（微生物学专业论文）昆虫病原线虫steinernema+akhursti所携带共生菌的鉴定与描述.pdf

周凯中山大学硕士学位论文 题目：昆虫病原线虫s t e i n e r n e m aa k h u r s t i 所携带共生菌的鉴定与描述 专业：微生物学 硕士生：周凯 指导老师：邱礼鸿副教授 摘要 致病杆菌属( x e n o r h a b d u s ) 和发光杆菌属( p h o t o r h a b d u s ) 细菌存在于昆 虫病原线虫肠道内并与之互惠共生。这类细菌能产生多种有生物活性的次级代谢 产物，包括杀虫毒素、抗生素、抗癌药物等，已成为一类新型的具有开发潜力和 应用前景的生物资源。为此，人们越来越重视对共生菌的采集、分离以及分类鉴 定工作。 本研究采用1 6 sr d n a 系统分析结合形态与生理生化鉴定的方法，对本室最 近定名的一个采自我国云南省的昆虫病原线虫新种s t e i n e r n e m aa k h u r s t i 所携带 的共生菌进行了分类鉴定与描述。通过反复分离纯化获得了三号& a k h u r s t i 线虫 所携带共生菌的初生型和次生型菌株；采用p c r 扩增得到这些菌株的1 6 sr d n a 部分序列并与g e n b a n k 中登录的已定名致病杆菌属细菌的同源序列进行比对， 构建系统发育树；同时以a p i 细菌鉴定试剂条为主对这些菌株的生理生化特性 进行了测试比较。1 6 sr d n a 序列分析与表型分析结果一致显示sa k h u r s t i 所携 带的共生菌很可能是致病杆菌属的一个新种，与丑j a p o n i c a 近缘。本研究为进 一步研究和开发利用昆虫病原线虫& a k h u r s t i 及其所携带的共生菌打下了坚实 的基础。 关键词：昆虫病原线虫共生细菌，1 6 sr d n a ，分类鉴定，生物资源 旦塑 主些查兰堡主兰垡堕塞垫竺一 t i t l e ：i d e n t i f i c a t i o na n dd e s c r i p t i o n o ft h es y m b i o t i cb a c t e r i a o f a n e n t o m o p a t h o g e n i cn e m a t o d es t e i n e r n e m aa k h u r s t i m a j o r ：m i c r o b i o l o g y n a m e ：z h o hk a i s u p e r v i s o r ：o i ul i n g h o n g a s s o c i a t ep r o f e s s o r a b s t r a c t x e n o ， 口b d u ja n d p h o t o r h a b d u s a l e s y m b i o t i cb a c t e r i a ( s b ) o f e n t o m o p a t h o g e n i cn e m a t o d e s ( e n ) t h e s e b a c t e r i ah a v eb e c o m ei m p o r t a n t b i o r e s o u r c e sa st h e yp r o d u c em a n yb i o a c t i v es u b s t a n c e s ，s u c ha si n s e c t i c i d a lt o x i n s ， a n t i b i o t i c sa n dp h a r m a c e u t i c s c o l l e c t i o na n dc o r r e c ti d e n t i f i c a t i o no ft h es y m b i o t i c b a c t e r i ai sc r i t i c a lf o ra l lr e l a t e ds t u d i e s i nt h ep r e s e n ts t u d y , t h es y m b i o t i cb a c t e r i ao fs t i e n e r n e m aa k h u r s t i ，a ne p n s p e c i e sr e c e n t l yd e s c r i b e db yt h i sl a b ，w a si d e n t i f i e da n dd e s c r i b e db yap o l y p h a s i c a p p r o a c h i n v o l v e d p h y l o g e n e t i ca n a l y s e s o f1 6 sr d n aa n dp h e n o t y p i c c h a r a c t e r i z a t i o n b o t ht h eg e n e t i ca n dp h e n o t y p i cd a t ao b t a i n e ds h o w e dc o n g l u d i e n t l y t h a tt h es y m b i o t i cb a c t e r i ao f & a k h u r s t ia r el i k e l y t ob ean e ws p e c i e so f x e n o r h a b d u sc l o s e dt ozj a p o n i c a t h ep r e s e n ts t u d yu n v e i l e dt h et a x o n o m i cs t a t u s o ft h es y m b i o t i cb a c t e r i ao fs a k h u r s t i ，w h i c hs e t sa s o l i df o u n d a t i o nf o rf u r t h e rs t u d y a n du t i l i z a t i o no ft h eb a c t e r i aa n di t sh o s tn e m a t o d e k e y w o r d s ：s y m b i o t i c b a c t e r i ao fe n t o m o p a t h o g e n i cn e m a t o d e s ，1 6 sr d n a ， i d e n t i f i c a t i o n ，b i o r e s o u r c e i i 周凯中山大学硕士学位论文 月u吾 昆虫病原线虫共生细菌是一类存在于昆虫病原线虫肠道并与之互惠共生的 革兰氏阴性细菌，属于肠杆菌科( t h o m a s p o i n a r ，1 9 7 9 ) ，兼性厌氧。目前， 该共生细菌总共包括两个属，分别为致病杆菌属( x e n o r h a b d u s ) 和发光杆菌属 ( p h o t o r h a b d u s ) 。其中致病杆菌属与斯氏属( s t e i n e r n e m a ) 线虫共生，而发光 杆菌属与异小杆属( h e t o r o r f l a b d i t i s ) 线虫共生( p o i n a r ， 1 9 9 0 ) 。近年来，随 着对昆虫病原线虫及其共生菌研究的不断深入，共生细菌的多种生物学功能不断 被发现。在自然界中，该类细菌随线虫侵入寄主昆虫血腔，最终导致昆虫患败血 症而亡。共生菌可分泌出如杀虫蛋白、抑菌物质、抗癌物质、胞外酶、胞内晶体 蛋白、色素及荧光素等多类有生物活性的次级代谢产物，一些活性成分已经显现 出良好的商业开发前景( 王立霞等，2 0 0 1 ) ；同时，在共生菌中已发现多个杀 虫毒素基因，并被克隆出来，这为生物农药的开发和抗虫基因工程提供了新的杀 虫基因资源( b o w e no ta 1 ，1 9 9 8 ) ，有望成为继b t 以后开发转基因抗虫作物 的毒素基因源。线虫一共生细菌复合体具有杀虫能力强、杀虫谱广、无抗药性等 特点，能有效的防治鳞翅目、鞘翅目等害虫( k a y ao ta 1 ，1 9 9 3 ) 。这些特异的 生物学功能使昆虫病原线虫共生菌已成为一类新型的具有开发潜力和应用前景 的生物资源，受到科学家们的广泛关注。 现己描述的昆虫病原线虫共生菌有两个属致病杆菌属( x e n o r h a b d u s ) 和光杆菌属( p h o t o r h a b d u s ) ，均属肠杆菌科( e n t e r o b a c t e r i a c e a e ) 。昆虫病原 线虫与细菌的共生关系有高度的专一性和稳定性。在自然状况下，一种线虫只与 一种细菌共生，其中，致病杆菌属细菌均与斯氏属线虫共生，光杆菌属细菌均与 周凯中山大学硕士学位论文 异小杆属线虫共生。现已定名的致病杆菌属细菌有9 种：上n e m a t o p h i a ，z p o i n a r i i ，x b o v i e n i i ，x b e d d i n g i i ，x j a p o n i c a x b u d a p e s t e n s i s ，x e h l e r s i i ，zi n n e x i 和上s z e n t i r m a i a 光杆菌属细菌有3 种：p u m i n e s c e n s ， pt e m p e r a t a 和pa s y m b i o t i c a ( a k h u r s t b o e m a r e ，2 0 0 2 ；b o e m a r e ，2 0 0 2 a k h u r s te ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 不同种或品系的共生菌所产生的代谢产物有明显的不同( w e b s t e re ta 1 ， 2 0 0 2 ) 。积累共生菌种质资源和准确的分类是进行其它有关研究的基础。昆虫病 原线虫共生菌是肠细菌科中建立比较晚的类群，其分类研究现在还处于比较初步 的阶段。共生菌的分类早期主要依靠传统的细菌分类方法，如菌体和菌落的表型， 生理生化特征等。近年来，随着分子生物学技术的迅猛发展，分子鉴定的方法在 共生菌的分类中发挥了很重要作用。 近几年来，本实验室在广东和云南等地进行了系统的昆虫病原线虫资源调 查，这些线虫均被储存在液氮中，它们所携带的共生菌也已从线虫中分离纯化， 并存储在液氮中。本研究通过1 6 sr d n a 序列分析结合传统的形态与生理生化鉴 定方法对本室最近描述的一个新种s t e i n e r n e m aa k h u r s t i 的共生菌进行鉴定和 描述，初步确定其为致病杆菌属的一个新种。本研究为开发和利用这种线虫及其 共生菌打下了基础。 2 周藏串出犬攀疆士学垃论支 笫一章昆虫病原线虫共生细菌的研究进展 1 1 引富 昆虫病原线虫( e n t o m o p a t h o g e n i cn e m a t o d e se p n s ) 是一类新型的生物杀 虫裁( 廖美德梁世中，2 0 0 1 ) 。这类线虫酶特点之一就楚体内带有鼷于 x e n o r h a b d u s 和p h o t o r h a b d u s 的共生菌。共生菌与线虫的共生关系可以概括为： 共生菌存在于线虫的肠道内，线虫携带共生菌进入寄主昆虫体内，并将共生翁释 放到琵虫豹血照中：线斑保护共生瞽不受寄主兔痰反应的影确；菸生菌在昆搬斑 腔内繁殖，产生毒素和抑菌物质，导致昆虫患败瓶症而在4 8 小时内死亡；欺生 藩藐分黧蘩莽兹嚣，鬟供线变繁藏发肖掰霆戆营养；霹薅共垒麓产生豹撬萤索， 能抑制其宦杂菌的侵染，为线虫的生长、发育和繁殖提供理想的环境( b o e m a r ep a j 。，1 9 9 6 ) 。图1 - 1 为瑟塞痰骧线虫生活变豹示意强( f f r e n c h c o n s t a n t8 嚣五， 2 0 0 3 ) 。 图卜1 酝廒病原线虫生活史 f i g 1 1l i f ec y c l e so fe n t o m o p a t h o g e n i cn e m a t o d e s 周凯中山大学硕士学位论文 斯氏线虫和异小杆线虫的生活史及携带共生菌的形式有明显不同：斯氏线虫 在寄主体内第代是雌雄异体，其共生菌x e n o r h a b d u s 存在于线虫肠道内的一个 特殊囊状结构内( v e s i c l e s ) ；而异小杆线虫在寄主体内第- 1 1 4 是雌雄同体，其 共生菌p h o t o r h a b d u s 则直接存在于线虫肠道内( b i r de ta 1 ，1 9 8 8 ：p o i n a r ， 1 9 9 0 ) 。 昆虫病原线虫对害虫有很强的致病力，起关键性作用的是共生菌( 蒲蛰龙， 1 9 9 4 ) 。近几年，共生菌外毒素蛋白的发现，为人类提供了新的杀虫蛋白和基因 同时，共生菌分泌产生的多种抗菌素，有很强的抑菌活性。这些特性使得共生菌 的研究越来越为人们所重视。人们对共生菌的认识也远远超出了原有水平 “细菌与线虫的共生关系”，现在许多学者已认识到，昆虫病原线虫共生菌是一 种亟待开发的、既能杀虫又能防病的生物资源。 1 2 昆虫病原线虫共生菌的生物特性 昆虫病原线虫共生菌属肠杆菌科( a k h u r s t ，1 9 8 3 a b ；a g u i l l e r ae ta 1 ， 1 9 9 3 ) ，但它们是一类特殊的肠杆菌科细菌，因为这些细菌呈硝酸还原酶阴性。 共生菌与肠杆菌科中亲缘关系最近的p r o t e u s 的区别如表卜1 。 x e n o r h a b d u s 为过氧化氢酶阴性，p h o t o r h a b d u s 为过氧化氢酶阳性，而且能 产生荧光物质。曾在人的伤口处分离到p h o t o r h a b d u s ，但是经权威医院的临床 研究发现，从伤口处分离到的p h o t o r h a b d u s 在正常条件下对人没有致病性 ( f a r m e re ta 1 ，1 9 8 9 ：c o l e p i c o l oe ta 1 ，1 9 8 9 ；g e r r a r d ，2 0 0 3 ) ，而且 d n a d n a 杂交实验表明，这些菌株明显不同于其它与昆虫病原线虫共生的 4 周凯 中山大学硕士学位论文 p h o t o r h a b d u s 属细菌( a k h u r s te ta 1 ，1 9 9 6 ) 。 表卜1 区别x e n o r h a b d u s 和p h o t o r h a b d u s 与肠杆菌科中亲缘关系最近的 p r o t e u s 属的特性 t a b l e1 1c h a r a c t e r i s t i c sd i f f e r i n gx e n o r h a b d u s a n dp h o t o r h a b d u sf r o mt h e n e a r e s tg e n u s ， d t e u s ,w i t h i nt h ee n t e r o b a c t e r i a c e a e + ：阳性；一：阴性；d ：部分阳性 1 2 1 共生菌的生理生化特性 x e n o r h a b d u s 的细胞是不产孢子的杆状型( 0 3 2 2 - 1 0um ) ，革兰氏染色 阴性，兼性厌氧，具有呼吸和发酵两种代谢类型。最适宜的生长温度通常是2 8 3 0 左右，有些菌株在4 0 c 也能生长。葡萄糖产酸，很少能对其他的碳水化合物 进行发酵。过氧化氢酶和硝酸盐还原反应均为阴性。许多区分肠杆菌科的试验对 x e n o r h a b d u s 这个属都是阴性的。在生长的稳定期，菌体会出现不同程度的型变 ( b o e m a r e a k h u r s t ，1 9 8 8 ) 。初生型细胞因具有周身的鞭毛而可以运动，同时 能在0 6 - 1 2 的琼脂上聚集( g i v a u d a ne t “，1 9 9 5 ) 。脂酶活性用吐温进行 周凯中山大学硕士学位论文 检测，大多数品系能水解吐温2 0 、4 0 、6 0 、8 0 和8 5 ；在卵黄培养基上卵磷脂酶 活性呈阳性；能在稳定期的培养液中产生原生质的晶体包涵体( b o e m a r ee ta j ， 1 9 8 3 ) 。次生型细胞一般没有鞭毛，是不可运动的，不过也有某些品系存在例外。 次生型细胞不能或少量吸收色素( a k h u r s t ，1 9 8 0 ) ，一般不产抗生素和蛋白包涵 体，但分解脂类的反应比初生型细胞强。大多数品系具有脱氧核糖核酸酶、蛋白 酶等活性。总之，次生型细胞缺乏初生型细胞的很多特征。 1 2 1 2p h o t o r h a b d u s 属的特征 p h o t o r h a b d u s 细胞是不产孢子的杆状型( 0 5 2 卜1 0 um ) ，革兰氏染色阴 性，周身具有鞭毛，能运动。兼性厌氧，有呼吸和发酵两种代谢类型。适宜生长 温度是2 8 3 0 ，有些品系在3 7 3 8 也能生长。所有的品系过氧化氢酶阳性， 硝酸盐还原反应呈阴性，缺乏许多肠杆菌科所具有的特征。p h o t o r h a b d u s 能水 解凝胶，大部分品系能对羊和马血清产生溶血作用，一些品系在2 5 。c 下还能使 羊血清产生不规则的环状溶血作用。p h o t o r h a b d u s 对吐温一2 0 都具有溶脂作用， 许多对吐温一4 0 ，6 0 ，8 0 和8 5 有溶脂作用。能利用葡萄糖产酸不产气，同时， 还能利用果糖，d 一甘露糖，麦芽糖，核糖和n 一乙酰基葡萄糖产酸。甘油发酵反 应微弱；能在以延胡索酸盐、葡萄糖胺、l 一谷氨酸盐、l 一苹果酸盐、l 一脯氨酸、 琥珀酸盐和l 酪氨酸作为主要的碳源中生长。亚培养时会出现自发的型变，产 生次生型细胞。自然环境中分离到的初生型细胞是野生型的，大部分细胞( 5 0 一8 0 ) 在生长稳定期能够合成原生质体包涵体和荧光素，黑暗中能看到多种波 长光线混和而成白光，然而不同品系的发光亮度是不同，一些菌落所发的荧光只 能在使用光度计或者闪烁计数计时才能被观察到。在1 5 0 种已报道的 6 周凯中山大学硕士学位论文 p h o t o r h a b d u s 各品系中仅有一种是不发荧光的( a k h u r s t b o e m a r e ，1 9 8 6 ) 。 初生型细胞发光强度是次生型细胞的1 0 0 倍以上。初生型细胞在营养培养基上产 粉红、红色、橙色、黄色或绿色色素，尤其是在胰蛋白酶大豆培养基和卵黄培养 基等富集培养基上。而次生型细胞产色素少，颜色不同，主要特征表现在不吸收 m a c c o n k e y 培养基上的中性红，并能产生抗生素。 1 2 2 共生菌的寄主专一性 共生菌与线虫问存在某种程度的专一性。在自然条件下，一种线虫只能与一 种共生菌共生，而某些种类的共生菌可与几种线虫共生( a k h u s t ，1 9 8 2 ，1 9 8 3 a a k h u r s t b o e m a r e ，1 9 9 0 ) ，例如共生菌上b o v y e n y i 可与曼r e l t i a e 、5 ： k r a u s s e l 、a f f i n i s 、丘i n t e r m e d i a 等几种线虫共生。所有斯氏线虫均与 x e n o r h a b d u s 共生；所有异小杆线虫均与p h o t o r h a b d u s 共生。表卜2 列出了部 分己知共生菌与其宿主线虫的对应关系。 表1 - 2 昆虫病原线虫共生细菌及其宿主线虫的对应表 t a b l e l 一2s y m b i o t i cr e l a t i o n s h i pb e t w e e nb a c t e r i as p e c i e sa n dh o s t s b a c t e r i as p e c i e sh o s t 丑n e m a t o p h i l a z j a p o n i c a 卫b o v i e n i i z p o i n a r i i 卫b e d d i n g i i s t e i n e r n e m ac a r p o c a p s a e 显k u s h i d a i s f e l t i a e ( = b i b i o n 如) k r a u s s e i ra f l f i n e si n t e r m e d i u m c u b a n u m sg l a s e r i s t e i n e r n e m as p n c 5 1 3 u n d e r d e s c f i b e ds t e i n e r n e m as d u n d e t d e s c f i b e ds t e i n e r n e m as p 7 周凯中山大学顶士学位论文 接表卜2 r 1 u m i n e s c e n ss u b s p 1 u m i n e s c e n s 只l u m i n e s c e n ss u b s p a k h u r s t i i 只l u m i n e s c e n ss u b s p 1 a u m o n d i i pt e m p e r a t a 且b a c t e r i o p h o r ag r o u pb r e c o n h n d i c a h b a c t e r i o p h o r ag r o u ph p 8 8 h m e g i d i s 线虫与共生菌的专一性表现在两个方面：共生菌对线虫基本营养的提供和感 染期线虫携带共生菌的能力。共生菌为线虫提供基本营养只体现出一定程度的专 一性。在斯氏线虫和异小杆线虫中，没有一种线虫可以与自身所携带共生菌以外 的其他共生菌一起进行单菌培养( a k h u r s t ，1 9 8 3 a ) 。虽然sf e l t i a e 可以同5 种其它斯氏线虫的共生菌成功地进行单体培养，但是该线虫不能在只有 p h o t o r h a b d u s 的培养基中生长；另外，对某些种类的线虫而言，其所需的最佳 营养并不是由它的天然共生菌所提供。例如在富脂的培养基上，sg l a s e r i i 与 上b o v i e n i i 培养时，比与zn e m a t o p h i l u s 及自身所携带共生菌培养时繁殖速 度更快( d u n p h y w e b s t e r ，1 9 8 8 ) 。目前，关于共生菌为其宿主线虫提供的基 本营养成分尚不清楚，但有一点可以肯定的是，在无菌环境下，线虫不能生长或 繁殖量很低。感染期线虫对其肠道内共生菌的携带和保持具有高度的专一性。尽 管某些斯氏线虫能与非昆虫病原线虫共生菌的细菌在体外繁殖，但线虫并不将这 些细菌留在肠道内，而且对其它斯氏线虫共生菌的保持力也是十分有限的 ( a k h u r s t ，1 9 8 3 a ) 。由此可见，线虫具有很强的选择其天然共生菌的能力，它 只将天然共生菌保留在肠道内。这种专一性在置c a 印d 船p 丑n e m a t o p h i l u s 之间体现得尤为明显，在sc a r p o c a p s a e 感染期线虫体内不存在其它任何线虫 的共生菌( d u n p h y w e b s t e r ，1 9 8 8 ) 。 8 刷凯 中山大学硕士学位论文 1 2 3 共生菌的型变 型变( p h a s ev a r i a t i o n ) 是共生菌的一个重要特性。a k h u r s t 最早于1 9 8 0 年报道了该现象，其后b o e m a r e 、b l e a k e y 和n e a l s o n 也发现了该现象，n t1 9 8 9 年，h u r l b e r t 报道了多型现象的发现。同种共生菌型变后的不同代谢途径及型变 对线虫产量和质量的影响，使得共生菌的型变成为近年来的研究热点。昆虫病原 线虫共生菌的型变根据其在琼脂培养基上产生两种形态的菌落，及它们吸收染料 能力的不同，被定义为两型现象，称为初生型和次生型( a k h u r s t ，1 9 8 0 ) ，或相 型1 ( p h a s ei ) 和相型2 ( p h a s ei i ) 。甚至有些菌还会出现一种特殊的中间形 态，同时具有初生型和次生型的一些特征，被认为可能是初生型向次生型转变过 程中部分改变后形成的过渡态，也可能是通过其它途径产生的具有中间类型性质 的变种。型变对于许多细菌而言，是一个常见的特征，如在沙门氏菌( s a l m o n e l l a s p p ) 、奈瑟氏菌( n e i s s e r i as p p ) 中发现的这种特征( s i l v e r m a n s i m o n ， 1 9 8 3 ) 。这几类细菌的型变是一个可逆的转变过程，通常发生在主要抗原如鞭毛 蛋白的变化上，此类抗原能使细菌免受寄主防御反应、避开噬菌体的侵染 ( r o b e r t s o ne ta 1 ，1 9 9 4 ) 。而昆虫病原线虫共生菌的型变不同于上述细菌 它们的型变与免受寄主防御反应及噬菌体的侵染无关( a k h u r s te ta ，1 9 9 2 a k h u r s t b o e m a r e ，1 9 9 4 ) 。 关于共生菌的型变，过去曾有人认为是污染的结果，但通过两型共生菌d n a 图谱分析证明，两型菌具有1 0 0 的同源性( a k h u r s t b o e m a r e ，1 9 9 4 ) ，因此 和生理生化特征而已。对于x e n o r h a b d u s 而言，这种型变是可逆的，即初生型菌 可以转变为次生型菌，次生型菌在一定条件下也可转变为初生型菌( a k h u r s to t a ，1 9 9 2 ) ；而对于p h o t o r h a b d u s 而言，目前还未发现次生型菌转变为初生型 9 周凯中山大学硕士学位论文 菌的现象( h u r l b e r te ta ，1 9 8 9 ) 。 昆虫病原线虫共生菌的两型菌除了在菌落形态上有很大差异之外，它们之间 的生理生化( b o e m a r e a k h u r s t ，1 9 8 8 ；g e r r i t s e n ，1 9 9 2 ) 、细胞表面的超级结 构( b r e h e l i no ta ，1 9 9 3 ) 特征也反应出很明显的区别。初生型菌具备的一 些生理生化特性，如：吸收染料、分泌蛋白酶和脂酶、产生胞内晶体蛋白、抑菌 物质、色素及荧光素( 荧光素只对p h o t o r h a b d u s 而言) 等，次生型菌皆不具备 或仅有少量的上述代谢物产生( b l e a k l e y n e a l s o n ，1 9 8 8 ) 。初、次生型菌的 主要区别特征为：( 1 ) 菌落形态：在营养琼脂( n a ) 培养基上，初生型菌落透明、 凸起，次生型菌落半透明、平坦；初生型菌落直径比次生型菌落大得多( a k h u r s t ， 1 9 8 0 ：a k h u r s t b o e m a r e ，1 9 9 0 ：b o e m a r eo t 甜，1 9 9 7 ) ；( 2 ) 运动性：初生 型菌在n b t a 培养基上培养时表现出群游习性；次生型菌在琼脂培养基上没有运 动能力( b o e m a r e a k h u r s t ，1 9 9 0 ) ，这是因为次生型菌细胞缺乏鞭毛蛋白的合 成系统，因而不能形成鞭毛( g i v a u d a ne ta ，1 9 9 5 ) 。两型菌间运动性的差异， 表明这些共生菌对宿主线虫的适应性方面存在着差异；也正是由于初生型菌能形 成鞭毛，次生型菌不能形成鞭毛，所以初生型菌能较次生型茵更好地占领线虫肠 道的特定部位，从而被线虫所携带；( 3 ) 吸收染料的能力：在n b t a 上，初生型 菌能吸收培养基中的溴百里酚蓝，而使菌落变成蓝色：次生型菌则不能吸收溴百 里酚蓝，故菌落为红色或栗色( a k h u r s t b o e m a r e ，1 9 9 0 ) ；( 4 ) 代谢产物：初 生型菌能产生蛋白酶、脂酶、磷酸脂酶、抗生素、胞内蛋白晶体等：次生型菌则 不能或少量产生( b o e m a r ee ta ，1 9 9 7 ) ；( 5 ) 粘着性：初生型菌对昆虫血细 胞的粘着力很强，次生型菌不能粘合血细胞( m o u r a u xe ta 1 ，1 9 9 5 ) ；( 6 ) 呼吸 强度：初生型菌的呼吸酶活性较弱，次生型菌的呼吸酶活性较强，所以初生型菌 周凯中山大学硕士学位论文 的呼吸强度比次生型菌的呼吸强度弱( s m i g i e s k io t 丑，1 9 9 4 ) ；( 7 ) 对营养 物质的需求：初生型菌和次生型菌的生长发育需要不同的营养因子，对维生素及 氨基酸种类有不同的需求( b o e m a r e a k h u r s t ，1 9 9 0 ) 。从上述比较可以看出， 共生菌的初生型和次生型菌在菌落型态及生理生化特征等方面都有很大的差异， 二者存在着不同类型的代谢途径。 感染期线虫只携带初生型菌，次生型菌则出现在初生型菌的体外培养物中。 二者在生理生化方面有明显的区别，初生型菌能为线虫提供更好的生长、发育和 繁殖条件。线虫和初生型菌一起培养时，其产量明显高于与次生型菌一起培养时 的产量( a k h u r s t b o e m a r e ，1 9 9 0 ) 。而且，当初生型菌和次生型菌共同和线虫 培养时，只有初生型菌能被线虫携带。造成这些明显差异的可能原因是：( 1 ) 次 生型菌不能象初生型菌那样产生多种酶类，如蛋白酶、脂酶、磷酸酶等，因而不 能很好地分解培养基，为线虫提供充分的营养；( 2 ) 许多次生型菌产生的抗生素 量很少，从而在线虫生长发育过程中，不能象初生型菌那样抑制其它微生物的生 长；( 3 ) 次生型菌细胞缺乏鞭毛蛋白的合成系统，不能形成鞭毛，而初生型菌能 形成鞭毛，这样初生型菌能更好地占据线虫肠道的特定空间，从而能被线虫携带。 由此可见，在生长过程中，尽量防止共生菌的型态变异，将有助于提高昆虫病原 线虫的产量和质量。( 4 ) s m i g i e l s k i ( 1 9 9 4 ) 研究发现：经过一段时间的饥饿， 次生型菌在补充营养后2 4 h 内开始恢复生长，而初生型菌在1 4 h 以后才开始生 长，由此表明，次生型菌比初生型菌能更为有效地吸收利用营养物质，这也就使 得次生型菌在昆虫体外环境中，能更好地同其它微生物进行竞争。实验表明：初 生型菌能更好地适应昆虫体内环境，也许这样能更好地分解昆虫体内的营养物 质，从而为线虫所利用；次生型菌则更适应于体外的环境。 周凯中山大学硕士学位论文 还有研究表明，环境压力的胁迫作用能诱导细菌的型变。在培养基中没有 n a c l 的情况下，发光杆菌能产生型变( k r a s o m i l o s t e r f e l d e h l e r ，1 9 9 4 ) 将两个属的共生菌在厌氧微生物的发酵罐中培养也能产生型变。这些实验虽不能 阐明型变的机制，但由此可以推断：共生菌的型变是对环境压力的一种适应性反 应。 共生菌型变的产生及其产生的机制一直是科学家的兴趣所在。在研究型变的 初期，p o i n a r ( 1 9 9 0 ) 提出型变是对噬菌体裂解作用的规避反应，因为他发现只 l u m i n e s c e n s 的一种噬菌体仅对初生型而不对次生型产生裂解作用。但是b o e m a r e 等人( 1 9 9 3 ) 的研究成果推翻了这种假说，他们从丑n e m a t o p h i l a 中仅分离到一 种噬菌体，而该噬菌体对两型细菌均能裂解，这至少能说明昆虫病原线虫的型变 并非是对噬菌体的规避反应；有些学者认为型变产生的原因可能是丢失了一种噬 菌体或质粒，但是实验研究证明，这种假设不成立：x e n o r h a b d u s 的次生型菌能 转变为初生型菌，而且两种变型之间质粒没有差异( l e c l e r c b o e m a r e ，1 9 9 1 ) 只 u m i n e s c e n s 的两种型态均有发光基因时基因( w a n g d o w d s ，1 9 9 1 ) ， 而且脂酶的合成调控是在翻译后水平上进行的( w a n g d o w d s ，1 9 9 3 ) ，这些均 表明两型菌在转化中并未丢失遗传物质。有些学者认为，型变的产生可能是由于 一些主要d n a 重组造成的。但是，a k h u r s t ( 1 9 9 2 ) 等通过对x e n o r h a b d u s 的两 种型态的r f l p ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，限制性片段长 度多态性) 分析，发现次生型菌中并没有d n a 重组现象的发生；k r a s o m i l o s t e r r f e l d ( 1 9 9 4 ) 提到型变可能是共生细菌为了适应侵染期( 即线虫静止期也叫休眠期) 线虫体内生存及体外培养条件的反应。其证据是侵染期线虫体内的克分子渗透压 浓度低至接近于可诱导次生型产生的培养基的克分子渗透压，此外，侵染期线虫 周凯中山大学硕士学位论文 可以停止取食而存活较长时间，在这种缺乏营养的休眠情况下，共生细菌为了最 大程度的减少能量消耗，在保留一些代谢产物基因如：抗生素、脂酶，蛋白酶、 荧光素等基因的前提下，暂时停止它们的产生是很合理的，因此这应该是共生细 菌对环境胁迫压力的一种适应。但是这与从线虫中分离的均为初生型细菌的结果 不相一致，除非共生细菌在离开线虫体内的很短一段时间内就接受到环境变化的 信息而由次生型转变为初生型。j o y c e c l a r k e ( 2 0 0 3 ) 最新的研究发现，尸 t e m p e r a t ak 1 2 2 中的h e x a 基因对维持该菌株的次生型状态发挥重要作用。对尸 t e m p e r a t ak 1 2 2 次生型h e ；c a 基因插入突变后，许多初生型菌的生理特征如产生 抗生素、胞外酶、荧光素又重新恢复，说明该基因在共生菌型变中发挥着重要作 用。 型变一直是共生菌研究的一个热点，但型变产生的机制仍不明了。揭示其中 的奥秘，能进一步阐明线虫和共生菌的互惠共生关系，对线虫的商品化生产具有 重要的指导意义。 1 2 4 致病性 侵染期线虫携带共生菌进入寄主体腔，一般在侵入后5 小时就可在寄主昆虫 的血腔内测到释放出共生菌，而这些共生菌通常会使昆虫在4 8h 内死亡( a k h u r s t d u n p h y ，1 9 9 3 ) 。 多数昆虫病原线虫共生菌被引入寄主血腔后都有很强的致病力。但由于不同 昆虫对线虫的抵御反应和能力不同，共生菌对不同昆虫的致病力也存在差异 ( a k h u r s t b o e m a r e ，1 9 8 6 ) 。但可以认为，昆虫病原线虫共生菌对昆虫有极强 周凯中山大学硕士学位论文 的致病力，因为将共生菌注射到大蜡螟体内，一般l d 。为l 5 个细胞( a k h u r s t ， 1 9 8 0 ) 。昆虫病原线虫共生细菌的致病性主要集中在以下几个方面：( 1 ) 共生菌 对昆虫的防御机制所做出的免疫反应；( 2 ) 共生菌产生的对昆虫有杀伤作用的内 毒素，外毒素及一些次级代射产物等。 除了突破寄主的结构障碍，有效的昆虫病原物必须能抵制寄主的防御反应。 对于一般昆虫病原物而言，主要有以下几种对策：( 1 ) 忍受寄主的防御反应；( 2 ) 避免寄主免疫系统的识别和反应；( 3 ) 破坏或抑制寄主免疫系统对异物的识别和 防御。昆虫被线虫侵染后，能进行细胞抵御，其血细胞产生吞噬及包被作用；另 外昆虫还可以进行体液防御，即产生一些杀菌蛋白、杀菌肽及各种酶( g i l l e s p i e p ta 1 ，1 9 9 7 ) 来抵御线虫一共生菌的侵染( t r e n e z e c ，1 9 9 8 ) 。针对寄主昆虫这 些不同的防御机制，共生菌会产生不同的免疫反应，归纳起来有以下几类：( 1 ) 共生菌能忍受和破坏寄主的体液包被。虽然最初共生菌被昆虫的血细胞包被，但 随后共生菌使血细胞丧失活性，从而能继续在昆虫的血腔中迅速繁殖( d u n p h y w e b s t e r ，1 9 8 5 ；b r e h e l i n ，e ta 1 9 9 3 ) , ( 2 ) 共生菌能避开寄主免疫系统的 识别和防御。有些共生菌侵入寄主昆虫体内，既没有被血细胞包被和溶解，也没 有凝集块的形成( b r e h e l i ne ta 1 ，1 9 9 3 ) ；( 3 ) 共生菌能抑制寄主酚氧化酶的 活性，从而阻止了寄主血细胞的黑化过程，细菌细胞壁的组分一脂多糖( l p s ) 能起到这一作用( d u n p h y w e b s t e r ，1 9 8 8 ) , ( 4 ) 阻止或抑制寄主昆虫抗菌肽 的产生。昆虫被线虫一共生菌复合体侵染后，能产生抗菌肽，以抵御这一复合体 的侵入。线虫能产生一种诱导酶抑制因子，这种抑制因子有保护共生菌的作用 ( g o t ze t 丑，1 9 8 1 ) 。ec a r p o c a p s a ed d 一1 3 6 品系能产生一种丝氨酸蛋白酶， 该酶能破坏昆虫分泌的杀菌肽( a k h u r s t d u p h y ，1 9 9 3 ) ：( 5 ) 共生菌能抵御寄 1 4 周凯 中山大学硕士学位论文 主昆虫分泌的溶菌酶、蛋白酶、脂酶等酶类，这些酶促使昆虫血细胞粘附在共生 菌的周围，起到溶解和破坏细菌的作用，然而共生菌能破坏这一作用而迅速繁殖 ( d u n p h y w e b s e r ，1 9 9 1 ) 。 此外，有研究发现共生菌的外膜特性和其免疫反应有关。o u n p h y ( 1 9 9 4 ) 通 过化学诱变的方法得到j i n e m a t o p h i l u s 菌株，研究发现，突变株的细胞外膜特 性发生了很大的变化，如疏水性增强，l p s 含量增多，表面阳离子电荷减少及外 膜蛋白( o m p ) 含量降低等，从而导致对大蜡螟的致病性降低。另外还发现，改 变野生型的细胞外膜特性，也能降低其对寄主昆虫的致病性。不过对于 p h o t o r h a b d u s 而言，通过化学诱变产生的突变株，其细胞的外膜特性也发生了 很大的变化，它的疏水性增强，血细胞的粘着力增强，外膜蛋白含量减少，l p s 含量增加，却使突变株同野生型相比杀虫活力增强( d u n p h y ，1 9 9 5 ) 。由此可见， p h o t o r h a b d u s 细胞外膜在共生菌免疫机制中的作用可能不同于x e n o r h a b d u s 。对 以上两个属共生菌的研究结果表明，共生菌的细胞外膜与抵御昆虫免疫反应有 关，二者间的关系有待于进一步研究确定，外膜蛋白的研究将有助于揭示其中的 奥秘。 1 2 5 代谢产物 昆虫病原线虫可以产生多种有生物活性的代谢产物，包括：杀虫物质、抑菌 物质、抗癌物质、胞外酶、以及其他代谢产物等五大类。 杀虫物质主要是杀虫毒素蛋白，另外一些二硫吡咯类的抑菌物质也具有一定 的杀虫作用。其中两个属的共生细菌均能产生对昆虫血腔具有较强的注射毒性的 周凯中山大学硕士学位论文 外毒素蛋白。此外，尸 u m j n e s c e n s 共生菌株w 1 4 还能产生多种具有口服及注 射毒性的高分子蛋白复合体( b o w e n ，1 9 9 8 ；g u o ，1 9 9 9 ) 。 不同种或同种不同品系的共生菌所产生的抑菌物质具有一定的差异。主要包 括七种类型：二硫吡咯类( m c i n e r n e y ，1 9 9 1 ) 、水溶性苯并芘类( m c i n e r n e y 1 9 9 1 ) 、羟化二苯乙烯类( r i c h a r d s o n ，1 9 8 8 ) 、吲哚类( s u n d a r c h a n g ，1 9 9 3 ) 、 蒽醌类( s z t a r i c s k a ip fa 1 ，1 9 9 2 ) 、细菌素( b o e m a r ee ta ，1 9 9 2 ) 和几丁质 酶( w e b s t e r ，1 9 9 8 ) 。 抗癌物质主要是由zb o v i e n i i 产生的一类二硫吡咯类物质，该类物质除了 具有抑菌作用外，还对结肠癌、乳腺癌、子宫颈癌等的癌细胞有不同程度的抑制 作用( w e b s t e ro ta 1 ，1 9 9 6 ) 。 共生细菌产生的胞外酶包括：蛋白酶、脂酶、磷酸脂酶和d n a 酶，而且不同 菌株可以产生不同的酶类，这些酶主要用于共生细菌分解昆虫血腔中的各种营养 物质，从而为线虫提供小分子的营养物，由于次生型共生细菌不能或很少分泌这 些酶，这可能是线虫不能在仅有次生型共生细菌的条件下正常繁殖发育的原因。 除上述代谢产物外，共生细菌还能产生胞内晶体蛋白、色素、荧光素等物质。 其中某些产物具有很大的应用潜力，引起学者们的广泛关注。 l _ 2 6 线虫及其共生菌应用的安全性 利用线虫防治害虫，一般采用的方法是在害虫的生境中释放大量的感染期线 虫，因而必须考虑线虫及其共生菌对高等动物及人的安全性问题。 p o i n