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石斛的离体培养及遗传稳定性的分子检测 摘要 石斛属( d e n d r o b i u m s w ) 是兰科( o r c h i d a c e a e ) 多年生草本植物。在本草纲目 中石斛被列为上品，具有明目强身、镇痛消炎、抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力等功 效。本研究以金钗石斛为材料，在离体培养、遗传稳定性两领域开展了工作，以期为资 源的离体保存、快繁等提供理论指导和构建技术平台，现取得以下结果： 1 茎段离体培养技术的建立与优化 选用金钗石斛的嫩茎为外植体，用7 0 酒精浸泡3 0 s 后，分别用以下两种方式灭菌， 1 ) 0 1 升汞灭菌1 2 m i n ，2 ) 0 1 升汞+ 数滴t w e e n 8 0 灭菌l o m i n ；两种灭菌方式的灭 菌效果差别很大，污染率分别为7 3 3 、1 6 7 。随后接种在m s + b a ( 1 o m g l ) + n 从 ( o 4 m g l ) + 蔗糖( 3 o ) + 琼脂粉( o 7 ) 培养基上，萌发后转接到m s + b a ( 1 2 m g l ) + n a a ( 0 4 m g l ) + 蔗糖( 3 0 ) + 琼脂粉( 0 7 ) 培养基上，通过器官型方式，诱 导侧芽的萌发增殖；壮苗培养以绑s + n a a ( 0 5m g l ) + i b a ( 0 5m g l ) + 蔗糖( 2 o ) + 琼脂粉( 0 7 ) 培养基上效果最佳；生根培养以纵s + n a a ( 1 0m g l ) + 蔗糖 ( 2 o ) + 琼脂粉( 0 7 ) 培养基上效果最佳；移栽时将一次性塑料杯底部及四周打 上孔，先放入两个松果后再铺上苔藓或者树皮均能获得9 0 以上的移栽成活率。 2 金钗石斛愈伤组织培养体系 愈伤组织诱导：采用无菌试管苗的茎段诱导愈伤组织，不同的基本培养基、生长激 素、细胞分裂素及激素浓度对愈伤组织的诱导上有一定差异，诱导率为改良m s ： m s 嘲s 改良m s 。；n a a i b a ；b a k t ：在m s + n a a ( o 8 m g l ) + 队( o 5 m g l ) + 蔗糖 ( 3 0 ) + 琼脂粉( 0 7 ) 培养基上诱导率稍高。 愈伤组织增殖：经综合评定，m s 啪s 改良m s 。 改良m s 。；n a a 、i b a i 从；蔗 糖 葡萄糖；在m s + n a a ( 0 8m g l ) + b a ( 0 5 m g l ) + 蔗糖( 3 0 ) + 琼脂粉( 0 7 ) 培养基上增殖效果最好，约9 0 d 左右增殖倍数可达2 3 9 8 倍。愈伤组织培养的最佳 时间是9 0 一l o o d 。 愈伤组织再分化：g a 对愈伤组织的再分化效果极强，远远强于b a 、k t ，当g a 浓度 为0 5 1 o m g l 时有利于诱导愈伤组织再分化，出苗整齐，生长状况好。 丛生芽壮苗增殖培养：经愈伤组织再分化形成的丛生芽在m s + i b a ( o 4 m g l ) + 蔗 糖( 2 0 ) + 琼脂粉( 0 7 ) 培养基上增殖效果及苗的生长状况最好。 3 愈伤组织遗传稳定性的r a p d 检测 采用4 2 个随机引物对金钗石斛不同继代次数的愈伤组织d n a 进行r a p d 检测，结果 表明，愈伤组织在继代1 5 代以内，没有检测到遗传变异，但在1 6 代时，d n a 分子标记变 异率为o 1 1 。 关键词：金钗石斛，离体培养，茎段，愈伤组织，遗传稳定性，分子标记 4 石斛的离体培养及遗传稳定性的分子检测 a b s t r a c t d e n d r o b i u m , ag e n u sf r o mo r c h l d a c e a ei sak i n do fe l i t eh e r b a g ep l a n t si n c h i n e s et r a d i t i o n a lm e d i c i n e ，w h i c hc h a r a c t e r i z e di nm u l t i p l ef u n c t i o n s ，s u c h a si n s e n e s c e n c e - r e t a r d i n g a n d c a n c e r p r e v e n t i n g ，e y e b r i g h t e n i n g a n d b o d y s t r e n t h e r i n g 、i m m u n e i m p r o v i n ge t c t os a t i s f yt h ei n c r e a s i n gd e m a n do f g e r m p l a s mc o n s e r v a t i o n ，m i c r o p r o p a g a t i o n ，a sw e l la st h ef u r t h e re x p l o i t a t i o n ， j 力v i t r oc u l t u r ea n dg e n e t i cs t a b i l i t ye v a l u a t i o nt ot h ei nv i t r om a t e r i a l so f t h e s eg e r m p l a s m sw e r ec a r r i e do u ti nt h i sp r e s e n ts t u d y t h em a i nr e s u l t sa r e a sf 0 1 l o w s ： 1e s t a b l i s h m e n to fa s e p t i cc u l t u r e sf o rs h o o ts e g m e n t s a f t e rr i n s i n gw i t ht a pw a t e r ，s h o o ts e g m e n t so fd e n d r o b i u mn o b i l ew e r e f i r s t l yd i p p e di n7 0 e t h a n o lf o r3 0s s e c o n d l y ，t h e yw e r es u r f a c e s t e r i l i z e d b yi m m e r s i o ni n ：1 ) o 1 ( w v ) h g c l2 f o r1 2 m i n ：2 ) 0 1 ( w v ) h g c l 2w i t h3 - 5 d r o p so ft w e e n8 0f o r1 0m i n t h ee f f e c to ft h et w om e n t h o d sw e r eq u i t ed i f f e r e n t ， a n dc o n t a m i n a t i o nr a t ew e r e7 3 3 a n d1 6 7 ，r e s p e c t i v e l y t h e nt h es h o o t s e g m e n t sw e r ei n o c u l a t e di nm s + b a ( 1 0m g l ) + n a a ( 0 4m g l ) + s u c r o s e ( 3 o ) + a g a r ( o 7 ) f o rg e r m i n a t i o n c o n s e q u e n t l y ，i nv lt r os h o o t sw e r et r a n s f e r r e d t om s + b a ( 1 2m g l ) + n a a ( o 4m g l ) + s u c r o s e ( 3 o ) + a g a r ( 0 7 ) f o r m u l t i p l i c a t i o nv i ap r o t o c o r ng e n e s i s 绷s + n a a ( o 5m g l ) + i b a ( o 5m g l ) + s u c r o s e ( 2 0 ) + a g a r ( 0 7 ) g a v et h eb e s te f f e c tf o rs t r e a t h e n i n gs e e d li n g f o l l o w i n gas h o o te l o n g a t i o ns t a g e 煳s + n a a ( 1 0m g l ) + s u c r o s e ( 2 o ) + a g a r ( 0 7 ) s h o w e dt h eb e s te f f e c to nr o o t i n g o n eo rt w op i n e c o n e sw e r ep u t t e d i nt h eo n e - - o f fp l a s t i cc u pw i t hs o m eh o l e sa n dt h e nl a y e dc o n s i d e r a b l el i c h e n o rb a r ko n t h ei nv i t r op l a n t ss h o w e dh i g h e rt h a n9 0 o fs u r v i v a l 凹v i f r o a f t e rt r a n p l a n t i n g 2c a l l u si n d u c t i o na n dr e g e n e r a t i o n i nv l t r os h o o t s e g m e n t so f d e n d r o b i u mn o b i l ew e r ee m p l o y e dt oi n d u c e c a l1 u s d i f f e r e n tb a s a l m e d i u m ，t y p e s a n dc o n c e n t r a t i o no fp l a n t g r o w t h r e g u l a t o r s ( p g r s ) d i v e r s e l ys h o w e dc a l l u sf o r m a t i o na b i l i t y t h eo d e r so fc a l l u s f o r m a t i o nr a t ei sa sf o ll o w s ：1 ) m o d i f i e dm s 2 ( mm s 2 ) m s 1 2 m s m o d i f i e dm s l ( m m s l ) ：2 ) n a a i b a ：3 ) b a k t t a k i n gt h ea b o v e - m e n t i o n e df a c t o r s i n t o c o n s i d e r a t i o n m s + n a a ( o 8m g l ) + b a ( 0 5 m g l ) + s u c r o s e ( 3 0 ) + a g a r ( o 7 ) s h o w e dt h eb e s te f f e c t w i t ht h ea d d i t i o no fn a a ( 0 8m g l ) ，b a ( 0 5 m g l ) ， 5 0，_矗 石斛的离体培养及遗传稳定性的分子检测 s u c r o s e ( 3 0 ) ，m sg a v et h em o s te f f i e n tm u l t i p i c a t i o no fc a l l u s ，f r o mw h i c h t h em u l t i p l i c a t i o ni n d e xc o u l dr e a c h2 3 9 8a t9 0 “d a ya f t e rt r a n s f e r a m o n gt h ep g r st e s t e d ，g as h o w e dt h eb e s te f f e c to nc a l l u sr e d i f f e r e n t i a t i o n w i t ht h es u p p l e m e n to f0 5 - - i o m g lg ai nt h em e d i u m 。t h em o s te f f i c i e n tb u d f o r m a t i o nw e r eo b t a i n e df r o mt h ec a l l u s ，a d d i t i o n a l l y ，t h ei n d u c e db u d s d e m o n s t r a t e dv i g o r n e s s ，a n dc o u l de a s i l yd e v e l o pi n t os h o o t s t h e s es h o o t sm i g h t s u b s t a n t i a l l ym u l t i p l yo nt h em sm e d i u ms u p p l e m e n t e dw i t hi b a ( 0 4 m g l ) a n d s u c r o s e ( 3 0 ) 3 g e n e t i cv a r i a t i o nd e t e c t i o no fc a l l u s t oi n v e s t i g a t et h eg e n e t i cs t a b i l i t yo fi nf i f r os h o o t so fp e n d r o b i u m n o b i l b g e n o m i cd n ao fi ny it _ r os h o o t sw i t h i n1 6c y c l e so fs u b c u l t u r ew e r eu s e dt op e r f o r m p c rw i t h4 2a r b i t r a r yp r i m e r s n oa b e r r a n tp r o f i l ew a ss c o r e dw h e nt h ec a l l i w e r em u l t i p l l e da sm a n ya s1 5c y c l e s ，w h i l et h e r ew e r ed n av a r i a t i o ni nc a l l u s a f t e rt h es u b c u l t u r eo f1 6t i m e s ，a n dt h ea b e r r a t i o nr a t ew a s0 1 l k e y , o r d s - p e n d r o b l u m n o b l l e 。i nv l f r oc u l t u r e s h o o ts e g m e n t s 。c a l l u s ig e n e t i c s t a b i l i t y m o l e c u l a rm a r k e r 6 石斛的离体培养及遗传稳定性的分子检测 缩略词表 缩略词表英文名 中文意义 2 ，4 d 姒 i b a n a a b a k t g a m s c m t r i s e d t a b m e e b t a e r a p d 2 , 4 d i c h l o r o p h e n o x ya c e t i ca c i d 3 i n d o l ea c e t i ca c i d 3 i n d o l eb u t y r i ca c i d n a p t h a l e n ea c e t i ca c i d 6 - b e n z y l a d e n i n e k i n e t i n g m b e r e l i n m u r a s h i g ea n ds k o o g m e d i u m c t e y l t r i e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e t r i h y d r o x y m e t h y la m i n o m e t h a n e e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a c e t i ca c i d b - m e r c a p t o e t h a n o l e t h i d i u mb r o m i d e t r i s a c el i ca c i d ，e d t ab u f f e r r a n d o m l ya m p l i f l e dp o l y m o r p h i cd n a 2 , 4 二氯苯氧乙酸 吲哚乙酸 吲哚丁酸 萘乙酸 6 苄基腺嘌呤 激动素 赤霉素 m s 培养基 十六烷基三甲基溴化胺 三羟基氨基甲烷 乙二胺四乙酸 b 一巯基乙醇 溴化乙啶 t r i s ，乙酸，e d t a 缓冲液 随机扩增多态性d n a 型旦! ! ! ：i ! z 1 2 z ：! ! i ! ! ! !鍪圣壁咝堕堡塑 7 石斛的离体培养及遗传稳定性的分子检测 第一章前言及研究进展 1 课题的提出 生物多样性是人类社会赖以生存和发展的物质基础。在2 l 世纪，谁拥有了资源， 谁就拥有可持续发展的主动权，各国政府都不惜花费大量人力和财力加强资源的争夺、 开发利用和法律保护。石斛属( o e n d r o b i u ms w ) 是兰科( o r c h i d a c e a e ) 多年生草本植 物。全世界约有1 0 0 0 种，分布于热带亚洲至大洋州，我国有7 4 种、2 变种；贵州已知 有2 1 种，主产于南部和西南部地区( 陈谦海等，2 0 0 4 ) 。在本草纲目中石斛被列为 上品，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳、明目强身、镇痛消炎等功效；现代药理研 究表明，石斛还具有抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力、扩张血管及抗血小板凝集等作 用( 王宪楷和赵同芳，1 9 8 6 ；马国祥等，1 9 9 4 ：王天山等，1 9 9 7 ；徐红等，2 0 0 1 ) 。此 外，石斛体内富含氨基酸，如铁皮石斛( 口o f f i c l n a l ek i m u r ae tm i g o ) 含有1 7 种氨 基酸，其中包括7 种人体必需氨基酸( 除色氨酸外) 和全部3 种半必需氨基酸( 黄民权等， 1 9 9 7 ) 。另外，石斛属植物也可供观赏，称为石斛兰( o e n d r o b l u mo r c h i d s ) ，以花艳丽 而著称。由于石斛自然分布较少，繁殖率低，又因近年来药用石斛的深入开发和广泛利 用，需要大量石斛作为原材料投入药品的研制和生产，野生石斛资源几乎遭到毁灭性的 开发，加上石斛赖以生存的野生环境遭的不断破坏，导致石斛资源严重匮乏，产量骤减， 我国己将其列为濒于绝灭的受保护的中药品种之一。种质资源遗传多样性降低使培育的 作物品种更易遭受自然灾害和病虫害的灭绝性危害，造成的后果是严重的，只有大力保 护和开拓种质资源的遗传多样性，才能培育出多抗且能适应条件不断变化的新品种。植 物种质资源保存最常用的方法是种子保存和、植保存及活体保存，但石斛由于自身的遗 传和繁殖特点不能用种子保存，只能利用种质资源库进行活体保存( e n g e l m a n n ，1 9 9 l ， 1 9 9 7 ) 。活体保存有一些难以克服的问题，如易遭受自然灾害和病虫害侵袭、维持的劳 动力和技术费用高、不便于进行资源交流等，寻求更经济、实用、安全的保存方法，为 重要种质资源提供必要的备份是非常重要的。怎样保护石斛资源、提高石斛产量，满足 市场需求是当今世界一大问题。 在最近几十年来，离体培养技术得到全面发展，其无菌培养、占用空间小、劳动力 和维持开支少等特点克服了活体保存中难以解决的问题( a s h m o r e ，1 9 9 7 ；e n g e l m a n n ， 1 9 9 7 ) 。目前已经在一些容易保存的模式植物上建立了离体保存技术体系，但这种保存 体系不一定完全适用于所有植物或外植体类型，对种质资源进行大规模保存前，对保存 体系不断进行改进研究是必要的。另外，植物组织培养中的体细胞无性系变异是非常普 遍的现象，而离体保存过程中的遗传变异研究还很少，考虑到遗传稳定性是决定一种保 存方法是否适用的重要条件，在离体保存技术日益成熟的情况下，对保存过程中的遗传 变异进行研究显得更加重要。鉴于此，本研究将对金钗石斛( 口n o b i l el i n d l ) 的快 8 石斛的离体培养及遗传稳定性的分子检测 速繁殖体系的建立进行研究，并对组织培养中可能出现的无性系变异进行监测和研究。 2研究进展 2 1 兰科植物离体培养研究进展 兰科植物是开花植物中最大的家族之一，且是单子叶植物中最高度演化的一科，全 世界约有7 0 0 多属，2 0 ，0 0 0 多种，广泛分布于全球各地，我国约有1 7 3 余属，l ，2 4 0 余 种( 陈心启和罗毅波，2 0 0 3 ；陈俊愉和程绪珂，1 9 9 4 ；陈谦海等，2 0 0 4 ) 。兰科植物的传 统繁殖方式为分株繁殖，繁殖系数低、速度慢，不能满足日益增长的市场需求。k n u d s o 于1 9 2 2 年首次证明兰花种子可以在含有矿质营养和蔗糖的简单培养基上萌发。这一发现 当时在“兰花界”引起不小的影响，这是兰花离体培养的最早报道。后来，法国人m o r e l ( 1 9 6 0 ) 采用大花蕙兰( c y m b i d i u mf a b e r ir o l f e ) 茎尖分生组织诱导形成原球茎，并 分化获得植株后，兰科植物的繁殖方式逐渐朝离体培养的方向发展，而且产业化程度不 断加强，这将是缓解兰科植物供需矛盾的有效方法，也为资源保存提供了一条捷径。 兰科植物对根癌农杆菌或发根农杆菌不敏感，缺乏合适的载体，基因工程起步较晚， 进展缓慢。但随着生物技术的发展，以及对兰科植物育种等研究的需要，生物技术在兰 科植物上的应用面逐渐扩大，例如，利用分子标记技术对兰科植物属间及种间进行分类， 以及应用基因工程进行品质改良等研究都在不断的深入。 2 1 1 外植体来源 用于兰科植物离体快繁的植物材料较多，通常选择种子、茎尖、花梗、叶片、根茎 等，不同种属的兰科植物选材不一样。花梗培养已在万代兰属( i a n c l aw j o n e se xr b r ) ( s a g a w a ，1 9 6 7 ) 、树兰属( e p i d e n d r u m ) ( s i g h ，1 9 8 2 ) 、石斛兰属( s i g h ，1 9 8 2 ) 、文心 兰属( o n c i d i u m ) ( b h o j w a n i ，1 9 9 7 ) 等属中获得成功；春兰( c g o e r i n g i i ( r c h b f ) r c h b f ) 多采用种子( 黄磊等，2 0 0 3 ) ；蝴蝶兰属( p h a l a e n o p s l s b l ) 培养 多用胚( 李听，1 9 9 0 ) 、茎尖和根尖( 傅连芳，1 9 9 0 ) 、花梗腋芽( 彭立新等，1 9 9 9 ) 、花梗 节问( 鲁雪华等，2 0 0 2 ) 等器官为外植体；大花蕙兰常利用种子、茎尖或侧芽等作为外植 体进行繁殖( 谭文澄，1 9 9 1 ；刘青林等，2 0 0 3 ) ；文心兰根诱导的愈伤组织体细胞胚胎植 株的再生率比以茎和叶为外植体诱导的高得多( c h e n 和c h a n g ，2 0 0 0 ) 。 2 1 2 原球茎诱导研究 兰花的组织培养中有几个关键的时期：原球茎的诱导、继代培养及壮苗的培育。通 过原球茎再生途径能大大加快兰科植物的繁殖，而且原球茎的诱导及再分化也是进行基 因工程研究的基础。 种子是较早用于诱导原球茎的材料。c h e n 和c h a n g ( 2 0 0 0 ) 用兰花种子诱导形成原球 茎并再分化形成试管苗。吴丽芳等( 2 0 0 5 ) 用云南独蒜兰( p e i o n e y u n n a n e n s i s r o l f e ) 石斛的离体培养及遗传稳定性的分子检铡 的种子为外植体，在m s + o 2m g l n a a 培养基上诱导形成原球茎。不同的兰花杂交种子 诱导原球茎的能力不同，张志胜等( 2 0 0 1 ) 对部分中国兰花远缘杂交种及其杂交种子的萌 发进行了研究，结果表明兰花杂交种子萌发形成的中间繁殖体的种类和数量，随杂交组 合不同而不同。 用叶片作外植体可减轻或避免对母株的伤害，且叶片数量多，取材又不受季节影响， 是较理想的外植体。大多数以叶片为外植体的成功报道是取试管苗的幼叶为培养材料， 而从成熟植株上取幼叶为外植体培养成功的报道不多。v i j ( v i j ，1 9 8 4 ) 和王怀宇( 1 9 8 9 ) 曾相继报道，啄蕊兰属( r o d r i g u e z i ar d z a ) 和蝴蝶兰属试管苗幼叶原球茎发生率可 达3 0 ，而成熟幼叶对诱导反应极弱。c o m p t o 和p r e e c e ( 1 9 8 6 ) 指出，成熟植物组织向培 养基中释放高浓度的抑制生长的物质，严重影响兰花组织的存活。 植物学家过去认为根顶端分生区是由高度决定的细胞构成，按照p e t e r s o n 的芽根形 成观点，根分生组织转化为芽的可能性极小。但s t e w a r t 和b u t t o r ( 1 9 7 8 ) 用树兰等材料 进行培养，首次成功地获得原球茎，虽然仅从愈伤组织再分化出一个植株，但此后这一 领域得到许多学者的关注，根培养相继在不同兰花中获得成功( t a n a k a ，1 9 7 6 ：k e r b a u y ， 1 9 8 4 ：p h i l i p 和n a i n a r ，1 9 8 6 ：s a n c h e z ，1 9 8 8 ) 。 此外，由于花梗及花芽取材方便，不伤母株，目前用其做外植体的报道不少。 s h i m a s a k i 等( 1 9 9 1 ) 利用春兰幼嫩花芽诱导形成原球茎，并分化大量再生植株。其他 兰科植物上也有不少报道( 谭文澄，1 9 9 1 ；鲁雪华等，2 0 0 2 ) 。 2 1 3 不定芽诱导研究 利用兰科植物的花梗、根状茎等诱导侧芽萌发，然后进行增殖培养也是兰花组织培 养常采取的方式。贾勇炯等( 2 0 0 0 ) 以建兰的花芽为材料，选取幼嫩花枝上部茎节切段， 在m s 培养基中直接分化出花芽和营养芽。王永清和余道平( 2 0 0 5 ) 以春兰成年植株的根状 茎作为外植体，通过诱导不定芽( 器官型途径) 成功地获得再生植株。此外，在大花蕙 兰( 李树和等，2 0 0 3 ) 、墨兰( cs i n e n s ej a c k s o ne xa n d r ) ( 项艳等，2 0 0 3 ) ，蝴蝶兰 ( 潘学峰等，2 0 0 5 ；张元国等，2 0 0 4 ) 等兰科植物上也经常使用此繁殖途径。 2 1 4 原生质体研究 植物原生质体培养既是基因工程的基础，也为育种开辟了一条新道路，兰花原生质 体培养为兰花体细胞杂交奠定了基础。作为单子叶植物，兰花原生质体的融合和培养比 双子叶植物困难。以蝴蝶兰、石斛兰、万代兰为材料，仅得到3 一5 的融合原生质体 ( 丁兰和付庭治，2 0 0 0 ) 。从兰花根尖、茎叶、原球茎、花瓣、愈伤组织、悬浮细胞均可 分离获得原生质体，但分离难度不同。c h e n 等( 1 9 9 0 ) 从几种蝴蝶兰的根、叶、花瓣、原 球茎得到了大量的原生质体，其中，试管苗幼叶能得到高质量的原生质体，存活率约9 0 ，原生质体电融合率达1 0 。目前，己从卡特丽亚兰( 凸t t l e y ah y b r l d aw i l l i a m 1 0 石斛的离体培养及遗传稳定性的分子检测 c a t t l e y ) 、石斛兰、蕙兰( cf a b e r i r o l f e ) 、蝴蝶兰等十几种兰花中分离出原生质体( 丁 兰和付庭治，2 0 0 0 ) 。 2 1 5 基因工程研究 兰花基因工程起步晚，进展缓慢，主要是因为兰科植物对根癌农杆菌或发根农杆菌 不敏感，缺乏合适的载体，而一些直接转移的方法如p e g 介导和电激法成功率又不高。 但近些年从兰花的不同组织中鉴定和分离了许多基因和相关基因片断。y a n g 和 c h u a ( 1 9 9 0 ) 从一种石斛兰分离出了高度表达的色素合成基因，还成功地克隆了蕙兰花叶 病毒外壳蛋白基因，用电子枪轰击法将这一基因导入兰花的原球茎和愈伤组织，得到较 高的转化表达，给兰花基因工程带来了希望。1 9 9 2 年g r i e s b s h 采用虾脊兰属( c a l a a t h e r b r ) 植物的胚顶端分生组织进行基因转化试验，在转化胚的发育植株中检测到倒s 基 因的特异型色斑。b l a r m i n o ( 2 0 0 0 ) 通过农杆菌介导方法，将蝴蝶兰的细胞团与农杆菌进 行共培养，得到1 0 0 多株具潮霉素抗性的蝴蝶兰植株。 2 1 6 影响兰科植物组织培养的因素 影响兰科植物组织培养的因素有基本培养基、外源激素、培养方式( 陈振光，1 9 9 6 ) 、 蔗糖浓度、光照( 徐卫辉和邓国础，1 9 9 5 ) 及原球茎的切割方式( 张志胜和欧秀娟，1 9 9 5 ) 等，这些因素对不同的品种有不同的影响。如春兰要求培养基中无机盐的量少，而蕙兰 要求的量较大，墨兰则不敏感( 陈丽等，1 9 9 9 ；范成明等，2 0 0 3 ) 。王熊( 1 9 8 4 ) 及吴汉珠 等( 1 9 8 7 ) 发现，生长素类对原球茎的诱导有利；细胞分裂素类对原球茎的分化有促进作 用。谷祝平和颜廷进( 1 9 8 9 ) 报道，较高浓度的b a 能促进大花蕙兰原球茎的增殖，较低浓 度b a 促进原球茎分化。k u s u m o t o ( 1 9 8 0 ) 认为2 的蔗糖有利于兰属原球茎的生长；但陈 丽等( 1 9 9 9 ) 发现高浓度蔗糖利于墨兰原球茎的快速生长。 2 2石斛离体培养的研究进展 2 2 1 快繁研究 2 2 1 1 茎段培养 石斛组织培养中常采用茎段为外植体，茎段是获得再生植株和丛生苗的有效途径。 基部茎段的增殖系数及生长速度比上部茎段高：继代增殖苗段比野生植株增殖快( 杨联 河等，1 9 9 8 ) 。金钗石斛组织培养研究较晚，张艳等( 2 0 0 1 ) 于国内首次报道了金钗石 斛的组织培养，得出以取材部位影响最大的结论。随后，高培元等( 2 0 0 2 ) 以带侧芽的金 钗石斛嫩茎段在附力f l b a ( 0 5m g l ) 、n a a ( 0 2m g l ) 的m s 培养基上诱导分化最佳，附加 b a ( 3 0m g l ) 、n 从( 0 5m g l ) 增殖最适。卢文芸等( 2 0 0 5 ) 以环草石斛( nl o d d i g e s l i r o l f e ) 、铁皮石斛、束花石斛( 口c h r y s a n t h u ml i n d l ) 、马鞭石斛和金钗石斛的茎段 为材料诱导侧芽萌发建立快繁体系，首次报道了在实验室获得马鞭石斛和束花石斛的组 1 1 石斛的离体培养及遗传稳定性的分子检测 培苗。其他石斛以茎段作为繁殖材料的报道很多( 朱艳和秦民坚，2 0 0 3 ) ，而有关金钗 石斛茎段培养的报告在国内却很少( 黄肇宇等，2 0 0 4 ；宋锡泉和宋琴曲，2 0 0 4 ； 刘伟等，2 0 0 2 ) 2 2 1 2 其他外植体培养 除种子和茎段作外植体外，石斛的离体培养还可用茎尖、叶片、幼根、种子或种胚 等作为外植体。叶秀磷( 1 9 9 5 ) 以石斛杂交种的幼嫩小叶片为外植体诱导出愈伤组织。石 斛幼根在n 6 + lm g l n a a + lm g l b h 及n 6 + 0 5m g l n a a + o 5m g l b a 培养基上能形成极 易分离的胚状体群或芽簇，将其转到n 6 或m s 培养基上，短期内能培养大批优质组培苗： 叶片在适当培养基中也能从叶脉处诱导愈伤组织，但诱导频率较低( 赵天榜等，1 9 9 4 ) 。 s o b h a n a 和r a j e e v a n ( 1 9 9 3 ) 利用5 种石斛的腋芽分别以v w ，k c ，m s ，m o r e l 培养基进 行离体培养，结果以v w 诱导芽增殖的效果最好；此外，作者用b a 可以产生最大数量的 丛生芽。铁皮石斛、霍山石斛( 1 3 h u o s h a n e n s ec z t a n ge ts j c h e n g ) 、美花石斛 ( 1 3 1 0 d d l g e s i ir o l f e ) 、马鞭石斛( 口f i t a b r i a u mh o o k v a r o c u l a t u mh o o k ) 、金钗 石斛等的种子在无菌培养基上均能萌发形成试管苗。石斛兰属植物胚培养试验和快速繁 殖研究表明：不同种类的石斛兰萌发时具有类似的最适萌发胚龄，石斛兰胚培养的晟适 通用培养基为改良n 6 或特制p t 培养基附加0 2m g l n a a + 2 蔗糖，加入椰乳能提高萌 发率( 曾宋君等，1 9 9 8 ) 。 2 2 2 原球茎培养及次生代谢产物的生产 在组织培养过程中，我们希望以最低的成本获得最高的产量，因此就要寻找一种有 效的方法。对石斛而言，可以直接利用原球茎提取石斛碱等此生代谢产物，这不仅降低 了成本，而且增加了产量，因而原球茎的培养及次生代谢产物的生产非常重要。宋经元 等( 2 0 0 4 ) 对铁皮石斛原球茎液体悬浮培养的可行性以及接种量和培养液体积对原球茎 生长的影响进行了研究。查学强和罗建平( 2 0 0 4 ) 研究了培养基、碳源、氮源及激素组 合对霍山石斛原球茎液体培养生长和多糖合成的影响。悬浮培养时若在培养基中添加 0 5m g l a b a 预培养3 0d ，原球茎的质量提高、同步性更好，可作为人工种子繁殖体( 魏 小勇，2 0 0 4 ) 。宋锡全等( 2 0 0 4 ) 用金钗石斛己开裂果实的种子经无菌处理，播种在改良 的k c 培养基上培养获得原球茎。陈庭和刘伟( 2 0 0 3 ) 对金钗石斛原球茎的生长与石斛 碱及多糖含量积累的关系进行了研究，得出二者与原球茎的生长基本呈正相关关系的结 论。此外，还有部分学者对金钗石斛原球茎的培养做了研究( 王国梅等，2 0 0 5 ，2 0 0 6 ； 刘伟等，2 0 0 2 ) 。石斛原球茎次生代谢产物的研究较晚，n a n 等( 1 9 9 7 ) 首次报道在石斛类 原球茎的组织培养过程中有大量的松柏醇产生。次年，黄民权和卢应京( 1 9 9 8 ) 报道铁皮 石斛愈伤组织培养物和它的原植物在多糖、单糖化学组成及其对外周蛋白细胞数和白细 胞移动抑制指数的影响等方面都存在着明显的相似性。利用发根农杆菌a g r o b a c t e r i u n 石斛的离体培养及遗传稳定性的分子检测 r h i z o g e n e s 的r i 质粒诱导药用植物产生毛状根，进行离体培养，是药用植物资源可持 续发展的有效途径之一( y o s h i k a w a 等，1 9 8 7 ；陈大华等，1 9 9 8 ：王莉等，2 0 0 2 ) 。李风 华等( 2 0 0 4 ) 用发根农杆菌a 4 菌株转化石斛产生毛状根，并对培养条件进行优化，筛选 优良无性系，以期为石斛生物碱的工业化生产奠定基础。由此看来利用石斛组织培养物 进行次生代谢产物生产可解决石斛资源短缺的问题，是一个值得研究的方面。 2 2 3 其他方面 2 2 3 1 离体开花 离体条件下花芽的形成已有不少报道( 王光远等，t 9 9 7 ；温云飞等，1 9 9 9 ) 。王光 远等( 1 9 9 5 ) 将铁皮石斛原球茎接种在m s + 2m g lb a + 0 5m g ln a a 的培养基上，花芽 形成频率为2 7 0 ；而原球茎先在0 5m g la b a 的培养基上预培养1 5d ，再转入含2 m g l b a 的m s 培养基上培养，花芽形成频率明显提高，可达8 4 4 ，而且每株植株花的 数目增加；但是在仅有a b a 的m s 培养基上培养的原球茎再生的植株未见花芽形成。 2 2 3 2 人工种子 植物人工种子( p l a n ta r t i f i c i a ls e e d ) 概念最早由m u r a s h i g e ( 1 9 7 8 ) 提出，它是 指将植物离体培养中产生的体细胞胚或能发育成完整植株的分生组织( 芽、愈伤组织、 胚状体等) 包埋在含有营养物质和具有保护功能的外壳内形成的在适宜条件下能够发芽 出苗的颗粒体。现已发展到运用多种系统包埋种胚、顶芽、小鳞茎等制作人工种子进行 快速繁殖( 魏小勇等，2 0 0 0 ) 。植物人工种子作为一项新兴的生物工程技术，在植物培养 材料的快速繁殖、保藏、运输等方面，展示了广阔的应用前景。石斛是名贵的药用植物， 自然条件下生长缓慢，种子萌发困难，而试管苗移栽成活率低。虽然人工授粉可以大大 提高许多石斛的结果率( 7 2 1 1 0 0 ) ，但繁殖困难，操作费工又费时，若能提高种 子的繁殖能力则能增加石斛的繁殖率，人工种子则是一种值得探寻的方法( 程式君， 1 9 8 6 ) 。郭顺新等( 1 9 9 6 ) 以原球茎为材料，建立了铁皮石斛人工种子的初步制作流程， 人工种子在改良煳s 培养基附加蔗糖的存活率、发芽率和成苗最好，发芽率可达8 0 以 上。张铭等( 2 0 0 1 ) 应用粘土和蛭石粉作基质包埋铁皮石斛种胚来制作人工种子。但直接 用于栽培的人工种子却尚无研究( 徐云鹏和于力文，1 9 8 4 ) 。 2 2 3 3 石斛离体材料的超低温保存 超低温保存是指在一8 0 以下超低温中保存种质的技术，通常称为液氮保存或 l n ( - 1 9 6o c ) 保存( 陈品良，1 9 8 9 ) 。在液氮中，活细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全 停止，植物处在相对稳定的生物学状态( 肖洁凝和黄学林，1 9 9 9 ) 。超低温技术的运用甚 至可能完全抑制保存材料的生长，从而延长继代周期，控制变异的产生，使变异降低到 可以接受的最低程度，并己取得重大进展( 伊华林和邓秀新，1 9 9 9 ) 。n a g 和s t r e e t 石斛的离体培养及遗传稳定性的分子检测 ( 1 9 7 3 ) 首次成功地将胡萝h 的悬浮细胞进行超低温保存。此后，超低温保存技术不断 完善。到目前为止，超低温保存的植物材料已涉及到细胞( 黄纯农等，1 9 9 5 ) 、原生质体 ( 马锋旺和李嘉瑞，1 9 9 8 ) 、愈伤组织( 李嘉瑞等，1 9 9 6 ) 、芽( 艾鹏飞和罗正荣，2 0 0 3 ) 、 茎尖( 曾继吾等，2 0 0 4 ) 、花粉( 石思信等，1 9 9 6 ) 、胚( 李云和李嘉瑞，1 9 9 5 ) 及种子( 胡 晋和龚利强，1 9 9 6 ) 等，并且许多已经植株再生。近年来，随着石斛研究的深化，石斛 离体材料的保存也取得了进展。林伟强等( 2 0 0 4 ) 对超低温保存后的铁皮石斛原球茎的脱 水蛋白进行分析后认为含水量是铁皮石斛超低温保存成功的关键因素。王君晖( 1 9 9 9 ) 研 究铁皮石斛种子、原球茎和类原球茎体的超低温保存，得出冻后存活率分别为9 5 、8 8 、4 8 8 0 。陈勇等( 2 0 0 1 ) 也得出铁皮石斛原球茎冻后存活率为8 8 的结论，同时 还得出原生质体冻后存活率为4 8 的结果。至今，一部分学者对石斛离体培养材料的超 低温保存做出了努力，对材料选择、预处理、化冻方法以及冻后恢复培养基进行了研究， 但比起其它植物在这方面的研究还相对落后。 2 2 3 4 石斛原生质体分离及细胞学观察 原生质体分离是组织培养中的个重要技术，可以用其进行原生质体融合培养单倍 体。詹忠根等( 2 0 0 4 ) 对铁皮石斛无菌试管苗叶片原生质体的游离及培养条件进行了研 究，得到合适原生质体分离的酶液配比，渗透压调节剂种类及浓度；还对原生质体分化 的培养基配方及光照等培养条件进行了研究。 组织培养是进行植物材料细胞学观察的好方法。叶秀磷( 1 9 9 5 ) 对石斛兰杂交种的愈 伤组织进行细胞学观察发现可在同一培养基上同时出现不定芽和类原球茎，且能进一步 发育成完整幼苗，类原球茎和不定芽分别来自愈伤组织的表层细胞和深层细胞；由愈伤 组织、不定芽和类原球茎交错在一起堵塞团块可多次切割继代培养，进行大量无性繁殖。 2 2 3 5 石斛的遗传转化 利用根癌农杆菌介导法获得转基因植物的关键是毒性基因的诱导表达，而在单子叶 植物中常常缺少这种诱导物质( 张明等，2 0 0 0 ) 。n a n 等( 1 9 9 7 ) 发现石斛类原球茎发育早 期产生的大量松柏醇可诱导毒性基因的表达，这使通过农杆菌介导法将克隆的基因转入 石斛类原球茎成为可能。通过基因枪法获得石斛转基因植物也实现，c h i a 等( 1 9 9 5 )