含有2 0 m m o j l 的4 一甲基苯胺( m b a ) ，其p h 值通过乙酸的加入量来调节。选择m b a 做为同电荷离子，因为它的p k a 值比眯唑的大，高的p k a 值易于缓冲溶液体系的调节， 也有利于电渗流和离子电泳淌度的调控，并获得最优化的分离。通过实验，对碱金属、碱 土金属以及铵离子的非水毛细管电泳分离的机理进行了讨论。 关键词：非水毛细管电泳，非水介质，正交实验设计，腺苷单磷酸，除草剂，碱金属碱 土金属，铵离子，分离机理 鄂州太学硕士学位论文 a b s t r a c t c a p i l l a r ye l e c n d p h o r e s i s ( c e ) i san e ws 印a r a t i o nt e c h n i q u e ，w h i c hi sc o l l s i d e r e d 鹪o n eo f m e p o w e m l la n a l ”i c a lc h e m i s n yb r 锄c h e s ，a n da l s oa ni n l p o n a l l ti m p r o v e m e n to f t l l es 印a r a t i o n s c i e n c e sm e rh i 曲p e 响n n 姐c el i 叫dc h r o 珂a t o g r a p h yi nm ee a r l y1 9 8 0 s ht r a d i t i o 砌c e ， t l l es e p 删i o nw a sc a r r i e do u tu i l d e rt h ea q u e o u sm e d i u m ，a n dm a i l l l yu s e df o rt h ea n a l y s i so f m ew a t e r - s o l u a b l es u b s t a n c e s i no r d e rt oa s s a yt l l el l y d r o p h o b i cs u b g t a e s ，n o n a q u e o u s c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r c s i s a c e ) m e t h o dh a sb e e nb r o u g h to u t 锄d 谢d e l yd e v e l o p e d6 ” r e c e n ty e a r s i nt l l i sd i s s e r t 砒i o n ，t h r e ea s p e c t so nm es t i l d ya 1 1 da p p l i c 砒i o no f n a c em e m o d h a s b e e n c a r r i e do u t 1 an o n a q u e o l l s c a p i l l a r y m e t l l o dw 嬲s e t u p t o s 印a r a t e t h r e ea d e n o s i i l e m o n o p h o s p h a _ t c sa n df o u r 叫c l e o s i d e s t h ei n n u e n c i n gf a c t o r so nt h es p a r a t i o n ，s u c ha st l l e n m n i n ge l e c t m l ”e ，o r g a l l i cm e d i u ma t l db u 疏r sp h ，h a v eb e e no p t i m i z e da i l da c h i e v e d w i m2 0 0m m o l lt r i s 2 0 0m i n o l lh 3 8 0 3 ，c h 3 c n ( 1 ：2 ：3 ，v ，“v ) a tp h + 1 0 oa st h e d e c t r o p h o r c s i ss o l u t i o n ，2 5k va s 也es 印a r a t i o nv o l t a g ea n d2 6 0n ma s 恤d e t e c t i o n w a v e l e n g n l ，a d e n o s i n cm o n o p h o s p h a t e sa i l dn u c l e o s i d e sh a v eb e e nb a s e l i n er e s o l v e df 如m e a c ho t h e r 诚m2 2m 证t h em e t h o di ss i m p k ，f 缸，a c c u r a t ea n dr e p r o d u c i b l e i th a sb e e n s u c c e s s 觚l ye m p l o y e dt oa s s a yt h ea d e n o s i n em o n o p h o s p h a t ep r o d u c t s i nt l l er e a c t i o n s 锄p l e s 硒mm en p h o s p h a t ea n l i n oa c i d sa i l da d e n o s i n e 2 b a s eo no r t h o g o n a le x p e r i m e n t d e s i g n ，t h er u 衄i n ge l e c 仃o l ”e ，o 略a i l i cm e d i m ， b u 行c r sp ha n ds e p a m t i o nv o l t a g ei nn a c eh a v eb e e no p t i 商z e da st h ee l e c 仃o p h o r e s i s s o i u t i o no f4 0m m o l ln h 4 a ci n9 0 a c n0 h 1 0 2 ) a n dt h ea p p l i e dv o l 诅g eo f - 2 5k v u n d e rt h co p t i m a l c o n d i t i o n s ，t 1 1 r e e l e r b i c i d e s ，2 ，4 - d ，d i c a m b aa 上1 d2 ，4 ，5 一t h a v eb e e n b a s e i i n es 印a r a t c dw i t l l i n1 6m i n t h em e t h o dh a sb e e nu s e dt od e t e m l i n et 1 1 er c s i d u e so f 2 ，4 一d ，d i c a m b aa 1 1 d2 ，4 ，5 一ti nt h r e eh u n d r e da c t u a lt o b a c c o1 e a fs 锄p i e s ，a n dt h er e s u l t sh a v e b e e ne v a l u a t e d 3 t h es e p a r a t i o nm e c h a n i s mo f a l k a l i ，a l k a l i n em e t a la n d 锄m o n i u mc a t i o n si nn a c eh a s b e e ni n v e s t i g a t e du n d c rt h eb a s i c a lp hv a l u eo nd i 伍：r e n ti n n e rd i a m e t e ro f c a p m a r y u s i i l g m e 0 ha st h eo 唱a n i cm e d i 啪，4 一m e t h y l b e n z y l a m i n e ( m b a ) a sc o _ i o n ，a c e t i ca c i da s n e g a t i v e l yc h a r g e dl i g a l l d t h eb a c k g r o u n de l e c 拄o l ”e s ( b g e s ) w i t h2 0m m 0 1 lm b a ( c o 。i o n ) a n dd i f e r e n tp hv a l u e sw e r ep r e p a r e db ya d d i n gh a ci nd i m r e n ta m o u n t s m b aw a s s e l e c t e dd u et 0i t sg r e a t e rp k av a l u e st l l a ni m i d a z o l e i t sh i g hp k av a l u e sa l l o wu st op r 印a r e i i 郑州大学硕士学位论文 b 踮i c a lb g e s ，t ot t l i l e 也ee o fm o b m 妙a n de l e c t r o p h o r e t i cm o b i l 姆o ft h ec a t i o n s ，a n d f i 皿a l yt o o b t a i nt h eo p t i n l a ls e p 碰m o no fm e m t h ee x p e r i m e n tr e s u l t sd e m o n s t 豫t e 恤t t h e r ee x i s t sm o r cc h r o m a t o g r a p h i ci n t e m c t i o nb e t v 旧e nc a t i o n sa i l di i l i l e rs u r f 配ei n n o n - a q u e o u sm e d i ae s p e c i a l l yu s i n gs m a l l e rd i a m c t e rc a p i l l 耐e s k e y w o r d s ：n 0 n a q u e o u sc 印i l l a r ye l e c t r 叩h o r e s i s ( n a c e ) ，n o n - a q u e o u ss 0 1 v e n tm e d i u m ， o r i h o g o n a l e x p e r i m e n td e s i g n ， a d e n o s i n em o n o p h o s p h a t e s ，h e r b i c i d e s ，a l ic a t i o n ， a j k a l i n em 咖lc a t i o n ，a m m o n i u mc a d o n ，s e a p a n i o nm e c m i s m 1 1 1 郑重声明 本人的学位论文是在导师指导下独立撰写并完成的，学位论文没 有剽窃、抄袭等违反学术道德、学术规范的侵权行为，否则，本人愿 意承担由此产生的一切法律责任和法律后果，特此郑重声明。 学位论文作者( 签名) ：橐娟袖 2 0 0 6 年5 月1 6 曰 郑州大学硕士学位论文 第一章非水毛细管电泳技术的研究进展及其应用 1 前言 1 9 8 1 年j o 昭e n s o n 和l u k a c s 【1 引首创的毛细管电泳( c 印i l l a r ye l e c 仃o p h o r c s i s ，c e ) 是以毛 细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据各组分之间电泳淌度和分配行为上的 差异而实现分离的一种新型液相分离分析技术，具有高效、快速、进样体积小、溶剂消 耗少等特点，已广泛用于化学、生物、药物、环境保护等领域，是分离学科中继高效液 相色谱( h p l c ) 之后的又一重大进展。1 9 8 4 年黜e 【4 1 提出了以分析物在毛细管电泳内的 胶束和缓冲溶液之间的分配为基础的胶束电动毛细管电色谱，使得中性物质的检测成为 可能。但在传统的毛细管电泳方法中，大多数是在水性的溶剂中进行的，这就要求分析 物具有良好的水溶性，即分析物有一定的亲水性。对在水溶液中溶解度很小的分析物， 通常在分离毛细管管壁上存在非常明显的吸附现象，对实验参数的调整存在一定的局限 性。为了解决强疏水性样品在毛细管电泳中的分离分析问题，1 9 8 4 年w 出r o h e l 等人1 5 j 首次提出采用非水毛细管电泳( n a c e ) 方法，以含有h c l 、高氯酸化四甲基等为电解质， 乙腈为有机溶剂对喹啉衍生物进行分离，取得了很好的分离效果。n a c e 并没有严格的 定义，在n a c e 中，并非要求完全的非水体系，通常溶剂介质中有机成分占5 0 以上， 主要表现非水性质的体系，就被认为是n a c e 。n a c e 和传统的水溶液电泳( 自由区带 电泳c z e ) 比较，可以在较高的电压下，电泳电流较低，可以产生很低的焦耳热，从而 提高了分离分析的效率。n a c e 可以在更宽的酸碱范围内进行物质的分析，具有易形成 离子对、增加疏水物质的溶解度，以及减少毛细管壁对分析物的吸附等优点。 2 0 0 0 年以前，国内外对n a c e 做过比较详细的综述，如：王荣英 6 】评述了n a c e 的原理和应用；徐木生等i _ q 评述了n a c e 的特点，并对水相和非水相体系的性质做了比 较；t e t s u o f 8 】综述了影响非水离子交换色谱和n a c e 的分离分析的基本因素。2 0 0 0 年熊 建辉等1 9 j 对n a c e 的分离系统的选择、可能的分离机理以及应用作了简要评述。通过对 e l s e v i e rs c i e n c e 和w i l e yi m e r s c i e i l c e 两个出版社的文章( 以n o n a q u e o u sc 印i 1 1 a r y e l e c 们p h o r e s i s 为关键词) 进行检索( 见图1 1 和1 2 ) ，发现最近2 年，在n a c e 的基础 与应用研究方面取得了很大进展，论文的发表数量也有很大增长，并成为当前c e 研究 的一大热点。 部州土学硕士学位论文 0 0 61 口0 71 q 口81 0 0 0 2 0 0 02 0 0 12 0 d 22 0 0 32 0 0 42 0 0 5 y e a r 图1 1 在e 1 s e “e rs c i e n c e 上n a c e 论文数 y e 缸 图1 2 在w i l e yi n t e r s c i e n c e 上n a c e 论文数 - 2 6 2 0 e 6 4 2 0 讯搿。啊u由3薯b唱fiz 帅 鲫 卸 拍 卸 仲 0 o -h摹专u州_苫讧穹暑口曩，z 郏州太学硕士学位论文 2 非水毛细管电泳技术简介 2 1 毛细管的前处理和保养 新毛细管柱可先用l m o l 几氢氧化钠溶液和重蒸水先后冲洗1 0 m i i l 再用相应的非水溶 剂冲洗5 m i n ，最后用运行缓冲溶液冲洗2 0 m i n 。每次进样前最好用缓冲溶液冲洗2 m i n ， 以提高分析的重现性【1 0 4 “。而且要经常更换缓冲液，一般是一天更换一次。实验结束后 用l m o l l 氢氧化钠、水溶液依次冲洗毛细管2 m i n 后再用氮气吹干存放，以备下次使用。 2 2 几种重要的影响参数 在分离分析过程中，表观p h 值、温度、离子强度、焦耳热、电渗流、毛细管内径 大小和涂层等参数都是非常重要的影响因素，下面做一简单的介绍。 2 2 1 表观p h 值( d h + ) p h 对非水溶剂无直接意义，但它直接影响到被分析物的离子化程度，从而影响分离 选择性12 1 。实验发现电渗流随着表观p h 值升高而增大【13 1 。p o 仃a s 研究了非水介质的基 本物理化学性质，提出了表观( p h + ) 值这个概念。目的是考察影响物质分离的选择性、 分析物的电泳淌度以及离子化行为等参数，以便对n a c e 有更深入的了解，从而扩展 其在分离中的应用。在有机溶剂中，p o r i - a s 等由已知弱酸的p k 矿值，引入了常规p h + 值概念，并用此来校正背景电解质的p h + 值。在弱酸p k a + 值已知的情况下，含有弱酸及 其相应盐的背景电解质的p h + 值可用h e n d e r s o n h a s s e l b a l c h 方程( 1 1 ) 来计算。 h e n d e r s o n - h a s s e l b a l c h 方程： 姆k 蹦o - ” 根据s a r i l l i n j 和k e 衄d l e r 报道【1 6 1 引，p k a 的值随着非水溶剂含量的增加而增大，所以 有机溶剂的比例十分重要。在醇和乙腈溶剂条件下，他们还发现分离的灵敏度和酸的羟 基取代基有关，当酸无羟取代基时灵敏度将降低。有机溶剂中p h t 不易测定，可在非水 介质中加入p h 调节剂( 如冰醋酸、三氟乙酸、氨水等) 进行控制和调节。而且三氟乙酸 有时不仅作p h 调节剂，还可以作离子对试剂2 0 1 ，对手性物质进行分离分析。 2 2 2 温度 在毛细管电泳中，温度对迁移的影响主要是通过粘度体现。粘度是温度的函数，而 淌度是粘度的函数，因此温度的控制非常重要。温度增加，粘度减小，淌度增加。在很 多情况下，在较高的温度下操作，加快分析速度，往往比减小柱长更简单易行。对于 迁移时间很短的物质，随着温度的降低，粘度增加，因此迁移时间增长，灵敏度将有所 郑州大学硕士学位论文 提高吲。温度有时也会影响络合物的形成常数。 2 2 3 离子强度 缓冲液的电解质浓度直接影响到电泳介质的离子强度，从而影响到z e t a 电势，而 z e t a 电势的变化又影响到电渗流。随着离子强度增强电渗流将减少矧。增加离子强度可 以增加样品的容量，增加样品的富集现象，从而提高分离效率( 2 3 】；但是，离子强度变大 的同时电流也增大，所以焦耳热也就变大，灵敏度就会降低。 2 2 4 焦耳热 在电解质相同的情况下，在非水介质毛细管电泳中的焦耳热比在水相中有明显的降 低。例如，甲酰胺中的电流值远小于水中的电流值口3 1 。因此可在非水溶剂中增加电解质 浓度或者在电解质浓度不变的情况下，提高运行电压，也可以获得较低的电流和较高的 分离效率，分析时间也相应缩短m 1 。在乙腈【2 4 1 或甲醇中也有类似的现象。 2 2 5 电渗流( e o f ) 图1 - 3 电渗流示意图 毛细管电泳中的电渗流实际上是高电场下由偶电层中水合阳离子或质子所引起的 流体朝负极方向的一种定向运动( 图1 3 ) 。电渗流是毛细管电泳中最重要和最有趣的性 质之一1 2 ”。电渗流( e o f ) 的形成是毛细管内壁和背景介质间的动力学作用结果，其大小 决定于毛细管内壁所带电荷、缓冲液的离子强度及溶剂的性质( 如粘度，相对介电常数 等) 。电渗流可看作是缓冲液泵，它的大小直接影响着分析物在毛细管中的迁移速度， 改变背景介质的组成可改变电渗流的方向和大小。若分析物的迁移方向与电渗流一致 时，可获得较短的分离时间，但分离度会降低；若分析物的迁移方向与电渗流相反时， 可获得较高的分离度，但分离时间会延长。因此，在c e 中电渗流是影响分离效率的一个 重要参数。 郜州土学硕士学位论文 表1 1 纯溶剂时熔融石英毛细管中的电渗流和管壁( 电势( 2 5 ) 口8 】 a c e t o n e 2 b u t a n o n e 、，a c e r d 它u t e r i u mo x i d e d n n m f m e o h d m s o e t o h f a e t l l v la c e t a c e t h f 1 一p r o p a t l o l m o r p h o l i n e 1 2 0 4 6 1 0 叫 7 6 5 4 6 1 0 一8 7 6 1 4 7 l o 一8 6 5 9 1 7 1 0 一8 5 8 6 3 0 x1 0 8 5 0 8 7 8 1 0 一8 4 4 6 0 8 1 0 一8 3 2 1 6 8 l o 一8 1 4 6 4 4 l o 一8 1 3 3 6 8 1 0 一8 1 1 2 6 4 1 0 一8 1 0 5 3 6 xl o 一8 4 1 2 7 3 l o 一9 3 4 4 0 7 l o 一9 在水体系中，毛细管内壁硅羟基的离解程度取决于缓冲液的p h 值。在非水体系中， 毛细管内壁硅羟基的离解方式和其它弱酸相似。有机溶剂使硅羟基的酸性降低，s c h w e r 等【2 6 】人已证实了此现象。离子在毛细管内壁的吸附量因溶剂不同而不同，这主要是因为 离子在不同溶剂中具有不同的稳定性。在非水介质中随着非水溶剂比例增加，电渗流减 少【2 6 1 。w r i g “2 4 1 比较了非水介质下的毛细管电泳与经典的毛细管电泳中电渗流的特点， 并列出了不同的溶剂和缓冲溶液中的电渗流的速度。而且他们还进一步研究了非水毛细 管电泳中的电渗流的重现性，结果与经典毛细管电泳中情况很相似。k 6 【2 8 l 详细考察 了各种溶剂中的电渗流淌度和 二甲亚砜 n - 甲基甲酰胺 甲醇n ，n 二甲基甲酰胺( 1 ：1 ) 混合溶剂 甲酰胺 甲 醇- 乙腈( 1 ：1 ) 混合溶剂 水。由于有机溶剂中分子氧的存在，使得许多化合物的粘度增加、 邦州大学硕士学位论文 极性降低、稳定性增强，因此相对于水体系来说，非水介质中物质的荧光强度有所增加。 j a i l s s o n 【6 3 1 等人比较早把荧光检测应用于非水毛细管电泳中，由于他们用n 一甲基甲酰胺 作介质时，n 甲基甲酰胺的背景吸收很大，u v 检测受到限制，从而采用合适的激发波 长进行l i f 检测。实验证实和水体系相比较，n a c e l i f 检测灵敏度增加两倍。 虽然荧光检测器能够提供极好的检测极限，但是它的通用性仍比紫外检测器差。因 为许多感兴趣的物质并不能显示天然的荧光，而必须用荧光试剂对其进行衍生，所以灵 敏度的提高是以复杂的衍生程序做为代价的。也可以用间接荧光检测避免这个问题。 w a i l g 等畔1 使用荧光素作荧光团在碱性的甲醇乙睛混合介质中实现了脂肪酸的间接荧光 检测。 2 3 3 电化学检测 电化学检测器作为c e 的常用检测手段，根据检测原理的不问可分为电势位检测器、 电导检测器、电流( 安培) 检测器等。由于电化学检测器结构简单，可选择的方法又比 较灵活，所以是n a c e 中较有希望的选择性检测器【6 5 1 ，特别适合对一些氧化电位很高的 化合物的测定。其中以电流检测器在n a c e 中最为常用。m a t y s i k 【6 l 】评述中强调了非水介 质中用电流检测器的两大优点：( a ) 由于可达到的电势范围变宽，拓展了分析物检测范 围，可高灵敏地测定一些不易被氧化或还原的化合物：( b ) 有机溶剂( 乙腈) 的使用能 降低电极表面氧化还原物的生成，从而提高了电极表面的重现性。基于乙腈溶剂相对水 相介质而言拓宽了分析的范围，也能降低电极表面氧化还原产物的生成，提高了电极表 面的重现性，故乙腈是n a c e 的电化学检测定法中最为理想的非水溶剂。如b a c k o r m 等【6 7 】 在含1 0m m 0 1 l 乙酸钠和1 m o l l 乙酸的乙腈介质中用铂微片型电极以电流检测法测定 3 ，4 一二甲氧基苯丙胺、3 ，4 二亚甲氧基苯丙胺以及三甲氧苯乙胺，测定结果达到了n m l 的水平。与紫外检测相比，灵敏度提高了2 3 个数量级，而且操作简单、方法灵活。电 化学检测在氧化模式下由于信号容易识别，检测灵敏度要比紫外检测的灵敏度高大约两 个数量级，该方法已被应用于头发样品的微量成分的测定。无接触电导检测在n a c e 也 各受关注，其命名原理就是检测池和溶液不直接相连。该方法设备简单，检测性能稳定， 检测的信号基于分析物和背景电解质中共存离子的迁移率之比。 另外，n a c e 中背景电解质的低电导降低了高电压分离电场与检测电路之间的干扰， 因而可用不带分离器的简单装置进行检测【6 8 】；同时，检测电极上不易形成氧化层也降低 了背景电流，从而提高了灵敏度。 肆州大学硕士学位论文 2 3 4 质谱检测器 因为水介质毛细管电泳常采用不挥发性电解质、表面活性剂等添加剂，所以与质谱 检测器的匹配性不好。n a c e 则弥补了上述不足，它采用易挥发的非水溶剂和电解质， 在质谱检测时可得到稳定的基线队删。非水介质是电喷雾离子质谱( e s i m s ) 检测的理想 介质，因为它们具有表面张力低、挥发性高以及易离子化等性能，在质谱检测中可形成 稳定和高灵敏度的喷射。因为喷射带走了大量电流，故n a c e 中e s i m s 表面毛细管出口 的接地由于电流较低就不太关键。有机溶剂易挥发的特性可降低干燥气的流速，从而可 增加质谱检测中的离子数。甲醇和乙腈以及它们的混合物和水介质相比都具有良好的喷 射特性和较强的信号，所以其是应用于e s i m s 中的首选溶剂7 0 。7 5 ，1 2 0 ，1 州。 h i l d e r 等订5 1 在测定青霉素v 发酵肉汤中的杂质和副产品时，对水相和非水毛细管电 泳与e s i m s 的联用进行了比较，结果显示乙腈甲醇( 含2 0m m o 儿乙酸铵) 非水体系 c e e s i m s 的测定效果优于水相；由于n a c e 中所使用的非水介质表现出各自不同的物 理化学性质，正如ma _ c y s i k l 7 6 l 在其评述中所阐述的观点那样，它们对e s i m s 检测的影响 有利有弊。 3 非水溶剂的性质与作用 在n a c e 中，非水介质一有机溶剂的性质对n a c e 的分离起着非常重要的作用。尽 管有机溶剂有很多种类，但是能用于n a c e 的溶剂并不多。有机溶剂的选择需要从以下 几个方面加以考虑：( a ) 溶剂的挥发性；( b ) 溶剂的介电常数；( c ) 溶剂的粘度； ( d ) 偶极矩以及( e ) 质子离解等多种因素。常用的试剂有甲醇( m e 0 h ) 、乙腈( a c n ) 、 甲酰胺( f a ) 、n 一甲基甲酰胺( n m a ) 、n n 一二甲基甲酰胺( d m f ) 、二甲亚砜( d m s o ) 、 n n 一二甲基乙酰胺、二氧化六环、四氢呋喃( n i f ) ，其中前四种最常用。碳酸丙稀、喹 啉、冠醚、环糊精( c d ) 以及其衍生物、离子对试剂主要用于手性分离。有机溶剂对n a c e 分离的影响主要体现在对电泳淌度0 e p ) 和电渗流o ) ( 方程式( 1 2 ) 、( 1 3 ) ) 的影响。 在( 1 2 ) 、( 1 3 ) 式中，z i 表示离子交换电荷数，e 表示原子所带的电荷数，r 表示原子 的半径，z i 、e 、r 均与溶剂化程度有关。i 。表示离子的z e t a 电势，与离子的溶剂化状态 有关。w a 表示管壁的z e t a 电势，与毛细管内表面的状态有关。口表示有机溶剂的粘度系 数，印表示真空中的介电常数，表示相对介电常数，由关系式( 1 2 ) 、( 1 3 ) 可以看 出介电常数s 和粘度_ 的比值。钾，也是影响淌度的重要参数，所以嘶是选择合适有机溶剂 的重要参数。 郑州土学硕士学位论文 。印2 丽2t ( 1 2 ) 8 0 卸l h p 一一 埠 ( 1 3 ) 表2 【7 7 1 列举了水和一些有机溶剂的物理化学参数。从表1 2 可以看出，因为n 甲 基甲酰胺和乙腈的8 向比较大，所以它们的电渗流也较大，用于电泳方向和电渗方向相 同的物质的分离，可以大大的缩短电泳时间。憎溶剂相互作用的强度与溶剂一溶剂相互 作用的作用的强度有关，它们在极性溶剂中强度很大，可以用内聚能密度v u ( 单位 体积上使所有溶剂分子转化成气态的能量) 来表示。如果溶剂间相互作用很强，将会影 响到溶质与溶剂问的作用。从表1 2 中可以看出，水的僧溶剂相互作用是最强的，甲酰 胺等有机溶剂的v u 值就小一些。相反的，静电相互作用与介质的介电常数值为 反比例关系，因此在极性溶剂中，如n m f ，f a 和水中，静电相互作用很弱。利用静电 相互作用的最好的的溶剂是d c e 和乙醇。n a c e 还要考虑有机溶剂的挥发性，与水相 比，大多数非水溶剂都具有低沸点高蒸汽压，这将会导致重现性和精密度的下降。所以 n a c e 的分析要快速而且要在密闭反应池的条件下进行。选择合适的有机溶剂不仅可以 提高分离效率，而且可以扩大分离物质的范围。 表1 2 水与常用非水有机溶剂的性质比较 水 h 2 0 1 0 0 7 8 40 8 98 8i 0 9 2 2 9 4 1 1 7 o 4 7 甲酰胺f a 2 1 01 0 953 3 03 30 9 7 1 5 6 8 o 7 1 04 8 - 甲基甲酰胺n m f1 9 9 51 8 2 416 51 1l 0 9 09 1 00 6 20 8 0 - 二甲基甲酰胺d m f1 5 283 67 o8 04 6o8 85 8 10 0 006 9 甲醇m e o h6 4 7 3 270 5 55 906 0 8 5 80 9 806 6 乙醇 e t o h7 8 32 4 61 0 82 3 05 46 7 6o s 6o 7 5 乙腈a c n8 1 1 3 5 70 3 41 0 50 6 65 8 lo 1 90 4 0 二甲亚砜d m s o 1 8 94 6 519 9 2 31 0 07 800 00 7 6 正丙醇1 一p 而h 9 7 l2 051 9 41 1 05 25 9 5 0 8 409 - q 郑州土学硕士学位论文 异丙醇 2 - p r o h8 2 4 51 9 92 0 41 00 4 8 5 5 80 7 6 o8 4 正己烷 二氯甲烷 n - h c x6 8 7 41 9 d c e4 0 o8 9 0 2 960 1 l 2 2 50 0 0o0 0 0 4 12 208 24 “0 1 3o 1 0 备注a ：使用化学方法，极性是由所有分子性质的总数或者溶剂与溶质分子间的相互作用所表现出来 的，也可以由经验性的k a m l e t 和t a 劬矿参数估计出来 备注b ，a ：氢键酸度( k m l e tt a ：分别测量氢键能力和氢键主体( 与电子受体的特性a n 有关；r 2 = o 9 3 9 5 ) 备注c ： b ：氢键碱度a i n l 吐t a 助：测量氢键受体的性质( 与电子对主体的特性d n 有关；r 2 = 0 9 4 1 5 ) p o n 粥等详细的阐述了甲酰胺作为有机溶剂的利弊，得出了8 个结论：( a ) 离子 淌度随离子强度的变化而变化；( b ) 离子强度受扩散系数影响；( c ) 当纵向扩散使区 带展宽时，分离效率受实验获得最大理论塔板数制约；( d ) 溶剂的p k a 影响分析对象的 电解情况； ( e ) 运行电泳溶液p h 是由合适的电解质和有机溶剂比例调节得到； ( f ) 缓 冲溶液的p h 是实验成败的基础；( g ) 有机溶剂的挥发性和吸水性与环境的湿度、有机 溶剂的离子淌度、有机溶剂的p k a 以及有机溶剂的稳定性有关；( h ) 在甲酰胺的光学吸 收之外，用电导或者是间接紫外法检测也是很好的策略。v a l = j o 等人以有机溶剂二甲 距砜( d m s o ) 作为背景电解质，用荧光检测法，比较了在水介质和非水介质下通过裸 管柱和聚乙烯醇涂层柱分离用荧光素诱导过的五种胺的分离效果，得出了如下结论：( a ) 在水介质条件下的裸管柱不能实现物质的分离；( b ) 在水介质的涂层柱条件下物质的分离 有微小的改观；( c ) 用涂层柱在以d m s 0 做为背景电解质条件下非常容易实现五种胺的基 线分离。主要是因为分析物的p k a 值在d m s o 中比理论值( 一般是水介质条件) 大，五 种胺的离子化程度发生了很大的变化，所以成功实现了五种胺的分离。但是由于d m s o 的粘度比水大的多，所以检测时间很长。p o r r a s 等人 8 0 】通过研究有机溶剂n n 一二甲基 甲酰胺( d m f ) 的稳定性，和它对电解质的淌度的影响以及分析物的p k a 值的变化，最后 指出：( a ) 分析物的p k a 比分析物在水溶液中的p k 丑大3 4 4 的数量级；( b ) 分析物的淌度 随着p h + 值的变化曲线成s 型变化如图1 3 ；( c ) d m f 作为背景电解质的优点在于它有优于 水，类似乙腈和甲醇的性质。p a l o n e n 等人 8 1 】用乙醇为背景介质，通过改变高电压，以 理论塔板数的实验值的大小描述实验结果，证实了乙醇为介质容易实现物质的分离。 郑州太学硕士学位论文 p h n d m f 图1 4 分析物的淌度与p h 的关系 f i g 1 4t h er e l a t i o n s h i pb e t 愀n 妇a n a l y t e sm o b i l 时a n dp hv 越u e s 4 n a c e 常用的电解质 在非水毛细管电泳中，使电泳溶液具有一定的导电性能是实验的必要条件。大多数 电解质在有机溶剂中的溶解度很低，这就限制了电解质选择的范围，所以电解质的选择 也很重要。三( 羟甲基) 甲胺( t r i s ) 的淌度低，而且它们的粒子的质荷比很大，既能降低 缓冲溶液的电导率，又可以在降低缓冲溶液浓度的同时减小管壁和溶质之间的吸附作用， 所以t r i s 是非水毛细管电泳最常用的电解质。目前乙酸铵也使用最多，一般是乙酸铵和 乙酸按一定的比例混合使用。研究结果表明季胺盐【8 2 8 4 1 、三氟醋酸盐【8 5 j 也可以作为电解 质使用。当然乙酸镁、柠檬酸、甲酸和甲磺酸、以及高氯酸盐【5 1 也可以使用。值得一提的 是含有乙酸铵电解质的电泳溶液很适宜毛细管电泳与质谱联用瞰8 7 ，1 4 4 1 ，因为电泳溶液具 有一定的挥发性，可以限制背景噪音或族化合物的形成。 5 n a c e 分析应用研究进展 基于n a c e 的诸多优点，已引起人们的广泛关注。人们多集中在对物质的手性分析 中，在其它方面的研究应用近年来得到了快速的发展。 5 1n a c e 在手性分离中的应用 水介质毛细管电泳对物质的手性分离早在几十年前就有报道【9 0 。9 5 】。非水介质下的毛 细管电泳的手性分离最早是在1 9 9 4 年由y e 和k 上l a l e d i 9 印提出。目前，非水介质的手性 分离研究很有限，主要是对单纯的非水介质基本信息认识不清，如影响有机溶剂的酸碱 性化学性质、离子强度和淌度等。 (i譬le。掌一叁譬。鼍 郑州大学硕士学位论文 5 1 1 手性分离的原理 在毛细管电泳中，对应体被拆分的原理是基于在缓冲溶液中对映体和手性选择剂反 应的差异： e 1 + ( 墨蕊l c s ( 1 4 ) e 2 + 圆弧c 8 ( 1 5 ) e ie 2 一分别是一种外消旋混合物的两个对映体；c s 一是手性选择剂；k 1 k 2 一分别是 两种对映体和手性溶剂的形成常数。淌度和手性选择溶剂的浓度关系如下： p 4 紫瓣 。， 一、扯。一分别是c s 在浓度为o 、m 时的淌度 c s 卜一手性选择剂的平衡浓度 两个对映体的淌度差( 分离灵敏度肛) 与手性选择剂的关系如下： ( 1 7 ) 当对映体和手性选择荆( 以环糊精c d 为例) 按1 ：1 混合，得到分离度公式如下： 取一乎 而蒜最 捌 ( 1 8 ) n 一是理论塔板数； 。g 一两对映体的平均淌度；斗。一电渗流。 所以为了提高分离度，增加理论塔板数，要尽可能增加两个对映体的淌度差( “) ， 优化平均淌度( 肛。g ) ，控制电渗流。而且要增大淌度差必须选择合适手性选择剂以及它 的合适的反应浓度，还要求电解质有合适的酸碱度【2 9 】。 5 1 2 电解质对k 1 、k 2 的影响 电解质种类对k l 、k 2 有重要的影响。w a n g 和k h a l e d i l l 砧用同一浓度的环糊精测定 了硫醚嗪、三甲丙醚嗪等对映体在水、甲酰胺、n 一甲基甲酰胺和n ，n 一二甲基甲酰胺 中的形成常数。结果表明：被测物与手性选择剂的形成常数随着电解质的极性变弱而减 小。而且w r e n 和r e w 9 3 9 7 1 通过实验得到，手性选择试剂存在的最佳浓度为： 1 髓b 。丽 ( 1 9 ) 郑州大学硕士学位论文 5 1 - 3 常用的手性选择试剂 和水介质毛细管电泳一样，手性选择剂在分离分析中扮演重要的角色。环糊精是最 常用的手性选择剂，在天然环糊精中b c d 最常用，由于它在水溶液中溶解度很小仅仅 1 6 m m ，但是在有机溶剂中，如在甲酰胺中溶解度超过4 0 0 m m 【9 2 ，9 8 1 。另外还有冠醚、喹 啉、离子对试剂等。关于这几种手性选择试剂的具体的用途和性质特征，w 缸g i l2 j 和王 荣英9 9 1 做了比较详细的综述，在本文不再多作描述。表1 3 列举了n a c e 在手性分离中 的应用实例。 表1 3n a c e 在手性分离中的应用 t a b i e l 3a p p l i c a t i o n so f n a c et o 也ec h i r a is e p a r 撕o n e t h o p r o p a z i n e c h l o r c v c l i z i n e m i a n s e 血 n e f o p a m p r o p i o m a z i n e l ，l - b i n 印h t h y l 一2 ，2d i y p r o p r a n o l o l 1 如p i c i d c c i a f l d e l a t e s a l b u t a r n 0 1 b e n 曲e x o l f e n n u r 锄0 1 p r o m e t h a z i n e i h x y d r o g e np h o s p h a t e d a n s y l 锄i n oa c i d s h p b - c d t c dm - d 乞d p c dh p - d - c d m b 七ds - d - c d p - c dh p - p - c d m - b - c ds - p - c d b c d s b c d c a m p h o r s u l p h o n a t e h d a s b - c d c m b c d s - b c d c m - b c d c 舡b - c d c m - b c d c 嘲p h o r s u l p h o n a t e c m - b c d c m b c d c m - b - c d q u i n i n e b - c d q a - d c d c i 仃i ca c i d ，r r i s f a c i 研ca c i d ，t r i s ，f a c i t r i ca c i d ，t f i s ，f a c i t r i c a c i d ，t r i s ，f a c i t r i ca c i d ，t d s ，f a c m i ca c i d ，t r i s ，f a c i m ca c i d ，t n s ，f a