（分析化学专业论文）指纹图谱在啤酒质量控制中的应用.pdf

摘要 摘要 随着人们生活水平的提高，消费理念不断成熟，健康、绿色成为食品消费 的主流，在酒类产品中人们越来越多的选择啤酒，啤酒行业由此得到了迅速发 展。啤酒的风味质量稳定是啤酒成功销售，并长期拥有固定客户和赢得新消费者 的前提。 虽然我国啤酒产量己连续多年保持世界第一，但国内啤酒行业由于缺乏先 进的质量监控和技术创新的手段，特别在图谱技术的开发及其在产品过程控制、 质量控制，啤酒风味开发的研究水平，与发达国家相比有较大的差距，严重制 约了啤酒行业的发展。 现代分析技术的不断进步，啤酒质量控制技术的研究己经得到不断的发展 和深入，其中把综合诸多现代分析技术及多学科交叉的指纹图谱技术作为啤酒 的质量控制方法是新的热点，联用仪器及相关化学计量学方法的快速发展也为 啤酒的风味物质分析与质量控制提供了强有力的手段和广阔的前景。 本文以啤酒为研究对象，采用多种现代分析仪器，并应用化学计量学方法 实现对啤酒指纹图谱的分析及其质量控制的研究。 论文的第一章论述了啤酒工业的发展现状及啤酒指纹图谱的发展状况，以 及化学计量学模式识别的应用情况。 第二、三章中以啤酒为实验对象，应用高效液相色谱法( h p l c ) 、顶空固相 微萃取气相色谱( h s - s p m e - g c ) 等色谱方法系统地对啤酒指纹图谱的建立进行 了研究。经过对各项实验条件进行调整与优化，所建立的各种实验方法可靠有 效，在此基础上最终建立了啤酒的h p l c 指纹图谱、啤酒的h s - s p m e g c 指纹图 谱：应用化学计量学方法中的p c a 投影法和欧氏距离聚类分析法对所采集的各 色谱数据进行了化学模式识别在啤酒质量控制应用中的探索，取得了较好的效 果；对啤酒中挥发性有机物的定性与定量问题，进行了研究与探讨，并提出了 快速判断啤酒分类的方法。 第四章概括了论文所取得的成果也对论文存在的不足及以后的工作提出了 看法与展望。 关键词：啤酒，质量控制，h p l c 指纹图谱，h s s p m e - g c 指纹图谱，p c a 投 影，欧氏距离聚类分析 a b s t r a c t a b s t r a c t a sp e o p l e sl i v i n gs t a n d a r d si m p r o v e , t h ec o n c e p to fh e a l t h y , g r e e nc o n s u m p t i o n h a sb e c o m eah o u s e h o l df a s h i o n i na l c o h o l i cp r o d u c t si n d u s t r y , f o re x a m p l e ，m o r e a n dm o r ep e o p l ea r ei nf a v o ro fb e e r s ，h e n c et h eb e e ri n d u s t r yh a sb e e nd e v e l o p i n g r a p i d l y t h eq u a l i t yo fb e e rf l a v o rs t a b i l i t y , w h i c hi s t h ek e yt oa t t r a c tl o n g - t e r m c u s t o m e r sa n dw i nn e wc o n s u m e r s ，i sv e r ye s s e n t i a lt os u c c e s s f u ls a l e s a l t h o u g hc h i n a sb e e ro u t p u th a sb e e nt h ef i r s tp l a c ei nt h ew o r l df o rm a n y y e a r s ，i nt h e d o m e s t i cb e e ri n d u s t r y , i ts t i l ll a c k si na d v a n c e dq u a l i t yc o n t r o l t e c h n o b g ya n dt e c h n i c a li n n o v a t i o nn 笸a n s 。p a r t i c u l a r l y i nt h e d e v e l o p m e n to f f i n g e r p r i n tm e t h o d sa n dt h e i ra p p l i c a t i o n si np r o c e s sc o n t r o l ，p r o d u c t sq u a l i t yc o n t r o l a n di n n o v a t i o n so f n e w - f l a v o r e db e e r s ，t h e r ei sa l a r g e rg a pb e t w e e nh o m ea n da b r o a d b r e w e r s i th a ss e r i o u s l yh a m p e r e ，| dt h ed e v e l o p m e n to f t h ed o m e s t i cb e e ri n d u s t r y w i t ht h ea d v a n c e m e n to fr m d e r na m l y s i st e c h n o l o g y , t h eb e e rq u a l i t yc o n t r o l t e c h n o b g yh a sb e c o m el i l o r ei n - d e p t ha n dm o r ec o m p r e h e n s i v e a sam e t h o df o r q u a l i t yc o n t r o lo fb e e r s ，f i n g e r p r i n tt e c h m l o g y i st h ef l e wh o ts p o t t h er a p i d d e v e l o p m e n to fn e wi n s t r u m e n t sa n dc h e m o m e t r i c sm e t h o d sh a sp r o v i d e dt h e b r e w e r sw i t hl o t so fn e wt o o l sf o rt h eq u a l i t yc o n t r o lo f b e e ri n d u s t r y i n t h i sp a p e r , b e e ri st h er e s e a r c ho b j e c t av a r i e t yo fm o d e r na n a l y t i c a l i n s t r u m e n t s ，a n ds o m ec h e m o m e t r i e sm e t h o d sa r ee m p b y e d t h e nb e e rf i n g e r p r i n t a n a l y s i sa n dq u a l i t yc o n t r o ls t u d i e sa r ec a r r i e do u t , a c c o r d i n gt oe a c hf i n g e r p r i n t m e t h o d c h a p t e ro n ed i s c u s s e st h es t a t u s o ft h eb e e r i n d u s l r ya n db e e rf i n g e r p r i n t d e v e l o p m e n t , a sw e l la ss o m ea p p l i c a t i o n sof p a t t e r nr e c o g n i t i o n i nt h es e c o n da n dt h i r dc h a p t e r s ，h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o r m t o g r a p h y ( h p l c ) ，h e a d s p a c es o l i d p h a s em i c r o e x t r a c t i o ng a sc h r o m a t o g r a p h y ( h s - s p m e - g c ) s y s t e ma r eu s e dt od e v e l o pf i n g e r p r i n tm e t h o d s f o rb e e r s a f t e ra d ju s t i n gt h e e x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n sa n do p t i m i z a t i o n , e x p e r i m e n t a lm e t h o d sa l er e l i a b l ea n d e f f e c t i v e ；t h es t a n d a r db e e rh p l cf i n g e r p r i n ta n dt h es t a n d a r db e e rh s s p m e - g c f i n g e r p r i n ta r eo b t a i n e d ；t h ea p p l i c a t i o n so fp a t t e r nr e c o g n i t i o nm e t h o d s ( p c a a b s t r a c t p r o j e c t i o nm e t h o da n de u c l i d e a nd i s t a n c ec l u s t e ra n a l y s i s ) i nb e e rq u a l i t yc o n t r o l , a c h i e v e g o o dr e s u l t s ；q u a l i t a t i v e a n d q u a n t i t a t i v e s t u d i e so fv o l a t i l e o r g a n i c c o n v o u n d si nb e e ra r ec o n d u c t e d ，a n da ne a s yw a yt od e t e r m i n et h ec l a s s i f i c a t i o no f b e e r si sp r o p o s e d 。 c h a p t e rf o u rs u m m a r i z e st h er e s u l t so fe x p e r i m e n t sa n da n a l y s i s ，a n da l s o c o v e r st h es h o r t a g eo f t h es t u d ya n dg i v e sa no u t l o o ko f t h ef u t u r e k e y w o r d s ：b e e r , q u a l i t yc o n t r o l ，h p l cf m g e r p r i n t ，h s s p m e - g cf i n g e r p r i n t , p c a p r o j e c t i o n , e u c l i d e a nd i s t a n c ec l u s t e ra n a l y s i s 1 1 1 学位论文版权使用授权书 本人完全了解同济大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：丁全珏 乒阳j 年3 月阳 同济大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、己公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 签名：丁参也 2 7 年；月，午日 第1 章弓l 言 第一章引言 ，1 啤酒行业发展现状 随着人们生活水平的提高，消费理念不断成熟，健康、绿色成为食品消费 的主流，在酒类产品中人们越来越多的选择啤酒。啤酒行业由此得到了迅速发 展，我国啤酒产量已连续多年保持世界第一，目前仍是世界上啤酒市场增长最 快的地区之一，预计今年我国啤酒产量有望突破4 0 0 0 万吨，这也意味着人均年 消费啤酒约4 8 瓶，超过世界平均水平。可见，在我国啤酒市场是十分巨大的。 但是，应该看到的是，我国啤酒市场的发展很不平衡，首先是啤酒生产厂家众 多，生产条件、产品质量参差不齐，难于进行有效的质量监管，其次，各类档 次的啤酒需求发展也不平衡。国外啤酒业巨头也加快了进军中国市场的步伐， 给中国啤酒生产企业带来了巨大的挑战。 啤酒的风味质量稳定是啤酒成功销售，并长期拥有固定客户和赢得新消费 者的前提。往往好的、稳定的啤酒风味取决于原料的质量、生产过程的控制， 以及包装物特性、啤酒储存条件等，同时也与流通条件、货架时间等有关。要 保持啤酒风味稳定、预防风味缺陷，基本做法是：一要严格生产、储存过程的 工艺质量管理及卫生控制，同时对流通及货架期啤滔做出储存条件的规定并予 以监督执行；二要通过生化、理化检测分析，预测啤洒货架期、保鲜值、风味 物质含量状况，但是在当前，我们在啤酒口感、风味的检测分析手段尚未完全 具备的情况下还仍然是依赖于啤酒的品评来进行啤酒质量的控制。国内啤酒 行业由于缺乏先进的质量监控和技术创新的手段，特别在图谱技术的开发及其 在产品过程控制、质量控制，啤酒风味方面的研究水平，与发达国家相比有较 大的差距，严重制约了啤酒行业的技术进步。 1 2 指纹图谱技术与啤酒质量控制 指纹( f i n g e r p r i n t ) 概念来源于法医学，依据每个人的指纹结构上微小差别 可以鉴别区分不同的人。近代指纹分析的概念结合生物技术的发展延伸到了 d n a 指纹图谱分析，而且应用范围也从犯罪学扩大到医学和其他生命科学领域。 啤酒指纹图谱是借用中药指纹图谱的发展和应用而来的，随着现代化分析仪器 第1 章引言 的广泛应用，啤酒指纹图谱技术也受到关注。 每一种类型的啤酒产品都有独特的风味和口感以区别于其它种类，即它们有 自己的指纹特征。我们通常所说的啤酒指纹图谱是指化学指纹图谱，指导啤酒 样品经适当处理后，采用一定的分析手段测定得到的能够标示该样品表现组分 群体特性的色谱或光谱的谱图，并使待测物的检测尽可能多地反映其全貌的各 种分析手段。 啤酒质量的稳定性和一致性的控制技术是企业发展的关键，这一点早为世 界知名啤酒企业集团的成功所证实。他们投入大量的人力资源开发风味物质定 性、定量技术，以保持啤酒质量的稳定性、一致性，达到壮大自己、超越和领 先对手的目的。其中，啤酒指纹图谱技术，特别是其中风味物质的图谱技术， 是世界各大啤酒集团进行质量控制的关键技术手段，严加保密，无现成技术参 考。而国内这方面的研究刚刚开始起步，因此，建立一种可靠的啤酒指纹图谱 方法，不论是在理论研究，还是将来在应用领域，都有着十分重要的意义。啤 酒指纹图谱对啤酒企业在生产过程中控制啤酒的风味、稳定啤酒产品的质量、 提升啤酒产业的水平具有重要的指导意义，也为广大消费者和执法部门鉴别啤 酒品质、打击假冒伪劣啤酒的违法行为提供强有力的技术支持，具有显著的经 济效益和社会效益。 1 2 1 啤酒指纹图谱的建立 啤酒指纹图谱具有整体性、模糊和可以部分量化的特征。因此，可以借鉴 中药指纹图谱技术，寻找同一种啤酒化学成分的相似性，从而构建啤酒指纹图 谱。 建立啤酒指纹图谱需要依靠现代仪器分析技术，主要有色谱法、光谱法、 联用技术等等。以下是一些先进的仪器分析技术在有关酒类质量控制中的应用， 可以看到，其中有不少提出了指纹图谱的概念，但鲜有针对啤酒指纹图谱研究 的报道。这些技术的发展为啤酒指纹图谱的建立提供了良好的技术保障。 a 气相色谱( g c ) 及气相色谱一质谱联用( g c m s ) 气相色谱法( g c ) 、气相色谱一质谱联用( g c - - m s ) 是比较常用的分析仪器。 所得的色谱图，其重现性、分辨率相对较好，提供的信息量大，操作简便，样 品预处理简单，而且由于是封闭系统色谱，外界影响因素较少，稳定性较好， 2 第l 章弓l 言 检测设备可选性较大，特别适合于挥发性物质的鉴别和含量测定。可以借鉴中 药指纹图谱技术的方法【】进行酒类的指纹图谱分析。陈泓等提出了用g c 建立 白酒指纹图谱并应用于白酒的质量控制。刘炯光、孙细珍等人也在该方面做了 不少相关的工作降6 1 。 b 高效液相色谱( h p l c ) h p l c 是2 0 世纪6 0 年代开始发展起来的一项现代分析技术，具有很高的分 离度，快速、灵敏、重现性好、应用范围广，目前已成为中药质量控制的首选 方法，适合于中药复杂成分的分离、分析和指纹图谱的建立。在酒类饮料的指 纹图谱建立方面也有不少相关的工作：魏新军、牛再功等将h p l c 指纹图谱应 用于参茸保健酒质量评价，达到了良好的结果；徐抗震、宋纪蓉等采用反相高 效液相色谱电化学检测法研究了1 4 种苹果酒样品的指纹图谱，为苹果酒的质量 控制、新产品的研发以及苹果酒行业标准的制定提供一种可行思路：张军翔、 冯长根等人利用高效液相色谱法建立了9 个品种葡萄酒的花色苷指纹图谱，对 不同品种葡萄酒进行识别【7 叫。用h p l c 测定啤酒中微量物质如一些高级醇、有 机酸等等甚至是测定了一些啤酒老化有关的物质，这些风味物质的测定都是很 有意义的工作f l o - 1 引。 c 高效液相与质谱联用( h p l c _ m s ) 技术 l c m s 技术可应用于很多领域。它具有灵敏度高、选择性强及速度快等特 点。e s i 、a p c i 等l c ，m s 接口技术的发展使l c m s 不断成熟，与紫外、二极 管阵列等检测法比较，l c m s 鉴定更准确，特异性更强。因而简化了实验步骤， 减少了样品预处理过程。这些特点使l c m s 在药物发展中占有重要地位，在啤 酒中风味物质的测定方面也能得到了广泛的应用1 1 9 乏3 1 ，如l s d ej a g e r ，g a p e r f e t t i 等利用l c m s 检测了一些食品和饮料6 种内酯；j lg o m e z - a r i z a 等人 利用t o f 三重四极杆质谱仪测定了葡萄酒中的花青素作为其指纹图谱，聚类分 析和因子分析的结果都很好；a l e x s s a n d e rs a r a u j o 等人应用电喷雾电离质谱得 到了啤酒的指纹，成功地对三类啤酒进行分类。 d 毛细管电泳( c e ) 高效毛细管电泳( h p c e ) 技术 毛细管电泳( c e ) 是较新的方法，是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离管 道，依据样品中各组分之间电泳速度或分配行为的差异而实现分离的液相分离 3 第1 章引言 技术。毛细管电泳用于检测中药指纹图谱，其优点在于：柱效高：分析速 度快，进样体积小( 纳升级) ；适于直接分析水溶液，可直接分析“脏样品； 大小分子可同时分析，毛细管极易清洗；开发新方法较快，仪器维护简单 笙 寸o h p c e 技术在中药材鉴别中的应用是近几年发展起来的，它具有高效、快速、 分辨力强、重现性好的特点。魏新军等采用高效毛细管电泳( h p c e ) 建立了干 红葡萄酒的乙醚提取物的指纹图谱，并进行指纹图谱分析，通过指纹图谱相对 峰面积和相对保留时间的分析，对不同批次的干红葡萄酒进行对比研究。结果 表明，该法简便可靠，可作为对干红葡萄酒进行质量评价的新方法i 矧。 e 红外光谱( ir ) 技术 北京市食品安全监控中心与清华大学开展红外指纹图谱等前沿技术在食品 安全监控中的应用研究。“红外指纹”图谱技术2 0 0 7 年年内将正式应用到食品安 全监控中，食品安全监控中心正在建立信息库。目前己经完成了奶粉、葡萄酒 等多项食品的红外指纹备案，2 0 0 7 年年内也将应用到食品安全监控中【2 卯。 1 2 2 啤酒指纹图谱的解析 a 化学计量学的应用 化学计量学( c h e m o m e t r i c s ) 是化学与分析化学学科的一个独特分支。化学计 量学为化学量测提供理论和方法，为各类波谱及化学量测数据的解析，为化学 化工过程的机理研究和优化提供新途径，它涵盖了化学量测的全过程，包括采 样理论与方法、试验设计与化学化工过程优化控制、化学信号处理、分析信号 的校正与分辨、化学模式识别、化学过程和化学量测过程的计算机模拟、化学 定量构效关系、化学数据库、人工智能与化学专家系统等，是一门内涵相当丰 富的化学学科分支1 2 6 之7 1 。 两个重要的条件与因素推动了这方面的发展。首先，大量涌现的现代化学 量测仪器，使化学与分析化学家比以往任何时侯都更容易获得大量化学量测数 据。最难解决的瓶颈问题是这些数据的解析及如何从中提取所需的有用化学信 息。另外，化学家与分析化学家首次遇到类似行为科学家或经济学家所遇到的 大量数据如何处理的问题。因为大量现代分析测试仪器、计算机技术的发展， 就构成了化学计量学发展的第二个条件。 4 第l 章弓l 言 化学模式识别是化学计量学研究中的一个十分重要的内容，它是一种多元 分析方法，主要用于样品的分类判别。它从化学测量的数据出发，借助数学方 法和计算机技术，从而揭示出事物内部规律和隐含特征。模式识别的方法可分 为有指导的方法、无指导的方法、显示方法等。有指导的方法需要有训练集， 通过训练集建立模型，可以识别未知样品，常见的包括线性判别、逐步判别分 析，神经网络和s i m c a 法等。无指导的方法包括最小生成树和聚类分析等。显 示方法包括变量变量绘图、线性投影、非线性投影等。在不同领域中的问题由 于有这各自的特点，根据数据形式和识别目的，需要选用合适的方法进行识别。 目前，联用色谱仪器的发展和广泛应用，已经成为某些分析的主流趋势。 然而，联用分析仪器，往往一个样本就能产生了大量的数据，数据的解析和化 学信息的有效提取就成为分析化学面临的一个难点。化学计量学多元校正与多 元分辨的复杂多组分解析方法的出现，为分析化学家提供了很多新机遇，复杂 色谱峰体系纯度检验、重叠色谱峰中组分数的确定及纯色谱与纯光谱的获得成 为可能，为复杂分析体系的定性定量解析提供全新思路。多元分辨与多元校正 技术主要有：g a m p e r l i n e 和v a n t e g i n s t e 的迭代目标转换因子分析法( i t e r a t i v e t a r g e tt r a m f o r r m t i o nf a c t o ra n a l y s i s ，i t t f ) 、w i n d i g 等的s i m p l i s m a ( s i m p l e t o u s e i n t e r a c t i v es e i f - m o d e l i n gm i x t u r ea n a l y s i s ) 、m a s s a r t 等的p a ( o r t h o g o m li r o j e c t i o n a p p r o a c h ) 、m a n n e 等的g e n t l e 法、m a e d e r 渐进因子分析( e v o l v i n gf a c t o r a n a l y s i s ， e f a ) 法等等。 在对指纹图谱的实际应用中，依靠指纹图谱评价对象质量时，必然遇到指 纹图谱判别的问题，所以有必要以化学计量学为基础，建立起指纹图谱的计算 机模式识别系统，来实现中药分析系统、科学、客观的目的，评价指纹图谱的 相关性，进而判别质量。啤酒指纹图谱的模式识别是根据所含化学成分用数学 手段对其进行分类或描述，化学计量学中回归分析、聚类分析、判别分析、因 子分析、相关分析、p c a 等多元统计方法及用于非线性体系的人工神经网络技 术等的应用1 2 7 瑚】。 b 风味物质的定性与定量分析 啤酒以其独特的风味、丰富的营养而有别于其他饮料，然而对其口味和风 味却很难有准确的定义。一般来说，啤酒的风味是人们的感觉器官，尤其是嗅 觉和味觉对产品的种综合反应，其中嗅觉主要是通过鼻子对香味、臭味、杂 第1 章引言 味的感受；而味觉则是通过口腔对酸、甜、苦、成、涩等味道的感知。当然， 这亦不能排除视觉( 色泽、外观包装、饮具、饮用环境、泡沫等) 、触觉( 温 度) 以及人的精神状态因素等对啤酒风味鉴别的干扰与影响。 啤酒含有大量的风味物质，成分非常复杂，目前可以检测出几百种啤酒化 学成分，除乙醇和c 0 2 外，尚有杂醇、醛类、酯类、酮酸、a - f 3 酸，有机酸、 蛋白质及分解产物，寡糖、多糖等【2 9 - 3 7 1 。这些物质中有些是易挥发性的，也有 些是非挥发性的；有些是酵母发酵的副产物，有些是在麦芽制造和麦汁制备过 程中产生的。它们有一个共同的特点：即含量虽低，但对啤酒风味影响甚大。 尤其是其中一种或多种成分的浓度明显升高，超过其阈值时，就会在啤酒的风 味和口味上产生变化，而导致异香、异味。反之，若啤酒中缺少某些重要的的 芳香成分或者是其浓度太低时，也会使啤酒风味与口味不协调。 因此，对啤酒风味物质的研究历来是啤酒行业关注的重点。有关风味物质 的定性与定量方法的研究有很多，主要用到的检测方法有h p l c 、g c 等等。 1 3 啤酒指纹图谱应用前景展望 酒类指纹图谱研究技术是在现代仪器分析技术基础上发展起来的，沿用了 中药指纹图谱的概念，为各种酒类“指纹”，进而对其进行真伪优劣鉴定和质量 控制。研究方法也有多种，分别从不同的角度反映了酒的化学成分信息和遗传 信息，各有利弊。目前，这些方法尚未成熟，指纹图谱的研究还处于初级阶段， 如何建立稳定可靠的标准指纹图谱及最终建立统一的指纹图谱数据库和谱效关 系库，尚待进一步的研究。 1 4 本文研究的内容 本文主要研究了啤酒的唧l c 指纹图谱、s p m b g c 指纹图谱，比较和评估 了建立指纹图谱的方法。并且利用化学计量学模式识别中的p c a 投影法和欧氏 距离聚类分析法对样本进行分类与识别。另外，对一些啤酒风味物质实现了定 性分析，并且尝试讨论了其对啤酒口味的影响及啤酒变质问题。本文第二章讨 论了啤酒h p l c 指纹图谱的建立与分析，第三章内容则是s p m e g - c 指纹图谱的 建立与分析。 6 第2 章啤酒高效液相色谱指纹图谱的研究 第二章啤酒高效液相色谱指纹图谱的研究 h p l c 作为一项现代分析技术，具有很高的分离度，快速、灵敏、重现性好、 应用范围广，目前己成为中药质量控制的首选方法。在酒类饮料的指纹图谱建 立方面也有不少相关的工作，有学者将h p l c 技术应用于参茸保健酒质量评价， 达到了良好的结剁7 1 。考虑到啤酒也是水溶液，尝试使用肿l c 来建立啤酒指纹 图谱也自然是酋选方法。 本章论述了h p l c 啤酒指纹图谱的研究工作，主要分以下几个部分展开： 1 啤滔指纹图谱h p l c 方法的建立。系统地建立了h p l c 方法，并且进行了方法 学考察。2 利用指纹图谱进行分析。构建啤酒的标准指纹图谱，并结合化学计量 学算法对啤酒进行鉴别。3 风味物质的研究。初步探讨了h p l c 指纹图谱中的部 分风味物质的定性方法，并且讨论了啤酒的变质问题。4 j 、结。回顾了啤酒h p l c 指纹图谱的建立和其在实际应用中的探索，明确了下一步的工作方向。 2 1 h p l c 指纹图谱方法的建立 2 1 1 仪器 v a r i a n 高效液相色谱仪( 包括二元泵，二极管阵列检测器，自动进样器) ； b 5 2 0 0 s d t 型超声波清洗器： 色谱柱： u l t i m a t ea q c 1 8 ( 5 9 m ，4 6 1 5 0 m m ) ， u l t i m a t ex b c n ( 5 1 t m ，4 6 15 0 m m ) ， u l t i m a t ex b p h e n y l ( 5 1 1 m ，4 6 15 0 m m ) ， u l t i m a t ex b c 8 ( 3 t m ，4 6x10 0 r a m ) ： 移液器( f i r m p i p e t t ec o l o u r 4 0 2 7 ，1 0 0 5 0 0 m l ，上海热电仪器有限公司) ； m i l l i - qg r a d i e n t 超纯水仪，美国m i l l i p o r e 公司。 2 1 2 试剂 甲醇( 色谱纯，m e r k 公司) ；超纯水( 电阻率1 8 2 m f l c m ) 第2 章啤酒高效液相色谱指纹图谱的研究 2 1 3 样品来源及预处理 本实验的啤酒样品均为市售啤酒，分别根据不同类别的啤酒，同时按照不 同生产厂家，同一生产厂家的不同生产批次的原则来挑选样品。 将开瓶后的啤酒用超声仪进行除气( 约2 0 分钟) ，静置，取2 5r n l 啤酒液加 入到l o m l 容量瓶中，加入高纯水稀释，摇匀，定容。用0 4 5 a m 的微孔滤膜过 滤，得到待测液样品。 2 1 4h p l c 条件选择及优化 2 1 4 1 色谱柱的选择 色谱柱作为分离过程中的固定相，分离效果好坏很大程度上取决于色谱填 料的选择。为了保证h p l c 分离快速、效果好，应该充分考虑各个色谱柱的物 理性质和参数，包括填料键合相、色谱柱键合方式、色谱柱长度、柱内径等。 考虑现有条件下的四种色谱柱：u l t i m a t ea q c 1 8 ( 5 l x m ，4 6 1 5 0 m m ) ( 室) u l t i m a t ex b p h e n y l ( 5 9 m ，4 6 1 5 0 m m ) u l t i m a t ex b c n ( 5 l x m ，4 6 1 5 0 m m ) u l t i m a t ex b c 8 ( 3 t a m ，4 6 1 0 0 m m ) 。l 号柱是亲水柱，能与1 0 0 水流动相 条件兼容，在高含水量的流动相中，对有机酸、缩氨酸、核苷和水溶性维他命 等强极性化合物具有保留能力，适合极性较强的物质分析。2 号柱对芳香族化合 物、在烷基键合相中保留能力差的强极性芳香族化合物具有优良的选择性。3 号 柱是极性最强的反相柱，适用于疏水性极强的化合物，当用c 1 8 和c 8 柱和典型 的反相洗脱液不能洗脱时，适合用氰基柱。4 号柱的长度最短，当遇到性质差别 比较大的样品时，与l 号柱相比，具有较高的效率。 在2 1 5 中提到的色谱条件( 除色谱柱外) 相同的情况下，本实验比较了上 述四种不同的色谱柱的分离效果，如图2 1 。 ( 1 ) 苯基柱：整体上和a q c 1 8 相近，但由于啤酒样中含有大量有机酸、酯等 物质，使用苯基柱并不能有效提高分离效果。 ( 2 ) a q - - c 1 8 ：峰形较好，主要物质能基本分开，整体上来说用表2 1 中的流 动相梯度比例能达到预期的分离效果。 8 第2 章啤酒高效液相色谱指纹图谱的研究 图2 1 四种色谱柱分离效果图比较 c ax b - p h e n y l ；ba q - c 1 8 ；cx b - c n ：dx b - c 8 ) ( 3 ) 氰基柱：分离效果是四根柱中最差的个，在保留时间小于5 m i n 时，出 现峰堆积现象。 ( 4 ) c 8 小柱：出峰较快，且峰形较好，但要达到良好的分离效果需进一步降低 流动相中有机相浓度。 综上所述，选择a q c 1 8 进行分离比较合理，在流动相中水相比例较高的 情况下能达到良好的分离效果。 9 a b c d 幻 柚 如 ” o 钳 知 柏 伯 。 翟 暮 第2 章啤酒高效液相色谱指纹图谱的研究 2 1 4 2 流动相选择 本实验选择水一甲醇体系作为流动相对啤酒提取物进行分析，啤酒中含有 蛋白质、脂肪、酸、酯等成分，由于各个组分存在极性差异，单一比例的流动 相难以实现对所有物质的较好分离，因此本实验采用梯度洗脱的方式提高样品 分离效率。梯度洗脱的程序表见2 1 5 节。 2 1 4 3 流速选择 柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。 对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4 6 m m 的色谱柱，流速一般选择lm l m i n 。 4 0 3 0 一 ) 毛 2 0 1 0 0 一i i q u l e s 图2 2 两种流速下的效果图比较( a 流速0 5 m l m i n ；b 流速为1 o m l m i n ) 但是由于啤酒样品中所含组分相对较多，当使用l m l m i n 流速时，出峰过快， 使许多组分的色谱峰挤在一起，不便于后续实验图谱的直观比较，因此选择 0 5 m l m i n 的流速。图2 2 即是两种流速下的色谱图。 2 1 4 4 检测波长的选择 啤酒样品成分复杂多样，每种成分都有自己的最佳检测波长，那么要如何 选择一个特定的检测波长以综合反应所有物质的紫外吸收，就需要记录所有波 l o a b 第2 章啤酒高效液相色谱指纹图谱的研究 长的吸收，根据该波长范围各波长下的吸收情况进行整体考虑，保证有一定的 响应信号且峰形对称、谱图整体匀称，重现性好。为了说明不同波长下，图谱 的差异，下面选择三条检测波长进行比较，见图2 3 。 从整体上看，2 3 5 n m 作为检测波长，基线不稳定，能检测出1 8 个峰，峰形 还可以。2 6 0 n m 检测波长下，响应信号最大，最多能检测出2 2 个色谱峰，且基 线平稳，峰形良好。3 0 0 n m 检测波长下，虽然基线平稳，但是响应信号很小， 在此波长下无法检测出大部分组分。 综上所述，2 6 0 n m 作为检测波长时，能够检测出的色谱峰较多。响应信号 较大，峰形也较好。所以最终选择2 6 0 n m 作为检测波长。 图2 3 不同检测波长下效果图的比较 ( a2 3 5 n m 检测效果：b2 6 0 n m 检测效果；c3 0 0 r n n 检测效果) 2 1 5 优化后的色谱条件 色谱柱：a q - c 1 8 ( 5 p m ，4 6 x1 5 0 m m ) c 第2 掌啤酒高散液相色诺指纹图谱的研宄 流动相：水( a ) 一甲醇( b ) 流速：05 m l m i n 检测波长：2 6 0 n m 洗脱：采用梯度洗脱，见表2 襄2 l 拂度冼脱程序表 21 6 仪器精密度测试 对一啤酒样品( 啥尔滨冰纯) 连续进样5 次得到的图谱见图2 4 对这些 色谱图进行积分处理，分别导出保留时间和相应蜂面积的数据报告，用相关系 数表示相似度，得到图谱之间相似度均在o9 9 以上。选取响应信号较大的峰， 考察峰面积、保留时问。经计算各峰面积的相对标准偏差均在5 n 以内，保留 时间一致，说明仪器精密度良好。 图2 4 仪器精密度测试 21 7 稳定性测试 按照2 i _ 3 所述预处理方法处理啤酒祥，同一个样品在制备好之后，在2 4 个小时内连续进样l s 次选取了4 张有代表性的图谱作为对比，保留时间为53 、 第2 章啤酒高教液相色谱指纹图谱的田f 究 6 5 、7 3 、8 0 、9 0 、9 8 、1 3 、1 & 5 、1 8 3 m 缸时相应的色谱峰发生了变化。下图 给出了保留时问为7 - 1 9 r a m s 的区域，可见有一些物质含量的变化比较明显。( 实 验温度2 5 。c ) 监 ； 拳瀚 吾 瑟蓉糍鋈叁2 1 n8 06 n4 n 2 0 髓2 5 稳定性测试 051 01 5 2 0 时闻，h 图2 6 保留时问为p b m l r s 的物质对应峰面积与时间的变化图 考察保留时间为9 s n d r , s 的峰，以相对峰面积对相应的时闻( 此处指样品经 预处理后保存的时阃) 作图，比较峰面积随时间的变化如图2 6 ，随着时间的 加长该峰的峰面积逐淅减小最终消失。在n h 内相对保留峰面积的r s d 小 于s ，似乎可以接受，但是平均值已经明显下降，从而可以判断明显存在变质。 因此，样品处理好之后应尽快进行实验，以减少由于保存过长耐间引起的实验 误差。 第2 章啤酒高效液相色谱指纹图谱的研究 表2 21 4 小时内相对标准偏差( 以峰面积计算) 2 1 8 样品测定 选择五个厂家六种啤酒：三得利清爽，哈尔滨冰纯，力波啤酒( 原味、清 爽) ，朝日生啤( 原味、清爽) ，青岛纯生共3 6 个样品( 产品目录见表2 - 3 ) 。按 照2 1 3 所述方法进行样品预处理，在2 1 5 所述条件下进行测定，及时保存好 数据以供后续处理。 表2 3 各批次啤酒样品目录及编号 1 4 第2 章啤洒高教藏相色带指纹嘲谱的研究 22h p l c 指纹图谱在啤酒分类中的应用 经过前面的测试工作得到了各啤酒样品韵高教液相色谱图。本节的主要 工作是尝试应用豳谱对啤酒样品进行分类可分为三部分：1 啤酒类别简介。 2 指纹谱图的建立和谱图对 匕。3 利用化学计量学模式识别分类。 221 啤酒类别 啤酒的分类方式较多【”j ，可阻按照啤酒豹色泽、浓度、生产方_ ；去、所用的 酵母性质等分娄。按照目前呻滔国家标准的定义，一般将啤酒分为熟啤酒、生 啤酒、鲜啤酒和特种啤酒。熟啤酒是经过巴氏灭菌或瞬时高温灭菌的啤酒。生 啤洒和鲜啤洒是不经过巴氏灭蒴或瞬时高温灭菌的啤酒。生啤酒是用特殊过滤 方法除苗的啤酒。特种啤酒是原材斜工艺有较大改变，具有特殊风味的啤酒， 如干啤酒、冰啤酒、低醇啤酒、小麦啤酒、浑浊啤俩等。 对照阻上内容本研宄工作涉及的啤酒归类如下：熟啤酒类即普通啤酒 包括三得利清爽、哈尔滨冰纯、力渡原咏、力波清爽：生啤酒类包括青岛纯 生、圣1 1 日生啤清爽。 222 谱图对比 2 2 21h p l c 指纹图谱的构建 考察2 i8 所测定的啤酒样品的色谱图如围27 所乐。将各批次样品的色谱 图进行对比分析，提取的特征峰，构建啤酒的h p l c 指纹罔谱( 图2 8 ) ，以此 作为判断啤酒风格特征及质量稳定性的参考标准。 囤2 7 各种啤酒的色谱原圈 第2 章啤洒高赦渡相色谱指纹图潜的研亢 l 2 ；盯。 l l 九 图2 8 畔佰的h p l c 指纹图谱 2 222 同一厂家啤酒图谱的比较 为比较同一类型，不同批次的啤酒图谱，取5 个批次的三得利样品的谱图 来进行讨论，见图29 。 经计算，谱图之间相似度均在0 9 9 以上( 见表3 2 ) 。根据此结果，可以认 为同一生产厂家日常的生产工艺是稳定的产品规格、生产日期和批次不影响 产品质量。图中微小峰面积的差异在可以接受的分析误差范围内。如果严格控 制生产工艺条件，啤酒中成分含量的差异可以控制在适当范围内该厂家生产 的啤酒的h p l c 图谱也因此具有一定的稳定性，即具有较高的相似度。若某批 次产品的f i p l c 图谱与用于比对的标准幽谱有较大差异例如相似度小于9 0 则可判定存生产、储存、销售等过程中出现r 问题，从而可以及时发现井解决 问题。 舶2 9 三得利清爽啤洒谐图 第2 聋啤酒高教液相色诺指纹图诺的研究 表2 4 三得利清爽各样品图谱之同相似度( 以峰匝积计算) l214e 2 2 2 3 不同厂家啤酒图谱的比较 以普通啤酒为例。考察三得利、力波、哈尔滨三个厂家的产品，所得h p l c 色谱图如21 0 。根据该图，结合表2 5 可以知道不同厂寡啤酒的h p l c 图谱差 异非常明显，如哈尔滨椰力波原味两者相似度只有o8 3 7 3 ，而同一厂家生产的 两种u 味啤锄即力波棘味和清爽，图谱相似度却达到0 9 9 3 6 。 这充分表明不同啤酒生产厂家所采用的原料和生产工艺有所差异而这种 差异正是通过h p l c 色谱图反映了出来也就是说通过i 毋l c 图谱的比较， u r 以实现对不同厂家啤酒的辨剐。但是，本实验中，力波原味和清爽啤酒图谱 相似度非常高无法实现区分。也说明引起啤酒口味不同的某些风味物质用这 里建立的h p l c 方法并不能充分展示出来。 网2 加不同生产厂家啤硝嘲诺比较 ( a 哈尔试：b 三得利；c 力渡清蛊：d 力渡原味) 耍! 王婴登茎型堡塑望堂塑塑堡! 望里! a bcd 第2 章啤酒高效液相色谱指纹图谱的研究 2 。2 3 模式识别的应用 经过谱图对比，初步的有了一个分类的概念。然而实际应用中，这样的分 类手段是不够的，因为没有有效的提取出谱图的信息，进而对谱图分辨的过程 效率较低。这时就需要利用化学计量学来建立起更为快速、可靠、直观的分类 方法。这里使用主成分投影和欧氏距离聚类