（分析化学专业论文）佛手多糖分离纯化、结构分析及抗氧化研究.pdf

浙江火学碗i j 学位论文 佛手多糖分离纯化、结构分析及抗氧化研究 中文摘要 本文以佛手为原料，利用提取分离和纯化技术、仪器分析技术、生物大分子 研究方法和体外抗氧化性方法对佛手中的多糖进行了系统研究，主要获得如下结 果： ( 1 ) 通过对佛手浸提时的一些单因素试验，确定了正交试验中料水比、浸提温 度、浸提时间的设计。正交试验得出浸提最佳工艺条件是；料水比1 ：3 0 、浸 提温度1 0 0 。c 、浸提时间3 5h ，而实验室最合算的条件可确立为料水比1 ：3 0 、 浸提温度8 0 、浸提时间3 5h 。 提取次数以三次为经济，三次提取率可达9 8 1 7 ，醇沉工艺条件为：四倍 量9 5 乙醇，8h 。按上述工艺多糖得率为3 4 。 ( 2 ) 对多糖的粗品脱蛋白后进行抗氧化研究发现：佛手多糖有较强的超氧阴离子 自由基清除作用，同时在一定程度上清除羟基自由基。f d + 还原抗氧化性能的 ( f r a p ) 研究发现佛手多糖具有抗氧化作用。试验没有检测到佛手多糖阻止f e 2 + 诱发的脂蛋白过不饱和脂肪酸的过氧化。因此f p 是可能属于第一类抗氧化物。 天然生物物质的抗氧化活性可能与分子量大小相关。 ( 3 ) 分离纯化时，使用s e v a g 法进行脱蛋白，对佛手多糖分离纯化的条件进行了 摸索，发现在使用d e a e c 柱进行纯化时，比较好的的分离条件是：1 5 m i n 不含 n a c 的缓冲溶液洗脱，接着是2 h0 1 m o l l n a c i ，然后用0 3m o f l n a c l 洗脱m 最后 o 。5m o t l n a c l 洗脱2 小时，得到三个组分，经h p l c 和电泳检验为均一组分，得到的三 个组分分别命名为f p l 、f p 2 、f p 3 。用考斯亮蓝法染色，可推断f p l 和f p 2 可能是睹蛋 白。 ( 4 ) 对f p l 和f p 2 两组分进行理化分析发现：f p l ，f p 2 的分子量为1 7 7 7 3 和6 5 9 8 9 。 两种多糖都是由鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖组成。 且两者都是硫酸多糖。f p l 有可能呋哺糖。而f p 2 是吡喃糖，且构型极可能是a 型。高碘酸降解可以得知：f p l 中有1 2 或l 一4 和1 3 位键合。f p 2 中也有1 2 或1 4 和1 3 位键合，且1 3 位键合占主要地位，f p 3 有可能是以1 3 相连为主链的多糖。 关键词：佛手，多糖，纯化，结构分析，抗氧化 i v 浙江人学硕 ：学位论文 佛手多糖分离纯化、结构分析及抗氧化研究 a b s t r a c t i nt h i st h e s i s ，t h ea d v a n c e si ni s o l a t i o n , p u r i f i c a t i o n ，b i o a c t i v ef u n c t i o n ，s t u c t u r e d e t e r m i n a t i o n ，s t r u c t u r e a c t i v i t yr e l a t i o n s h i po fp o l y s a c c h a r i d e s w e r er e v i e w e d t h e n t h r e e p o l y s a c c h a r i d e s f r o m b e r g a m o t w e r ei s o l a t e da n d p u r i f i e d ，t h e y w e r e s y s m e m a t i ci n v e s t i g a t e du s i n gp l o l y s a c c h a r i d e si s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o nt e c h i n q u e ， f u n c t i o ne v a l u a t i o nm e t h o do fa n t i o x i d a n t p r o p e r t i e s ，i n s t u m e n ta n a l y s i st e c h n i q u e a n d b i o m a r o m o l e c u l e t e c h n i q u e t h er e s u l t ss h o w e d a sf o l l o w s ： ( 1 ) s o m em o n o f a c t o r si n e x t r a c t i n gb e r g o m a tp o l y s a c c h a r i d e s w e r e f i r s t l y s t u d i e d ，t h e nt h em o s tr a t i o n a lt e c h n o l o g i cf a c t o r sw e r eo b t a i n e dt h r o u g ho r t h o g o n a l t e s t w ef o u n di fw et a k em e a s u r ea sf o l l o w s ：1 0g r a m sb e r g a m o tp o w d e rw e r e s o a k e dw i t i l3 0 0 m lw a t e r ( w e i g h to f m a t e r i a l ：w e i g h to f w a t e r = 1 ：3 0 1a n de x t r a c t e da t t e m p e r a t u r eo f 8 0 。cf o r3 5 h 、, t h e ni tw a sp r e c i p i t a t e dw i t h4t i m e sv o l u m eo f9 5 e t h a n o lf o r8 ha t0 * c t h ey i e l do f p o l y s a c c h a r i d ew e r e3 4 w et l l i n kt h ea b o v e m e t h o di st h em o s tr a t i o n a lu n d e rt h el a bc o n d i n t i o n ( 2 ) t h es c a v e n g i n ga b i l i t yt os u p e r o x i d ea n i o nr a d i c a l sa n d h y d r o x y lr a d i c a l sw e r e i n v e s t i g a t e db y c h e m i l u m i n e s c e n c e t e c h n i q u e t h e y e x h i b i t e d g o o ds c a v e n g i n g a c t i v i t i e s i n e l i m i n a t i n gs u p e r o x y g e na n i o nr a d i c a l sa n dh a dat r a c ea m o u n to f s c v e n g i n ge f f e c t o nh y d r o x y lr a d i c a l s 1 1 1 e p o l y s a c c h a r i d e e x t r a c t sa l s os h o w e d p o t e n t i a la n t i o x i d a n tc a p a c i t yb y t h ef e r r i cr e d u c i n ga n f i o x i d a n tp o w e r ( f r a p ) a s s a y n e v e r t h e l e s sn o n ea n t i o x i d a t i v ea c t i v i t yw e r em e a s u r e db yd e t c t i n gp e r o x i d a t i o no f p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i df r o my o l kl i p o p r o t e i ni n d u c e db yf e r r o u si o n w ec o n s i d e t h es c a v e n g i n g a c t i v i t ym a y r e l a t i v et om o l e c u l a r w e i g h t ( 3 ) w h e ni np e r i o do fp u r i f i c a t i o nf o ra b o v ec r u d ep o l y s a c c h a r i d e s w er e m o v e t h ep r o t e i n 、航ms e v a gm e t h o di nt h ep o l y s a c c h a r i d e s t h em o s to p t i m u me l u t i o n c o n d i t i o ni np u r i f i c a t i o np o l y s a c c h a r i d e su s i n gd e a e ci so 1 m o l ln a c if o r2 h ，0 3 m o l ln a c if o r6 ha n d0 5m o l ln a c lf o r2 ha f t e re l u , 缸t gw i t ht r i s - h c l ( p h = 7 。0 ) t r k f f e r s o l u t i o nf o r1 5r a i n t h r e ep o l y m c c h a r i d e sw e i ec o l l e c t e dm i dt h e i rp t r i t yw e r ei d e n t i f i e db y h p g p ca r ds d s p a g e m e l i 2 0 d s t h e yw e r en a m e d f p l f p 2a n df p 3 f p la n df p 2w o e v 浙江大学硕上学位论文 佛手多糖分离纯化、结构分析1 ；6 乏抗氧化研究 e , l y c o p r o t e i r t ( 4 m 嚣m 0 1 e a d 越w e i g m o f f p l 涨i f p 2 w e r e d e 嘧h 矗n e d w 曲 p c a s1 7 7 7 3 d a la n d 6 5 9 8 9 d a l p h y s i c o - c h e m i c a lc h a m c 岫f i c sa n a l y s i s i n d i c a t e dt h e yw e f eb o t hi l a d e u po f # a e t o s e ，m r r f f l o s e ，r h a m n o s e ，x y l o s ea n d # u c o s e a n dc o n t a i n e ds u l f a t e dr a d i c a l n l l d u g h p e r i o d 啦o x i d a t i o n a n dr a 删y s i s ，t h e r e s u l ts h o w e dt h em a i n p o l y s a c c h , a i i d ec h a i no f f p la n d f p 2 m u s t b e l ，3 l i l l k a g e t h e y a l s o h a v e a c h a i n o f l 2 0 r l 4 l i l k a g e k e y w o r d s ：b e r g a m o t ，p o l y s a c c h a r i d e ，p u r i f i c a t i o n ，s t u c t u r ea n a l y s i s ，a n t i o x i d a t i v e 浙江夫学硕士学位论文 佛手多糖分离纯化、结构分析t ；! ；乏抗氧化研究 第一章文献综述 1 - 1 认识多糖 在生物体内的高聚物中，糖是最后被研究的领域。糖与脂肪和蛋白质并列 为三大营养物，但是蛋白质构成酶和骨骼结构，脂肪构成细胞膜，而糖并没有 吸引太多的关注。起初人们只把多糖当作能源物质来看待。多糖是由二十多 个到上万个单糖基以糖苷键结合而成天然大分子物质，我们容易注意到它的 名字来自”碳水化合物( c a r b o h y d r a t e ) “，由于其分子式( c h 2 0 ) n 使得它看起来像 是用碳和水做成的。多糖不是一种纯粹的化学物质，而是聚合程度不同的混 合物，组成多糖的单糖可以相同也可以不同。由相同的单糖组成的多糖称为均 多糖( h o m o p o l y s a c c h a r i d e s ) ，如以d 葡萄糖为主链的淀粉、纤维素和糖原； 以不同的单糖组成的多糖称为杂多糖( h e t e r o p o l y s a c e h a r i d e s ) ，如阿拉伯胶是由 戊糖和半乳糖等组成2 。 1 2 功能性多糖分类3 ，4 现已从天然产物中分离出3 0 0 余种功能性多糖类化合物，具有一定功能性 的天然多糖按照来源可大致分为五大类：植物多糖：同中药的研发相结合， 目前主要亚洲国家研究较多：具体有：当归多糖、南瓜多糖、茶叶多糖、枸 杞多糖，人参多糖、大枣多糖等。藻类多糖：自1 8 1 8 年英国人s a n f o r d 从 褐藻发现了褐藻胶以来，海藻工业( 实际上是生产海藻多糖) 大为发展。后 来从各类海藻中陆续分离出各种多糖，例如从褐藻中分离出褐藻、褐藻糖胶 等。现行研究较多的藻类包括：紫菜多糖、红藻多糖、海带多糖、多管藻多 糖、螺旋藻多糖、羊栖菜多糖等5 。真菌类多糖：真菌是我国天然药物资源 和中草药的一个极为重要的组成部分，1 9 5 1 年美国人r e i l l y h 首次发现担子 菌有抑瘤活性。在真菌多糖方面，日本研究的较深入，并且有数种多糖应用 于临床。截至1 9 7 7 年，在专利文献中可查到，人们已试验筛选出1 6 9 种担子 菌的多糖有抗癌活性。如今国内研究比较多的有：香菇多糖、银耳孢糖、裂 褶菌多糖、灰树花多糖、茯苓多糖、猪苓多糖、灵芝多糖以及木耳多糖、虫 浙江人学顾上学位论文 佛手多糖分离纯化、结构分析及抗氧化研究 草多糖、酵母葡聚糖等等。但就我国已着手开展的多糖课题中，真正研究得 比较清楚的只有香菇多糖等少数几种6 ，r 。动物类多糖：主要是来源于多种哺 乳动物的多糖，如壳聚糖、硫酸软骨素b ( d e r m a t a ns u l p h a t e ) 、肝素多糖，这些 多糖的生物活性作用主要是抗凝血活性。细菌类多糖：肺炎球菌 ( p n e u m o c o c c a l ) 荚膜多糖、脑膜炎球菌荚膜多糖、流感杆菌荚膜多糖等，这 一类多糖主要是作为疫苗研究。其中肺炎球菌等多糖在美国已经应用于临床， 该类多糖的研究国内还不多。 1 3 多糖药理作用研究近况 近几十年来，由于相关研究包括膜的化学功能、免疫物质的研究以及对新 药物资源的寻找等，人们发现多糖在生物体中不仅是作为能量资源或结构材料， 更重要的是它参与了生命科学中细胞的各种活动，具有多种多样的生物学功 能。已发现不少多糖物质及其衍生物具有药用价值，多糖的研究日益受到重视。 由于多糖在h i v 或其它致病源与血细胞结合过程中扮演了重要的角色，它成 为免疫系统控制和癌症治疗的最重要的线索之一。现简单叙述一下多糖主要 的几类作用。 1 3 1 调节免疫作用 多糖主要是通过启动免疫细胞，如启动t 淋巴细胞、b 淋巴细胞、激活 巨噬细胞( m 由) 、自然杀伤细胞( n k ) 、细胞毒t 细胞( c t l ) 、淋巴因子激活 的杀伤细胞( l a k ) 等，还能促进细胞因数生成活化补体，从而实现对机体的免 疫调节作用。 ( 1 ) 抗肿瘤 有些多糖能提高m 巾的吞噬功能，从而起到抗肿瘤的作用。李莉8 等观察 了防风多糖体内对s l s o 对移植瘤生长的影响，以及对s 1 8 0 瘤细胞免疫小鼠腹腔 巨噬细胞( m 中) 吞噬活性的影响；发现防风多糖体内应用能明显抑制s 1 8 0 实体 瘤的生长( 抑瘤率为5 2 9 2 ) ，提高s 1 8 0 瘤免疫小鼠腹腔的mm 吞噬活性 ( p o 0 1 ) ，并能使s 1 8 0 瘤免疫小鼠腹腔m 巾与s l s o 瘤细胞混合接种时的抗肿瘤 2 浙江大学硕十学位论史 佛手多糖分离纯化、结构分析及抗氧化研究 活性( p 0 o r ) 提高为9 8 6 。马志章9 等报道，天然和人工培养的黑柄炭角中提 取的活性多糖能提高小鼠腹腔m 巾吞噬活性，用3 h t d r ( 甲基3 h ) 胸腺嘧啶硫 苷酸掺入法检测，肿瘤细胞增殖抑制率可达8 5 9 0 。谢遵江1 0 等探讨人参多 糖在体外对l a k 细胞增殖功能的影响和抗肿瘤作用。结果发现人参多糖与 i l - 2 联合体外培养，人参多糖能促进l a k 细胞的增殖能力( p 0 0 5 ) ，抗肿瘤 作用明显增加。 除了提高宿主免疫功能外，多糖还直接作用于肿瘤细胞。8 0 年代就发现 磷脂酰肌醇( p i ) 转换增强是肿瘤细胞的一个特征性生化改变。抑制或干扰 p i 转换具有一定的抗癌作用。张文女1 1 等发现茯苓多糖干扰膜的肌醇磷脂代 谢，明显抑制磷脂酰肌醇( p 1 ) 转换，茯苓多糖明显抑制肿瘤细胞。肿瘤细胞膜 磷脂脂肪酸组成明显异常，其中最显著的是花生四烯酸( c 2 0 ：4 ) 升高，花生四烯 酸( c 2 0 ：4 ) 是高度不饱和脂肪酸，易被细胞内自由基攻击发生过氧化反应产生具 有致癌和促进肿瘤生长的毒性物质丙二醛( m d a ) 。王炳岩1 2 等发现海藻多糖能 减少白血病l 6 1 5 小鼠脂质过氧化物( l p o ) 含量而增加过氧化氢酶( c a t ) ，超氧 化物歧化酶( s o d ) 的活性，说明海藻多糖能抑制自由基的产生和加快自由基的 清除，防止过氧化氢自由基与单线态氧的产生，使细胞分裂发生抑制，从而 导致肿瘤生长的抑制。 ( 2 ) 抗病毒 对多糖抗病毒研究目前主要有硫酸多糖、中性多糖及糖复合物f 脂多糖、 糖蛋白及糖肽) 。许多藻类多糖证明具有抗病毒活性。其中，硫酸多糖的研究 是当今多糖研究中的一个热点。具有抗h i v 活性的多糖都大多为硫酸多糖。 目前该类多糖的研究很多，具体有；硫酸香菇多糖、忍冬多糖、螺旋藻多糖、 裂褶多糖以及从空心莲子草( 螃蜞菊) 提取分离的硫酸化多糖等。抗h i v 作用的 机理目前认为其可能在于大多数多糖的大分子能够机械性或化学性地结合 到h i v 的g p l 2 0 分子上，遮盖了病毒与细胞的结合位点，从而竞争性地封锁 了病毒感染细胞。抑制感染细胞h i v 的复制。中性多糖和糖复合物多是通 过提高机体免疫机能来达到抗病毒目的。其中许多已经在临床中得很好效果， 如猪苓多糖、云芝多糖作为辅剂已成功用于肝炎病毒的治疗上3 。张莅峡1 3 等 选择5 种r n a 和d n a 类病毒，在l 9 2 9 ( , - j 鼠传代纤维母细胞) 及h e l a ( 宫颈癌 浙江夫学坝f j 学位论文 佛手多糖分离纯化、结构分析及抗氧化聊f 究 细胞株) 细胞上进行抗病毒作用的实验研究。结果对水泡性口炎病毒( v s v ) 、 单纯疱疹病毒i 型( h s v i ) 和柯萨基病毒b 3 型( c b 3 v ) 三种病毒均有明显的 抑制作用，对腺病毒i i i 型病毒抑制作用稍弱。于红1 4 等报道了从钝顶螺旋藻中 提取的一种水溶性多糖类化合物，即钝顶螺旋藻多糖( p s p ) ，在培养细胞内抗 单纯疱疹病毒i 型( h s v i ) 作用的研究。以不同剂量的p s p 作用于病毒复制 周期的各个阶段，以病毒半数感染量( t c i d 5 0 ) ，细胞病变( c p e ) ，蚀斑形成 ( p f u ) ，m t t 染色细胞保护率( m t t 法) 及核酸分子杂交作为评价指标，判断药 效。结果表明：p s p 对v e r o 细胞毒性极低；对h s v i 无直接灭活作用，可干 扰病毒向宿主细胞吸附，且经p s p 预处理的细胞，能明显阻滞病毒产生细胞 病变p s p 可有效地抑制病毒复制，但不影响病毒的释放；p s p 可明显抑制h s v i 糖蛋白g g m r n a 的表达。 ( 3 ) 抗衰老 免疫系统与机体的衰老有密切关系，免疫功能下降或紊乱引起胸腺萎缩，t 细胞损耗从而导致机体衰老，多糖能从整体上提高机体免疫功能，延缓衰老。孙 文娟”等用北五味子粗多糖以一定剂量连续对小鼠灌胃3 7 d 观察小鼠的存活时 间、连续游泳时间和免疫器官重量试验。大鼠连续灌胃2 0d ，测血清l p 0 含量 和s o d 活性。结果发现北五味子粗多糖能明显提高小鼠耐氧及抗疲劳能力。增加 正常小鼠疫器官重量。并明显增强小鼠网状内皮系统的吞噬功能。可明显降低老 年大鼠血清过氧化脂质( l p 0 ) 含量，提高超氧化物歧化酶( s o d ) 活性，具有抗衰老 作用。南沙参多糖”能降低老龄小鼠肝、脑脂褐素含量，显著抑制老龄小鼠血清 中丙二醛的生成；提高老龄小鼠红细胞中超氧化物歧化酶及全血中谷胱甘肽过氧 化物酶的活性；可使老龄小鼠肝、脑中b 型单胺氧化酶的活性降低。同时，南沙 参多糖还可延长果蝇的平均寿命和最高寿命，具有抗衰老作用。 1 3 2 防止动脉粥样硬化作用 多糖具有抗凝血和降血脂作用，防治动脉粥样硬化疗效确切，使动脉粥 样硬化病程减慢，病变减弱，已形成的病变停止发展。多糖防治动脉粥样硬 化主要通过降血压、降血脂、抗凝血作用来实现。现已发现的具有降血脂活 4 浙江人学硕士学位论文 佛手多糖分离纯化、结构分析及抗氰化研究 性的多糖有海带多糖、褐藻多糖、甘蔗多糖、硫酸软骨素、灵芝多糖、茶叶 多、紫菜多糖等。银耳多糖可明显降低高脂血症大鼠血清游离胆固醇、胆固 醇脂、甘油三酯、脂蛋白含量，降低高胆固醇血症小鼠总胆固醇含量，并可 预防小鼠高胆固醇血症的形成7 。自1 9 1 6 年从肝脏提得肝素并用作抗凝血剂 以来，不仅肝素的来源和应用有了进展，又发现了藻酸( a l g i n i ca c i d ) 、昆布多 糖、海带多糖等抗凝血作用。肝素是一种应用临床的天然抗凝血剂，可通过 抑制凝蛋白酶原转变为凝血酶，固有抗凝血作用。褐藻多糖普通具有抗凝血 活性。王静风”等发现枝管藻多糖能够显著延长小鼠全血凝血时间、大鼠体外 凝血酶原时间和白陶土部分凝血活酶时间，且呈明显的量效关系，提示抗凝 血作用。 1 3 3 降血糖作用 t a d a s h ik i h o ”等从真菌p e s t a l o t i o p s i s 中提取了一种半乳甘露聚糖p s n ， 半乳糖与甘露糖比为1 ：9 ，p s n 分子量为2 4 0 0 0 ，是一种高分枝的杂多糖。结 构以0 ( 1 3 ) - d - 呋喃半乳糖为主链，末端为非还原的1 3 一d 呋喃半乳糖残基， 一d 一甘露糖残基同酵母甘露聚糖。p s n5 0 m g k g 能显著降低正常小鼠和链脲 佐菌所致的糖尿病小鼠的血糖。姜秀莲等报道，银耳多糖2 5 0 m g 、5 0 0 m g 及 1 0 0 0 m g k g 能明显降低四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖水平，亦可显著降低高血糖 动物及正常动物血糖含量，升高血清胰岛素水平。在注射四氧嘧啶前4 小时 口服银耳多糖3 0 0 m g k g ，小鼠血糖含量明显降低，葡萄糖耐量曲线恢复正常， 表明银耳多糖对四氧嘧啶引起的糖尿病具有预防作用2 0 。 1 3 4 疫苗作用 这类作用多糖主要为病原性细菌的荚膜多糖。该多糖作为细菌的表面结 构成份。在动物或人体内具有一定的免疫原性，刺激机体产生相应的抗体细 菌荚膜多糖属于非胸腺依赖性抗原，它不能在主要组织相容性复合物蛋白上 存在和加工，从而不能对t 辅助细胞( t h ) 进行激活，缺乏成熟的t h ，机体只 能产生i g m 主导的抗体反应，由i g g 引发的抗体反应很少。因此本身诱导抗 浙江人学硕士学位论文 佛手多糖分离纯化、结构分析及抗氧化研究 体产生的能力较弱，维持时间也很短。为克服这一缺陷，将多糖菌苗与其外 膜蛋白、脂多糖或胸腺依赖性载体( 如d t p ，t t p ) 结合，使之成为胸腺依赖性 抗原，激发t 和b 淋巴细胞的协同作用，能够大大增强其免疫原性，此项工 作已在脑膜炎球菌和流感杆菌菌苗的研制中获得成功。脑膜炎球菌荚膜多糖a 型结合疫苗1 9 9 9 年在英国得到推广应用，并获得成功。2 1 1 3 5 抗溃疡作用 高益槐等观察从赤芝提取的氨基葡聚糖对实验性溃疡大鼠的保护作用， 大鼠溃疡造型用应激法( 冷水中游泳3 0 m i n ) 、醋酸法、消炎痛法和幽门结扎法 诱导产生。结果表明：氨基葡聚糖与雷尼替丁对照同样可以降低胃中氢离子 浓度( p 2 0 0 万) 上同一条柱，求出柱的空体积v0 ， 根据ve v0 与l0gm 之间存在着线性关系，可绘制标准曲线。最后，将待测 样品按上述不变的条件上柱，求得待测多糖的ve 。通过标准曲线上的ve v 0 ，查得待测多糖的分子量对数，便可求出m 。此法测分子量比较耗时，有条件 的情况下，一般用凝胶渗透色谱法( g p c ) 3 7 , 3 8 ，原理与凝胶过滤一样，其柱 填料由刚性和半刚性材料制成。凝胶柱己经商品化，目前较好的是l o n p a k 系 和t s k 系，前者用于分离多糖，用水作洗脱剂，后者即可分离多糖又可分离 蛋白质，用缓冲液如磷酸盐作洗脱剂。分离时间短通常3 0 分钟内完成，但是 要配备r i 检测器。对于粘度大的多糖，可采用粘度法求分子量。亦有用蒸汽压 渗透法，此法用于一些寡糖的分子量测定是很有利的，但它最大的缺点是测定 的结果是数均分子量，而由糖复合物( 特别是糖蛋白) 得到的寡糖在多数情况下 是不均一的，因此不能精确地了解某一糖链混合物中各个组分的分子量。此外 还有超离心法、光散射法、端基法、玻璃纤维纸电泳、聚丙酰胺凝胶电泳测 分子量1 3 ，多糖分子量不是均一的，采用不同性质的测定方法没，应当说明测 定方法的性质。 9 浙江人学顾上学位论文 佛手多糖分离纯化、结构分析及抗氧化研究 1 , 4 2 3 多糖的结构测定 ( 1 ) 多糖的水解 根据多糖一级结构的定义，要分析一级结构，首先要解决的问题是如何 把多糖水解成单糖，常用化学方法水解多糖，水解法包括完全酸水解、部分 酸水解、乙酰解和甲醇解等。i ) 完全酸水解：将多糖以强酸( 硫酸、盐酸) 等试 剂作用，在一定温度下( 8 0 1 0 0 。c ) 进行完全酸水解( 4 1 0h ) 。水解的难易程度与 组成多糖的单糖性质、单糖环的形状和糖苷键的构型有关。一般呋喃糖苷键 较吡喃型易水解，a 型较b 型易水解，含有糖醛酸或氨基糖的多不易水解，当然 水解也受条件影响，如用一般无机酸则( 1 4 ) 一键较( 1 6 ) 键易水解，但如用醋 酐( 含5 硫酸) ，则( 1 6 ) 键也容易水解。通常己糖的水解条件为1 mol l 硫 酸1 0 0 。c 4 小时，戊糖为0 2 5 mol l 硫酸7 0 * ( 2 8 小时，但水解氨基葡聚糖就要 用4 m ol l 盐酸1 0 0 c 9 小时。i i ) 部分酸水解：利用多糖链中部分糖苷键如 呋喃型糖苷键、位于链末端的糖苷键和支链上的糖苷键易水解脱落，而构成糖 链的主链重复结构的部分和糖醛酸等对酸水解则相对稳定的特点，对多糖常采 用部分酸水解法处理。用弱酸水解( 通常用o 0 2 mol l 无机酸) 就以得到这些 糖残基形成的糖苷键，这也有助于某成环类型的确定。部分水解没有规范的操 作过程，水解时所有的酸的强度和水解时间的掌握都很要，这些往往是通过 预实验来决定”。 ( 2 ) 单糖的分离与测定 水解之后的多糖经中和、过滤，可采用纸层析( pc ) 、薄层层析( tlc ) 、 气相色谱法( gc ) 、液相色谱法( hplc ) 和离子色谱法1 3 进行分析。多糖水 解产生物的gc 分析，通常是先经衍生化处理成易挥发组成分，常用的衍生化 方法有硅烷基化和乙酰化处理”。经柱前衍生化的单糖也可用液相色谱来分析 “。通常它可直接进样测定，用示差检测器来检测单糖。离子色谱法不需要衍 生处理，而且检测灵敏度甚至比hplc 法更高。离子色谱法的原理是将样品 经强碱性物质离子化后，通过离子色谱柱经脉冲安培检测器检测。 ( 3 ) 糖链结构的分析 用于糖链结构分析的主要有化学法、免疫法、酶法和波谱法。 l o 浙江人学硕上学位论文 佛手多糖分离纯化、结构分析及抗氧化研究 化学法 高碘酸氧化法：高碘酸可以选择性的氧化断裂糖分子中的连二羟基或连 三羟基处，生成相应的多糖醛、甲酸，反应定量地进行。每开裂一个c c 键消耗 一分子高碘酸，通过测定高碘酸的消耗量和甲酸的生成量，可以判断糖苷键的 位置、连接方式、支链状况和聚合度等结构信息。以葡萄糖为例，以1 2 或1 4 键合的葡萄糖基经高碘酸氧化后，每糖基消耗一分子高碘酸，无甲酸生成；而 1 6 键合的葡萄糖基消耗二分子高碘酸，生成一分子甲酸；以1 3 键合的糖基 不被高碘酸氧化。高碘酸的氧化反应必须在控制的条件下进行，以避免副反应 的产生( 超氧化反应) 。一般使多糖与最小量的高碘酸反应，溶液ph 值控制在 3 - 5 ，且应避光、低温，同时需做空白试验。 s mit h 降解：s mi t h 降解是将高碘酸氧化产物还原后进行酸水解 或部分水解。由于糖基之间以不同的位置缩台，用高碘酸氧化后则生成不同的 产物，由降解产物来获取多糖的结构信息。以1 4 、l 一6 糖苷键的己糖基为例， 其高碘酸氧化、sm it h 降解反应如图1 1 甲基化反应：将多糖中各种单糖残基中的游离羟基全部甲基化，进而将甲 基化多糖水解，水解后得到的化合物，其羟基所在的位置即为原来单糖残基的 连接点。根据不同甲基化单糖的比例，可以推测这种连接键型在多糖重复结构 中的比例。多糖的甲基化方法较多，有p u r d i e 法、h a m o r t h 法、m e n z i e s 法、 h a k o m o r i 法等。甲基化反应的关键在于甲基化完全，通常采用红外光谱法来检 测3 5 0 0cm 1 外有无吸收来判断是否甲基化多糖中含有游离oh 。目前，最常 用的甲基化方法是改良h a k o m o r i 法“。改良h a k o m o r i 先将样品溶于无水二 甲亚砜中，然后与甲基亚磺酰甲基钠( sm sm ) 反应，使多糖上游离羟基离子化， 多糖成为阴离子后，易与ch3i 反应。通常该法需重复数次进行，多糖甲基化完 全后，水解成甲基化单糖，经乙酰化后通过gc 或g c ms 分析，也可用hpl c 直接进行分析。 免疫法4 单糖与多糖本身并没有抗原性，通过化学方法( 如戊二醛法、过碘酸氧 化法等) 将它们与载体( 如牛血清白蛋白、麻仁球蛋白) 制成一种偶联物， 就可获得抗原性，尔后用其对选择的动物进行免疫，即可产生抗血清。该抗 浙江大学硕士学位论文 佛手多糖分离纯化、结构分析及抗氧化研究 血清与相应的半抗原有特异的亲各力，而与其相应半抗原衍生物只有不同程 度的亲和力。通过测定半抗原对特异的抗血清与偶联物结合的抑制常数，再与 己知结构的糖链相比较，有相近抑制常数的多糖，其结构也相似，这就是利用免 疫方法分析糖链结构的原理。 酶法4 3 ，“ 酶学测定法。糖苷酶是研究糖苷链结构必不可少的一种工具。这是由于 它们具有高度的底物专一性，尤其对糖苷连接的异头体的构型( n b ) 和糖残 基的绝对构型( d l ) ；至于对糖残基成环的方式( n i l 喃环还是呋喃环) 、连接方式 ( 1 2 、1 3 、1 4 或1 6 ) 是否存在分支以及配糖体的性质等方面的要求，就 不是非常严格，可以有些变动。它在糖链结构研究中的应用，主要是：确定糖链的 残基的顺序，阐明糖链的一级结构；以及确定每个组成单糖残基的异头体构型。 在完成上述的目标时，所用的酶都是外切糖苷水解酶，而内切糖苷水解酶主要 是用于从糖复合物中释放出糖链，以及了解糖链和非糖部分的连接情况。有时 也可将长的糖链切断为较短的寡糖片段，以利于结构分析。 波谱法4 红外光谱仪和拉曼( rar na1 1 ) 光谱：红外光谱仪是分析多糖结构有力的 工具，例如多糖的特征吸收峰来鉴定多糖，3 6 0 0 3 2 0 0 c m 1 吸收峰为o h 的伸缩 振动；3 0 0 0 2 8 0 0c m d 吸收峰为c h 3 ，c h 2 ，c h 等的c h 伸缩振动。1 2 4 0c m 一、 8 2 0c m 。1 有弱吸收峰，分别为s = o ，c o s 伸缩，表明含有硫酸基4 5 。8 9 0c m “ 吸收峰来判别1 3 一糖苷键的存在，8 4 0c m 。1 吸收峰来判别n 糖苷键的存在，吡哺 糖苷在1 1 0 0 1 0 1 0c m d 间应有三个强吸收峰，而呋喃糖苷在相应区域只出现两 个峰，8 1 0 、8 7 0c m 。1 是甘露糖的吸收峰，1 2 6 0 与1 7 3 0c m 。1 是酯基或o 一一乙酰基 的特征。此外红外光谱在3 5 0 0c m “处有无吸收常用来判断甲基化反应是否完 全。拉曼光谱的使用范围和作用与红外光谱相似，但具有前者所没有的长处，如 可直接用固体样品测定且吸收峰较光滑的特点。 质谱法 质谱不能直接用以糖链的研究，需要用其他化学方法标记，常用的有过 碘酸盐氧化一f a b - m s 法、乙基标记法、直接f a b m s ( 快速原子轰击质谱1 法测 糖基的顺序。含有邻二羟基的糖基被过碘酸盐氧化后碳碳键断裂形成两个醛 浙江人学硕17 学位论文 佛手多糖分离纯化、结构分析及抗氧化研究 基，并使糖环被打开，用n a b d 。将醛基还原就形成多羟基聚合物。这种甲基 化产物可提供很多关于连接及顺序的信息。乙基标记法的基本思路是对全甲 基化的多糖或大分子寡糖进行部分水解，得n d , 分子寡糖用乙基标记部分水 解发生的位置，用g c m s 法确定小分子寡糖的结构，再从寡糖互相重叠的情 况推断分子的结构。直接f a b m s 可以了解分子量和样品均一性的情况。 核磁共振法 1 hnm r 主要解决多糖结构中糖苷键的构型。多糖中不同糖苷键的相对 含量可以根据峰面积之比求得，即可以测定多中各种残基的比例。尽管糖链 中氢谱重叠十分严重，但5 0 0 或6 0 0 m hz 的高分辨1 h n m r 能准确测定结构 表征基团的位移和峰宽。”cn m r 不但能确定各种碳的位置，而且还能区别 分子的的构型和构象。带有微型计算机的傅立叶转换的应用使那些天然丰度 较低的1 3 c 、”n 得到满意的n m r 谱图，e l # i , ，2 d n m r ，1 3 c 、1 5 n 、3 1 p 的 nm r 数据对糖链一级结构分析是必不可少的。对于n 连接的糖链完备的1 d n mr 数据库已经建立，并已成功应用于糖肽和糖蛋白上n 糖链的结构4 6 的分析。”c n m r 谱较1 h n m r 更具有实用性。1 3 c n m r 的6 可达2 0 0 ppm 以上，讯号清晰。此外，nmr 也应用于糖链二级结构的研究。 多糖的结构分析是糖化学的核心所在，也是分析分子结构与功能的关系 的基础，表1 1 是对多糖结构分析方法的比较。 1 4 2 4 多糖构象分析 这里多糖的构象是指多糖的高级结构，迄今为止，已有几百种多糖得到 分离纯化，并确定了其一级结构，同时也发现多糖的一级结构与基生物活性 有关，但越来越多的研究表明多糖的生物活性与其二级结构更为密切。常用 于多糖构分析的方法有x 射线纤维衍射、园二色散( c d ) 、理论算法、电子 衍射等。以前经常用经典的单晶x 射线衍射法来研究多糖的立体结构，而且 也取得了很大进展，但是绝大多数多糖不能形成单晶，通常以粉末存在，不 适合做单晶。x 射线纤维衍射的出现则弥补了这一不足，加上立体化学方面的 信息包括键角、键长、构型角和计算机模拟数据就可以准确地确定多糖的构 型。进行x 射线衍射样品必须高度有序，至少在样品中存在足量的微晶。多 浙江大学硕 学位论文 佛手多糖分离纯化、结构分析及抗氧化砷f 究 糖通常不能结晶，必须通过外界诱导才能呈现相当部分的微晶态。x 射线纤维 衍射一般采用多糖溶液溶于纤维扩张器中，让其在控制条件下干燥即可”。 表1 - 1 多糖结构分析方法的比较 1 5 多糖结构与功能关系 多糖结构与功能关系的研究在生命科学领域越来越重要，是一个复杂的 课题。影响多糖生物学活性的结构因素包括多糖的主链性质、支链性质和多 糖分子的高级结构，多糖的理化性质如分子质量、溶解度和强度等在一定程 度上影响多糖活性的发挥。其中多糖主链的糖单元组成、糖苷键类型均直接 决定多糖的活性，多糖支链的类型、聚合度、支链在多糖链上的分布及其取 代度决定多糖活性大小，多糖分子的高级结构如链的柔韧性和空间构像与多 糖的活性紧密相关4 8 。 1 4 浙江人学硕上学位论文 佛手多糖分离纯化、结构分析及抗氧化研究 1 5 1 多糖初级结构与活性关系 ( 1 ) 主链组成与糖苷键类型 多糖主链上相邻糖基的连接方式( 即糖苷键的类型) 是决定多糖活性的重 要因素。抗肿瘤活性多糖结构研究表明4 9 5 0 山茶曲霉的黑曲霉多糖因为它是由 ( 1 3 ) 和( 1 4 ) 连接的d d 一葡聚糖，因易被淀粉酶断裂水解，从而表现为无抗 肿瘤活性，异地农多糖也是n d 葡聚糖，但是以( 1 - - 3 ) 键连接的部分多，即使淀 粉酶水解了某- - ( 1 4 ) 键，( 1 3 ) 键连接的部分影响宿主的时间也是足够长的， 因此有抗肿瘤活性。一般( 1 3 ) 一一d 葡聚糖和1 3 一d 葡聚糖主链( 1 3 ) 键占优 势，就有活性，以1 3 ( 1 - - 6 ) 连接的d 一葡聚糖活性就低。同是以葡聚糖为主链的多 糖，香菇多糖具有较强的抗肿瘤活性，而淀粉则无任何生物学活性，这在一 定程度上源于两者主链糖苷键的类型不同，前者为( 1 ，3 ) 键型，后者为( 1 ，4 ) 键型。研究表明，多数具有突出生物学活性的葡聚多糖都以( 1 ，3 ) 糖苷键连接； 凝结多糖是一种( 1 ，3 ) 葡聚糖，地衣多糖是由3 3 ( 质量分数，下同) ( 1 ，3 ) 一 葡聚糖和6 6 ( 1 ，4 ) 一葡聚糖组成的混合多糖，d e m l e i t n e r 等比较了两者糖基 衍生物的抗肿瘤活性，在相同取代条件下，凝结糖衍生物的抑瘤率远大于地 衣多糖衍生物，说明( 1 ，3 ) 键型比( 1 ，4 ) 键型在葡聚多糖及其衍生物的抗肿瘤 活性中作用更大5 1 。除了葡聚糖外，其他多糖的活性也受到糖苷键类型的影响， 如具有抗肿瘤活性的甘露多糖为( 1 ，6 ) 键型；活性半乳多糖则以( 1 ，3 ) 键型连 接。从菌体中提得的活性多糖一般由葡萄糖组成，而且葡聚糖主链上b ( 1 3 ) 的苷键和支链上1 3 ( 1 6 ) 的苷键为必须，因为连接的支链可以使连接的主链具 有水溶性”。 ( 2 ) 硫酸根 从构效关系上讲，硫酸化是多糖类抗h i v 的必要条件，且每个糖单元的 s 0 4 。含量低于2 个者都仍无抗h i v 活性，而含2 - 3s 0 4 2 - 个者才能获得最佳抗 h i v 活性，如小分子量的牛腺多糖无抗病毒活性，引入一定量的硫酸基团后，就 有了较强的抗乙型肝炎病毒活性。而且藻酸硫酸化后具有抗凝血作用，含硫量 达1 7 ，呈现显著的抗凝血作用5 2 。香菇多糖本身只有抗肿瘤活性，硫酸化后 具有抗h i v 活性，能抑制h i v - i 产生的细胞病变非硫酸化葡聚糖、木糖呋喃 聚糖、核糖呋喃聚糖、肝素和凝胶聚糖无抗h i v 活性，不抑制逆转录酶，但 浙江火学硕十学位论文 佛手多糖分离纯化、结构分析及抗氧化研究 硫酸化后有抑制逆转录酶的活性。显然硫酸根在h i v - i 生长过程中起了重要作 用5 3 。 1 5 2 多糖的高级结构与活性关系 多糖高级结构研究还比较少，但科学家己肯定多糖的高级功能的影响比 一级结构要重要得多，x 一衍射线分析表明，香菇多糖及长褶多糖均具b 三股 绳状螺旋型立体，在香菇多糖加入尿素或二甲亚砜，其活性丧失，这二种多 糖的比旋光度在水溶液和在尿素或二甲皿砜中的不同，暗示多糖立体构型改 变，从而引起活性丧失”。 1 5 3 多糖理化性质与活性关系 水溶性与分子量与活性的关系 多糖溶于水是其发挥生物学活性的首要条件，如从获苓中提取的多糖组 分中，不溶于水的组分不具有生物学活性，水溶性组分则具有突出的抗肿瘤 活性。向多糖引入分支可在一定程度上削弱分子间氢键的相互作用，从而增 加其水溶性，如具有n 葡聚糖构型的灵芝多糖，不溶于水，羧甲基化后溶解 性提高，在体外表现出一定的抗肿瘤活性。经红外光谱分析，羧甲基化后， n 一葡聚糖在3 4 0 0 c m 。1 处的羟基伸缩振动峰变窄，且向高波长方向振动，说明 分子间的氢键在引入羧甲基分支后被破坏5 5 。有些含有疏水分支的多糖不溶于 水，经过氧化还原成羟基多糖后才溶于水，从而产生生物活性5 6 。多糖分子 质量越大，分子体积越大，不利于多糖跨越多重细脑膜障碍进入生物体内发 挥生物学活性。褶多糖起初由于分子质量太大，影响临