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2诱变育种与耐药突变 3 发酵条件优化 4抑菌物质的初步定性 结论一 致谢 声明 科研成果简介 参考文献 文献综述：类细菌素的研究进展 1 类细菌素研究的背景 2 天然防腐剂的发展 4 3 4 4 - - - 4 4 4 5 4 6 4 7 4 9 5 4 5 5 3 类细菌素产生菌一一一一一6 2 4 枯草芽孢杆菌抗茵物质的研究进展 参考文献 图形目录 图1 硫酸庆大霉素标准曲线一一1 9 图2 图3 图4 紫外线诱变l l l 8 - 4 的致死曲线一 d e s 诱变l 卜i - e 6 5 的致死曲线 不同碳源对类细菌素产量的影响 图5 不同浓度的葡萄糖对类细菌素产量的影响 图6 不同氮源对类细菌素产量的影响 2 6 2 8 3 1 3 2 3 2 图7 不同浓度的牛肉膏对类细菌素产量的影响一3 3 图8 不同生长因子对类细菌素产量的影响 图9 斜面接种量对类细菌素产量的影响 图1 0 图1 1 液体种子接种量对类细菌素产量的影响一 培养基起始p h 值对类细菌素产量的影响 i l 3 3 3 5 3 6 3 6 图1 2 图1 3 图1 4 图1 5 图1 6 图1 7 图1 8 图1 9 图2 0 图2 1 温度对类细菌素产量的影响 培养时间对类细菌素产量的影响一 - - - 3 7 一一3 7 培养基装量对类细菌素产量的影响一一一3 8 标准曲线中牛津杯的排列位置照片一一一一2 0 初筛照片( 平板滤纸片法) l l l 8 - 4 培养液对金黄色葡萄球菌的抑制作用照片一2 2 l l l 8 - 4 菌株的扫描电镜照片一一_ _ - 一2 4 蛋白酶k 处理后抑菌试验结果照片一一一3 9 高产菌株的质粒电泳照片 质粒消除菌株的质粒电泳照片 表格目录 表1 硫酸庆大霉素标准曲线的测定结果一一 表2 有抑菌作用的菌株数统计一 表3 对不同指示菌有抑制作用的菌株数统计 表4 1 1 株广谱抗菌菌株抑菌圈的比较 一一一4 0 一4 1 2 0 一一2 l 一一2 2 表5 不同p h 下l l l 8 4 菌株培养液与空白样对比一一2 3 表6 l l l 8 4 菌株的生理生化特征 表7 l l l 8 4 菌株的抗菌谱分析一 表8 l l l 8 - 4 对硫酸庆大霉素的耐药水平 - 2 3 - - - 2 5 表9 紫外线诱变l l l 8 4 的存活率一_ 一- 一2 6 表1 0 硫酸庆大霉素耐药突变株效价分析一 2 7 1 上一i e 6 5 和l l l8 - 4 的效价比较一一一2 7 l l - i e 6 5 对利福平的耐药水平一一一2 7 d e s 诱变l l i e 6 5 的存活率一2 8 利福平耐药突变株效价分析一一一2 9 l l i 卜3 3 7 和l l i e 6 5 的效价比较一2 9 l l i i 一3 2 7 产量稳定性一一一一3 0 正交试验因素、水平设计表一一一一3 4 i l l 他坞m m 表表表表表表表 四川大学硕士学位论文 表2 0 表2 1 表2 2 表2 3 细菌素和抗生素的区别 细菌素的分类及举例 紫外线诱变突变株效价分析 硫酸二乙脂诱变突变株效价分析 3 8 6 0 5 9 2 7 2 9 四川大学硕士学位论文 类细菌素产生菌的筛选改良及其发酵产物 性质的初步研究 微生物学专业 研究生：李凛指导教师：胡承副教授 摘要 以从四川某酒厂采集的酒糟和酒糟没出液为样本，以平板培 养法富集，e p 管培养菌液，平板滤纸片法初筛，摇瓶培养菌液， 杯碟法复筛的筛选方法，得到一株对多种革兰氏阳性指示菌、革 兰氏阴性指示菌及部分霉菌具有广谱抗菌活性的类细菌素产生 菌，菌株编号l l l 8 4 。经形态观察及生理生化实验，鉴定该菌为 枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l l s ) 。 在类细菌素产生菌高产菌株的选育过程中，采用紫外线与d e s ( 硫酸二乙脂) 组合诱变方法，并且根据生化和遗传学原理，设计 了组合抗生素耐药突变筛选方法。试验证明采用抗生素硫酸庆大 霉素、利福平作为选择压力，能有效的除去低效价菌株，避免了 随机筛选的盲目性，提高高产菌株的检出率，两轮诱变共挑取1 5 5 7 株突变株，检出4 3 0 株正相突变株，检出率达到2 7 6 ，较传统的 筛选法优越。以枯草芽孢杆菌l l l 8 4 为出发菌，通过紫外线诱变， 筛选出一株抗硫酸庆大霉素浓度为0 3 9 l 的突变株l l - i - e 6 5 ， 效价达到2 1 7 u m 1 ，较出发菌l l l 8 4 ( 效价为1 6 4 u m 1 ) 提高了 3 2 。以硫酸庆大霉索耐药突变株l l i e 6 5 为出发菌，通过d e s 四川大学硕士学位论文 诱变，筛选出一株抗利福平浓度为0 5 9 l l 的突变株l l i i 一3 3 7 ， 效价达到2 8 8 u m l ，较出发菌l l i e 6 5 提高了3 3 ，较原始菌株 l l l 8 4 提高了7 6 。类细菌素高产菌l l - i i 一3 3 7 连续传代7 代之 后，类细菌素的产量保持稳定，耐药性标记保持稳定。 通过单因素分析和正交实验法，对高产菌l l i i 一3 3 7 的培养 基组成和发酵条件进行了研究，确定了l l - i i - 3 3 7 的最佳培养基 配方为：葡萄糖l o g l ，牛肉膏2 0 9 l ，酒糟浸出液l o g l ，氯化 钠5 9 l ，蒸馏水l l ，培养基初始p h 6 5 。最佳培养条件为：优化 培养基2 5 0 m i 三角瓶装量7 0 m l ，接种量1 ，3 7 摇瓶培养9 6 h ， 效价达到4 1 9 u m l ( 以硫酸庆大霉素为对照) 。 对该类细菌素生物学特性进行初步研究，发现该类细菌素对 蛋白酶k 敏感，经过1 2 1 处理2 0 r a i n 后仍能保持较好的抑菌活性， 证明热稳定性较好。 经质粒提取和琼脂糖凝胶电泳，检测到一条明显的质粒带， 经过质粒消除，该菌失去了产生抑菌活性物质的能力，可以推测 该菌株编码类细菌素的基因可能存在于质粒上。 关键词：类细菌素枯草芽孢杆菌发酵条件耐药突变质粒 诱变育种 四川丈学硕士学位论文 s t u d yo ni m p r o v e m e n t s t r a i ns c r e e n i n g a n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fan o v e l b a c t e r i o c i n - l i k ep r o d u c i n gs t r a i n m a j o r ：m i c r o b i o l o g y p o s t g r a d u a t e ：l il i n t u t o r ：h uc h e n g a b s t r a c l an o v e lb a c t e r i o c i n l i k ep r o d u c i n gs t r a i nw a ss c r e e n e da n d i s o l a t e df r o mm a t u r ea l c o h o ld i s t i l l e r yg r a i na n dy e l l o ww a t e rs a m p l e s an e ww a yw a su s e dt oi s o l a t et h eb a c t e r i u mp r o d u c i n ga n t i b i o t i c s u b s t a n c e ：c u l l u r eb a c t e r i u mi ne pt u b e st h e ni s o l a t et h e mb y p a p e r - d i s kt e s ta n dc y l i n d e r - p l a t em e t h o d t h es t a i nw a si d e n t i f i e da s b a c i l l u ss u b t i l i s b yp h y s i o l o g i c a l b i o c h e m i c a lt e s t i n g a n d m o r p h o l o g i cc h a r a c t e r i s t i c s ，i tw a sn a m e dl l l 8 - 4 i nt h ep m c e d u r eo fs e l e c t i n gb a c t e r i o c i n l i k e h i g h - p r o d u c i n g s t r a i n ，g e n t a m y c i ns u l f a t ea n dr i f a m p i c i nw e r ea d d e di nt h ec u l t u r e m e d i u ma ss e l e c t i o n p r e s s u r e t h i sn e wm e t h o d c a r lo b v i a t e l o w - p r o d u c i n gs t r a i na n di n c r e a s i n gt h es u c c e s s f u lr a t eo fo b t a i n i n g h i g h - p r o d u c i n gs t r a i n ，i ti sb e t t e rt h a nt r a d i t i o n a ls c r e e n i n ga p p r o a c h e x p e r i m e n ts h o w e dt h a tu s i n gb a c i l l u ss u b t i l i sl l l8 - 4 ( w i t ht h ey i e l d o fb a c t e r i o c i n - l i k eb e i n g16 4 u m 1 ) a sp a r e n ts t r a i n ，a f t e ru vm u t a t i o n ， t h em u t a n tl l i - e 6 5r e s i s t a n tt o0 3 9 lo fg e n t a m y c i ns u l f a t ew a s o b t a i n e d ，t h em u t a n tp r o d u c e d2 1 7 u m lb a c t e r i o c i n - l i k ea n di n c r e a s e d b y3 2 c o m p a r e dw j t l lt h ep a r e n ts t r a i n s u b s e q u e n t l y , t h em u t a n t l l 一1 一e 6 5w a su s e da sp a r e n ts t r a i n ，a f t e rd e sm u t a t i o n ，t h em u t a n t l l - i i - 3 3 7w a sr e s i s t a n tt oo 5 9 lo fr i f a m p i c i nw a so b t a i n e d t h e m u t a n tp r o d u c e d2 8 8 u m lb a c t e r i o c i n l i k ea n di n c r e a s e db y3 3 c o m p a r e dw i t ht h ep a r e n ts t r a i na n d7 6 c o m p a r e dw i t ht h ef i r s t 3 四川大学硕士学位论文 p a r e n ts t r a i nb a c i l l u ss u b t i l l sl l i8 。4 t h eh i g h - p r o d u c i n gs t r a i nl l i i - 3 3 7w a ss t a b l ei nb a c t e r i o c i n - l i k ep r o d u c t i o na f t e rc o n t i n u o u s s u b c u l t u r e sf o rs e v e ng e n e r a t i o n s f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sf o rb a c t e r i o e i n l i k ep r o d u c i n gh a v eb e e n e s t a b l i s h e d ：1 g l u c o s ea sc a r b o ns o b i c ) e ，2 b e e fe x t r a c ta sn i t r o g e n s o l t r c e ，1 e x t r a c tl i q u i do ft h ef r e s hd i s t i l l e r yg r a i na sg r o w t hf a c t o r ， i n i t i a lp h 6 5 ，1 0 0 m lc u l t u r em e d i u mi n2 5 0 m lc o n i c a lf l a s k ，s e e d sa g e f o r2 4 h i n o c u l a t i o nl a n dc u l t u r et e m p e r a t u r e3 7 f o r9 6 h t h e b a c t e r i o s t a s i sa c t i v i t yc a l lr e a c h4 1 9 u m 1 t h e r e 倍sn oa c t i v i t ya p p e a r sw h e nt h es u p e m a t a n tw a st r e a t e d 埘t hp r o t e i n a s ek t h i sk i n do fb a c t e r i c o i n 1 i k es u b s t a n c eh a sv e r y l l i 曲h e a ts t a b i l i t yw h e ni tw a su n d e ra c i dc o n d i t i o n t h ep l a s m i dw a si s o l a t e df i o mt h ee e l lo fl l i i 3 3 7 t h e e x p e r i m e n to f p l a s m i dc o n f i r m e dt h a tt h ep l a s m i dh a ss o m er e l a t i o nt o t h ea b i l i t yo f i t sb a c t e r i o s t a s i ss u b s t a n c ep r o d u c i n g k e y w o r d s ：b a c t e r i o c i n l i k e ； b a c i l l u s s u b t i l i s ； f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s ；r e s i s t a n tm u t a t i o n ；p l a s m i d ；m u t a n tb r e e d i n g 4 四川大学硕士学位论文 类细菌素产生菌的筛选改良及其发酵产物 性质的初步研究 前言 随着社会的进步，人们生活水平不断提高，食品工业也在不 断的发展。据统计，我国食品工业总产值在1 9 9 9 年达到6 0 2 0 3 亿元人民币。占全国工业总产值的9 3 “1 ，但是由于腐败变质导 致生产的食品约有l o 2 0 损失，这是一个巨大的浪费。因此， 研发安全有效的食品防腐剂，是食品工业发展的关键问题之一。 食品防腐剂一般分为人工合成防腐剂( 无机防腐剂、酸性防腐剂 和脂性防腐剂) 和天然防腐剂( 植物性来源、动物性来源和微生 物性来源) 两大类。1 ，以前由于人工合成防腐剂成本低廉，因此长 期以来在食品工业中占主导地位。但随着生活水平的提高和科学 技术的发展，人们逐渐认识到人工合成防腐剂在适用条件、对食 品风味的影响以及对人体的毒害作用等方面或多或少存在缺陷， 因此，近年来研究者纷纷把目光投向天然防腐剂的开发”1 。天然防 腐剂的缺点是在自然界中的生产周期长，人工提取和制造工艺复 杂，技术投资规模大，产品得率低，价格昂贵。1 ，这使得天然防腐 剂不能完全取代人工合成防腐剂。但在以乳酸链球菌素( n i s i n ) 为代表的细菌素类天然防腐剂的生产中克服了这些缺点，从而使 对细菌素的研究成为人们研究天然防腐剂的重点“1 。 细菌素是某些细菌在代谢过程中由核糖体合成产生的一类具 有抑菌杀菌作用的蛋白或多肽，其抑菌范围不局限于同源菌，产 生菌对其细菌素有自身免疫性”1 。它与人工合成防腐剂相比具有杀 菌力强、适用条件广、在人体内能被蛋白酶分解、无毒副作用、 水溶性好、热稳定性好、不影响食品风味等优点“1 ，它的生产过程 同其他天然防腐剂相比具有生产周期短，生产效率高，成本低廉 四川大学硕士学位论文 等优点，因此，细菌素非常适合作为天然防腐剂用于食品工业。1 。 目前食品工业中研究得最透彻的细菌素是乳酸链球菌素n i s i n ，它 干1 9 6 9 年被联合国粮食与农业组织( f a o ) 和世界卫生组织( w h o ) 跃 合专家组推荐为高效安全天然防腐剂，现在广泛的运用于肉类工 业、奶制品工业、酿酒工业和罐装食品工业”。 细菌素也有它的局限性，细菌素大多是由革兰氏阳性菌产生 并抑制革兰氏阳性菌，对大多数革兰氏阴性茵和真菌没有抑制作 用“，这限制了它的使用范围。在人们对细菌素的研究过程中， 陆续发现了另外一些拮抗物质，宣f 】盥悬苤些垫董查岱逝过猩虫 直丝趟链金盛主生鲍= 差县壹地苴苤苴使旦丝虽自壁垒邀：但基 自壁地剑堇兰医阻挂苴：堇兰医堕壁菌独基重“”1 ，国外的学 者于1 9 5 8 年正式将这类物质定义为类细菌素并对其展开了研究 “”。目前已经有链霉菌“、苏云金芽孢杆菌“”、地衣芽孢杆菌。“、 链球菌“”、铜绿假单胞菌“”、日本根瘤菌1 等产生类细菌素的报 道：有报道称将类细菌素作为防腐剂加入食品中能抑制大肠杆菌 的生长o “，类细菌素能抑制口腔厌氧微生物在口腔医学中发挥作 用池“，类细菌素能够作为药品使用在临床上。等等。 在国外，对类细菌素的研究已经进行的相当深入，但是在国 内相关的研究却很少。本文着眼于开发新型的类细菌素，从酒糟 中筛选出一株类细菌素产生菌，用组合抗生素耐药突变筛选法对 其进行改良，对该菌的最适发酵条件、产生的抑菌物质性质、抑 茵基因可能存在的位置等进行了研究，为今后工业化的开发和医 药利用奠定基础。 四川大学硬士学位论文 材料与方法 1 材料 1 1 样品来源 从四川某酒厂采集的发酵成熟的酒糟和酒糟浸出液。 1 2 培养基枷 1 2 1 细菌培养基( g l l ) ： 牛肉膏3 0 ，蛋白胨i 0 0 ，氯化钠5 0 ，琼脂2 0 0 ，p h7 o 7 2 ，1 2 1 高压蒸汽灭菌2 0 m i n 。 1 2 2 种子培养基( g l l ) ： 葡萄糖5 0 ，蛋白胨1 0 o ，牛肉膏1 5 ，酵母膏6 0 ，琼脂2 0 0 ， 氯化钠5 0 ，p h 7 2 7 5 ，1 1 5 。c 高压蒸汽灭菌2 0 m i n 。 1 2 3 指示菌生长培养基( g l ) ： 葡萄糖1 0 ，蛋白胨1 0 0 ，酵母膏6 0 ，牛肉膏3 0 ，琼脂2 0 0 ， p h7 2 7 5 ，1 1 5 c 高压蒸汽灭菌2 0 m i n 。 1 2 4 抑菌活性检测培养基( g l ) ： 下层培养基：i 5 水琼脂培养基。 上层培养基：l o m l 指示菌生长培养基中加入0 i m l 指示菌菌 悬液( 指示菌培养于指示菌生长培养基斜面3 7 过夜，用l o m l 无菌水刮洗斜面，制成菌悬液) 。 1 2 5 菌种鉴定培养基： 菌种鉴定中使用的培养基和试剂见参考文献4 3 。 1 2 6 硫酸庆大霉素培养基( g l ) ： 葡萄糖5 0 ，蛋白胨1 0 0 ，牛肉膏1 5 ，酵母膏6 0 ，琼脂2 0 0 四川大学硕士学位论文 氯化钠5 0 ，硫酸庆大霉素0 3 ，p h 7 2 7 5 ，11 5 c 高压蒸汽灭 菌2 0 m i n 。 1 2 7 利福平培养基( g l ) ： 葡萄糖5 0 ，蛋白胨1 0 0 ，牛肉膏l - 5 ，酵母膏6 0 ，琼脂2 0 0 ， 氯化钠5 0 ，利福平0 5 ，p h 7 2 7 5 ，1 1 5 高压蒸汽灭菌2 0 m i n 。 1 3 主要试剂与设备 1 3 1 主要试剂 庆大霉素标准品：s i g m a 公司 庆大霉素注射液：四川长征制药股份有限公司 利福平胶囊：成都锦华药业有限责任公司 蛋白胨：北京奥博星公司 琼脂粉：进口分装 其他试剂：均采用国产分析纯或化学纯 1 3 2 主要设备 p h s 一2 c 酸度计：上海康仪仪器有限公司 光学显微镜：日本o l y m p u s 光学显微镜 扫描电镜：h i t a c h i - - 4 5 0 型 d d y - - i i l 8 型电泳仪：北京六一仪器厂 d y c z - - 2 8 a 型电泳槽：北京六一仪器厂 1 4 抑菌活性指示菌“”。 金黄色葡萄球菌a 3 0 1 ( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u sa 3 0 1 ) 金黄色葡萄球菌a 3 0 9 ( s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s 青霉素敏感型) 绿脓杆菌( p s e u d o m o n a s p y o c y a n e a ) 大肠杆菌( 西c h e r i c h 如c o l d 枯草芽孢杆菌( b a c i l l u s s u b t i l i s ) 鸟链球菌( s t r e p t o c o c c u sa v i u m ) 四川大学硕士学位论文 表皮葡萄球菌s t a p h y l o c o c c u se p i d e r m i d i s ) 粪链球菌( s t r e p t o c o c c u s f a e c a l i s ) 酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 2 方法 2 1 类细菌素效价的测定n 。“例 由于该类细菌素尚未确定成分，没有标准品或结构类似物做 参照，故以硫酸庆大霉素作为参照物。制作硫酸庆大霉素对金黄 色葡萄球菌的标准曲线，该类细菌素的效价参照对金黄色葡萄球 菌具有相同抑菌效果的硫酸庆大霉素标准品的效价来定义。 2 1 1 指示菌的制备 将金黄色葡萄球菌a 3 0 1 ( s t a p h y l o c o c c u sa h r p u sa 3 0 1 ) 培养 于指示菌生长培养基斜面3 7 c 下过夜，用l o m l 生理盐水将斜面细 胞洗下制成菌悬液，将菌悬液稀释为浓度1o g 个m l 。 2 1 2 抑菌活性检测平板的制备 采用双层平板法。下层培养基：l - 5 水琼脂培养基l o m l ；上 层培养基：将2 1 1 中制备的金黄色葡萄球菌a 3 0 1 菌悬液在4 8 下加入指示菌生长培养基中，每l o o m l 指示菌生长培养基中加 入i m l 菌悬液，摇匀，每平板倒l o m l 。 2 1 3 效价测定方法( 一剂量法) 1 ) 制2 0 u m l 、4 0 u m l 、6 0 u m l 、8 0 u 皿1 、l o o u m l 、1 2 0 u m l 、 1 4 0 u m l 、1 6 0 u m 1 、1 8 0 u m l 、2 0 0 u m l 的硫酸庆大霉索标准溶 液。 2 ) 取2 1 _ 2 中制备好的平板2 7 套，每三套为一组，共分9 组。 每个平板中均匀放置6 个牛津杯( 1 0 x 8 6 c m ) ，每间隔的3 个 牛津杯点入0 3 m ll o o u m l 的硫酸庆大霉素标准品( c 。) ，其余 四川大学硕士学位论文 3 个牛津杯点入0 3 m l 同一浓度的硫酸庆大霉素标准品 ( 1 0 0 u m l 除外) ，每一组内的三套平板取同一浓度。将全部平板 用瓦盖盖住，置于3 7 培养箱中培养1 5 h ，测定抑菌圈直径。 3 ) 将上述2 7 个平板中8 1 个l o o u m l 硫酸庆大霉索标准品的抑菌 圈直径的平均值作为标准曲线的校正点。将每个浓度的9 个抑 菌圈直径所得的平均值校正成适当的数值。 4 ) 以上述l o 个浓度的硫酸庆大霉索标准溶液校正后的抑菌圈直 径( m m ) 为纵坐标，相应的浓度对数为横坐标，在双周半对数 坐标纸上绘制标准曲线。或将上述数据以d = al g c + b 进行回归， 其中：d 为抑菌圈直径( 咖) ，c 为抑制剂浓度( u m 1 ) ，a 、b 为常数。 2 1 4 类细菌素效价的测定 将上清液按2 1 _ 3 方法进行加样，同一浓度做3 个重复，置 于3 7 培养箱中培养1 g h ，测定抑菌圈直径，根据标准曲线计算 培养液效价。 2 2 类细菌素产生菌的筛选m “删 2 2 1 有抑菌活性菌株的初筛 初筛采用平板滤纸片法。将样品用无菌水适当稀释，取一定 量涂布于细菌培养基平板上，3 0 倒置培养7 2 h 。待长出菌落后用 无菌牙签挑取单菌落接种于加有l m l 细菌培养基的1 5 m le p 管中， 密封，3 0 振荡培养7 2 h 。将培养液以1 0 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，取上 清液2 0 u 点于放置在抑菌活性检测平板上的5 m m 无菌滤纸片上， 3 7 倒置培养1 5 h ，挑取滤纸片周围具有较大抑菌圈且抑菌谱较广 的菌株进行复筛。 2 2 2 有抑菌活性菌株的复筛 复筛采用杯碟法。将初筛菌种以划线法或平板单菌落法进行 纯化、保藏。将纯化保藏后的初筛菌种接入装有1 0 0 m l 细菌培养 四川大学硕士学位论文 基的2 5 0 m l 三角瓶中3 0 c 摇瓶培养7 2 h ，按1 的接种量接入装有 l o o m 细菌培养基的2 5 0 m 1 三角瓶中，3 0 ( 2 摇瓶培养7 2 h 。将培养 液以1 0 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，用一剂量法方法测定各菌株上清液的抑 菌活性。 2 2 3 有机酸作用的排除“ 上清液对指示菌的抑制作用可能是类细菌素也可能是枯草芽 孢杆菌生成的有机酸。为了排除有机酸的干扰，用1 n 的n a o h 和 1 n 的h c l 将各菌株上清液调p h 为5 0 、5 5 、6 0 、6 5 、7 0 、7 5 ， 同时设一组空白样，两组同时做抑菌试验。 2 2 4 过氧化氢的检测_ “_ “ 上清液对指示菌的抑制作用可能是类细菌素也可能是枯草芽 孢杆菌生成的过氧化氨。为了排除过氧化氢的干扰，采用过氧化 物酶法对各菌株培养过程中过氧化氢的存在进行检测。 2 3 类细菌素产生菌的鉴定“刚 2 3 1 菌种的初步鉴定 采用形态观察和生理生化试验相结合的方法进行特性鉴定 并以伯杰氏细菌鉴定手册( 第八版) 作为分类参考。 23 2 扫描电镜的制片方法” 1 ) 将菌悬液用p h 7 2 的0 1 m 磷酸盐缓冲液( p b s ) 冲洗三次。 2 ) 最后一次悬浮于适量p b s 中，浓度以滴在3 4 m m 2 小玻片上密 度均匀菌落不互相重叠为宜( 稍多为宜，因为在固定相脱水过 程中要脱落许多) 。 3 ) 菌悬液稀释到适当浓度后，滴在小玻片上，室温静置1 0 m i n ，将 多余细胞悬液吸去。 4 ) 将小玻片面朝上放入培养皿底部，用吸管沿瓶壁缓慢加入1 戊二醛溶液，没过样本，4 固定2 h 以上。 四j i i 大学硕士学位论文 5 ) 用p b s 冲洗三次小玻片。 6 ) 用丙酮逐级脱水，5 0 、7 0 、9 0 各一次，1 0 0 两次，每次5 l o m i n 。 7 ) 用醋酸异戊脂逐级脱丙酮，5 0 、7 0 、9 0 各一次，1 0 0 两次， 每次5 l o m i n 。 8 ) 放入临界点干燥仪，进行干燥。 9 ) 以碳、金分别喷涂。 1 0 ) 取出样本，扫描电镜观察。 2 3 3 抗菌谱分析 采用杯碟法。将筛得的菌株按2 2 2 方法培养，取培养液以 1 0 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，取0 。3 m l 上清液点入不同指示菌平板上的牛 津杯中，于指示菌最适生长温度下培养1 5 h ，观察有无抑菌圈出现 以及抑菌圈的大小。 2 4 紫外线诱变与硫酸庆大霉紊耐药突变株的筛选 2 4 1 硫酸庆大霉素抑制枯草芽孢杆菌l l i8 - 4 的试验” 将枯草芽孢杆菌l l l 8 4 培养子种子培养基斜面3 7 下过夜， 用生理盐水洗脱并制成1 0 8 个m l 的菌悬液，取0 2 m l 菌悬液涂布 于细菌培养基平板上，滴加少量硫酸庆大霉素于平板中央，3 0 倒置培养7 2 h ，观察平板中央是否形成透明的抑菌圈。能形成抑菌 圈者，说明硫酸庆大霉素能够抑制枯草芽孢杆菌l l l 8 4 的生长。 2 4 2 枯草芽孢杆菌l l l 8 - 4 耐药水平的测定”1 制备含0 、0 1 、0 2 、0 3 、0 4 、0 5 、0 6 、0 7 、0 8 、o 9 、 l io g l 的硫酸庆大霉素培养基平板，涂布l l l 8 - 4 菌悬液0 2 m i ( 浓 度约为1 0 8 个m 1 ) 于各平板上。3 0 倒置培养7 2 h ，观察各平板 生长情况，确定硫酸庆大霉素抑制l l l 8 - 4 生长的最低浓度。 2 4 ，3 紫外线诱变枯草芽孢杆菌l l i8 - 4 “1 “鳓 四川大学硕士学位论文 将枯草芽孢杆菌l l l 8 - 4 作为班发菌株，在种子培养基斜面上 3 7 下过夜，用无菌生理盐水洗脱，制成1 护个m l 的菌悬液，加 入玻璃珠振荡混匀。取适量菌悬液置于培养皿中，使其刚刚铺满 培养皿底部，待紫外灯预热2 0 m i n 后，将培养皿置于磁力搅拌器 上，开动搅拌器，用4 0 w 、灯距3 q c m 的紫外灯分别照射o s 、3 0 s 、 6 0 s 、9 0 s 、1 2 0 s 、1 8 0 s 、3 0 0 s 后取菌液0 1 m l ，将菌液适当稀释 后，各取0 2 m l 涂布在种子培养基平板上，3 0 c 避光培养7 2 h 后 计数，以测定紫外线诱变的致死率。以上操作均在暗室红光下进 行。 2 4 4 硫酸庆大霉素耐药突变株的筛选“ 在4 0 w 、灯距3 0 c m 的紫外灯下照射( 时间分别为o s 、3 0 s 、 6 0 s 、9 0 s 、1 2 0 s 、1 8 0 s 、3 0 0 s ) 后的枯草芽孢杆菌l l l 8 4 菌悬液， 分别涂布在含有最低抑菌浓度0 3 9 l 硫酸庆大霉素培养基平板 上，3 0 c 避光培养7 2 h 后，生长的菌株就是硫酸庆大霉素耐药突 变株，再进行高产菌的筛选( 方法同2 2 1 和2 2 2 ) 。将筛选到 的硫酸庆大霉素耐药突变株作为下一轮d e s 诱变的出发菌。 2 ，5d e s 诱变与利福平耐药突变株的筛选 2 5 1 利福平抑制枯草芽孢杆菌l l i - e 6 5 的试验0 7 将枯草芽孢杆菌l l - i e 6 5 培养于种子培养基斜面3 7 下过 夜，用生理盐水洗脱并制成1 0 8 个m l 的菌悬液，取0 2 m l 菌悬液 涂布于细菌培养基平板上，滴加少量利福平于平板中央，3 0 倒 置培养7 2 h ，观察平板中央是否形成透明的抑菌圈。能形成抑菌圈 者，说明利福平能够抑制枯草芽孢杆菌l l i e 6 5 的生长。 2 5 2 枯草芽孢杆菌l l i - e 6 5 耐药水平的测定。7 1 制各含0 、0 1 、0 2 、o 3 、o 4 、0 5 、0 6 、0 7 、0 8 、0 9 、 1 o g l 的利福平培养基平板，涂布l l - i e 6 5 菌悬液0 2 m ( 浓 度约为1 酽个m 1 ) 于各平板上。3 0 c 倒置培养7 2 h ，观察各平板 四川大学硕士学位论文 生长情况，确定利福平抑制l l - ir e 6 5 生长的最低浓度。 2 5 3d e s 诱变枯草芽孢杆菌l l - i - e 6 5 “。1 将筛得的枯草芽孢杆菌l l i e 6 5 作为出发菌株，在种子培 养基斜面上3 7 下过夜，用无菌生理盐水洗脱，制成1 0 7 个m l 的 菌悬液。取菌悬液4 m l ，d e s ( 硫酸二乙脂) 0 3 m l ，p h 7 0 的0 1 m 磷酸缓冲液1 6 m l ，于2 8 ，2 0 0 r p m 摇床上分别作用0 、1 0 、2 0 、 3 0 、4 0 、5 0 、6 0 m i n 后，加入中止剂2 5 硫代硫酸钠0 8 m l ，各取 样5 m l 离心洗涤三次( 转速1 0 0 0 0 r p m ，l o m i n ) ，最后用5 m l 生理 盐水悬浮。 将处理时间分别为0 、1 0 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0 、6 0 m i n 的菌悬液 适当稀释，各取0 2 m l 涂布于种子培养基平板上，3 0 c 倒置培养 7 2 h 后计数，以计算3 e s 诱变l l - i e 6 5 的致死率。 2 5 4 利福平耐药突变株的筛选“ 取经d e s 诱变( 时间分别为1 0 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0 、6 0 m i n ) 的 枯草芽孢杆菌l l i e 6 5 的菌悬液涂布于含有最低抑菌浓度 0 5 9 l 利福平培养基平板上，3 0 倒置培养7 2 h 后，生长的菌株 就是利福平耐药突变株，再进行高产菌的筛选( 方法同2 2 1 和 2 2 2 ) 。 2 6 发酵条件优化试验，”1 类细菌素的产生不仅取决于菌种本身，而且受发酵条件的影 响。在摇瓶发酵模式下，我们试验了培养基组分，接种量和接种 形式，起始p h 值，温度，通气量，发酵时问对类细菌素产量的影 响。 2 6 1 培养基组分的优化 2 6 1 1 单因子试验 测定不同的碳源、氮源、生长因子对类细菌素产量的影响。 四川大学硕士学位论文 2 6 i 2 正交试验优化培养基 通过上述单因子试验，先确定因素和水平，再用正交实验法 确定优化发酵培养基的组成。 2 6 2 发酵条件对类细菌素产量的影响 测定接种形式、接种量、培养基起始p h 值、培养基装量、温 度、培养时间对类细菌素产量的影响。 2 7 l l - i i - 3 3 7 产类细菌素的特性m “蜘 2 7 1 对蛋白酶k 的敏蒜性 取l l i i 一3 3 7 菌株的培养液以1 0 0 0 0 r p m 离心l o m i n ，取上清 液l m l ，用l n 的n a 0 h 和l n 的 l c l 调节p h 为蛋白酶k 的最适作用 p h 7 6 ，按0 5 9 l 加入蛋白酶k ，在3 7 c 下温育l h 。再将p h 调回 类细菌素的最适p h 6 5 ，以未经处理的原液做对照，以一荆量法做 抑菌试验。 2 7 2 热稳定性 取l l - i i 一3 3 7 菌株的培养液以1 0 0 0 0 r t 瑚离心l o m i n ，取等量 上清液分别于5 0 、7 0 c 、9 0 、1 2 1 保温2 0 m i n ，以未经处理 的原液为对照，以一剂量法做抑菌试验。 2 8 类细菌素产生菌的质粒提取和检测 2 8 1l l i i 一3 3 7 质粒的提取“踟 2 8 1 1 溶液的配置 溶液+ 1 ：5 0 m m o l l 葡萄糖，2 5 m m o l lt r i s c 1 ( p h 8 0 ) ， l o m m o l le d t a ( p h 8 0 ) ，6 8 9 5 1 0 4 p a 高压灭菌1 5 m i n ，4 保 存。 溶液2 ：0 2 m o i l n a o h ( 临用前用l o m o l l n a o h 溶液稀释) ， 1 s d s 。 溶液3 ：5 m o l l 乙酸钾6 0 m l ，冰乙酸1 1 5 m l ，水2 8 5 m l 。 四川大学颈士学位论文 2 8 1 2l l - 1 1 - 3 3 7 茵株质粒的提取 质粒的提取采用碱裂解法： 1 ) 将菌株的l ? h 培养物加入e p 管中，用微量离心机于4 c 下以 1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 s ，去掉上清液，使细菌沉淀尽可能干燥。 2 ) 将细菌沉淀重悬浮于l o o u l 用冰预冷的溶液1 中，剧烈振荡混 匀。 3 ) 加2 0 0 u l 新配制的溶液2 ，盖紧管口，颠倒e p 管混匀内容物， 动作宜轻宜慢。确保e p 管整个内表面于溶液2 接触，4 处理 1 0 m i n 。 4 ) 加1 5 0 u l 用冰预冷的溶液3 ，盖紧管口，颠倒e p 管混匀内容物， 4 处理5 m i n 。 5 ) 用微量离心机于4 下以1 2 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，取上清液转移 到另一e p 管中，丢弃沉淀物。 6 ) 在上清液中加入等量的酚：氯仿( 2 5 ：2 4 ) ，振荡混匀，用微 量离心机于4 下以1 2 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，取上清液转移到另一 e p 管中，丢弃沉淀物。 7 ) 在上清液中加2 倍体积1 0 0 l 醇，混匀，室温放置2 m i n 。 8 ) 用微量离心机于4 c 下1 2 0 0 0 r p m 离心5 m i n 。 9 ) 小心吸去上清液，将e p 管倒置于一张纸巾上，使所有液体流 出，再将附于管壁的液滴除尽，在空气中使沉淀干燥l o m i n 。 1 0 ) 用s o u l 的t e ( p h 8 0 ) 重新溶解沉淀。贮存于一2 0 c 备用。 2 。8 2l l i i 一3 3 7 质粒的凝胶电泳“” 2 8 2 1 配制试剂 1 0 电泳缓冲贮存液：1 0 8 9 t r i s 碱，5 5 9 硼酸，4 0 m 10 5 m o l l e d t a ( p h8 0 ) ，加水定容至1 l 。 l 电泳缓冲工作液：8 9 m m 0 1 lt r i s 碱，8 9 m m o l 硼酸， 2 m m o l le d t a 。 1 0 加样缓冲液：2 0 ( w v ) f i c o l l4 0 0 ，0 ，l m o l le d t a 四川大学硕士学位论文 钠，p h 8 0lo ( w v ) s d s ，0 2 5 ( w v ) 溴酚蓝，o 2 5 ( w v ) 二 甲苯青。 溴化乙锭溶液：1 0 0 0 贮存液0 5 9 l ，5 0 m g 溴化乙锭，1 0 0 m l 水。 工作液：0 5 u g m l ，按1 ：1 0 0 0 稀释配制凝胶和染色液 2 8 2 2 试验条件 电泳电压为5 v c m ，m a r k e r 为 d n ae c o r i h i n d i i i 双酶切。 2 8 2 3 试验步骤 1 ) 制备凝胶，将电泳缓冲液和融化了的电泳级琼脂糖( 1 0 ) 混 匀，冷却至5 5 ，倒入已封好的凝胶灌制平台上，插入样品梳。 2 ) 待胶凝固后，从制胶平台上除去封带，拔出梳子，放入装有电 泳缓冲液的电泳槽中，缓冲液高出凝胶表面l m m 。 3 ) 用适量的1 0 加样缓冲液制备d n a 样品，然后用移液枪将样品 加入样品孔中。 4 ) 接通电级，使d n a 向阳级移动，在5 v c m 的电压压迫下进行电 泳。当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离d n a 片断的距离 时，关闭电源。 5 ) 将凝胶在e b 染液中染色，并在紫外透射仪上观察并照相。 2 9 类细菌素产生菌的质粒消除 ”1 质粒消除采用变温s d s 法。 1 ) 菌株接种与种子培养基中3 0 c 摇瓶培养7 2 h 。 2 ) 接种o 5 m l 该菌液于2 5 m lo 0 1 5 s d s 种子培养基中，3 0 摇瓶培养4 8 h 。 3 ) 接种