（发育生物学专业论文）盐芥氧化还原相关基因dhar和fesod的功能研究.pdf

山东师范大学硕士学位论文 盐芥氧化还原相关基因o h a r 禾n 角瑚汐的功能研究 摘要 盐芥拟南芥的近亲，具有非常强的耐盐能力，能够耐受5 0 0 m m 氯化钠的冲击。 分析植物的耐盐机理大致可以分为一下四类：一是泌盐，如中华补血草，其通过特殊的 生理结构一盐腺，将体内多余的盐分分泌排出体外，以维持体内低盐环境；二是离子区 域化，如盐地碱蓬，其肉质化的叶和茎意味着细胞中液泡将细胞质中的盐离子大量泵入 液泡内以维持细胞质的离子稳态：三是超强的抗氧化能力，细胞内离子浓度的异常增高 通常会引起活性氧的增加，活性氧的活跃会危害生物大分子如蛋白质，核酸的功能，植 物细胞通过积累大量的还原性物质如抗坏血酸，以中和活性氧，或者通过酶促反应清除 活性氧，减少活性氧对细胞的危害，主要的酶包括各类c a t ，p o d ，s o d ，m d a r 等； 四是渗透保护物质，如脯氨酸，甜菜碱等小分子有机物质，它们可减少细胞因胞内高离 子浓度引起的细胞失水而保护细胞。 盐芥由于不具备形态学上的特殊结构盐腺和肉质化的茎叶，而不能通过泌盐和 离子区域化抗盐。所以我们推测其较强的抗盐能力是源于其超强的抗氧化能力和迅速积 累渗透保护物质的能力。在此，我们主要从抗氧化能力的角度去研究探讨盐芥的耐盐机 理。 本论文的思路如下：找出最为活跃的活性氧清除酶类，用r n a i 的方法将其 k n o c k d o w n ，以观察植物耐盐能力的变化。所以我们实验的第一步是找到我们研究的靶 基因，我们从g e n b a n k 中找到盐芥基因的e s t ，从中筛选出活性氧清除酶类，设计引 物，分别以正常生长条件下的盐芥和盐处理的盐芥的r n a 为模板进行r e a l t i m ep c r ， 以期找到盐处理前后转录变化最大的基因。令我们失望的是我们选取的各基因对盐处理 的反应方向和变化幅度都非常接近。所以，我们挑选了变化幅度最大的d h a r 和f e s o d 作为我们接下来的研究对象。我们从这两个基因的e s t 序列中选取大约3 0 0 b p 作为沉 默的靶向序列。将沉默表达载体导入农杆菌后通过点花浸染盐芥。经除草剂筛选后先用 p c r 的方法进行分子鉴定，以确认转基因成功。再用n o r t h e r nb o l t i n g 的方法检测沉默 的效果，待确认靶向基因被沉默以后检测植株的耐盐能力与野生型相比有无变化，有多 大程度的变化，从而得出盐芥活性氧清除系统对其抗盐能力贡献大小的初步结论。由于 植物的抗氧化系统比较复杂：机理分酶促和非酶促两种，酶促机制中的功能分子多种多 样：有c a t 、p o d 、s o d 、d h a r 、m d a r 五大类，而s o d 又可以根据其金属辅基 山东师范大学硕士学位论文 的不同分为c u z n s o d 、f e s o d 、m n s o d 。所以单个基因的沉默并不能引起植物抗氧 化能力在很大程度上的改变，这从我们的实验中可以看出：d h a r 和f e s o d 的沉默没 有引起盐芥耐盐能力的明显改变，这反映了植物在抗氧化方面存在冗余机制以补偿失去 的部分。 关键词：盐芥活性氧基因沉默 分类号：q 7 8 2 山东师范大学硕士学位论文 f u n c t i o na n a l y s i so ft h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l ao x i d o r e d u c t i o nr e l a t i v e g e n e sd h a ra n df e - s o d a b s t r a c t a st h ec o l s er e l a t i v eo f a r a b i d o p s i st h a l i a n a ，t h e l l u n g i e l l as a l s u g i n e ai sw e l la d a p t e d t os a l t ye n v i r o n m e n t ，w h oc a nr e s i s tt h ea s s a u l to f5 0 0 m mn a c i t h em e c h a n i s mo fp l a n t s s a l tt o l e r a n c ec a nb ed i v i d e di n t of o u rc a t e r g o r i e s ：t h ef i r s tk i n dr e f e r st ot h o s ee q u i p p e dw i t h s a l tg l a n d sl i k el i m o n i u ms i n e n s e ，w h os e c r e t e st h ee x c e s s i v es a l ti o n so u to fc e l l st o m a i n t a i nt h eh o m e o s t a s i so fc e l l s t h es e c o n da r et h o s ew h oc a l lr e g i o n a l i z es a l ti o n si n t o v a c u o l et oa v o i dh i g hc o n c e n t r a t i o ni o n si nc e l lp l a s m a , f o re x a m p l e s u a e d as a l s a ( l ) p a l l c a nd ot h i sb yp u m p i n gl a r g ea m o u n to fs a l ti o n si n t ot h ev a c u o l ea n dc a u s el e a fc a r n i f i c a t i o n t h et h i r da r et h o s ew h oe q u i p p e dw i t hs t r o n ga b i l i t yt or e s i s tt h ea s s a u l to fr o s ，t h el e v e lo f r o s m a yr i s et oah i g hl e v e lw h e np l a n t sa r et r e a t e dw i t hs a l t ，a n dt h ea c t i v i t yo fs a l tm a y c a u s ed a m a g et ot h em a c r o m o l e c u l a r , l i k ep r o t e i n s ，n u c l e i ca c i d s p l a n tc a nr e l i e v et h e d a m a g eb ya c c u m u l a t i n gh i g hc o n c e n t r a t i o no fr e d u n d a n c ym a t e r i a l sl i k ea p xe t ct o n e u t r a l i z et h er o s ，o rp l a n tc a nd i m i n i s ht h ed a m a g et h r o u g he n z y m ea c t i v i t y , t h u sr e l e a s e t h ed a m a g et oc e l l sc a u s e db yr o s t h em a i n s t r e a me n z y m e sa r et h o s el i k ec a t , p o d ，s o d ， m d a r ，e t c t h ef o u r t ha r et h o s ep o s s e s ss t r o n ga b i l i t yo fo s m o t i ca d j u s t m e n t ，p l a n t sd ot h i s b yi n c r e a s i n g t h en u m b e ro fs o l u t ep a r t i c l e sp r e s e n ti np l a n tc e l l s c o m p a t i b l es o l u t e sa r ea s m a l lg r o u po fc h e m i c a l l yd i v e r s eo r g a n i cc o m p o u n d st h a ta r eh i g h l ys o l u b l ea n dd on o t i n t e r f e r ew i t hc e l l u l a rm e t a b o l i s m ，e v e na th i 曲c o n c e n t r a t i o n ，m a t e r i a l sl i k et h i sa r et h e a m i n oa c i dp r o l i n e ，t h eq u a t e r n a r ya m m o n i u mc o m p o u n d 1 3 - a l a n i n eb e t a i n e ，e t c w h i l et h e l l u n g i e l l as a l s u g i n e a ，w h i c hl a c k st h es a l t yg l a n d s a n dp u m p st or e s t r i c ti o n s ， c a nr e s i s tt h es h o c ko f 。s a l tb yn ow a yb u td i m i n i s h i n gt h e d a m a g ec a u s e db yr o sa n d m a i n t a i n i n gw a t e rb ya c c u m u l a t eo s m o t i cp r o t e c t i v em a t e r i a l h e r ew ew o u l dl i k et od o r e s e a r c ho nt h ea b i l i t yo ft h e l l u n g i e l l as a l s u g i n e at or e s i s tr o st oc o r r e l a t et h er e l a t i o n s h i p w i t hi t sa b i l i t yt ot o l e r a t es a l te n v i r o n m e n t t h eg u i d e l i n eo ft h i sr e s e a r c hi sa sf o l l o w i n g ：f i r s t l y , w et r yt of i n do u tt h em o s ta c t i v e r o se l i m i n a t ee n z y m e sa n dc l o n et h e i rc o d i n gg e n e s ，t h e nw ek n o c kd o w nt h i sg e n eb yr n a i n t e r f e r e ，a n dm e a s u r eh o wt h ea b i l i t yo fp l a n tt or e s i s ts t r e s sc h a n g e s ot h ef i r s ts t e po fo u r 3 山东师范大学硕士学位论文 r e s e a r c hi st of i n do u tt h et a r g e tg e n e ，w ed ot h i sb yf i r s t l yt os e a r c ht h eg e n eb a n kt of i n do u t t h ee s to ft h e l l u n g i e l l as a & u g i n e aa n dd ob l a s to nn c b it os c r e e nt h o s ea r el i k e l yt ob e r o se l i m i n a t ee n z y m e s t h e nw ed e s i g np r i m e r s ，u s i n gr n a p u r i f i e df i o mw i l dt y p ep l a n t s g r o w ni nn o r m a lc o n d i t i o n sa n ds a l t yc o n d i t i o n sa st e m p l e st oa m p l i f yt a r g e t e dg e n e sa n d q u a l i f yt h ec o p i e so ft h eg e n e sw i t ht h eh o p eo ff i n d i n go u tt h eo n ew h o s et r a n s c r i p t i o n c h a n g e dt h em o s ta f t e rt r e a t e dw i t hs a l t h o w e v e rt oo u rd i s a p p o i n t m e n tt h eg e n e sw ec h o o s e a sp o o l sd ot h es a m ec h a n g ea f t e rt r e a t e dw i t hs a l t s ow ec h o o s et h em o s to ft h e ma st h e f o l l o w i n gt a r g e t s ，t h e ya r ed h a ra n df e s o d w ec h o o s e3 0 0b a s ep a i ra st h et a r g e t e d s e q u e n c et oc l o n ea n dd e s i g ns i l e n c i n gv e c t o r a f t e rt r a n s f o r m e di n t ot h ea g r o b a c t e r i u m ，w e t r a n s f o r mt h et h e l l u n g i e l l as a l s u g i n e au s i n gt h ef l o w e rd i p p i n gm e t h o d a f t e rs c r e e n e dw i t h h e r b i c i d ea n dp c ri d e n t i f yt om a k es u r eg e n et r a n s d u c t i o ns u c c e s s f u l l y t h e nw et e s t i f yt h e s i l e n c i n gr a t eu s i n gn o r t h e r np r o t o c 0 1 t h e nw em e a s u r et h ea b i l i t yo fs a l tt o l e r a n c eo f p l a n tt oc o r r e l a t et h et w oa s p e c t s h o w e v e rb e c a u s eo f t h ec o m p l e x i t i e so f p l a n ts a l tt o l e r a n c e m e c h a n i s m ：t h r o u g he n z y m ew a yo rn o n e n z y m ew a y , d i f f e r e n tf u n c t i o n a lm o l e c u l a r , s ot h e l o s ef u n c t i o no fo n eg e n ec a n h a r d l yc a u s ea n yc h a n g ei nt h ea b i l i t yo f e l i m i n a t er o s ，w h i c h c a nb es e e nf r o mo u re x p e r i m e n t ，w h i c hr e f l e c t st h e r ea r er e d u n d a n c ym e c h a n i s mi nt h e p l a n t k e y w o r d s ：t h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l a ；r o s ；g e n es i l e n c i n g ； c a t e g o r y ：q 7 8 4 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如没有其他需要特别声 明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：易1 1 、兰钙 导师签字： l l 参珥乏 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权堂 拉可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：沥f 、兰芎 导师签字： 签字日期2 。 1 年铜o 日 。，镬 山东师范大学硕士学位论文 第一部分文献综述 1 盐芥( t h e l l u n g i e i l ah a i o p h i l a ) 一一种新型的耐盐模式植物 土壤高盐是限制植物的生长、发育和产量的最严重的胁迫因素之一。长期以来，提 高植物的耐盐性成为全世界人们的伟大目标，但是由于植物的耐盐性是一个极其复杂的 过程，以往通过传统的育种和遗传工程长期研究，进展缓慢，虽然取得一些成就，但距 离人们的要求还相距甚远。据联合国教科文组织不完全统计，目前全世界盐碱土地面积 大约有约9 5 亿b m 2 ，我国盐碱土地面积也不少，约为o 3 7 亿l 蚰2 ，占世界盐碱地的1 2 8 左右【1 1 。因此，分析植物对于盐胁迫的反应，研究其反应机制，提高作物的耐盐性，不 仅对于揭示植物耐逆的机理有重要的理论意义，而且对于耐盐作物的培育，具有重要的 实践意义。 对未来植物耐盐研究的看法：在将来的研究中应用比较生理学的方法，结合基因组 学，蛋白质组学，代谢组学的方法可能会给我们的研究带来新的思路。现在一种被广泛 认可的观点是：耐盐植物所拥有的耐盐基因在甜土植物的基因组中也存在，不仅如此， 二者对这类基因的调控机制也是相差无几，只是调控的门槛不同罢了。对盐芥和拟南芥 进行比较研究会为以上观点提供证据。在对耐盐植物和不耐盐植物进行比较研究时应该 认识到对于甜土植物来讲正常的低盐环境对于盐生植物来说并非正常：对于盐生植物来 说盐渍环境才是正常的，而不是所谓的胁迫，生长发生抑制的情况发生在低盐或者高盐 环境下。这就要求我们在理解盐生植物和甜土植物在盐渍环境中的基因表达变化的时候 要考虑这些因素：对于盐生植物来说对照组为零含量的氯化钠并不合适，并且剂量效应 实验应当覆盖一系列可能合适的外部氯化钠浓度【2 】。 盐生植物的研究，近几十年逐渐引起人们的重视，研究盐生植物的资源，必须从众 多的盐生植物类群中选择合适的研究材料进行基础生理和分子生物学的研究。近几十年 关于盐生植物的耐盐机理研究的报告很多。但至今仍有很多问题未能解决，十字花科 中盐芥( t h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l a ) 在我国分布广，主要在吉林、河北、内蒙古、山东、 江苏、河南等省盐碱地土壤上。它耐盐性强，与高等植物中的模式植物拟南芥的亲 缘关系非常近，数百个盐芥克隆的e s t 分析说明盐芥和拟南芥的c d n a 和氨基酸序列 平均有9 0 9 5 是相同的( z h u 未发表资料) ，所以有研究者提出：盐芥也可作为研究 耐盐性模式植物( b r e s s a n 等2 0 0 1 ；z h u2 0 0 0 ，2 0 0 1 ；v o l k o v2 0 0 3 ) p 】。 2 0 0 0 年，山东师范大学张慧教授首次提议将盐生植物盐芥( t h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l a ) 山东师范大学硕士学位论文 1 8 5 7 年o e s c h u l z 把盐芥( a r a b i d o p s i ss a l s u g i n e a ) 从拟南属a r a b i d o p s i s 中独立出来建 立了盐芥属t h e l l u n g i e l l a ，定名为t h e l l u n g i e l l as a b u g i n e a ，同属的植物还有小盐芥( z 物种，但在植物分子生物学领域，普遍把t h e l l u n g i e l l as a l s u g i n e a 与zh a l o p h i l a 视为同 属一个“生物学种”，而把两个学名视为同名( s ”锄e ) ，但更常用t h e l l u n g i e l l ah a l o p h i l a 。 2 植物中活性氧的种类、产生和消除 2 1 活性氧的种类和产生机制 多个基因，编码包括与r o s 产生及清除相关的酶【刀，并具高度的灵活性和互补性。所有 r i f ! ：一f 吩ff 卜p 6 山东师范大学硕士学位论文 2 2 r o s 网络中清除酶类的细胞学定位及协同作用 植物r o s 网络中的酶包括两大类，即r o s 产生酶【9 】和清除酶。植物中r o s 的产生 主要源于重要的需氧生化反应，如呼吸和光合电子传递链 1o 】以及乙醇酸盐、黄嘌呤【l l 】 和葡萄糖的氧化等。另外，质膜n a d p h 氧化酶n 2 1 、细胞壁过氧化物酶【1 3 】、质外体草 斟1 钾氧物酶和单胺氧化酶等多种酶系统也可产生大量r o s ，从而在r o s 信号转导中 发挥作用。有关r o s 产生的生化反应及酶系统，本实验室文章植物中活性氧的产生 及清除机制有过较详细的综述【1 8 】。 图1 - 2 植物细胞d p r o s 清除通路的细胞学定位【1 9 1 。 f i g1 - 2 l o c a l i z a t i o no fr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) s c a v e n g i n gp a t h w a y si np l a n tc e l l s 虽然细胞不同区室中的r o s 清除路径相互分离【l6 1 ，但h 2 0 2 等r o s 极易跨膜扩散， 且抗坏血酸、谷胱甘肽【1 7 】等小分子抗氧化剂能在细胞不同区室间跨膜运转，因而细胞各 区室的清除酶必须协同作用。有关拟南芥的研究表明，r o s 清除网络 1 9 】在细胞不同区 室间的协同作用模式非常复杂，如一般认为光胁迫导致叶绿体或过氧化物酶体中r o s 的过量产生，但有实验却发现光胁迫诱导的是细胞质而非叶绿体中清除酶类的表达【2 0 1 。 另外，植物体中至少有三种r o s 清除酶可同时在叶绿体及线粒体中表达，说明这两个 7 山东师范大学硕士学位论文 细胞器间具高度协同的防御应答机制。 2 3 植物体内r o s 在信号转导中的作用 大多数的生物或者非生物胁迫都会诱导活性氧的产生，尤其是超氧化物阴离子( o 。 a n dh 。0 。) 和过氧化氢，可能是在细胞内也可能是在细胞外，产生的方式是扰乱叶绿体 和线粒体电子传递链的正常运转和活化质膜附着的n a d p h 氧化酶或者细胞壁附着的 n a d ( p ) h 氧化酶一过氧化酶，还有可能是胺类氧化酶。活性氧被看做是细胞代谢的有毒副 产物，但是越来越多的证据表明在真核细胞内它们作为信号分子也起到了信号转导的作 用而引起特殊的下游反应【2 1 1 。在拟南芥中激活两个有丝分裂元激活的蛋白激酶m p k 3 m p k 6 对于过氧化氢的胁迫反应是必须的。而o x l l 激酶在植物中起到活性氧感受者的作 用，能够激活上述两种酶类，o m t k l 起到了有丝分裂元激活蛋白激酶脚手架的作用，能 够激活由过氧化氢诱导的植物细胞死亡。直接产生的或者通过s o d 产生的过氧化氢能够 诱导抗氧化基因的表达，例如抗坏血酸过氧化物酶、过氧化氢酶，从而对活性氧起到脱 毒的作用【2 2 1 。在植物应对渗透胁迫时有效的活性氧清除体系起到了非常关键的作用，但 是该体系在植物应对非生物胁迫时起到了多大的作用并不清楚。另外，有充分的证据证 明许多蛋白的表达和功能的正常行使都取决于氧化还原的状态。 图1 - 3 细胞活性氧感受和活性氧信号转导机制示意图 f i g l 一3s c h e m a t i cd e p i c t i o no fc e l l u l a rr o ss e n s i n ga n d s i g n a l l i n gm e c h a n i s m s 山东师范大学硕士学位论文 植物可以通过至少三种机制检测到活性氧的存在：r o s 受体、氧化还原敏感的转 录因子以及磷酸酶类。r o s 存在会引起钙离子信号的产生和磷酸酯酶c d 的激活，产 生磷脂酰胆碱酸( p a ) 的。p a 以及钙离子激活蛋白酶o x l l 激活了蛋白酶m a p k ，诱导或 者激活不同转录因子以调节活性氧的清除和产生途径。氧化还原敏感的转录因子被活性 氧激活或者抑制可能会影响到o x l l 或者其它激酶的表达【2 3 1 。s a 以及n o 可能参与了信 号转导，起到了放大信号的作用。 在胁迫状态下，例如盐渍环境，细胞内增加的蛋白质降解活性如不及时清除，会引 起胺的增加并引起毒性【2 4 】。铵离子被谷氨酰胺合成酶与谷氨酸结合形成谷氨酰胺，在体 外实验中谷氨酰胺脱氢酶g d h 催化了2 酮戊二酸的还原性的氨基化以及谷氨酸的氧化 性脱氨基反应，该酶在植物组织中大量存在。g d h 全酶有一个六氨基结构，组成两个 亚肽链片段，两个片段在分子质量和带电性方面很少有不同。这两个肽链片段是由不同 基因编码的。在植物的碳代谢和氮代谢中该酶的具体生理功能仍不清楚。在植物发育的 早期，在跗基节部位的发育成熟的叶片和代谢活跃的幼叶具有高的g o g a t 表达、蛋白 积累和活性，但是g d h 浓度和活性却很低。在发育的稍晚时期g s 和g o g a t 在衰老 的叶片中减少，伴随着g d h - n a d 、a 1 、g d h 蛋白的积累，衰老叶片中细胞外氨基化的 活性的增加【2 5 1 。在耐盐的水稻栽培中，g d h 的氨基化活性在盐胁迫增加时也相应增加， 而在盐敏感植株体内则减少，在大豆这种耐铵植物的根部，氨基化的g d h 活性还是很 高。我们的实验中一种可能的假设是g d h 是一个胁迫响应蛋白，揭示了一种g s g o g a t 途径之外的对铵同化的方法。我们的假设得到了大量实验的验证。由盐和甲萘醌( 维生 素k ) 以及铵离子诱导产生的r o s 诱导了一类基因的表达，产生g d h 的一个0 【亚基， 引起该亚基以及阴离子谷胱甘肽脱氢酶同工酶的积累，以及体外阴离子g d h 活性的增 加。在抗坏血酸存在的情况下上述情况会逆转，这表明r o s 作为初始信号促进g d h n a d 表达。气相色谱质谱研究结果支持了阴离子谷胱甘肽脱氢酶中阴离子的作用以及谷氨 酸向脯氨酸合成中的作用，在盐渍环境中g d h 活性的增加伴随着编码该酶同工酶的基 因的表达上调。所有这些结果支持了g d h 的阴离子同工酶在抗击胁迫中的作用，因为 基因表达、蛋白的积累以及体外的阴离子活性都是受到盐的剂量和时间效应的调控【2 6 】。 9 山东师范大学硕士学位论文 a b i o t i c s t r e s s 图1 4 在胁迫条件下g d h 的作用和角色 f i 9 1 - 4 r o l eo f g d hu n d e rs l r e s sc o n d i t i o n s 活性氧能引起细胞损伤和细胞死亡，同时它们也在许多信号转导过程中起到了中心 作用，例如胁迫感应识别，光合反应的调节，虫害的响应，程序性细胞死亡，激素活动 以及植物的生长和发育【2 7 1 。在拟南芥中总共有1 5 2 个基因组成的网络控制了活性氧的代 谢，这个调控网络能够调节活性氧的生成速率以及在不同细胞组分中的活性氧清除，维 持活性氧水平的平衡，既能保证信号转导又不至于对细胞造成伤害。在叶细胞中，光合 反应进行时产生的过氧化氢和超氧化物阴离子有着精确的平衡机制，并且活性氧清除酶 类如s o d 、a p x 、c a t a l a s e 的活性也存在精确地平衡机制。在叶绿体中存在至少三种 a p x 的同工酶：一类类囊体结合的a p x ，一类基质a p x ，还有一类l u m e n a p x 。最近发 现基质a p x 在拟南芥的线粒体中也存在，同样，叶绿体也具有四种不同的s o d 同工酶： 一类铜锌s o d ，三类铁s o d ，并且抗坏血酸谷胱甘肽循环能够还原氧化抗坏血酸和谷胱 甘肽。相反，细胞质中仅含一类a p x 以及一类在极端的光和热胁迫条件下才会诱导表 达的a p x ，还有抗坏血酸谷胱甘肽循环中的各种酶类【2 8 】。 1 0 山东师范大学硕士学位论文 厂啦晚 。 图1 5 活性氧的清除机制。 f i g l - 5t h ee l i m i n a t i o nm e c h a n i s mo fr o s 脱落酸( a b a ) 的作用模式与植物细胞的氧化胁迫有关。现在已知的脱落酸的信号 转导涉及了r o s 生成的上游和下游件，因此我们详细地描述了r o s 在a b a 信号转导 中的角色【2 9 1 。r o s 可以诱导细胞质内的钙离子增加，可以诱使气孔关闭，用过氧化氢 处理保卫细胞，激活了钙离子通透性离子通道，同样引起了胞质钙离子增加。而这种过 氧化氢替代a b a 的处理方式，在a b a 不响应的g c 以突变体中无法奏效1 4 5 1 。在拟南芥 保卫细胞，a b a 对i c a 通道的调节需要利用胞质内的n a d h ，另外，a b a 可以在拟南 芥、鸭跖草保卫细胞和玉米胚中增加细胞中的r o s 水平【3 0 1 。 有报道认为，鸭跖草保卫细胞中过氧化氢可以诱导胞质的碱化，也有研究显示，在 拟南芥保卫细胞中施用a b a 后胞质的碱化发生在r o s 产生之前。在鸭跖草保卫细胞中， a b a 处理后3 0 s ，有r o s 生成m 。这两项研究表明，r o s 有时候处于胞质碱化的上游， 有时也出现在胞质碱化的下游，而这恰恰反映了a b a 信号转导的平行传导和分支传导 的特剧3 1 】，但进一步研究细胞内r o s 的稳态变化和r o s 产生仍是必要的，而这要求有 更灵敏高效的r o s 检测探针。 在根毛细胞、根表皮细胞以及叶肉细胞中发现保卫细胞可以激活钙离子通道，而且 r o s 对这些离子通道的调节作用也在几个系统中得到验证【3 2 】。体外生化研究表明，过 氧化氢可直接作用于a b i i 和a b l 2 类2 c 蛋白磷酸酶，使其失活。a b l l 和a b l 2 是a b a 信号转导的负调节因子。在2 种p p 2 c 的显性突变体中a b i l j 和a b i 2 一j 中，a b a 不再能 激活钙离子通道 3 3 】。在a b i h 突变体中，a b a 诱导的r o s 产生以及a b a 对i c a 通道的 激活均被阻断。在显性突变体a b i 2 j 中，过氧化氢对钙离子通透性离子通道的激活作用 以及诱导气孔关闭作用均被阻断。a b a 激活的p k o s t l 被鉴定为在r o s 产生的上游起 作用，因为o s t l 的突变阻断了保卫细胞中a b a 诱导的r o s 产生【4 7 1 。 帷。 一 一 山东师范大学硕士学位论文 图1 - 6 氧化胁迫发生时的信号转导 f i gl 6t h es i g n a lt r a n s d u c t i o nu n d e ro x i d a t i v ec o n d i t i o n s 最新的研究发现a b l l 蛋白能与o s t l 和a b i 卜1 而不能和a b i 2 - 1 突变蛋白互作，从而 阻断a b a 对o s t l 蛋白激酶的激活作用【3 4 1 。过氧化氢可以抑制外流性钾离子通道，从而 抑制a b a 和r o s 诱导的气孔关闭。臭氧抑制气孔开却并未抑制其关，过氧化氢和臭氧抑 制保卫细胞开却并未抑制其关，过氧化氢和臭氧抑制保卫细胞钾离子内流，这与a b a 能 维持气孔开关一致4 8 1 。然而，r o s 同时可以抑制钾离子外向和内向离子通道表明。最初 人们对r o s 的研究集中在细胞过氧化中的作用、产生机制以及消除机制，进一步研究发 现r o s 在生命活动中也起了不可或缺的作用，它们参与了细胞信号转导的各个方面，是 生命系统的重要组成部分，对r o s 的研究也是我们解释生命根本机制的一个突破口 【3 5 】。在今后的研究中将集中在r o s 的感受机制以及对基因表达的调控，包括对r o s 消 除基因的调控机制的研究。 在进化过程中，生物需要适应缺氧环境，活性氧在其生物体内的活动经历了几次修 1 2 山东师范大学硕士学位论文 饰【3 6 1 ，植物通过不时激活胁迫反应来适应不断变化的环境。过氧化氢的产生是受严格 控制的，这很有可能是植物释放胞内信号的一种方式，有时候也用一氧化氮来代替，最 终达到控制一系列过程的目的，至于这些信号分子是如何相互作用的以及它们如何相互 识别仍不为人知【3 7 1 。以后的研究需要重点是活性氧怎样参与到细胞的整个信号网络中， 以及这些化学分子和它们的胞内产生位点怎样影响到信号转导的，是什么决定了活性氧 所传递的信掣4 9 1 。 用脱落酸和过氧化氢处理诱导了一+ 4 6 k d a 的m a p k 的激活和抗氧化基因c a t l ， c a p x 、g r l 的表达以及所有的抗氧化酶类的表达：c a t , a p x ，g r ，s o d 。现有的证据支持 这样一种观点：活性氧是植物对生物的和非生物胁迫反应信号转导的汇集场所【3 8 1 ，但遗 憾的是对此我们却知之甚少，所以揭示r o s 是怎样融合植物对生物和非生物胁迫的反 应是件非常有意义的事情，为此我们需要应用大规模的转录组学的方法，蛋白质组学以 及代谢组学的方法来研究。活性氧和激素信号转导网络控制了生物和非生物胁迫响应都 是通过活性氧进行的【3 9 】。 图1 7 生物胁迫和非生物胁迫的交互作用 f i g l - 7c o n v e r g e n c ep o i n t si na b i o t i ca n db i o t i cs t r e s ss i g n a l i n gn e t w o r k s 脱落酸这类植物激素参与了非生物胁迫如干旱、低温、渗透胁迫的响应，脱落酸也 控制了一系列生长和发育过程，包括种子的发育、休眠、萌发、气孔运动等。相反，植 物激素s a j a e t 在生物胁迫响应中起中心作用，在很多情况下脱落酸作为植物抵抗病 山东师范大学硕士学位论文 害的负调控因子【删。例如，a b a 缺乏的番茄突变体对病虫害有更强的抵抗能力，但外 施a b a 会使得番茄重新对病害容易感染。众所周知a b a 和e t 在大多数情况下是相互 拮抗的。遗传学研究表明e r a 3 与e i n 2 是等位关系，而编码膜附着的可能是二价阳 离子感受器f 4 4 1 ，这可能是赤霉素和乙烯信号转导的交差之处。另外，茉莉酸抗性植株和 茉莉酸敏感植株对a b a 介导的萌发抑制敏感，表明茉莉酸与脱落酸之间是起拮抗作用。 在野生型植株内，外施a b a 引起了茉莉酸和乙烯响应的防御基因表达的下调1 4 2 j 再加 上外施甲基化的j a 和e t 不能逆转这些防御基因的表达，所有这些数据表明a b a 介导 的非生物胁迫响应是个主要的过程。最近的研究发现其他新鉴定的分子也参与了胁迫响 应的交叉。例如一氧化氮和钙离子信号在植物防御反应中发挥了重要作用。钙离子依赖 蛋白在番茄体内可能是通过介导脱落酸、水杨酸、茉莉酸、乙烯的信号转导来控制生物 的和非生物胁迫的响应的【钉j 。 图1 - 8 活性氧信号传导的机制 f i g l 一8g e n e r a l i z e dm o d e lo f t h er e a c t i v eo x y g e ns p e c i e ss i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a y 2 4 有关r o s 的最新研究进展 2 4 1 活性氧与气孔开度 在受到干旱胁迫时植物激素脱落酸会丢失，诱导气孔关闭，从而减少水分的丢失。 我们用辐射性热量监测仪分离到了两个拟南芥的同位基因突变体( o s t l j 和o s t l 2 ) ，此二 1 4 山东师范大学硕士学位论文 者突变体表现为在胁迫条件下蒸腾作用降低，从而导致植物体温升高。o s t l 为隐形突变 体，它们不但扰乱了脱落酸介导的气孔关闭而且影响了脱落酸对光诱导的气孔开放的抑 制作用，相反对于这类突变体，光和二氧化碳介导的气孔调节却不受影响，这表明o s t l 是特异性的脱落酸信号转导成分。通过克隆的方法分离到o s t l 基因，并发现其在气孔保 卫细胞和维管组织中表达，凝胶实验表明o s t l 是一个脱落酸激活的蛋白激酶。活性氧 最近被发现是保卫细胞脱落酸信号转导的必须中间成分，脱落酸诱导的r o s 产生在o s t l 的保卫细胞中被阻断了，当用过氧化氢和钙离子处理时会引起与野生型植株相同程度的 气孔关闭，这些结果显示o s t l 在脱落酸识别和r o s 生成的中间起作用，而o s t l 与其他 脱落酸不敏感突变体相关基因的相对位置仍不清楚。气孔位于植物表皮，控制了植物光 合作用所需要的二氧化碳的吸收和植物通过蒸腾作用丧失水分的过程。气孔的开与关是 由两个保卫细胞渗透势的膨胀和萎缩来控制的。在干旱条件下植物合成脱落酸，诱导气 孔的关闭，从而减少由于蒸腾水分的丧失。脱落酸直接作用于保卫细胞并且通过钾离子 和其他阳离子外流以及其他有机渗透调节物质来诱导气孔关闭。现如今我们对脱落酸的 了解主要源于病理学和细胞生物学的研究，事实表明脱落酸通过调节钙离子浓度来调节 细胞膜表面的离子通道，从细胞外空间的内流来增加细胞内钙离子浓度【4 3 】。 2 4 2 细胞死亡与r o s 细胞因胁迫死亡的过程通常是由植物激素介导的。例如，乙烯、茉莉酸和唾液酸。 另外，研究表明活性氧类的超氧化物阴离子和过氧化氢是植物细胞死亡的中心调控因 子。在臭氧诱导的植物细胞程序性死亡过程中，乙烯和活性氧相互促进对方的增加会引 起活性氧的增多，程序性细胞死亡和h r 在许多方面有着相似的特征。唾液酸促进程序 性细胞死亡，但茉莉酸却抑制活性氧的产生。药理学研究表明可逆磷酸化，钙离子信号 转导以及g 蛋白对p c d 的调节作用是受重金属胁迫诱导的。过氧化氢是表皮细胞死亡 的调节者。由于过氧化氢在水稻根表皮细胞的特异性积累而诱发细胞死亡，我们的研究 表明外施过氧化氢也会引起细胞死亡。水稻在根结处气生根是对其浸水缺氧的一种适应 性调节，从而减少了吸氧的茎叶与耗氧的根部之间的距离。 乙烯参与了植物的许多细胞死亡的过程。浸水诱导的气生根生成对重金属毒性的调 节以及对病虫害的防御相关的h r 过程有重要作用。在水稻，气生根的生成是其正常发 育过程的一部分，但在浸水条件下生成更多气生根【删。 3s m ai ir n a 的世界与基因沉默 m 东师范大学颐j 哮位论文 31 对小r n a 的认识 分子细胞生物学长时间以来都被一种蛋白质中心的观点所主导。近些年来非编码 s m a l i r n a 的出现开始挑战这个观点。大量的这些s m a l i r n a 【4 ”在不同水平调节着基因的 表达，从而发挥了重要的生理调节功能。 3 11 已经鉴定的r n a 的种类 现有的主要有三种经典的r n a ：信使r n a ，转运r n a ，核糖体r n a 。信使r n a 被翻译成蛋白质，而转运r n a 和核糖体r n a 则在翻译过程中行使“管家”功能。而小 r n a 是不被翻译成蛋白质的，相反这些长约2 0 3 0 n t 的r n a 分子通过干扰信使r n a 的翻译调节了一系列的生物过程。小r n a 有多种类型，现在研究的比较多的和研究的 比较清楚的主要分为三种类型：s i r n a ，m i r n a 以及p i r n a 蚓。 c l a s s k r n a s m e d i a t i n g p m t e i n s y m h e 5 i s m r n a s ( m e s s e n g e rr n a s ， t r ar e c h p t s o f p r o t e i n c o d i n g g e n e s t h