（海洋生物学专业论文）扣囊复膜酵母海藻糖合成代谢的初步研究.pdf

中国悔洋大学博士学位论文 扣囊复膜酵母海藻糖合成代谢的初步研究 摘要 海藻糖在生物圈内无处不在，其独特的物理化学特性使其成为细胞应激代谢 物，在不同的逆境胁迫中保护生物大分子。海藻糖在工业中有极好的应用前景， 如在干燥和冷冻期间维持细胞膜的完整性；增加多种不稳定物质的稳定性；提高 冷冻细胞的生存能力；提高生物物质如酶、疫苗等的稳定性；在食品和制药工业 中作为冷冻保护剂和高效保存剂等。 在本实验室前期工作中。从土壤中分离到一株能利用淀粉合成海藻糖的野 生型扣囊复膜酵母菌株，该菌株在含淀粉的培养基中经4 8 h 发酵可积累占细胞 干重1 8 的海藻糖，但细胞内海藻糖酶活力较高，分解合成的海藻糖，对海藻 耱积累不利。本研究以该野生型酵母为出发菌株，经过e m s 诱变，得到一株中 性和酸性海藻糖酶活力均显著降低的突变株a 1 1 ，突变株a 1 1 在含淀粉培养基 中的生长能力并未下降但经4 8 h 发酵，细胞内海藻糖的积累量却比野生型细 胞提高了5 0 。 为了解扣囊复膜酵母a 1 1 海藻糖的合成代谢。通过实验确定了该菌株海藻 糖的生物合成途径，结果表明其海藻糖合成途径与啤酒酵母和大肠杆菌的一样， 即由u d p 葡萄糖与6 磷酸葡萄糖在6 一磷酸海藻耱合成酶催化下合成6 一磷酸海藻 糖，然后由6 - 磷酸海藻糖磷酸酯酶催化下合成海藻糖。该合成途径的关键酶6 磷酸海藻糖合成酶经过超滤浓缩、s e p h a r o s ec l - 4 b 和d e a e s e p h a m s ef a s tf l o w 阴离子交换层析等系列纯化过程，经s d s p a g e 和n a t i v e - p a g e 电泳检测，都 呈现一条6 6 k d a 的条带，证实6 磷酸海藻糖合成酶被纯化，纯化倍数3 3 倍，收 率6 1 。s d s p a g e 和n a t i v e p a g e 电泳上显示的结果，说明扣囊复膜酵母6 磷酸海藻糖合成酶与啤酒酵母和其他真核生物的不同。 对纯化的6 - 磷酸海藻糖合成酶的生化特性进行研究表明，该酶反应的最适 温度是3 7 ，最适p h 6 6 。酶的温度和p h 稳定性均很差；c a 2 + 、k + 和m g “对 酶活性有激活作用，最适激活浓度分别是1 0m m o l l 、3 5m m o l l 和3 5m m o f l ， 说明该酶是金属酶；而c u 2 + f e 3 + ，h 9 2 + , c 0 2 + 对酶活性有抑制作用，h 9 2 + 对酶 中国海洋大学博士学位论文 的抑制作用说明，酶活性中心存在含吲哚基团的氨基酸残基；e d t a 、p m s f 和 碘乙酸对酶活力均有很大的抑制作用，而二硫苏糖酵( d t t ) 对酶活性有保护作 用。e d t a 对酶的抑制作用证实该酶是金属酶，p m s f 和碘乙酸对酶的抑制作用 表明，该酶的活性中心存在半胱氨酸( c y s ) 和丝氨酸( s e t ) 残基；纯化酶对 u d p g 的k m 和v m a x 分别为9 9m m o l l 和1 1 8 3n m o l m i n ；对6 - p 届的k i n 和 v m a x 分别为4 0 2m l n o i l 和8 3 8n m o l m i n 。 海藻糖是酒精酵母的应激代谢物，在正常生理条件下，细胞内海藻耱含量、 6 _ 磷酸海藻糖合成酶活力【= 上及6 - 磷酸海藻糖合成酶基因表达量均很低，当细胞处 于逆境胁迫时，它们都会显著增热。为研究不同逆境胁迫对扣囊复膜酵母a l l 海藻糖积累的影响，对处于对数生长初期的细胞施加各种逆境胁迫发现所有施 加的逆境胁迫均不能提高细胞内海藻糖的含量和6 一磷酸海藻萜合成酶的活力。为 从转录水平上研究不同逆境胁迫对该菌株海藻糖积累的影响，采用c o d e h o p 引 物设计策略，设计简并引物，对扣囊复膜酵母6 磷酸海藻糖合成酶基因进行简并 p c r 扩增，得到基因的部分序列，根据该序列设计特异引物，进行r t - p c r ，检 测细胞内6 磷酸海藻糖合成酶基因的m r n a 水平，发现在不同逆境胁迫中该菌 株的6 磷酸海藻糖合成酶基因的表达量稳定不变。因此，扣囊复膜酵母海藻糖的 积累模式、6 一磷酸海藻糖合成酶的激活作用以及6 一磷酸海藻糖合成酶基因的表达 模式，与酒精酵母和其他真菌的明显不同，扣囊复膜酵母海藻糖的合成对逆境胁 迫不应答。 本研究结果表明扣囊复膜酵母a l l 的6 - 磷酸海藻糖合成酶以及海藻糖的积 累机制明显不同于已研究的酒精酵母和其他多数真核生物。 关键词：海藻糖：合成代谢；扣囊复膜酵母 中国海洋大学博士学位论文 p r e ii m i n a r ys t u d yo rs y n t h e s iso ft r e h a i o s ei n s a c c h a r o m y c o p s i sf i b u li g e r a a b s t r a c t t r e h a l o s oi san o n - r e d u c i n gd i s a c c h a r i d et h a th a sb e e nf o u n di nm a n yo r g a n i s m s i na d d i t i o nt ob e i n gn o m e d u c i n 岛i tp o s s e s s e ss e v e r a lu n i q u ep h y s i c a lp r o p e r t i e s , w h i c ha c c o u n tf o rt h ep r i n c i p a lr o l eo f t r e h a l o s oa sas t r e s sm e t a b o l i t e i ti sn o wb e i n g r e c o g n i z e da sac r u c i a ld e f e n s em e c h a n i s mt h a ts t a b i l i z e sp r o t e i n sa n db i o l o g i c a l m e m b r a n e su n d e rav a r i e t yo fs t r e s sc o n d i t i o n s b a s e do ni t s u n i q u ep r o p e r t i e s t r e h a l o s oh a sb e c o m ea ni m p o r t a n tt a r g e tf o rb i o t e c h n o l o g y , w h e r ei ti sp r o d u c e df o r f o o dm a n u f a c t u r e ，v a c c i n ep r o t e c t i o n ，p h a r m a c e u t i c a l sa n dc o s m e t i cp r o d u c t s i nt h ep r e v i o u ss t u d i e s ，w ef o u n dt h a ts a c c h a r o m y c o p s i sf i b u l i g e r as d uc o u l d 9 a c c u m u l a t et r e h a l o s o e f f i c i e n t l y ( u pt oo 1 8 9 幢d r yw e i g h t ) a tt h ee n t r a n c e o f s t a t i o n a r yp h a s ed u r i n gg r o w t ho ns t a r c ha st h es o l ec a r b o ns o u r c e b u tt h es t r a i nc 趾 s y n t h e s i z ea c i dt r e h a l a s ea n dn e u r a lt r e h a l a s e ，w h i c h c a l lm o b i l i z et r e h a l o s e a c c u m u l a t e db yt h ec e l l s t oe n h a n c ey i e l d so f t r e h a l o s oi nt h i ss t r a i n ，i ti si m p o r t a n t t od e l e t eo rd e c r e a s et h ea c t i v i t yo ft h ea c i da n dn e u t r a lt r e h a l a s e si nt h ec e l l s b y ： m u t a g e n e s i so fe m s ( e t h y l m e t h a n e s u l f o n a t e ) ，o n em u t a n t ( a 11 ) t h a ta s s i m i l a t e d t r e h a l o s es l o w l y , b u tg r e wo no t h e rc a r b o ns o u r c e sa sf a s ta si t sp a r e ms t r a i n , w a s i s o l a t e d i ns h a k i n g3 0 0m lf l a s k , t h ec o n t e n to ft r e h a l o s oi nt h em u t a n ta l lw a s i n c r e a s e db y5 0 t h a nt h a to ft h ew i l dt y p es t r a i nw h e ng r o w ni ny p sm e d i u m n e a c t i v i t i e so fa c i da n dn e u t r a lt r e h a l a s o so ft h i sm u t a n tw e r el o w e rt h a nt h o s eo ft h e w i l dt y p e a sar e s u l t , t r e h a l o s ea c c u m u l a t i o nw a sd i s t i n c t l ya d v a n c e di nt h em u t a n t a 1 1 t r e h a l o s o - 6 一p h o s p h a t es y n t h a s e ( s f t p s l ) a c t i v i t yw a sd e t e c t e di nt h ec e l le x t r a c t o fs f i b u l i g e r a ，s u g g e s t i n gt h a t t r e h a l o s os y n t h e s i sp a t h w a yi nt h i ss t r a i nw a sa ss a r b e a st h a ti ns c e r e v i s i a ea n de c o l i t h es t t p s lw a sp u r i f i e d3 3 f o l dt oh o m o g e n e i t y b yd t r a f i l t r a t i o na n ds e v e r a ls t e p so fc o l u m nc h r o ma _ t o 掣a p h yt h ep u r i f i e de n z y m e h a sa p p a r e n tm o l e c u l a rm a s s e so f6 6k d a , a sd e t e r m i n e db yn a t i v e - p a g ea n ds d s - i i i 中国海洋大学博士学位论文 p a g e t h eo p t i m a lp ha n dt e m p e r a t u r eo ft h ep u r i f i e de n z y m ew e r e6 6a n d3 7 1 2 ， r e s p e c t i v e l y t h ee n z y m ew a sa c t i v a t e db yc a 2 + , 霹a n dm 矿，w i t h 霹s h o w i n gt h e h i g h e s tr a n ka t3 5r e t o o l l , i n d i c a t i n gt h a tt h ep u r i f i e de n z y m ew a sm e t a l l o e n z y m e o nt h eo t h e rh a n d ，m n 2 + , c u 2 + , f h 矿a n dc 0 2 + i n h i b i t e dt h ee a l z y m ew i t hh 9 3 + s h o w i n gt h eh i g h e s ti n h i b i t i o n t h ei n h i b i t i o nb ym e r c t l r i ci o n sm a yi n d i c a t et h e i m p o r t a n c eo fi n d o l ea m i n oa c i dr e s i d u e si nt h ee n z y m ef u n c t i o n t h ep 谢f i e d e n z y m ew a ss t r o n g l yi n h i b i t e db yi o d o a c e t i ca c i da n dp m s f , s h o w i n gt h a tc y s r e s i d u e sa n ds e rr e s i d u e sw g l ge s s e n t i a lf o rt h ee n z y m ea c t i v es i t e s k ma n dv m a x v a l u e so ft h ee n z y m ef o rg l u c o s e 6 - p h o s p h a t ew e r e4 0 2m m o f la n d8 3 8 n m o l m i n , r e s p e c t i v e l y , w h i l ek i na n dv m a xv a l u e so ft h ee n z y m ef o ru d p - g l u c o s ew e r e9 9 m m o l la n d11 8 3n m o l m i n ，r e s p e c t i v e l y t r e h a l o s eb e l o n g st ot h ee a r l ym e t a b o l i cr e s p o n s ea se x p o s u r eo fe x p o n e m i a l l y g r o w i n gc e l l s t ov a r i o u ss t r e s sc o n d i t i o n si nsc e r e v i s i a e s t u d i e si nm a n y m i c r o o r g a n i s m sh a v e s h o w nt h a tn l m e r o u sf o r m so fs t r e s si n d u c et r e h a l o s e a c c u m u l a t i o n , m o s to ft h et i m et h r o u g hr e g u l a t i o na tt h el e v e lo ft r a n s c r i p t i o n t o i n v e s t i g a t e dt h ee f f e c t so fv a r i o u ss t r e s st r e a t m e n t so na c c u m u l a t i o no ft r e h a l o s ei n s a c c h a r o m y c o p s i sf i b u l i g e r aa i1 e x p o n e n t i a l l yg r o w i n gc e l l sw e r es u b j e c t e dt o v a r i o u ss t r e s st r e a t m e n t s i tw a sn o t i c e dt h a tn e i t h e rt h ea c t i v a t i o no fs f t p s ln o rt h e c h a n g ei nt r e h a l o s ec o n t e n tw a so b s e r v e di nt h ec e l l so fa 11 af r a g m e n to fs f l p s l g e n ei nt h i ss t r a i nw a sa l s oc l o n e db yd e g e n e r a t ep c ru s i n gt h ec o d e h o ps t r a t e g y a n dm u l t i p l y - a l i g nt p s ls e q u e n c e s t h i ss e q u e n c ea l l o w e du st o i n v e s t i g a t et h e e x p r e s s i o no fr p s lg e n e ，w h i c hw a f ta l s ok e p tc o n s t a n tu n d e rt h ev a r i o u ss t r e s s c o n d i t i o n s t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt p s la c t i v a t i o n , t r e h a l o s ea c c u m u l a t i o na n d s f t p s l , g e n ee x p r e s s i o ni ns a c c h a r o m y c o p s i s f i b u l i g e r aa 1 1w e r ed i f f e r e n tf r o mt h o s e i nsc e r e v i s i a ea n dm o s to f o t h e rf u n g i a l t o g e t h e r , t h er e s u l t si nt h i ss t u d ys h o wt h a ts f f p s lp r o t e i na n dt r e h a l o s e m e t a b o l i s mi nr e s p o n s et o s t r e s sc o n d i t i o n si ns a c c h a r o m y c o p s i sf i b u l i g e r ac l e a r l y d i f f e r 矗咖t h a to fsc e r e v i s i a ea n dm o s to fo t h e re u k a r y o t e s t h ee x p r e s s i o no f s f t p s lg e n ei s n tr e s p o n s et ot h ed i f f e r e n ts t r e s st r e a t m e n t s k e yw o r d s ：t r e h a l o s e ，s y n t h e s i s ，s a c c h a r o m y c o p s i s f i b u l i g e r a ，y e a s t i v # h 。棒￥p * p，0#，。# h p lvlek，hg；霹r_f；喾膨擎_并鞋l #，；_t； ； j i 扣囊复膜酵母海藻糖合成代谢的初步研究 第一章绪论 1 本课题的研究背景和意义 1 1 研究背景 海藻糖( t r e h a l o s e ) 是一种非常稳定的非还原性二糖，由两个吡喃葡萄糖分子 通过洳1 ，1 糖苷键连接而成，其高度稳定性是由于连接两个葡萄糖残基的糖苷键具 有非常低的能量( 1 k j m 0 1 ) ，而在另一非还原性二糖蔗糖中，其糖苷键的能量为2 7 k j m o l ( p a i v a , 1 9 9 6 ) 。因此，海藻糖若非受到强酸、强碱或海藻糖酶的攻击，不会被 降解( g a n c e d o 2 0 0 2 ) 。 1 9 世纪初，海藻搪首先在黑麦麦角菌中发现，当时认为它是细胞的储藏物质， 后来发现海藻糖广泛存在于微生物、动物和植物中，特别是那些具有抗脱水作用 的生物。这些特殊生物具有在脱水条件下存活多年的特性，包括所谓的“复苏植物” 鳞叶卷柏( s e l a g i n e l l al e p i d o p h y l l a ) 、某些咸水虾、线虫和酒精酵母等，当它们失去 体内9 9 的水分后，仍具有在获得水后迅速复活的能力l b e i n , 1 9 7 4 ；v o g e l ， 2 0 0 1 ) 。这是因为当细胞处于饥饿、干燥、高温、高渗透压及有毒物质等胁迫环境 时，细胞内海藻糖含量迅速上升，非特异性地保护生物膜、稳定蛋白质和核酸等 生物大分子的结构，起着保护剂的作用。海藻糖在生物体内扮演极特殊的角色， 其应用研究因此得到了广泛的关注和重视( a r a n d a , 2 0 0 4 ) 。 海藻糖特有的物理化学性质使其具有许多潜在的应用价值。如，在食品工业 中可利用其非还原性、保湿性、耐冻性、干燥性、良好的甜味等特性，作为食品 保鲜剂、防腐剂和甜味剂。另外，它不能与氨基酸或蛋白质反应，因此在食品加 工过程中可避免产生褐色物质( 美拉德反应) ( 础c h d s ，2 0 0 2 ) 。海藻糖最近己通 过欧州标准及美国食品药物管理局( f d a ) 认证，作为安全有效的食品添加剂或保护 剂；在医药工业，海藻糖作为天然生物保护剂，其应用因解决了冷链问题可能引 起生物制品业的重大革新，将会带来巨大的经济效益和社会效益。如用海藻糖取 代自蛋白应用于疫苗、诊断用品、酶、蛋白质、细胞因子，干扰素等生物制品的 保藏中，可在室温保存数年而不失效，不仅降低保藏费用，还可防止由白蛋白导 致的疫苗血源污染等问题( i d r i d g e ，1 9 9 5 ) 。海藻糖甚至可作为人淋巴细胞、红细 扣囊复膜酵母海藻塘合成代谢的初步研究 胞、肺切片及移植器官等的保护剂，如在胰岛保存液中添加海藻糖，可使被保存 胰岛的复活率由原来的5 8 提高到9 2 ( b e a t t i e ，1 9 9 7 ) 。日本的h a y a s h i b a r a 公司 已利用海藻糖作为蛋白质和其他生物制品的稳定剂，应用于医药工业中；在化妆 品领域，日本已开发出多种适合于各种年龄消费者的海藻糖化妆品，作为洁肤剂、 保湿剂、紫外吸收剂、稳定剂、唇膏品质改良剂等；在精细化工领域，作为口腔 清凉剂等的甜味剂，海藻糖酯作为表面活性剂用于日化、纺织、三次采油等工业； 在农业生产中，通过基因工程技术将海藻糖合成酶基因导入植物，培育抗逆品种； 此外，海藻糖可作为分子生物学用酶的稳定剂( c o l a f o ，1 9 9 2 ) 。 海藻糖独特的生物学功能引起了人们的密切关注，有关海藻糖的研究也越来 越受到科学工作者的重视。国外对海藻糖的研究较多，尤其是日本、美国和欧洲， 海藻糖的代谢与调控、对生物大分子的保护机理、海藻糖基因工程及酶转化法生 产是目前研究和开发的重点。日本林原生化研究所是研究海藻糖生产的先锋，他 们首先开发出利用酶法从淀粉直接生产海藻糖的新技术，并申请了专利，使日本 成为第一个能直接利用淀粉生产海藻糖的国家似i y a z a l ( i ，1 9 9 3 ) 。英美科学家则致 力于海藻糖基因工程方面的研究工作，采用转基因技术己经在番茄中积累海藻糖 ( p i l o n - s m i t s 。1 9 9 8 ；r o m e r o ，1 9 9 7 ) 荷兰植物生物技术公司把大肠杆菌的海藻糖合 成酶基因o t s b a 导入甜菜、马铃薯中，在获得大量廉价海藻糖的同时，增强了植物 的抗旱性和抗寒性( h o l m s t r o m ，1 9 9 8 ) ，美国科罗拉多医科大学将酵母菌的t p s l 基 因转入烟草，并获得具抗早性的转基因植株( h o l m s t r o m ，1 9 9 6 ) 。 我国对海藻糖的开发研究起步较晚，最初多集中于从酵母菌中提取海藻糖， 近年来，随着国内科研水平的提高，以淀粉为原料生产海藻糖的研究日益增多。 广西南宁中诺生物工程公司采用基因工程菌制备酶制剂，以淀粉为原料生产海藻 糖，获得的产品成本远低于酵母提取法，使中国成为第二个利用淀粉直接生产海 藻糖的国家( 胡宗利，2 0 0 4 ) ；在海藻糖基因工程研究中也取得了一定进展，如周 坚等利用基因工程技术得到海藻糖合成酶转基因烟草( 周坚，2 0 0 1 ) ；刘莉等克隆 了芝田硫化叶菌新型甜淀粉酶基因，并在大肠杆菌中表达( 刘莉等，2 0 0 0 ) 。 1 2 研究的目的和意义 为使海藻糖在工业中得到更广泛的应用，需开发经济有效的生产工艺，降低 2 。“b产沓甏；自、-# ；，pf，；。； ，；m蟊_p，1，者* 0 扣囊复膜酵母海藻塘合成代谢的初步研究 售价。目前海藻糖的生产方法主要有发酵法、酶转化法和基因重组法，这些方法 的关键是得到高效积累海藻糖的微生物。淀粉因资源丰富、来源广泛、价格低廉， 一直是发酵工业的最好原料，而扣囊复膜酵母是所有酵母菌中转化淀粉能力最强 的。迄今为止，本实验室是唯一利用扣囊复膜酵母菌( s a c c h a r o m y c o p s i s f i b u l i g e r a ) ， 通过一步发酵淀粉进行海藻糖生产研究的，分离得到的野生型扣囊复膜酵母 ( s a c c h a r o m y c o p s i s f i b u l i g e r as a u ) 菌株在含淀粉的培养基中经4 8 小时发酵，海藻 糖的积累量高达细胞干重的1 8 ( c h i ，2 0 0 1 ) ，说明该菌株是利用淀粉合成海藻糖 的优良菌株。 扣囊复膜酵母属于二形态酵母，细胞中海藻耱的代谢及调控仍未知，了解该 酵母海藻糖的代谢途径、参与代谢的相关酶及酶基因的特性、海藻糖合成和分解 代谢的调控机制，对于更好的利用该菌株进行工业生产，提高海藻糖产量有重要 的指导意义，同时对生物抗逆性机制及极端环境的适应机制研究具有重要的理论 意义，而且在海藻糖生物工程中也具有重要的指导和应用价值。 t 2 海藻糖的结构和理化性质 海藻糖，化学名为a - d g l u c o p y r a n o s y l a - d g l u c o p y r a n o s i d e ，是由两个吡喃葡 萄糖分子以a 1 ，l 糖苷键连接而成的双糖。海藻糖的分子式为c 1 2 h 2 2 0 l l 其 h a w o r t h 式和分子构象式如图1 1 所示。海藻糖的分子内不存在醛基，为非还原性 双糖，这种结构使海藻糖具有极强的稳定性和低呈色性( 杉本利行，1 9 9 5 ) 。 图1 1 海藻糖分子的h a w o r t h 式和分子构象式 f i g 1 1t h eh a w o r t hf o r m u l aa n ds t r u c t u r a lf o r m u l ao f t r e h a l o s c o h o h 海藻糖可以几种固体形式存在，最常见的是二水化合物，熔点9 7 0 ，将其加 + 热至1 3 0 0 ，失去结晶水，成为无水结晶体，熔点可达2 1 4 - 2 1 6 0 ；其水溶液性质 稳定，无色无嗅，1 2 1 感略甜，不会焦糖化；溶解热，含结晶水的为5 7 8 k j m o l ，不 含结晶水的为5 3 4 k j m o l ；甜度相当于蔗糖的4 5 ；溶解度，1 0 ( 2 时为5 5 3 9 ，5 0 0 时为1 4 0 1 9 ，9 0 0 时为6 0 2 9 9 ：化学性质十分稳定，不能使斐林试剂还原，也不 能被a 糖苷酶水解，但在强酸条件下能被水解为两个葡萄糖分子；在p h 3 5 ，1 0 0 0 2 4 h ，9 9 残存，1 2 0 0 ，9 0 m i n 褐变。在含蛋白质溶液的沸水中，9 0 r a i n 褐变；水 溶液在3 7 0 下可保存1 2 个月( 黄平，1 9 9 5 ) 。海藻糖的其它性质如下： 1 ) 稳定性：海藻糖与蔗糖属同分异构体，但由于它不具有还原性，因此对热 和酸都具有非常好的稳定性。在加热过程中不易与氨基酸和蛋白质发生反应，海 藻糖几乎不能被一般的酶分解，只能被特异性的海藻糖酶水解。 2 ) 吸水性：无水结晶海藻糖具有很强的吸水性，如遇含水物质，能有效地吸 收该物质中的水分子，自身成为含水结晶海藻糖。因此，无水结晶海藻糖是一种 理想的热敏性物质的脱水剂。 3 ) 抗腐蚀性：海藻糖不易生成不溶性的葡聚糖，而且能抑制由砂糖产生的不 溶性葡聚糖的附着，因此，海藻糖不易被口腔中引起龋齿的变异链球菌利用，是 高稳定、低甜度、抗龋齿的天然食品甜味剂，可广泛应用于糖果，糕点、饮料、 调味品及保健食品中。 4 ) 防腐剂和抗变性剂：常用的防腐技术和工艺易产生蛋白质变性问题，且化 学防腐剂又有一定的毒性，而海藻糖可弥补这些缺陷。据报道，在大米加工过程 中加入海藻糖，可使米质保持数年不变；在乳制品、肉类、水果等商品中使用， 可改善产品的感官品质，延长这些产品的货架期。在淀粉类食品中添加海藻糖， 也可明显抑制淀粉的老化，延长产品的货架期( 黄平，1 9 9 5 ) 。 3 海藻糖的生物学功能 海藻糖在生物圈内无处不在，从原核生物到真核生物的细胞内都存在。海藻 糖的特殊分子结构使其有别于其他糖类，作为非还原性糖，其独特的物理和化学 性质，如高亲水性、化学稳定性，形成非吸湿性玻璃体及不形成分子内氢键等t 使海藻糖成为应激代谢物( a r a n d a , 2 0 0 4 ) 。 4 扣囊复膜酵母海藻糖合成代谢的初步研究 海藻糖在不同生物中有不同的功能，在原核生物中可用作碳源，在蓝细菌中 作为相容性溶质( o a l i n s k i ，1 9 9 0 ) ，在分支杆菌等微生物中作为细胞壁的糖酯，称 为索状因子( c o r df a c t o r ) 的结构成分，引起寄主的免疫反应( s p a r g o ，1 9 9 1 ) 。在 酵母和丝状真菌中，大量的海藻糖可作为储存碳水化合物和细胞应激反应保护剂。 某些昆虫含有海藻糖，可在飞翔和逃跑时迅速代谢( a r g u e l l e s 。2 0 0 0 ) 。参与海藻糖 代谢的酶甚至在高等动物中也存在，尽管它们的确切作用仍不清楚。在人类，小 肠上皮细胞和肾近端小管中发现海藻糖酶，在小肠中它可能参与糖跨膜转移或参 与水解从体外摄取的海藻糖，而肾中海藻糖酶的生理功能仍是个谜，因为血液中 未发现海藻糖( i s h i h a r a ，1 9 9 7 ；a r g u e l l e s ，2 0 0 0 ) 。在高等植物中，以前认为只有少数 抗干旱植物存在海藻糖，但最近研究表明，海藻糖在植物中可能普遍存在，海藻 糖合成酶基因转入经济作物中引起的基因多效性问题，如生长表型缺陷和代谢改 变等，说明6 磷酸海藻糖如同在酒精酵母中的作用一样，在植物中可能也是一种 重要的调节因子，参与糖代谢的调节( w i n g l e r ，2 0 0 2 ) 。 在原核生物和真核生物中海藻糖的生理功能多种多样，在酶系统、基因组成、 生物合成和分解的调控机制方面都有很大差异。 3 1 原核生物中海藻糖的生物学功能 在多种细菌中外源海藻糖可作为唯一碳源和能源，海藻糖的分解代谢机制已在 杆菌的不同种中进行了深入研究，在大肠杆菌中，高渗透压时，海藻糖的水解是 由质膜海藻糖酶( t r e a 编码) 催化，释放的海藻糖随后被磷酸转移酶系统的i i “ 酶吸收，值得注意的是，高渗透压同时刺激了大肠杆菌中海藻糖的合成，这是由 于海藻糖合成酶基因o t s a 和o t s b 在高渗透压下被诱导而高效表达，o t s a 和o t s b 分 别编码6 磷酸海藻糖合成酶和6 磷酸海藻糖磷酸酯酶：这两个看起来相互矛盾而 又同时发生的海藻糖合成与水解作用，发生在空间上隔离的两个代谢途径中，合 成酶定位在细胞质中( k a a s e n 。1 9 9 2 ) 。 在低渗透压下，海藻糖的降解由另一途径完成( b o o s , 1 9 8 7 ) 。磷酸转移酶系 统的特定酶i i t r e ( e i i c b ”，由t r e b 编码) 和e l l a g l 。共同转移6 磷酸海藻糖等二糖进 入细胞质，并进一步被细胞质水解酶( t f e c ) 分解，产生葡萄糖和6 磷酸葡萄糖， 基因t r e b 和t r e c 构成一个启动子，它的表达受6 磷酸海藻糖诱导，受葡萄糖分解代 i；，oi( 。 扣囊复膜酵母海藻糖合成代谢的初步研究 谢物抑制( h o r l a e h e r , 1 9 9 7 ) ，此外，一种新的细胞质海藻糖酶( t r e f ) 已被发现， t r e f 与t r e a 在氨基酸水平上有高度序列同源性，为其编码的基因的表达受高渗透， 压弱诱导，不受海藻糖的诱导，部分依赖6 因子( a x g u e l l e s ，2 0 0 0 ) 。 在枯草杆菌中，海藻糖不参与逆境保护作用而作为碳源( w h a t m o r e ，1 9 9 0 ) ，磷 酸海藻糖酶( t r e a ) 负责海藻糖的分解，由基因t r e a 编码，t r e a 酶活性存在于细 胞质内，在对数晚期增加，被海藻糖诱导，受葡萄糖和果糖的抑制。序列分析表 明它与其他的温度敏感的寡1 , 6 葡萄糖苷酶，特别是大肠杆菌的6 - 磷酸海藻糖水解 酶( 由t m c 编码) 有高度同源性( h e l f e r t , 1 9 9 5 ) 。在枯草杆菌中也存在一个特异 酶，“，它是一种海藻糖透过酶，由t r e p 基因编码，与t r e a 一起在跨膜过程中 使海藻糖磷酸化，t r e a 和t r e p 受一个启动子控制，被6 磷酸海藻糖诱导，受碳分 解代谢产物抑制，也被抑制物t r e r ( 姚r 编码) 抑制( b f i r k l e n , 1 9 9 8 ) 。 海藻糖在蓝细菌、嗜盐脱硫弧菌( d e s u l f o v i b r i oh a l o p h i l u s ) 和一些紫色硫细 菌和非硫细菌中作为相容性溶质( a r g u e l l e s ，2 0 0 2 ) 。海藻糖积累依赖于培养基的成 分，与其他有机溶质相平衡( 如甜菜碱、甘氨酸或k + ) ，因此，在嗜盐脱硫弧菌中 胞内海藻糖水平在缺乏外源甘氨酸氨基乙酯时增加，而在嗜盐光合细菌氯盐外硫 红螺菌( e c t o t h i o r h o d o s p i r a h a l o c h l o r i s ) 中，培养基中氮源消耗引起甜菜碱的快速 代谢和海藻糖增加( r e e d ，1 9 8 4 ) 。海藻糖代谢酶在嗜盐脱硫弧菌中已鉴定，它包括 6 磷酸海藻糖合成酶和海藻糖酶，它们的活性与酵母菌的相当，但有一些其他特点， 作为嗜盐酶其最适n a c i 浓度为1 0 0 3 0 0 m m o l l ，m g c l 2 、甘氨酸和甜菜碱对酶有 稳定作用，最适p h 碱性，被磷酸和甜菜碱激活，受盐的抑制( a r g u e l l e s ，2 0 0 0 ) 。 在分支杆菌属( m y c o b a c t e r i u m ) 、诺卡氏菌属( n o c a r d i a ) 、红球菌属 ( r h o d o c o c c u s ) 、棒状杆菌属( c o r y n e b a c t e r i u m ) 的一些种中，海藻糖不单独存 在，而是作为细胞壁的糖酯称为索状因子( c o r df a c t o r ) 的结构成分，索状因子可 引起寄主的免疫反应，如在结核分支杆菌( mt u b e r c u l o s i s ) 中索状因子可抑制吞 噬体与溶酶体融合，从而有效的阻止吞噬作用，导致细菌在寄主细胞内长期存在 ( s p a r g o ，1 9 9 1 ) 。 一在豆科根瘤菌的共生作用中，海藻糖储存于根瘤中，并成为占优势的碳水化合 物( 不考虑提供的碳源和氮源) ，内源海藻糖在培养基中碳源或氮源消耗完后开始 代谢，有趣的是，尽管根瘤菌不能在外源海藻糖上生长，但海藻糖酶、海藻糖磷 酸化酶和磷酸海藻糖酶三个明显的水解酶活性却同时存在于根瘤的不同区域，在 6 扣囊复膜酵母海藻糖合成代谢的初步研究 普通大豆根瘤菌中海藻糖的储存好像与抗旱性有关( s a l m i n e n , 1 9 8 6 ；k a z u b i k o ， 1 9 9 6 ) 。 在某些放线菌中也发现了海藻糖，如链霉菌属的菌种，二糖合成贯穿于整个菌 落形成过程，但海藻糖优先储存于气生菌丝和孢子中，在无水的情况下，在孢子 中代替水起保护作用，孢子萌发早期合成特定的海藻糖酶引起海藻糖分解，此前 细胞量会显著增加0 1 l b e i n ，1 9 7 4 ；m a r t i n , 1 9 8 6 ) 。 3 2 酵母菌和其他丝状真菌中海藻糖的生物学功能 3 2 1 作为储藏物质 在酵母和真菌中，海藻糖可作为储存物质( e l b e i l l 1 9 7 4 ) 。但是海藻糖作为贮 存物质这一功能引起了大量争议，因为一般认为储存物质是在外源能量超出细胞 生长和生物合成需要时合成，在细胞生长受到威胁时降解，而海藻糖是在细胞生 长开始下降时优先合成，当有过量外源能量时却不合成，其他基本营养提供与否 也不是限制因素。另外，细胞饥饿、休眠时，贮存的海藻糖仍保持完整，不用于 维持生命，但是它却在细胞从逆境胁迫恢复生长和孢子萌发早期快速代谢。此外， 储存物质的降解可提供能被快速利用的能量，在这方面，海藻糖可能比其他物质 具有生态学上的优势，然而与外源碳源释放的能量相比，海藻糖降解释放的能量 只占很小的一部分( t h e v e l e i n , 1 9 8 4 ；w i e m k e n , 1 9 9 0 ) 。 真菌孢子中含有较高浓度的海藻糖，孢子对极端环境有很高的抗性，这表明海 藻糖是作为应激保护剂而不是储存物质( t h e v e l e i n , 1 9 8 4 ) 。 海藻糖在酵母菌中由海藻糖酶分解成两分子的葡萄糖，酒精酵母和其他一些酵 母含有中性和酸性海藻糖酶：中性海藻糖酶( n t h l 和n t h 2 ) 基因在酒精酵母中已 被克隆( 定位于染色体上) ( l o n d e s b o r o u g h ，1 9 8 4 ) ；在乳糖克鲁斯酵母中 ( k l u y v e r o m y c e sl a t i s ) 也被克隆，它是细胞质酶，在p h 7 0 时表现最大活性，被 c a 2 + 或m n 2 + 激活，受m 9 2 + 擗1 。n t h l 受由依赖c a m p 的蛋白激酶引起的磷酸化 作用控制，表现在酶直接参与了由明显生理刺激引起的海藻糖代谢( 如孢子萌发 和应激恢复生长等) ( a m a r a l 1 9 9 7 ) 。 对酵母中酸性海藻糖酶( a t h l ) 的生理功能了解的较少，它存在于酒精酵母和 产朊假丝酵母( c a n d i d au t i l i s ) 等酵母的液泡中，在酸性p h ( 4 5 ) 时表现出最大 扣囊复膜酵母海藻糖合成代谢的初步研究 酶活力，不受依赖c a m p 的磷酸化作用的调节，不受二价阳离子影响，也不参与 海藻糖的生理降解，受葡萄糖抑制，值得注意的是a t h l 序列与n t h l 不同源，也 。不与其他已测序的大肠杆菌、昆虫和兔子中的酸性海藻糖酶同源( f r a n f o i s ，2 0 0 1 ) 。 3 2 2 作为应激保护剂 酒精酵母在高温或细胞生长的稳定期，可在其体内积累高达细胞干重l o 一 1 5 的海藻糖，而在正常生长条件或对数期却没有或很少积累海藻糖，在酵母细胞 中海藻糖的积累已被证实在对不同胁迫应答中起关键作用( w i e r n k e n ，1 9 9 0 ； p l o u r d e o w o b i ，2 0 0 0 ) 。海藻糖具有在胁迫条件下防止细胞内蛋白质聚集和帮助蛋 白质正确折叠的功能，某些化合物( 如热激蛋白，h s p ) 也可能参与了细胞保护机 制，研究表明，海藻糖和h s p l 0 4 分子伴侣是细胞质内蛋白质再折叠以及热损伤的 胞质网状结构糖蛋白复性时必需的( s i n g e r ，1 9 9 8 ) 。高水平的海藻糖可保护蛋白质 避免变性，也可抑制变性蛋白