（有机化学专业论文）groupⅡintron编码的成熟酶对intron剪接的影响.pdf

g r o u p i ii n t r o n 编码的成熟酶对i n t r o n 剪接的影响 摘要 g r o u pi ii m r o n 是催化r n a ，可以通过两步连续的转酯反应从前体m r n a 中自剪接，连接两侧e x o n ，释放出典型的套索状i n t r o n 。典型的g r o u pi ii n t r o n 二级结构由六个茎环结构域组成( 结构域i v i ) ，其中结构域i v 环区包含一个 开放阅读框架( o p e nr e a d i n gf r a m e ，o r f ) ，编码多功能蛋白质，该蛋白质一般 具有反转录酶、成熟酶和核酸内切酶三种活性。 本论文研究海洋蓝细菌t r i c h o d e s m i u me r y t h r a e u m 基因组中g r o u pi ii n t r o n 编 码的反转录酶样( r t l ) 蛋白对g r o u pi ii n t r o n 自剪接的作用。ze r y t h r a e u m 的 核糖核酸还原酶( r i r ) 基因中包含3 个g r o u pi ii n t r o n ，其中第一个g r o u pi ii n t r o n ( 以下简称i n t r o n1 1 ) 和第三个g r o u pi ii n t r o n ( 以下简称i n t r o n1 3 ) 都包含一个 o r f ，该o r f 可能编码对i n t r o n 自剪接和移动有重要作用的r t l 蛋白。将i l 编码序列( 删除其中的o r f ) 插入p d r i v e 质粒载体，构建p d r 1 d 表达载体。 将r t l 编码序列插入p a r 3 质粒载体，构建p a r r t l 2 表达载体。因为p a r 3 和p d r i v e 彼此相容，通过电转化将两种表达载体p a r r t l 2 和p d r 1 d 导入 e s c h e r i c h i ac o l i ，筛选得到双质粒菌株，诱导表达，提取总r n a ，r t - p c r ，琼 脂糖凝胶电泳分析鉴定p c r 产物，d n a 检测显示两条带，一条对应于前体r n a ， 另一条对应于剪接r n a 。首次证明在ec o l i 中，r i r 基因的i n t r o n1 1 编码的r t l 蛋白能够帮助i n t r o n1 1 进行自剪接。 将突变的r t l 编码序列插入p a r 3 质粒的p b a d 启动子后，构建表达载体 p a r - r t l m ，与表达载体p d r 一1 d 共同转化e s c h e r i c h i ac o l i 细胞，诱导表达，提 取总r n a ，r t - p c r ，d n a 检测显示只有一条前体条带，说明突变的r t l 不能 帮助i n t r o n1 1 进行自剪接。 另外，将构建含有g r o u pi ii n t r o n 的表达载体p d n l - 4 ( ze r y t h r a e u m 的d n a 聚合酶i i i1 3 亚基基因d n a n 包含4 个g r o u pi ii n t r o nd n a n - 1 ，2 ，3 ，4 ，它们都不编 码r t l 蛋白质) 与p a r r t l 2 表达载体共同转化e s c h e r i c h i ac o l i 细胞，诱导表 达，提取总r n a ，r t - p c r ，d n a 检测显示一条f j 体条带，也说明了r t l 蛋白 不能帮助非同源性的i n t r o n 进行自剪接。 实验证明：在e s c h e r i c h i ac o l i 中，r i r 基因的i n t r o n1 1 是在i n t r o n 自身编码 的r t l 蛋白的辅助下进行自剪接的，而非宿主体内的蛋白质。r t l 蛋白能专一 性的帮助编码它的g r o u pi ii n t r o n 进行自剪接，而不能帮助非同源性的g r o u pi i i n t r o n 进行自剪接。 进化 关键词：g r o u pi ii n t r o n ，r i b o z y m e ，r n a 剪接，逆转录归巢，逆转录转座， e f f e c t o fg r o u pi ii n t r o n e n c o d e d m a t u r a s eo ni n t r o n s a b s t r a c t g r o u p i ii n t r o n sa r ec a t a l y t i cr n a sa n ds o m em e m b e r sw e r ef o u n dt os e l f - s p l i c e f r o mt h e i rp r e - r n a sb yt w oc o n s e c u t i v et r a n s e s t e r i f i c a t i o nr e a c t i o n sj o i n i n gt h e f l a n k i n g e x o n sa n dr e l e a s i n gt h ei n t r o ni nat y p i c a ll a r i a tf o r mw i t ha 2 ，5 - p h o s p h o d i e s t e r b o n d t h et y p i c a lg r o u pi ii n t r o n sf o l di n t oac o n s e r v e d s e c o n d a r ys t r u c t u r ec o n s i s t i n go fs i xd o u b l e - h e l i c a ld o m a i n s ( d i 一- , d v i ) ，o fw h i c h d o m a i ni ve n c o d e sm u l t i p l ef u n c t i o n a lp r o t e i nw i t hr e v e r s et r a n s c r i p t a s e ，m a t u r a s e a n de n d o n u c l e a s ea c t i v i t i e s t h ee f f e c t so fr e v e r s et r a n s c r i p t a s e l i k e ( r t l ) p r o t e i ne n c o d e db yg r o u pi ii n t r o n o ft r i c h o d e s m i u me r y t h r a e u mo n g r o u pi i i n t r o n s e l f - s p l i c i n g a r es t u d i e di n e s c h e r i c h i ac o l i t h r e eg r o u pi ii n t r o n sw e r ef o u n di nt h er i b o n u c l e o t i d er e d u c t a s e g e n e ( r i r ) o fze r y t h r a e u m t h et h r e ei n t r o n sa r el o c a t e di nt h ef i r s th a l fo ft h eg e n e a n da r e2 , 5 2 4 ，1 , 7 5 7 ，a n d2 ，5 5 4n u c l e o t i d e sl o n g ，r e s p e c t i v e l y b o t ht h ef i r s ti n t r o na n d t h et h i r di n t r o nc o n t a i na no p e nr e a d i n gf r a m e ( o r f ) w h i c hl i k e l ye n c o d e sar e v e r s e t r a n s c r i p t a s e - l i k e ( r t l ) p r o t e i np l a y i n ga ni m p o r t a n tr o l ei ns e l f - s p l i c i n ga n dm o b i l i t y o fg r o u pi ii n t r o n s i n t r o n c o n t a i n i n gd n aw a sp c r a m p l i f i e da n di n s e r t e di na c o l e i - d e r i v e dp d r i v ep l a s m i dv e c t o r t h ec o d i n gs e q u e n c eo ft h er t l p r o t e i nw a s p c r a m p l i f i e da n di n s e r t e di nam o d i f i e dp a r 3p l a s m i dv e c t o r t h ep a r 3p l a s m i d w a sd e r i v e df r o map a c y c18 4p l a s m i dt h a ti s c o m p a t i b l ew i t hc o l e i d e r i v e d p l a s m i d s i n d i v i d u a lr e c o m b i n a n tp l a s m i dw a si n t r o d u c e di n t oe s c h e r i c h i ac o l ic e l l s t h r o u g he l e c t r o p o r a t i o n f o rc o e x p r e s s i o ne x p e r i m e n t s ，t w op l a s m i d sw e r ei n t r o d u c e d s e q u e n t i a l l y i n t ot h es a m eec o l ic e l l s a n dt r a n s f o r m e dc e l l sw e r es e l e c t e da n d m a i n t a i n e di nt h e p r e s e n c eo fb o t ha m p i c i l l i na n dc h l o r a m p h e n i c a l ec o l ic e l l s c o n t a i n i n gt h es p e c i f i e dp l a s m i dw e r ei n d u c e df i r s t l yb yl a r a b i n o s ea n dt h e nb y i p t g t b t a lr n a so ft h ei n d u c e dc e l l sw e r ee x t r a c t e da n dt r e a t e dw i t hr n a s e f r e e d n a s eu s i n gt h er n e a s ym i n ik i t ( q i a g e n ) r e v e r s et r a n s c r i p t i o n ( r t ) a n ds u b s e q u e n t p c rw e r ec a r r i e do u tu s i n gs p e c i f i e dp r i m e r sa n dt h er t - p c rk i t ( q i a g e n ) t h e r e s u l t i n gd n ap r o d u c t sw e r ei d e n t i f i e db yt h e i rp r e d i c t e ds i z e sa n dc o n f i r m e d t h r o u g ht h ea g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s t h e r ea r et w ob a n d so nt h ea g a r o s eg e l s t m n e db ye bu n d e ru vl i g h ta f t e re l e c t r o p h o r e s i s ，o n eb a n dc o r r e s p o n d i n gt ot h e p r e - r n aa n dt h eo t h e rb a n dc o r r e s p o n d i n gt ot h es p l i c e dr n a i ti st h ef i r s tt i m et o p r o v et h a t i nec o l i ，t h er t lp r o t e i ne n c o d e db yt h ef i r s ti n t r o nc a nf a c i l i t a t e s e l f - s p l i c i n go ft h ef i r s tg r o u pi ii n t r o n t h er t lp r o t e i n c o d i n gs e q u e n c ew i t hm u t a t i o n sw a sp c r a m p l i f i e da n d i n s e r t e di nam o d i f i e dp a r 3p l a s m i dv e c t o rb e h i n dap b a op r o m o t e rw h i c hi s i n d u c i b l ew i t hl a r a b i n o s e t w op l a s m i d sw e r ei n t r o d u c e ds e q u e n t i a l l yi n t ot h es a m e ec o l ic e l l st h r o u g he l e c t r o p o r a t i o n t h r o u g ht h es a m em e t h o d ，t h e r ei so n eb a n do n t h ea g a r o s eg e l ，o n e c o r r e s p o n d i n gt ot h ep r e r n a p r o v i n gt h a t i nec o l i t h e m u t a t i o n a lr t l p r o t e i ne n c o d e db yt h ef i r s ti n t r o nc a n tf a c i l i t a t es e l f - s p l i c i n go ft h e f i r s tg r o u pi ii n t r o n p r o v i n gw h e t h e rt h er t lp r o t e i ne n c o d e db yt h ef i r s ti n t r o nc a nf a c i l i t a t e s e l f - s p l i c i n go fo t h e rg r o u pi ii n t r o n s t h ed n ap o l y m e r a s ei i i1 3 s u b u n i tg e n eo f t r i c h o d e s m i u me r y t h r a e u mc o n t a i n sf o u rg r o u pi ii n t r o n sw h i c hd o n te n c o d er t l p r o t e i n s r e c o m b i n a n tp l a s m i d sp d n - 1 - - , p d n - 4c o n t a i n i n gt h ef o u rg r o u pi ii n t r o n s r e s p e c t i v e l ya r ec o n s t r u c t e d t w op l a s m i d sw e r ei n t r o d u c e ds e q u e n t i a l l yi n t ot h es a m e ec o l ic e l l st h r o u g he l e c t r o p o r a t i o n a sm e n t i o n e da b o v e t h e r ei so n eb a n do nt h e a g a r o s eg e l ，o n ec o r r e s p o n d i n gt ot h ep r e - r n a p r o v i n gt h a ti nec o l i t h er t lp r o t e i n e n c o d e db yt h ef i r s ti n t r o nc a n tf a c i l i t a t es e l f - s p l i c i n go fo t h e rg r o u pi ii n t r o n i ns u m m a r y , i ne c o l i g r o u pi ii n t r o nc a ns e l f - s p l i c ew i t ht h eh e l po ft h er t l p r o t e i ne n c o d e db yi t s e l f , n o th o s tp r o t e i n s b u tt h er t lp r o t e i ne n c o d e db yt h ef i r s t i n t r o nc a n tf a c i l i t a t es e l f - s p l i c i n go fo t h e rg r o u pi ii n t r o n s k e yw o r d s ：g r o u pi i i n t r o n ，r i b o z y m e ，r n as p l i c i n g ，r e t r o h o m i n g ， r e t r o t r a n s p o s i t i o n ，e v o l u t i o n 附件一 东华大学学位论文原创- l 生声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体 己经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对 所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：习f 盈当 日期：妇7 年，月莎日 附件二 东华大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允 许论文被查阅或借阅。本人授权东华大学可以将本学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 不保密田。 学位论文作者签名：习沲纽 醐：1 引射日 艚狮虢姘 日期：a 一年惘伊日 g r o u pl ii n tr o l l 编码的成熟酶对i n tr o l l 剪接的影响 1 1 引言 第一章绪论弟一早珀t 匕 1 9 8 2 年，c e e h 等以原生动物嗜热四膜虫( t e t r a h y m e n at h e r m o p h i l a ) 为材料， 研究r r n a 的基因转录问题时发现：转录产物r r n af j 体( 约6 4 0 0 n t ) 很不稳定， 在鸟苷和镁离子存在下切除自身的4 1 3 个核苷酸的内含子( i n t r o n ) ，使两个外显 子( e x o n ) 拼接起来，变成成熟的r r n a 。这个催化反应是在完全没有任何蛋白质 酶的存在下发生的，称之为自我剪接( s e l f - s p l i c i n g ) ，证明了r n a 具有催化功能。 为了区别于传统的蛋白质催化剂酶，c e c h 将这种具有催化活性的r n a 定名 为r i b o z y m e ( r i b o n u c l e i ca c i de n z y m e ) o j 核酶。由于发现核酶，l9 8 9 年，c e c h 获得 了诺贝尔化学奖。目前，自我剪接核酶主要包括两种：g r o u pii n t r o n 和g r o u pi i i n t r o n 。 g r o u pii n t r o n 自我剪接中只需要鸟苷( g ) 和镁离子即能自发进行，无需供 给能量和酶催化。g r o u pii n t r o n 典型反应是包括两步磷酸酯键转移反应的r n a 剪接反应。首先，一个外源鸟苷的3 羟基攻击5 剪接位点的磷原子，并与i n t r o n 的5 端第一个核苷酸形成3 ，5 磷酸二酯键；然后，5 - e x o n 的3 羟基攻击3 剪接位点的磷原子，导致i n t r o n 的释放合外显子的连接。i 型自我拼接的内含子 分布很广，存在于真核生物的细胞器( 线粒体和叶绿体) 基因，低等真核生物核 的r r n a 的基因，细菌和噬菌体的个别基因中。 g r o u p i ii n t r o n 本身也具有催化功能，能够自我完成拼接。它与g r o u pii n t r o n 自我拼接的差别在于转酯反应无需游离鸟苷酸发动，而是由内含子靠近3 端的突 起腺苷酸残基的2 - o h 攻击5 磷酸基引起的。经过两次转酯反应，内含子成为 套索( 1 a r i a t ) 结构被切除，两个外显子得以连接到一起。 g r o u pi ii n t r o n 存在于植物和真菌的线粒体和叶绿体中1 1 1 ，它们也存在于大 约2 5 的真核生物基因组中，要么是以全长形式存在，要么是以缩短的形式存 在1 2 , 3 】。最近，在古细菌中也发现存在g r o u pi ii n t r o n l 4 6 1 。 g r o u pi ii n t r o nr n a 结构包括六个结构域，其中结构域v 是核酶的催化中心 盯8 】；结构域i 最大，对催化反应很重要；而结构域v i 包括突起a ，在剪接后的 g r o u pi ii n tr o n 编码的成熟酶对i n t f o i l 剪接的影响 产物中形成分支位点。结构域i v 环内含有丌放读码框架( o p e n i n gr e a d i n gf r a m e ， o r f ) ，编码o r f ，从功能上定义为四个结构域：r t ( 反转录酶的活性，亚结构 域o 7 ) ，x ( 成熟酶的活性，与i n t r o n 的剪接相关) ，d ( - - j e 保守的d n a 结合区域) ， e n ( 内切酶的活性) 【9 1 1 】。蛋白质对i n t r o n 担当了两种功能。它通过x 结构域的活 性帮助i n t r o n 在体内剪接，表现为成熟酶的活性；它也允许i n t r o n 作为一个移动 的元件；侵入到不含有i m r o n 的位点，这个过程涉及了o r f 结构域的所有四个 结构域，及催化的r n a 的活性。 g r o u p i ii m r o n 具有两种显著的特性：l 、它们是催化r n a ( r i b o z y m e ) ，不 需要蛋白质的帮助能从前体m r n a 中将自己剪接；2 、能编码反转录酶( r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e ，r t ) ，是反转录因子，能插入到新的位点。所以，g r o u p i ii n t r o n 能 够有效地整合进无i n t r o n 等位基因( r e t r o h o m i n g ) ，也能够以极低的频率整合进 非等位基因( r e t r o t r a n s p o s i t i o n ) 。 1 2g r o u pi ii n t r o n 的研究进展 1 2 1g r o u pi ii n t r o n 的分布 g r o u pi ii n t r o n 广泛地分布在低等真核生物和高等植物的线粒体和叶绿体基 因组中。典型的细胞器g r o u pi ii m r o n 插入高度保守的基因，例如细胞色素氧化 酶和核酮糖- l ，5 一二磷酸羧化酶加氧酶( r u b i s c o ) 亚基。约三分之一的细胞器g r o u p i ii n t r o n 编码与r t 同源的o r f 。 大约十年前，发现了第一个细菌g r o u pi ii n t r o n 。最近，细菌基因组测序表 明g r o u pi ii n t r o n 在革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中很普遍；在已测序细菌基因 组中，约四分之一包含g r o u pi ii n t r o n 。与细胞器g r o u pi ii n t r o n 不同，几乎所有 的细菌g r o u pi ii n t r o n 都编码r t 相关的o r f 或者退化的o r f 。另外，大多数细 菌g r o u pi ii n t r o n 插入到基因间，或者插入到可移动d n a 内，例如i s 元件和质 粒【1 2 1 3 】；最近发现细菌g r o u pi ii n t r o n 也分布于保守基因内。 g r o u pi ii n t r o n 很少存在于古细菌中。目前已测序的古细菌基因组中，仅2 个相近物种含有g r o u pi ii n t r o n ，它们是m e t h a n o s a r c i n aa c e t i v o r a n s 和 m e t h a n o s a r c i 聆口m a z e i i 14 , 1 5 】。 g r o u pi ii n t t o n 编码的成熟酶对i n tr o n 剪接的影响 在后生动物线粒体基因组和真核生物细胞核基因中至今还没有发现过g r o u p i ii n t r o n 。 1 2 2g r o u pi ii n t r o n 的结构 g r o u pi ii n t r o n 主要分为两个亚组i i a 和i i b ，每个亚组又可进一步分为两个 亚族( a 1 、a 2 和b 1 、b 2 ) 。g r o u pi ii n t r o n 典型的二级结构由六个茎环结构域 组成( 结构域i - v i ) ，这些结构域从一个中央核心坏放射出来，使得5 和3 剪接 位点在空间上相互靠近；六个结构域的近端螺旋由位于中央核心环上的少数核苷 酸残基连接起来。 结构域i 很庞大，可进一步分成亚结构域a 、b 、c 、d ：其中包含涉及拉近5 和3 剪接位点的序列和e x o n 结合序列( e x o nb i n d i n gs e q u e n c e ，e b s ) 。结构域 i 的其它序列与结构域v 相互作用形成催化核心，是唯一对催化反应必需的结构 元件。 结构域v 的一级序列和二级结构反映其核心催化作用，它是g r o u pi ii n t r o n 中最保守的，大部分是3 4n t 长的茎环结构。 结构域v i 是靠近3 剪接位点的螺旋结构，包含参与套索状结构形成的突起 a ，其2 - o h 通过2 ，5 磷酸二酯键结合到i n t r o n 的第一个核苷酸残基上。 结构域i v 是g r o u pi ii n t r o n 中最不保守的区域。许多g r o u pi ii n t r o n 编码多 功能蛋白质，其o r f 完全或几乎完全位于结构域i v 内；对于这些g r o u pi ii n t r o n 来说，结构域i v 占其全部序列的7 5 以上。结构域i v 编码的蛋白质，包括四 个结构域即r t 、x 、d 、e n ；结构域r t 具有反转录酶活性，包含反转录转座子 ( r e t r o t r a n s p o s o n ) 和其它反转录酶特有的保守氨基酸序列；结构域x 具有成熟 酶活性，是假定的与成熟酶活性相关的r n a 结合结构域；结构域d 是非保守的 d n a 结合区域；结构域e n 是i m r o n 移动所必需的，具有d n a 内切核酸酶活性， 它包含一个z n 指样的模体，具有与g r o u pii n t r o n 编码的同类内切核酸酶相似的 h n h 模体。 1 2 3g r o u pi ii n t r o n 的剪接反应 g r o u pi ii m r o n 的自剪接反应是通过两步转酯反应实现的。第一步转酯反应 g r o u pi ii n tr o n 编码的成熟酶对i n tr o n 剪接的影响 中，通过i n t r o n 结合序列( i n t r o nb i n d i n gs e q u e n c e ，i b s ) 与相应的e b s 相互作 用j 下确定位5 剪接位点，使之接近结构域v i 的突起a 1 1 引，该腺苷酸残基的2 - o h 进攻5 剪接位点的磷酸二酯键，释放5 = e x o n ，形成套索状中问产物。 第二步转酯反应中，通过两个单一的碱基配对相互作用f 确定位3 - e x o n ； 这种相互作用随着r n a 结构种类的不同而不同，对于g r o u pi i ai n t r o n ，碱基配 对相互作用是 r 丫和6 - 6 ，而对于g r o u pl i b 和i i ci n t r o n ，碱基配对相互作用是 y 吖，和i b s 3 e b s 3 1 1 7 ，1 引。第二步转酯反应与第一步相似，随着5 - e x o n 释放，其 3 - o h 进攻3 剪接位点的磷酸二酯键，导致i n t r o n 两侧e x o n 的连接，并释放出 套索状i n t r o n 。因为在剪接反应中磷酸二酯键的断裂和连接是均等的，因此剪接 反应在能量方面是可逆转的，不需要外源能量，例如a t p 。 在体外，自剪接反应需要相对极端的反应条件，包括盐、镁离子，有时还要 考虑温度( 例如5 0 0m mk c l ，1 0 0m mm g c l 2 ，4 5 0 c ) 1 1 9 】。在体内，已知i n t r o n 的剪接反应需要蛋白质因子，帮助i n t r o nr n a 折叠成具有催化活性的结构；对 许多i n t r o n 来说，最重要的剪接因子是i n t r o n 编码蛋白质；它通过未剪接的m r n a 翻译出来，结合到位于i n t r o n 结构域i v a 内具有高亲和力的位点上【2 川，外加与 i n t r o n r n a 其它区域的相互作用，蛋白质诱导结构变化，从而促进自剪接 2 1 , 2 2 1 ， 产生剪接的e x o n 和核糖核蛋白( r i b o n u c l e o p r o t e i n ，r n p ) 颗粒。r n p 仍然结合 着蛋白质的套索状i n t r o n ，是i n t r o n 移动所必需的。 所有独特的成熟酶( o r f 中的x 结构域活性) 都是内含子专一性的剪接因 子，但是密切相关的成熟酶可能有交叉反应。在植物叶绿体中，只有一个编码成 熟酶相关蛋白质的g r o u pi ii n t r o n 即t r n k - 1 1 ，该i n t r o n 位于t r n a l y 5 基因中。t r n k - 1 1 编码的蛋白质称为m a t k ，v o g e lj 等证明了m a t k 可能对许多缺少o r f 的g r o u p i ii n t r o n 的剪接有帮助1 2 3 1 。m a t k 包含一个非常保守的结构域x 和一个退化的r t 模体，但是缺少e n 结构域。 在高等植物中，四个成熟酶相关的蛋白质是由核基因编码的，分别称为 n m a t - 1 a ，n m a t - l b ， n m a t - 2 a 和n m a t - 2 b ，均含有线粒体靶向序列，可能在 一个或多个线粒体g r o u pi ii n t r o n 的剪接过程中发挥作用，这些线粒体g r o u pi i i n t r o n 的大部分不编码o r f l 2 4 1 。像m a t k 一样，它们有一个保守的结构域x ，但 是在r t 结构域中含有变异，且缺少e n 结构域或者在e n 结构域中含有变异，这 g r o u pi li n tr o n 编码的成熟酶对i n tr o l l 剪接的影响 表明丢失移动功能。 1 2 4g r o u pi ii n t r o n 的移动反应 g r o u pi ii n t r o n 的移动反应主要是通过反转录归巢( r e t r o h o m i n g ) 实现的。 在反转录归巢过程中，i n t r o n 以极高频率侵入具有高度位点专一性的双链d n a 靶剧2 5 1 。当然，也能够以很低的频率插入到非位点专一性靶点，该过程称为逆 转录转座( r e t r o t r a n s c r i p t i o n ) 【2 9 1 。 r n p 识别d n a 靶位点起始反转录归巢，典型的归巢位点包括插入位点上 游2 5b p 和下游1 0 b p 的区域。识别正确位点后，蛋白质结合到上游靶点( 对 l a c t o c o c c u sl a c t i s 的l i 1 t r bi n t r o n 是- - 2 5 和一1 3 ) ，进而促进d n a 局部解螺旋。 在剪接发生时，剩余的上游靶点( 对l i 1 t r b 来说是一1 2 到一1 ) 与i n t r o nr n a 通过相同的i b s l e b s l 和i b s 2 e b s 2 碱基配对而相互作用【3 0 3 3 1 。与此同时， 3 - e x o n 通过i b s 3 e b s 3 ( 6 6 ) 碱基配对f 确定位【3 0 , 3 4 ，这也与剪接中的碱基配 对类似。然后，i n t r o n 反向剪接进无义链，反向剪接反应与剪接反应相反，所以 是由r n a 催化的。蛋白质识别3 - e x o n 中的序列，利用e n 结构域切割d n a 靶 点的有义链( 对l i 1 t r b 来说是+ 9 位置) ，从而产生一个游离的3 - o h ，r t 以此 为引物引发反转录反应【3 5 , 3 6 】。一旦引发，r t 就会以插入i n t r o n 为模板合成 c d n a ，从而产生插入i n t r o n 的有义链。i n t r o nd n a 无义链第二链的形成还没有 在实验上是得到验证，但一般认为是通过重组修补途径完成的。该过程称为靶 点引发的反转录反应( t a r g e t - p r i m e dr e v e r s et r a n s c r i p t i o n ，t p r t ) ，与由非长术端 重复( n o n l o n gt e r m i n a lr e p e a t ，n o n l t r ) 反转录因子( r e t r o e l e m e n t ) 进行的反 应相似【3 7 3 9 1 。 1 2 5 天然g r o u pi ii n t r o n 的多样性 ( 1 ) 细胞器g r o u p i ii n t r o n 大约二十年前发现g r o u pi ii n t r o n ，一直以细胞器i n t r o n 作为研究模型。但是， 在过去十年罩，对细菌i n t r o n 理解越来越深刻，而且细菌i n t r o n 可能是最古老， 所以细菌g r o u pi ii n t r o n 可能很快会成为新的研究模型。在这一部分中，比较了 g r o u pi ii n t t o n 编码的成熟酶对i n t t o n 剪接的影响 细菌g r o u pi ii n t r o n 和细胞器的g r o u pi ii n t r o n ，描述了迄今已知的i n t r o n 中各种 可能的变异。 在线粒体和叶绿体中，大部分不编码移动相关的o r f 1 ，8 9 1 。典型的细胞器 i n t r o n 分布在保守的看家基因中，例如细胞色素氧化酶和核酮糖1 ，5 二磷酸羧化 酶加氧酶( r u b i s c o ) 亚基；在一个特定基因中有时可包含多达1 0 个i m r o n ( 既 有g r o u pii n t r o n 又有g r o u pi ii n t r o n ) 。所以，剪接必须能有效地进行，以维持宿 主基因的功能。因为含有或者缺少i n t r o n 的菌株之间在适应性方面没有明显的差 异，所以这些i n t r o n 被认为是表型沉默的。少部分细胞器i n t r o n 具有移动性，但 是它们的分布不均衡。在低等真核生物中，大约一半g r o u pi ii m r o n 编码含有r t 的o r f ，推测可能是可移动的；而在高等植物中，几乎所有i n t r o n 都不含有o r f ， 每个细胞器中大约仅有1 2 0 的i n t r o n 含有o r _ f ( 例如叶绿体中的m a t k 和线粒体 中的m a t r ) 。低等真核生物和植物之间的这种差异表明在植物进化中o r f 逐步 的退化和丢失。 对细胞器g r o u pi ii m r o n 来说，其r n a 结构的退化和o r f 模体的退化都是 非常普遍的。在许多例子中，退化的i n t r o n 很可能丢失了移动能力，但是它们必 须保持剪接能力，因为它们存在于保守基因中。类似地，具有退化r t 模体的 o r f 很可能不再促进i n t r o n 的移动，但是它们可能保留着剪接功能( 成熟酶) 。 最简单的退化类型是r n a 结构变化，例如结构域v 或v i 中的错配，保守 模体内的主要变异，大的插入或者局部删除。这些变异在高等植物细胞器i n t r o n 中很普遍，以不同的程度发生【1 , 4 0 】。虽然不可能确切地知道个别变异会损害催化 活性，但是高等植物中还没有i m r o n 在体外能够进行自剪接的事实逐渐地表明了 这一点【8 】。相反，低等真核生物的g r o u pi ii n t r o n 倾向于具有更标准的二级结构， 而且很多在体外能进行自剪接。 o r f 的退化也是很普遍的。许多细胞器o r f 在移动性相关的结构域中具有 适度的缺陷，例如y a d d 模体中的突变或者内切核酸酶的缩短；因为这些缺失 零星地分布在亲缘关系很远的i n t r o n 中，所以它们似乎独立地发生了很多次【9 1 。 也发现了退化更严重的o r f ，例如，植物中t r n a l y 5i n t r o n 编码的o r fm a t k 在 对应于r t 结构域0 - - - 4 的区域内没有序列同源性，但是具有可检测的结构域5 7 的残迹和很保守的结构域x 【4 i 】。从这些结果可以推断出该蛋白质保留与结构域x g r o u pi ii n t r o l l 编码的成熟酶对i n tr o f l 剪接的影响 相关的成熟酶活性，但是丢失了移动功能。在高等植物的叶绿体中，l 口垠截去 了r t 结构域o 1 ，并在r t 结构域内含有两个大的插入片段( 1 5 0a a ) ，它是否 具有移动功能值得怀疑【9 】。同样在植物中，几个核编码蛋白质即n m a t 1 a 、 n m a t 1 b 、n m a t 2 a 和n m a t - 2 b 与线粒体成熟酶蛋白密切相关，但是在i n t r o n 中并 没有发现存在编码它们的同源序列。据推测，这些蛋白质是由线粒体成熟酶 衍生而来的，然后转运进线粒体在i n t r o n 剪接和或移动中发挥作用。最后， e u g l e n a 叶绿体中含有两个i m r o n 编码的o r f ，即m a t l 和m a t 2 ，它们的整个r t 和x 模体中发生了严重的退化，但是很可能在剪接中有作用，因为它们在e u g l e n a 中很保守，而且其宿主i n t r o n 位于光合系统基因 1 4 2 , 4 3 1 。 反式剪接是基因组退化的一种形式，其中i m r o nr n a 由位于基因组不同位 置的两个或多个片段编码【4 4 1 。i n t r o n 片段与其侧翼e x o n 一起分别转录，然后所 有的i n t r o n 片段相互结合形成与标准的顺式剪接i n t r o n 近似的r n a 结构；由此 发生的剪接反应连接两个由基因组上相距很远的部分编码的e x o n 。在高等植物 中有很多反式剪