基因工程与体外表达ppt.ppt

1,基因工程与体外表达GeneEngineeringandGeneExpression,2,基因工程是指在体外对DNA分子按照既定的目的和方案，对DNA进行剪切和重新连接，然后把它导入宿主细胞，从而能够扩增有关DNA片段，表达有关基因产物，进行DNA序列分析，基因治疗，研究基因表达的调节因子（如启动子、增强子等），以及研究基因的功能等。,3,第一节基因工程中的工具酶一、限制性核酸内切酶（restrictionenzyme）它是一种核酸内切酶，能从双链DNA内部特异位点识别并且裂解磷酸二酯键。,4,5,2限制性内切酶的命名EcoRE代表Escherichia属co代表coli种R代表RY13株,6,3限制性内切酶的识别和切割位点通常是46个碱基对、具有回文序列（palindrom）的DNA片段，大多数酶是错位切割双链DNA，产生5或3粘性末端（stickyend）。,如EcoR切割后产生5粘性末端：,7,Pst切割后产生3粘性末端：,有一些酶沿对称轴切断DNA，产生平端或钝端（Bluntend）,如Sma：,8,二、其他常用的工具酶1.DNA聚合酶(DNApolymeraseI)有聚合酶活性有35核酸外切酶活性有53核酸外切酶活性,9,10,11,12,2.DNA聚合酶大片段DNA聚合酶大片段(largefragmentofDNApolymeraseI)为DNA聚合酶I用枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)裂解后产生的大片段，这个片段也称为Klenow片段（Klenowfragment）。,有53聚合酶活性有35核酸外切酶活性,无53核酸外切酶活性,13,Klenow片段的主要用途有：(1)补齐双链DNA的3末端。,14,(2)通过补齐3端，使3末端标记。5-G-OHKlenow5-GTT*A*A-OH3-CAATT-OHd*ATP,dTTP3-CAATT-OH(3)在cDNA克隆中，第二股链的合成。(4)DNA序列分析。,15,3.逆转录酶（reversetranscriptase）是一种RNA依赖的DNA聚合酶，即以RNA为模板合成DNA，合成方向为53延伸，无35外切酶活性。,用于以mRNA为模板合成cDNA，构建cDNA文库。,16,17,4.T4DNA连接酶（T4DNAligase）T4DNA连接酶催化双链DNA一端3-OH与另一双链DNA的5端磷酸根形成35磷酸二酯键，使具有相同粘性末端或平端的DNA两端连接起来。,18,19,5.碱性磷酸酶（alkalinephosphatase）能去除DNA或RNA5端的磷酸根。制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身连接，提高重组效率。,20,21,6.末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT），简称末端转移酶。它的作用是将脱氧核苷酸加到DNA的3-OH上，主要用于探针标记；或者在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接。,22,23,第二节基因克隆的载体,质粒、噬菌体、粘粒、病毒载体,24,一、质粒（plasmid）质粒是存在于多数细菌和某些真核生物染色体外的双链环状的DNA分子。,质粒含有复制起始点，此复制起始点与其他一些顺式调控因子构成复制子，能利用细菌染色体DNA复制和转录的同一套酶系统，在细菌体内独立地进行自我复制及转录。,25,作为克隆载体的质粒应具备下列特点：（1）分子量相对较小，能在细菌内稳定存在，有较高的拷贝数。,（2）具有一个以上的遗传标志，便于对宿主细胞进行选择，如抗生素的抗性基因，-半乳糖苷酶基因（LacZ）等。,（3）具有多个限制性内切酶的单一切点，便于外源基因的插入。如果在这些位点有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。,26,27,28,29,质粒一般只能容纳小于10kb的外源DNA片段。,30,二、噬菌体噬菌体(bacteriophage,phage)是感染细菌的病毒，用作克隆载体的噬菌体有两种：一种是噬菌体，另一种是M13噬菌体。野生型噬菌体经过改造，已衍生出100多种克隆载体。噬菌体载体分为插入型和替换型(置换型)两类。目前应用较广的是EMBL系列、gt系列和Charon系列等。,31,32,gt10和gt11载体适用于建立cDNA文库。这两个载体都属插入型载体，能克隆7kb以下的外源DNA。gt11为表达型载体。,33,Ziplox载体,34,三、粘性质粒（cosmid）粘性质粒是由噬菌体的噬菌体的粘性末端（cos区）与质粒重新构建的载体，为双链、环状DNA。其克隆容量可达4050kb。,35,四、M13噬菌体M13噬菌体（M13phage）是一种大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体，全长约6.5kb。M13感染细菌后，经过复制转变为双链的复制型（RF）。复制型M13可用作克隆载体。,36,37,五、病毒载体逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、EB病毒等作为基因转移的载体。多数病毒载体均已质粒化，病毒载体质粒主要由病毒启动子、包装元件、选择性遗传标记，以及pBR322的复制子组成。,38,第三节基因克隆的基本过程基因克隆主要分为以下几个步骤：制备目的基因和相关载体；将目的基因和有关载体进行连接；将重组的DNA导入受体细胞；DNA重组体的筛选和鉴定；DNA重组体的扩增、表达和其他研究。,39,一、目的基因的获得（一）从基因组文库中获得,（二）从cDNA文库中获得,（三）用聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增有关DNA片段,（四）人工合成,40,二.载体的选择,41,三、DNA分子的体外连接,（一）粘性末端,（二）人工接头的使用,（三）加入同聚体尾,（四）平端连接,42,（一）粘性末端,43,44,定向克隆,45,（二）人工接头,46,（二）人工接头,47,（三）加入同聚体尾,48,（四）平端连接,49,四、外源DNA导入宿主细胞将重组DNA或其他外源DNA导入宿主细胞，常用的方法有以下几种。（一）转化（transformation）（二）感染（infection）（三）转染（transfection）,50,五、目的基因的筛选和鉴定将外源基因导入宿主细胞以后，首要任务是筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩增。所用的方法主要有遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、PCR等。,51,（一）遗传学方法1.抗生素筛选法(1)单抗生素筛选大多数克隆载体带有抗生素抗性基因，如氨苄青霉素（ampicillin,Amp）、四环素(tetracycline,Tet)、卡那霉素(kanamycin,Kan)抗性基因。带有完整抗生素基因的载体转化宿主菌后，其宿主菌能在含有相应抗生素的琼脂平板上生长。,52,（2）双抗生素筛选,53,双抗生素筛选结果示意图,54,2.蓝-白筛选（互补）许多载体（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和氨基端145个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点。这种载体适用于可编码-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主细胞。宿主和载体编码的片段各自均无酶活性，但它们可以互补形成具有酶学活性的蛋白质。这种现象称为互补。,55,因此，当载体的多克隆位点没有插入外源DNA片段时，互补能正常进行，产生有活性的-半乳糖苷酶。能使人工底物X-gal变成蓝色,产生蓝色菌斑或菌落。如果载体的多克隆位点插入了外源DNA片段，导致产生无互补能力的氨基端片段,带重组体的细菌形成白色菌斑或菌落。,56,（二）免疫学方法如果克隆基因的产物是已知的，并且在菌落或噬菌斑中表达，因而可用相应的抗血清或单克隆抗体，通过放射免疫、化学发光或显色反应进行筛选。,57,（三）核酸杂交法对菌斑或菌落进行原位分子杂交是从基因组文库、cDNA文库或重组质粒中筛选目的基因的最有效的方法之一，而且这种筛选不取决于目的基因是否表达。,58,菌落原位杂交的原理,59,（四）PCR技术PCR技术具有高度的灵敏度和特异性，能在极短的时间内将目的基因扩增至数百万倍，通过琼脂糖凝胶电泳，可直接观察到产物的存在。,60,(五)酶切鉴定用抗生素筛选、蓝白筛选等方法筛选出的菌落需进一步进行酶切分析，鉴定插入片段的大小和插入方向。（1）插入片段大小的鉴定（2）插入片段方向性的鉴定,61,第四节真核细胞转染一.真核细胞转染的方法与基本原理（一）磷酸钙沉淀法,（二）电穿孔法,（三）DEAE-葡聚糖法,（四）脂质体介导的基因导入,（五）显微注射法,62,二.转染细胞的筛选(一)TK-细胞突变株筛选转染细胞细胞内TTP的合成有两条途径从头合成可被氨甲喋呤阻断补救合成胸苷激酶(TK)是关键酶TK+:细胞生长TK-细胞+含TK基因的载体:细胞生长,63,（二）药物筛选转染细胞哺乳动物细胞中最常用的选择性标记物中包括有细菌新霉素抗性基因（neor）。此基因具有对氨基糖苷抗生素G-418（新霉素衍生物）的抗性。G-418是用于阻断细胞内的蛋白质合成，从而达到杀伤真核细胞的目的。如果将带有neor基因的质粒导入细胞，并在含有G-418的培养基中培养，未转染的细胞被杀死，而存活的细胞便是转染细胞。,64,第五节基因的改造(一)寡核苷酸介导的定点诱变法的建立（二）含U模板法（三）PCR定点诱变法,65,寡核苷酸介导的诱变方法的基本原理：,66,含U模板法,67,PCR介导的定点诱变法,68,第六节克隆基因的表达基因工程的主要目的之一，就是要制备大量有用的蛋白质和多肽，尤其是人体蛋白。得到了克隆的基因或cDNA后，按照正确的方向插入表达载体，连在启动子的后面，导入相应的宿主细胞，即可进行表达。在不同的表达系统中，其表达方式不尽相同。,69,真核生物结构基因示意图,真核生物基因的结构特点,70,原核生物基因的结构特点基因是连续的,无内含子,71,一、大肠杆菌表达系统,大肠杆菌表达外源基因的优势繁殖迅速培养简单操作方便遗传稳定,72,大肠杆菌表达外源基因的劣势1.缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统如糖基化或磷酸化等修饰作用2.内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白,造成表达产物不稳定,73,（一）基因表达的基本要素1目的基因和密码子(1)目的基因目的基因如果来自真核细胞必须是cDNA。cDNA的始密码子（ATG）上游部分（5端非编码区）必须除去。对于一些分泌性蛋白，还应除去信号肽部分。,74,(2)密码子生物体对密码子的偏爱性,密码子偏爱性对外源基因表达的影响,75,2载体的选择所用表达载体必须是大肠杆菌表达载体，含有大肠杆菌RNA聚合酶所能识别的启动子（如PL、tac、T7等）和SD序列。,76,3目的基因与载体的连接（1）利用合适的接头进行连接引入ATG,77,（2）融合蛋白融合蛋白是指表达的蛋白质由原核多肽和真核蛋白连接在一起。有些载体的SD序列后面带有一段大肠杆菌蛋白质的结构基因，此结构基因的3端为多克隆位点，便于目的基因插入，经转录和翻译之后，即产生融合蛋白。,78,表达融合蛋白的优点(1)融合蛋白较稳定，不易被细菌蛋白酶水解。(2)如果大肠杆菌的结构基因是一段信号肽，可产生分泌型产物。(3)可利用针对原核部分的单抗进行亲和层析，便于纯化。(4)原核蛋白部分可用蛋白酶切掉，释放出天然的真核蛋白质。(5)目的蛋白溶解性好，由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性。,79,80,81,82,4受体菌株和诱导条件(1)根据载体所携带的启动子选择特定的菌株,(2)诱导表达,83,5.表达蛋白的种类(1)分泌型异源蛋白的表达,分泌表达形式的优点：目的蛋白稳定性高目的蛋白易于分离目的蛋白末端完整,84,分泌表达形式的缺点：相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因即便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多。,85,(2)包涵体及其性质外源基因表达产物在细菌内的存在形式有可溶性和不可溶性两种方式。表达产物在宿主中的存在形式是可变的。培养基的营养状况好，诱导表达的时间短，降低表达效率都有利于可溶性表达产物的形成。反之则容易形成不可溶性的表达产物即包涵体。,86,包涵体表达形式的优点：能简化外源基因表达产物的分离操作能在一定程度上保持表达产物的结构稳定,87,包涵体表达形式的缺点：以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30%。,88,包涵体的溶解与变性包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错配的二硫键和次级键。,89,包涵体的复性与重折叠（refolding）包涵体的复性与重折叠的主要任务是：将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠通过次级键的形成使蛋白质复性,90,6.分离、纯化表达产物根据溶解性的特点，外源基因表达的蛋白质分为可溶性的和不可溶性的。提取可溶性的蛋白质时在非变性条件下进行。提取非可溶性的蛋白质时在变性条件下进行。,91,（二）提高外源基因表达水平的措施1提高翻译水平（1）调整SD序列与ATG之间的距