（生物化学与分子生物学专业论文）atpa引起glur5ka巯基亚硝基化机制的研究.pdf

- “ ， 徐州医学院硕士学位论文 缩略词表 a b b r e v i a t i o n 缩略词英文全称 7 - n i7 - n i t r o i n d a z o l e a 2 318 7c a l c i u mi o n o p h o r e b c i p 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o 3 i n d o l y lp h o s p h a t e b s ab i o t i n - s w i t c ha s s a y c g m p c y c l i cg u a n o s i n em o n o o h o s p h a t e c h a p s 3 - ( 3 c h o l a m i d o p r o p y l d i m e t h y l a m m i n o ) - 1 - p r o p a n e s u l f o n a t e d a p i 4 ，6 - d i a m i d i n o - 2 - p h e n y l i n d o l e d i v d a yi nv i t r o d m e md u l b e c c o sm o d i f i e de a g l e sm e d i u m d m f d i m e t h y lf o r m a m i d e d m s o d i m e t h y ls u l f o x i d e d t t d l d i t h i o t h r e i t o l e b s s e a g l e sb a l a n c e ds a l ts o l u t i o n f b s g l u g l u t a m i ca c i d g l u r 6g l u t a m a t er e c e p t o r6 g s n o s - n i t r o s o g l u t a t h i o n e h e p e s n - 2 - h y d r o x y e t h y l - p i p e r a z i n e - n - 2 - e t h a n e s u l f o n i ca c i d 中文全称 7 硝基吲唑 钙载体 5 溴4 氯3 吲哚磷酸 生物素转换法 环磷酸鸟苷 3 - ( 3 - 胆酰胺丙基) - 二 乙胺】- 丙磺酸 4 ，6 二脒基2 苯吲哚 盐酸 体外培养天数 d u l b c c c 0 改良培养基 二甲基甲酰胺 二甲基亚砜 二硫苏糖醇 e a g l e s 平衡盐溶液 胎牛血清 谷氨酸 谷氨酸受体6 亚硝基谷胱甘肽 n 2 羟乙基哌嗪n 2 乙磺酸 1 徐州医学院硕士学位论文 i b i m m u n o b l o t t i n g i p i m m u n o p r e c i p i t a t i o n k ak a i n i ca c i d k a rk a i n i ca c i dr e c e p t o r ， 一、 m k 8 0 1 ( + ) m k 8 0 1h y d r o g e nm a l e a t e ：， m m t s m e t h y l m e t h a n e t h i o s u l f o n a t e f ) - m e1 3 - m e r c a p t o e t h a n o l n b t n e m n e t h y l m a l e i m i d e n m d a n - m e t h y l - d - a s p a r t i ca c i d n n o sn e u r o n a ln i t r i co x i d es y n t h a s e n o p b s p c r s d s n i t r i co x i d e p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n s o d i u md o d c c y ls u l f a t e s n a p s - n i t r o s o o n - a c e t y l - d l - p e n i c i l l a m i n e w bw e s t e r nb l o t 2 免疫印迹 免疫沉淀 海人藻酸 海人藻酸受体 5 甲基二氢丙环庚烯 亚胺马来酸 甲基甲硫甲基亚砜 p - 巯基乙醇 氮兰四唑 乙基顺丁烯二酰亚胺 n 一甲基一d 天冬氨酸 神经性一氧化氮合酶 一氧化氮 磷酸盐缓冲液 聚合酶链反应 十二烷基硫酸钠 亚硝基氮乙酰青霉胺 免疫印迹 盼奄p 、 徐州医学院硕士学位论文 a t p a 引起的g lu r 5 - k a r 巯基亚硝基化机制和作用的研究 中文摘要 目的g l u r 5 k a r 在多种神经性疾病( 比如中风、多发性硬化以及多种神经 退行性疾病) 中发挥着重要作用。巯基亚硝基化类似于磷酸化和酰基化，在生物 系统中，包括神经递质的释放、神经毒性和细胞凋亡方面，具有广泛的作用。但 是，对于g l u r 5 k a r 的巯基巯基亚硝基化尚未见报道。本文旨在研究g i u r 5 激动 剂a t p p a 引起其巯基巯基亚硝基化的机制和作用。 方法转染g l u r 5 2 a 或其突变体的h e k 2 9 3 细胞被用来检测g i u r 5 。k a 巯基亚 硝基化和鉴定其承担巯基亚硝基化的关键半胱氨酸。q u i k c h a n g ek i t 被用来制备 g i u r 5 2 a 的突变体。混合培养的原代海马神经元被用来揭示g l u r 5 k a 巯基亚硝 基化的主要机制，电生理记录被用来记录g i u r 5 介导的全细胞电流记录。d a p i 染色被用来显示带有聚集浓缩或者碎片细胞核的凋亡细胞。 结果1 、h e k 2 9 3 细胞表达的重组体g i u r 5 2 a 能被亚硝化，c 2 3 1 和c 8 0 4 承 担关键作用。 2 、转染了g i u r 5 、p s d 9 5 和n n o s 或者g l u r 5 和n n o s 的h e k 2 9 3 细胞免疫沉 淀证明g i u r 5 可通过p s d 9 5 介导组装成信号模块g i u r 5 p s d 9 5 n n o s 。 3 、a t p a 刺激可以诱导原代培养的海马神经元中g i u r 5 k a 的巯基亚硝基化，但 其程度要远低于n m d a 刺激引起的g i u r 5 巯基亚硝基化。 4 、a t p a 刺激引起原代培养的海马神经元中g i u r 5 k a 巯基亚硝基化主要是通过 g i u r 5 - k a - g q p l c - i p 3 r 信号通路和n n o s 激活介导的。 5 、g l u r 5 k a 巯基亚硝基化抑制了a t p a 刺激诱导的g i u r 5 k a r 介导的全细胞电 流 6 、n n o s 抑制剂7 n i 、p l c 抑制剂u 7 3 1 2 2 、i p 3 r 抑制剂2 - a p b 和胞内c a 2 + 螯 合剂b a p t a 对a t p a 刺激诱导的原代海马神经元的凋亡具有明显的保护作用。 3 - 徐州医学院硕士学位论文 结论a t p a 刺激诱导的g l u r 5 一k a r 导的全细胞电流的衰减。a 巯基亚硝基化 激活了非经典的g l u r 5 一k a g q p l c i p 。r 信号通路，导致胞内钙库内质网中大量c a 2 + 释放到胞浆中，大量的c a 2 + 进一步导致了n n o s 的激活，最终使得g l u r 5 发生巯基 亚硝基化，抑制了a t p a 刺激诱导的g i u r 5 k a r 介导的全细胞电流的衰减，诱导 了混合培养的原代海马神经元的凋亡。抑制g l u r 5 k a r 巯基亚硝基化的药物7 n i 、 u - 7 3 1 2 2 、2 - a p b 和b a p t a 对此具有明显保护作用。 关键词a t p ag l u r 5巯基亚硝基化 g 1 u r 5 一k a r g q p l c i p 。r 信号 通路神经元性一氧化氮合酶 4 徐州医学院硕士学位论文 a t p as t i m u l a t i o ni n d u c e dg i u r 5 - k a s - n i t r o s y l a t i o nv i a g l u r 5 - k a r - - g q - p l c - i p 3 rp a t h w a ya n dt h ea c t i v a t i o no f n n o s a b s t r a c t o b i e c t i v e g i u r 5 - c o n t a i n i n g k m n a t e r e c e p t o r s c o n t r i b u t e s g r e a t l y t ot h e p a t h o p h y s i o l o g yo fn e r v o u ss y s t e md i s e a s e s ，s u c ha ss t r o k e ，m u l t i p l es c l e r o s i sa n dm a n y n e u r o d e g e n e r a t i v ed i s e a s e s s - n i t r o s y l a t i o n , a n a l o g o u st op h o s p h o r y l a t i o na c e t y l a t i o n , e x e r t sav a r i e t yo fe f f e c t si nb i o l o g i c a ls y s t e m s ，i n c l u d i n gn e u r o t r a n s m i t t e rr e l e a s e , n e u r o t o x i c i t ya n da p o p t o s i s h o w e v e r , t h em e c h a n i s mo fg l u r 5s n i t r o s y l a t i o ni sp o o r l y u n d e r s t o o d m e t h o d sh e k 2 9 3t r a n s f e c t e dw i t hg l u r 5 - 2 ao ri t sm u t a n tw a su s e dt od e t e c t g l u r 5 s - n i t r o s y l a t i o na n di d e n t i f yi t sn i t r o s y l a t i o ns i t e s q u i k c h a n g ek i tw a su s e dt o p r 印a r es i t e - d i r e c t e dm u t a g e n e s i so fg l u r 5 t h em i x e dc u l t u r e dp r i m a r yp o c a m p a l n e u r o n sw a su e s dt or e v e a lt h em e c h a n i s m sf o rg i u r 5s n i t r o s y l a t i o n n e e l e c t r o p h y s i o l o g i c a lr e c o r d i n g s w e r ep e r f o r m e di nt h ec o n v e n t i o n a lw h o l e - c e l l p a t c h - r e c o r d i n g n e4 ，6 一d i a m i d i n o 一2 - p h e n y l i n d o l ed i h y d r o c h l o r i d e ( d a p i ) s t a i n i n g w a su e s dt ov i s u a l i z ea p o p t o t i cc e l l sw i t hc o n d e n s e do rf r a g m e n t e dn u c l e i 1 、r e s u l t sr e c o m b i n a n tg i u r 5 2 ae x p r e s s e db yh e k 2 9 3c o u l db es - n i t r o s y l a t e d a n di t sc r i t i c a lc y s t e i n ef o rs - n i t r o s y l a t i o nl i e di nc 2 31a n dc 8 0 4 2 、i m l t l u n ep r e c i p i t a t i o nw i t hh e k 2 9 3t r a n s a c t e dw i t hg l u r 5 2 aa n dn n o so r g l u r 5 2 a , p s d - 9 5a n dn n o si n d i c a t e dt h a tg l u r 5 2 ac o u l di n t e r a e tw i t hn n o sv i a p s d 一9 5 ，a n da s s e m b l et h es i g n a l l i n gm o d u l eg l u r 5 p s d - 9 5 n n o s 3 、a t p as t i m u l a t i o nc o u l di n d u c eg l u r 5 一k ae x p r e s s e db yh i p p o c a m p a ln e u l o n s s - n i t r o s y l a t i o n , b u tt h ed e g r e eo fw h i c hi sm u c hl o w e rt h a nn m d as t i m u l a t i o n c o u l di n d u c eg i u r 5 k as - n i t r o s y l a t i o n 4 、g l u r 5 - k as - n i t r o s y l a t i o ni n d u c e db ya t p as t i m u l a t i o nw a sm a i n l yc a r r i e do u tv i a g i u r 5 - l ( a - g q - p l c - i p 3 rp a t h w a ya n dt h ea c t i v a t i o no fn n o s 5 、g l u r 5 - k a s - n i t r o s y l a t i o n i n h i b i t e dg l u r 5 - m e d i a t e dw h o l ee e l l c u r r e n t s 5 徐州医学院硕士学位论文 a t t e n u a t i o n 7 n i 、u 7 312 2 、2 - a p ba n db a p t ah a das i g n i f i c a n tp r o t e c t i v ee f f e c to nt h e a p o p t o s i s c o n c l u s i o ng i u r 5 - k as - n i t r o s y l a t i o ni n d u c e db y 删s t i m u l a t i o na c t i v a t e st h e n o n c l a s s i c a lg l u r 5 - l 5 2 1 0 0 s s ) 1 8 c y c l e 6 8c8 m i n x “l ( 12 5n g ) o fo l i g o n u c l e o t i d ep r i m e r 撑l xp l ( 12 5n g ) o fo l i g o n u c l e o t i d ep r i m e r 铊 o i l “lo f 帅m i x d d h 2 0t oaf i n a lv o l u m eo f5 0p i t h e na d d lp io fp f u t u r b od n a p o l y m e r a s e ( 2 5u 1 ) 加1s t l d p n l 限制性修饰酶消化5 0 1 - l l 突变产物，然后2 - 5 1 x i 转化到超级感受态，涂 板，挑取单克隆测序。 2 3d a p i 染色检测细胞凋亡 培养的原代海马神经元培养满1 4 天后，进行试验，各种抑制剂提前加入半小 1 4 徐州医学院硕士学位论文 时后加入a t p 孵育六小时，然后进行d a p i 染色。生长于培养板的细胞，3 7 e c 的 p b s 溶液轻洗两遍，用4 多聚甲醛固定5 分钟，3 7 0 c 的p b s 溶液再轻洗2 次， 加入1 0p 咖ld a p i ( 4 ，6 - - d i a m i d i n o 一2 - p h e n y l i n d o l e ，4 , 6 - 二氨基一2 一苯基吲哚， 荧光性的d n a 结合染料，用含0 2 t r i t o n x 1 0 0 的p b s 溶解) ，3 7 0 c 孵育3 0 分 钟。在o l y m p u s v a n o x 显微镜上，以4 0 0 n m 入射光激发，4 5 5 n m 接受观察。实验 结果的判定方法为：染色较亮，呈蓝绿色，染色质浓缩，甚至碎裂的细胞为凋亡 样细胞；凋亡率的计算方法：随机选取的l o 个4 0 0 倍视野下，计数凋亡细胞和总 细胞数，两者相比得到神经细胞凋亡率。 2 4 蛋白质巯基亚硝基化测定 采用j a f f r e y 和s n y d e r 报道的生物素转换法( b i o t i n - s w i e hm e t h o d ) 4 】，在实验 过程中要避光。 2 4 1 用h e n 液( 2 5 0m mh e p e s - n a o h ，p h7 7 ，lm me d t a ，o 1m mn e o c u p r o i n e ) 匀浆，1 0 0 0 94 。c 离心1 0m i n ，取上清；测蛋白，计算蛋白浓度，转变为统一浓度 o 8 m g m l ，每次取0 8 m g 分装蛋白，用h e n 液补充至l m l t 2 4 2 向分装的蛋白中加1 0 c h a p s 到终浓度为o 4 ，再加4 倍体积b l o c k i n g b u f f e r ( 9 体积h e n 液和l 体积2 5 s d s 的混合液将m m t s 稀释1 0 倍) ，置于5 0 0 c 2 0 m i n ，不断摇匀； 2 3 3 加2 倍体积冰丙酮放入一2 0 。c ，2 0 3 0 m i n 后2 0 0 0 9 ，4 c 离心1 0m i n ，弃上 清； 2 4 4 加h e n s 液( 2 5 0m mh e p e s ，p h7 7 ，1m me d t a ，0 1m mn e o e u p r o i n e ，1 s d s ) 0 i m l m g 重悬，转入e p 管中，加b i o t i n - h p t p ( 4 m m ) ，即l a b e l i n gs o l u t i o n , 体积 为重悬液的l 3 ，再加a s c o r b a t es o l u t i o n ( 终浓度为l m m ) ，2 5 0 c 水浴2 h ： 2 4 5 加2 倍体积的冰丙酮放入一2 0 0 c ，2 0 m i n 左右，2 0 0 0 94 0 c 离心1 0m i n ，弃上 清； 2 4 6 加h e n s 液8 0u l 重悬，加2 倍体积的中和液( 2 0 m mh e p e s - n a o h ，p h7 7 ， 1 0 0 m mn a c l ，l m me d t a ，0 5 t r i t o n x - 1 0 0 ) ，再加1 5 u l ，s t e p t a v i d i n - a g a r o s e ，冷库 1 5 徐州医学院硕士学位论文 旋转混匀过夜； 2 4 7 用含6 0 0 r a mn a c i 的中和液，每管加6 0 0u l ，5 0 0 9 x l m i n ，室温离心洗涤5 次； 2 4 8 用洗脱液( 2 0m mh e p e s - n a o h ，p h7 7 ，1 0 0m mn a c i ，1m me d t a ，和 1 0 0m m 2 - 巯基乙醇) 加4 x s a m p l eb u f f e r , 鞭g 匀煮沸5 m 氓冷却待用。用免疫印迹法 检测蛋白巯基巯基亚硝基化情况。 2 5 蛋白浓度测定 收集的细胞样品，以牛血清白蛋白为标准品，按l o w r y 法【1 5 测定蛋白浓度。 2 6 免疫印迹 蛋白样品及经生物素转换法处理的样品，s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( p o l y a e r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ：p a g e ) 分离后，以半干转法电转移至n c 膜 上。将n c 膜置3 b s a 封闭液中室温孵育4 h 后，加入一抗工作液，4 0 c 孵育4 h 或过夜，t b s t 洗膜( 5m i n 3 ) 后，加入a p 标记的二抗的工作液，室温孵育2 小时，t b s t 洗膜( 3m i n 5 ) ，水洗。使用n b t b c i p 试剂盒，在新鲜配制的a p 显色液中显色，流水洗涤终止反应。 2 7 膜片钳电生理技术 膜片钳电生理技术测k a 受体离子通道电流，p a d t r a c k g f p o l u r 6 单独或与 p a dt r a c e - r f p n n o s 共转染h e k 2 9 3 细胞，转染后2 4 4 8 小时进行电生理记录， 在电压钳制的条件下，采用传统的全细胞膜片钳记录模式经行电流的记录，玻璃 微电极由外径为1 5 毫米内径为l m m 的玻璃毛胚经垂直电极拉制仪 ( p p 8 3 0 ；n a d s h i g e ) 两步拉制而成，电极内充灌电极内液( 1 4 0 r a mc s c i ，1 0 m m t e a ，10m m h e 1 ) e s ，5m m e g t a , 1m m m g c l 2 ，p h7 2 ，2 8 0 - 3 0 0 m o s mp e rl i t e r ) ， 电极电阻在3 - 5 兆欧之间，细胞外液为( 1 5 0m mn a c i ，5m mk c i ，1m mm g c l 2 ，2 m m c a c l 2 ，1 0m mg l u c o s e , a n d1 0m mh c p o s ( p h7 4 ，31 0 3 2 0m o s mp e rl i t e r ) 。膜电 流用膜片钳放大器a x o n p a t c h7 0 0 b ( a x o ni n s t r u m e n t s ，f o s t o r c i t y ，c a ) 记录，用 d i g i d a t a1 3 2 2 a 和p c l a m p9 0 系统软件采集和分析膜电流，串联电阻自动补偿，在 整个实验中膜电压钳制在6 0 m y , 在室温2 2 2 5 0 c 下进行 1 6 徐州医学院硕士学位论文 2 8 数据处理 用于分析统计的软件有p c l a m p9 2 ，s i g m as t a t 3 5 统计学处理实验数据以均 数4 - 标准差( m e a n - 4 - s d ) 表示。统计分析采用单因素方差分析( a n o v a ) ，多个 实验组与一个对照组比较采用最小显著差法( l s d ) ，实验组之间比较采用q 检验 ( n e w m a n - k e u l st e s t ) ，p 0 0 5 为统计学有显著性差异。 1 7 徐州医学院硕士学位论文 结果 1h e k 2 9 3 细胞表达的重组体g l u r 5 2 a 巯基能被亚硝化，c 2 3 1 和c 8 0 4 承担关 键作用。 首先，通过抗g l u r 抗体直接免疫印迹，确认h e k 2 9 3 细胞系不能表达g l u r 5 蛋白( f i g i a ) 。为了研究g i u r 5 能否亚硝化及使其巯基亚硝基化的合适g s n o 浓度 和孵育时间，我们用生物素转化法做了g i u r 5 的浓度曲线和时程( f i g b ，c ) 。结果 显示，g l u r 5 巯基亚硝基化程度随g s n o 浓度上升而升高，而用5 0 0 p m g s n o 刺激后 g l u r 5 巯基亚硝基化在2 h 达到最高。结果提示，可选择5 0 0 p m 、孵育2 h 作为g i u r 5 巯基亚硝基化最佳条件。 为了进一步确认g l u r 5 巯基能被亚硝基化，用旧g s n o 替代新鲜g s n o ，或者不 添加m m t s 或b i o 廿n - h p d p ，或者加n e m0 5 h 后加g s n o 孵育2 h 或加g s n o 孵育2 h 后用d t t 处理o 5 h ，再检测g l u r 5 巯基亚硝基化程度。结果显示，1 日g s n o 使g l u r 5 巯基亚硝基化程度大幅下降，不加m m t sg l u r 5 巯基亚硝基化程度明显加深，不加 b i o u n h p d p 则检测不到g l u r 5 巯基亚硝基化，n e m 和d ，i 1 则阻止了g l u r 5 巯基亚硝 基化。结果提示，g l u r 5 巯基亚硝基化检测结果是可靠的。 为了研究内源性n o 对g l u r 5 巯基亚硝基化的影响，选用了n n o s 抑制剂7 n i 、 g l u r 5 特异激动剂a t p a ( 1 0 p m ) 和钙载体a 2 3 1 8 7 作用于共转了 t r a c k - c m v - g f p g l u r 5 - 2 a 和t r a c k c m v r f p g l u r 5 一n n o s 的h e k 2 9 3 细胞结果显 示，单独加a t p a ( 1 0 p m ) 和钙载体a 2 3 1 8 7 ，g l u r 5 巯基亚硝基化程度很高，而分别 与7 n i 共同作用后g i u r 5 巯基亚硝基化程度明显减弱。 为了鉴定g l u r 5 承担巯基亚硝基化的关键半胱氨酸，选择性的突变了c 2 3 1 、 c 8 0 4 以及两者的双突变，再检测其巯基亚硝基化能力。结果显示( f i g l i ) ，g i u r 5 突变体c 2 3 1 、c 8 0 4 的巯基亚硝基化程度明显下降，两者的双突变更甚。结果提示， c 2 3 1 、c 8 0 4 可能是g l u r 5 承担巯基亚硝基化的关键半胱氨酸。 1 8 徐州医学院硕士学位论文 2g l u r 5 可通过p s d 9 5 介导组装成信号模块g i u r 5 p s d 9 5 n n o s 为了研究g l u r 5 、p s d - 9 5 和n n o s 的相互作用，我们做了免疫沉淀实验。如f i 9 2 a 所示，共转了g l u r 5 2 a 和n n o s 免疫沉淀显示，g i u r 5 2 a 和n n o s 不能直接相互 作用，而( f i 9 2 b ) 共转了g i u r 5 2 a 、p s d 9 5 和n n o s 免疫沉淀显示，三者共转 两两都能结合。结果提示，g i u r 5 可通过p s d 9 5 的p d z 2 结构域介导和n n o s 相 互作用，组装成信号模块g l u r 5 p s d 9 5 n n o s 。 3a t p a 刺激可以诱导原代培养的海马神经元中g l u r 5 k a 的巯基亚硝基化，但 其程度要远低于n m d a 刺激引起的g l u r 5 巯基亚硝基化 为了探讨a t p a 刺激能否诱导海马神经元中g l u r s - k a 的巯基亚硝基化，我们 用1 0 p m 的a t p a 孵育不同时间段。如f i 9 3 a 所示，a t p a 刺激诱导的海马神经元中 g 1 u r 5 一k a 的巯基亚硝基化时程依然是在2 h 的时候g l u r 5 巯基亚硝基化程度最高。 下面的样品制备都是1 0 p m 的a t p a 孵育2 h 。 接着，为了进一步比较内源性n o 和外源性n o 对g l u r 5 - k a 巯基亚硝基化的影 响，a t p a 和g s n o 被分别用来刺激神经元。f i 9 3 b 表明，加了n m e0 5 h 以后再用 a t p a 和g s n o 刺激，g l u r 5 一k a 巯基亚硝基化很微弱，单独用a t p a 和g s n o 分别刺 激神经元，后者引起g l u r 5 一k a 巯基亚硝基化要高于前者。结果提示，外源性n o 刺激可能更强烈更容易引其巯基亚硝基化。 另外，为了比较n m d a 和a t p a 刺激后g i u r 5 - k a 巯基亚硝基化程度，二者被单 独或者联合作用于海马神经元。统计结果表明，n m d a 刺激引起的g l u r 5 - k a 巯基亚 硝基化程度要远高于a t p a ( f i 9 3 c ) ，而提前半小时加入的n m d a r 抑制剂m k 8 0 1 和n n o s 的抑制剂7 n i 则明显抑制了g i u r 5 一k a 巯基亚硝基化( f i 9 3 d ) 。结果提示， n m d a r 是比g 1 u r 5 一k a 对c a 2 + 通透性更高。 4a t p a 刺激引起原代培养的海马神经元中g i u r 5 k a 巯基亚硝基化主要是通过 g i u r s - k a - g q - p l c i p 3 r 信号通路和n n o s 的激活介导的 为了研究a t p a 刺激引起原代培养的海马神经元中g l u r 5 - k a 巯基亚硝基化的 主要机制，设计了一系列实验，所有抑制剂均提前0 5 h 加入。 1 9 徐州医学院硕士学位论文 首先，为了研究n n o s 和g i u r 5 一k a 自身离子通道对a t p a 刺激引起g l u r 5 - k a 巯基亚硝基化的影响，n n o s 的抑制剂7 n i 和g l u r 5 的抑制剂n s 3 7 6 3 被作用于a t p a 刺激的原代培养的海马神经元。统计结果表明( f i 9 4 h ) ，7 n i 明显抑制了a t p a 刺 激引起的g i u r 5 - k a 巯基亚硝基化，n s 3 7 6 3 则不是很显著但有统计学差异。结果提 示，n n o s 是影响a t p a 刺激引起的g 1 u r 5 一k a 巯基亚硝基化的关键因素，而a t p a 可 能引起g i u r 5 一k a 通过通过信号模块g i u r 5 p s d 一9 5 n n o s 引起自身一定程度亚硝 基化。 接着为了研究g i u r 5 - k a 代谢型信号通路中p k c 和i p 3 r 对a t p a 刺激引起 g i u r 5 一k a 巯基亚硝基化的影响，p l c 的抑制剂u 一7 3 1 2 2 和i p 3 r 的抑制剂2 - a p b 被 作用于a t p a 刺激的原代培养的海马神经元。统计结果表明( f i 9 4 b ) ，u - 7 3 1 2 2 和 2 - a p b 明显抑制了a t p a 刺激引起的g 1 u r 5 一k a 巯基亚硝基化，但彼此之间没有统计 学差异。结果提示，u - 7 3 1 2 2 和2 - a p b 是影响a t p a 刺激引起的g 1 u r 5 一k a 巯基亚硝 基化的关键因素，而这两者影响力可能相近。 然后为了研究l 型钙通道和内质网受体r y r 对a t p a 刺激引起g i u r 5 一k a 巯基 亚硝基化的影响，l 型钙通道的抑制剂尼夫地平和r y r 的抑制剂t e t r a c a i n e h y d r o c h l o r i d e 被作用于a t p a 刺激的原代培养的海马神经元。统计结果表明 ( f i 9 4 c ) ，n i f e d i p i n e 轻微降低了a t p a 刺激引起的g i u r 5 一k a 巯基亚硝基化，而 t e t r a c a i n eh y d r o c h l o r i d e 则没有统计学差异。结果提示，l 型钙通道对a t p a 刺 激引起的g i u r 5 巯基亚硝基化影响较弱，但有统计学差异而r y r 则没有影响。 另外，为了研究胞内钙离子浓度对a t p a 刺激引起g 1 u r 5 一k a 巯基亚硝基化的 影响，c a 2 + - a t p a s e 抑制剂t h a p s i g a r g i n 和胞内c a 2 + 螯合剂b a p t a 被作用于a t p a 刺激的原代培养的海马神经元。f i 9 4 d 统计结果表明，t h a p s i g a r g i n 加重了a t p a 刺激引起的g l u r s - k a 巯基亚硝基化，而f i 9 4 e 则表明b a p t a 则基本清除了a t p a 刺激引起的g i u r 5 - k a 巯基亚硝基化。结果提示，胞内c a 2 + 浓度对a t p a 刺激引起 的g i u r 5 - k a 巯基亚硝基化起着至关重要作用。 综上所述，a t p a 刺激引起g i u r 5 - k a 巯基亚硝基化主要通过 徐州医学院硕士学位论文 g l u r 5 一k a _ g q p l c i p 3 r 信号通路和n n o s 的激活来介导，而二者又通过胞内钙库的 钙释放联系起来。 5g l u r 5 巯基亚硝基化抑制了a t p a 刺激诱导的g l u r 5 介导的全细胞电流的衰 减 为了研究g i u r 5 巯基亚硝基化对其离子通道功能的影响，膜片钳实验被用来 检测a t p a 刺激引起的g l u r 5 调节的全细胞电流。f i 9 5 a ，c 表明，外源性n o 供体 g s n o ( 5 0 0 p m ) 刺激1 5 m i n 后，无论是转染了t r a c k c m v g i u r 5 2 a g f p 的h e k 2 9 3 细胞还是混合培养的海马神经元中，a t p a 刺激诱导的g l u r 5 调节的全细胞电流相 对于c o n t r o l 组衰减明显被降低，而n e m 封闭巯基5 m i n 后则阻断了这种作用。f i 9 5 b 则表明钙载体a 2 3 1 8 7 刺激l o m i n 以后，共转染了t r a c k c m v g l u r 5 2 a - g f p 和 t r a c k c m v n n o s r f p 的h e k 2 9 3 细胞中，a t p a 刺激引起的g l u r 5 调节的全细胞电 流相对于c o n t r o l 组衰减明显被降低。结果提示，g l u r 5 巯基亚硝基化抑制了a t p a 刺激诱导的g i u r 5 调节的全细胞电流的衰减。 6 不同药物对a t p a 刺激诱导的海马神经元凋亡的影响 为了研究a t p a 刺激不同时间诱导的海马神经元凋亡率，d a p i 染色被用来检 测海马神经元的存活情况。f i 9 6 a 表明，a t p a 刺激6 h 时，凋亡率已经达到7 9 3 。 结果提示，a t p a 刺激6 h 是研究不同药物对a t p a 诱导的海马神经元凋亡的影响的 合适时间点。 为了探讨不同抑制剂对a t p a 诱导的海马神经元凋亡是否有保护作用，d a p i 染色被用来检测海马神经元的存活情况。统计结果表明，a t p a 刺激诱导的海马神 经元凋亡可以被n n o s 抑制剂7 n i 、p l c 抑制剂u 一7 3 1 2 2 、i p 3 r 抑制剂2 - a p b 和胞 内c a 2 + 螯合剂b a p t a 明显抑制( f i 9 6 b d ，e ，f ，j ) ，另外几种工具药则没有显著作用 ( f i 9 6 b c ，g ，h ) ，而，c a 2 + - a t p a s e 抑制剂t h a p s i g a r g i n 则加重了细胞凋亡 ( f i 9 6 b i ) 。结果提示，对a t p a 刺激诱导的海马神经元凋亡的确是通过g q p l c - i p 3 信号通路和n n o s 的激活来作用的，并且与胞内c a 2 + 浓度密切相关。 2 l 徐州医学院硕士学位论文 讨论 在本研究中，我们首次阐明了a t p a 刺激引起的g l u r 5 - k a 巯基亚硝基化的主 要机制，并首次鉴定了g 1 u r 5 - 2 a 的巯基亚硝基化位点。在此基础上，我们研究了 g 1 u r 5 一k a 巯基亚硝基化对离子通道功能和细胞凋亡产生了深远影响。这些为研究 和治疗神经系统疾病开辟了一个全新的领域，提供了新的药物靶点。 我们先前研究已经证实【2 引，g i u r 6 一k a 能够巯基亚硝基化，并促进 g i u r 6 p s d 9 5 m l k 3 信号模块的组装，从而激活m l k 3 及其下游的信号通 路，n m d a 受体也类似【2 ”1 1 。这促使我们设想，k a 受体另一亚型g l u r 5 是否同样 能被巯基亚硝基化并在神经系统疾病中发挥重要作用。我们的研究结果证实了我 们的想法，不论是外源性n o ( f i g l b ，c ) 还是内源性n o ( f i g l g ) 都能使g l u r 5 一k a 巯基亚硝基化。为了鉴定g l u r s - k a 巯基亚硝基化位点，参阅了不少文献n 3 ，在 实验室相关研究的基础上，选择性的突变了c 2 3 0 和c 8 0 4 两个半胱氨酸以及它们 的双突变，生物素转化检测g i u r 5 - k a 巯基亚硝基化。结果表明：c 2 3 0 和c 8 0 4 突 变后它们巯基亚硝基化程度明显降低，两个位点一起突变以后g l u r 5 巯基亚硝基 化更加微弱( f i g li ，j ) 。这表明，c 2 3 0 和c 8 0 4 是承担g l u r 5 一k a 巯基亚硝基化的关 键半胱氨酸。这对于揭示g i u r 5 - k a 的分子特性和寻找新药物靶点有着重要作用。 g l u r 5 - k a 相当长的时间仅仅被视为受体门控型通道传递神经递质和c a 2 + 等 n 嘲，而我们的实验结果表明a t p a 刺激能够引起g i u r 5 巯基亚硝基化；另一方面， 脑缺血再灌注可能通过激活n m d a r p s d 9 5 n n o s 信号通路产生n o ，导致k a 受体亚基g l u r 6 巯基巯基亚硝基化汹1 ，我们检测g i u r 5 - k a 是否像n m d a 受体一 样，通过p s d 9 5 的p d z 2 结构域结合n n o s ，进而自己产生n o 。免疫沉淀显示 ( f i 9 2 ) ，信号模块g i u r 5 p s d 9 5 一n n o s 在表达g l u r 5 、p s d 9 5 和n n o s 的h e k 2 9 3 细胞中被组装，这表明a t p a 刺激以后，g i u r 5 激活g l u r 5 p s d 9 5 n n o s 信号模块 产生n o 并使其自身巯基亚硝基化，从这个意义上讲，n n o s 抑制剂7 n i 可抑制这 徐州医学院硕士学位论文 种作用。 有文献研究表明乜，k a 受体亚型g l u r 5 既是离子渗透性受体也是代谢型受 体，g l u r 5 调节的c a 2 + 增加很大程度上通过一个非经典的机制调节，这个机制通 过g q 蛋白、磷脂酶c 的激活，和通过肌醇三磷酸( i p 3 ) 受体的激活从胞内钙库 释放c a 2 + 来实现这彻底改变了对g i u r 5 的传统认识。我们把这种非经典机制介导 的信号通路称之为g i u r 5 k a g q p l c i p 3 r 通路，也就是说a t p a 的刺激既能引起 c a 2 + 内流，也能激活其下游信号通路。与此同时，有文献证实啊一一1 ，巯基亚硝基化 依赖于合适的n o 浓度，在没有外源性n o 供体，比如g s n o ，s n p 等，分解释放大量 的n o 的情况下，神经元中的n o 主要依赖激活的n n o s 催化l a r g 分解产生n o ，而 n n o s 是一种c a 2 +