（植物学专业论文）4个节旋藻样品遗传多样性及亲缘关系的研究.pdf

中文摘要 节旋藻属于蓝藻门( c y a n o p y t a ) 、颤藻科( o s c i l l a t o r i a c e a e ) 、节 旋藻属( a r t h r o s p i r a ) ，是一类光合自养的原核生物。在地球上，节 旋藻已有3 5 亿年的生存历史，因为体内含有极丰富的营养成分和生 理活性物质，故具有广阔的开发利用前景。当今国内外研究和商业化 开发使用最多的2 个种是钝项节旋藻( 彳p l a t e n s i s ) 和极大节旋藻( 彳 m a x i m a ) ，它们的原产地分别为非洲c h a d 湖和中美洲墨西哥t e x c o c o 湖，都属于喜高温的物种。 1 9 9 6 年，乔辰教授等在鄂尔多斯高原碱湖中发现了3 种节旋藻 和1 种螺旋藻，近些年对鄂尔多斯高原碱湖节旋藻的研究已有很多报 道，主要集中在对该地区节旋藻的发现、形态解剖结构及生理生化特 性等方面的研究。有关遗传多样性的研究较少，使用扩增片段长度多 态性( a f l p ) 分子标记技术分析节旋藻样品的遗传多样性及亲缘关 系的研究未见报道。 本文以鄂尔多斯高原碱湖的钝顶节旋藻( a 1 ) 和方胞节旋藻( a 4 ) 为材料，运用a f l p 技术和形态特征观察，分别从分子水平和形态学 水平研究其扩增片段长度的多态性和形态特征的差异，并与引进的非 洲c h a d 湖钝顶节旋藻( a 2 ) 和墨西哥t e x c o c o 湖的极大节旋藻( a 3 ) 作比较，探讨它们的遗传多样性和亲缘关系。目的是丰富和完善节旋 藻的基础研究内容，对鄂尔多斯高原碱湖节旋藻种质资源遗传多样性 的保护和利用具有重要意义。 a f l p 研究显示，筛选出的1 2 对引物扩增得到大小在2 5 1 0 0 0 b p 之间的4 8 7 条清晰条带，其中3 8 0 条( 7 8 2 3 ) 呈多态性，平均每对 引物得到3 2 7 5 条多态性带。4 个样品的特异性条带数多少为 a l a 2 a 3 ，鄂尔多斯高原碱湖a 。和的多态性均高于引进种a 2 和 a 3 ，表现出前者d n a 分子有较高的遗传多样性。4 个样品间的平均 遗传距离在0 3 8 8 7 0 9 6 7 9 间，其中a 2 与a 3 的遗传距离最小，a 3 与 的最大，其余样品介于它们之间，说明4 个样品存在一定的遗传 分化。从遗传距离和聚类分析表明，引进的钝项节旋藻a 2 和极大节 旋藻a 3 的亲缘关系最近，不同原产地的钝项节旋藻a i 与a 2 的亲缘 关系次之，鄂尔多斯高原碱湖的方胞节旋藻与其它3 个样品的亲 缘关系较远，其中与a 3 的亲缘关系最远。 形态学研究结果表明，经主成分分析，螺距、螺数、螺宽、体长 和细胞长度是区分4 个样品表型差异的主要性状；藻体颜色和细胞宽 度是区分的次要性猛；末端形态和沉浮类型对区分的作用不大。经判 别分析，4 个样品的判别准确率在9 0 0 0 旷1 0 0 o 之间，综合判别率 为9 7 o ；在判别函数的二维点图中，样品间的判别中心相距较远， 其分布形成明显的类群，表明4 个样品的形态差异较明显，存在一定 的遗传分化。4 二个样品的欧氏距离在2 9 3 5 5 2 7 5 之间，其中a l 与 a 2 间的欧氏距离最小为2 9 3 5 ，表明它们的形态特征较为接近。与 其它3 个样品的欧式距离都较大，其中与a 3 之间的最大为5 2 7 5 ，与 a l 之间最小为4 7 1 4 ；聚类结果表明2 个不同原产地的钝项节旋藻a l 与a 2 亲缘关系最近，方胞节旋藻与其它3 个样品有较远的亲缘关 系，其中与a ，的亲缘关系最远，结果与传统分类学结果一致，但与 a f l p 分析结果有区别。产生这种相悖的原因，推测是由于各自的生 态环境明显不同和长期地理隔离促使两者在遗传上发生了一定的分 化，且这种分化主要表现在形态学以外的遗传指标上，而有关形态学 的遗传指纹相对较稳定，变异较小。 关键词：节旋藻，a f l p ，形态特征，遗传多样性，亲缘关系 a b s t r a c t a r t h r o s p i r ai s ag r o u po fp h o t o s y n t h e t i ca u t o t r o p h i cp r o k a r y o t e ， w h i c hh a se x i s t e do nt h ee a r t hf o r35h u n d r e dm i l l i o ny e a r s i tc o n t a i n s a b u n d a n tn u t r i t i o n a l i n g r e d i e n t s a n d p h y s i o l o g i c a l a c t i v em a t e r i a l s ； t h e r e f o r ei th a sab r i g h tp r o s p e c tf o re x p l o i t a t i o n a p l a t e n s i s ( a z ) i n c h a dl a k ei na f r i c aa n da m a x i m a ( a 3 ) i nt e x c o c ol a k ei nm e x i c oa r e m a i n l yi ni n v e s t i g a t i o n a n dc o m m e r c i a l i z a t i o na tp r e s e n t t h e s et w o a r t h r o s p i r a sg r o w w e l li nh i g ht e m p e r a t u r e i n19 9 6t h r e es p e c i e so fa r t h r o s p i r aa n das p e c i e so fs p i r u l i n aw e r e f o u n di nt h ea l k a l i n el a k eo fe r d o sp l a t e a ub yp r o f q i a oc h e ne ta 1 i n r e c e n ty e a r sm a n ys t u d i e sa b o u tal ，w h i c hi sm a i n l ya b o u tm o r p h o l o g y a n a t o m i cs t r u c t u r ea n dp h y s i o l o g i c a lb i o c h e m i c a lc h a r a c t e r , h a sb e e n r e p o r t e d b u tt h e r ei sl i t t l er e p o r ta b o u tg e n e t i cd i v e r s i t y a f l pa n a l y s e s a b o u tg e n e t i cd i v e r s i t ya n dr e l a t i o n s h i po f4s a m p l e so fa r t h r o s p i r ah a v e n o tb e e nf o u n di np a p e r s i nt h i s p a p e r , t e c h n i q u e o fa f l pm o l e c u l a rm a r k e ra n dt h e o b s e r v a t i o no fm o r p h o l o g i cc h a r a c t e r i s t i c s w e r eu s e dt or e v e a lt h e d i f f e r e n c e sa n dr e s p e c t i v ec h a r a c t e r i s t i c so fa l ，a 2 ，a 3a n da 4 ，u s i n gb o t h m o l e c u l a ra n dm o r p h o l o g i c a ll e v e l st op r o b et h e i rg e n e t i cd i v e r s i t i e s ， e v o l u t i o n a r ys t a t u sa n dr e l a t i o n s h i p s t i l ea u t h o rw a n t st oe n r i c ha n d c o n s u m m a t et h eb a s i ci n v e s t i g a t i o no f a r t h r o s p i r aw h i c hi sm e a n i n g f u lt o p r o t e c t a n du t i l i z et h eg e n e t i c d i v e r s i t y o fa r t h r o s p i r ag e r m p l a s m r e s o u r c ei ne r d o sp l a t e a u t h ea f l pr e s u l t ss h o w e dt h a tt w e l v ep a i r so fs e l e c t e da f l pp r i m e r w e r eu s e dt oa m p l i f yt h eg e n o m ed n ao f4s a m p l e so f a r t h r o s p i r a ，a n d 4 8 7c l e a rb a n d i n g sw h o s es i z e sa r eb e t w e e n2 5a n d10 0 0 b pc a nb eg a i n e d 3 8 0b a n d so ft h e ma r ep o l y m o r p h i s m ，a n de a c hp r i m e rc a no b t a i n3 2 7 5 p o l y m o r p h i cb a n d i n g sa v e r a g e l y t h e t o t a ls u mo ft h es p e c i f i cb a n d si sa 4 a l a 2 a 3 ，w h i c hs h o w st h a tt h eg e n e t i cd i v e r s i t yo fl o c a ls a m p l e s a la n da 4i nt h ea l k a l i n el a k eo fe r d o sp l a t e a ui ss u p e rt oe x o t i co n e sa 2 a n da 3 t h ea v e r a g eg e n e t i cd i s t a n c eo f4s a m p l e si sb e t w e e no 3 8 8 7a n d o 9 6 7 9 ，a m o n gw h i c ht h es h o r t e s tg e n e t i cd i s t a n c e i sb e t w e e ns a m p l ea 2 a n da 3a n dt h el o n g e s tg e n e t i cd i s t a n c ei sb e t w e e ns a m p l ea 3a n d i t m e a n st h a tt h e r ew e r es o m eg e n e t i cd i f f e r e n c e sa m o n gs a m p l e s l n e 一一一r n c l u s t e ra n a l y s i sb a s e do nu p m g aa n d _ t h ed a t ao fg e n e t i cd i s t a n c e i n d i c a t e st h a tt h ei n t r o d u c e ds a m p l e sa 2a n da 3h a v et h ec l o s e s tg e n e t i c r e l a t i o n s h i p ，a n dt h ea p l a t e n s i sa l a n da 2h a v ear e l a t i v e l yf a r t h e r g e n e t i cr e l a t i o n s h i p h 嬲a f a r t h e rg e n e t i c ，r e l a t i o n s h i p w i t ho t h e r s a m p l e s a n dt h eg e n e t i cr e l a t i o n s h i pb e t w e e na 4 沥da 3 i st h ef a r t h e s t t i l em o r p h o l o g i cr e s u l t ss h o w e dt h a tb yt h ep r i n c i p a lc o m p o n e n t a n a l y s i s d i s t a n c e sb e t w e e nt h es p i r a l s ，s p i r a l s c o i l ，s p i r a l sb r o a d ， 一- t r i c h o m el e n g t ha n dc e l l sl o n ga r et h em a i nt r a i t s ，w h i c hd i s t i n g u i s h4 s a m p l e so fa r t h r o s p i r a t r i c h o m ec o l o ra n d c e l l sb r o a da r et h es e c o n d a r y t r a i t s t h ee n do ft r i c h o m ea n dt y p e so fu p sa n dd o w n sh a v el i t t l ee f f e c t o nd i s c r i m i n a t i o n t h ed i s c r i m i n a t i v ea n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt h ea c c u r a t e r a t eo ft h ed i s c r i m i n a t i o ni sb e t w e e n9 0 o a n d 10 0 o ，a n dt h e i n t e g r a t i v e d i s c r i m i n a t i v er a t ei s9 7 o t h e2 d p l o t c e n t e r so f d i s c r i m i n a t i v ef u n c t i o n so ft h e4a r t h r o s p i r as a m p l e sa l er e m o t ef r o m e a c ho t h e r g e n e t i cv a r i a t i o nw a se x i s t e di nt h e s e4s a m p l e sw h i c hh a v e m o r p h o l o g i c a ld i f f e r e n c e t h ec l u s t e ra n a l y s i ss h o w e dt h a tt h er a n g eo f a v e r a g ee u c l i d e a nd i s t a n c ei n4s a m p l e si sb e t w e e n2 9 3 5a n d5 2 7 5 ；t h e t w oa p l a t e n s i sa la n da 2h a v et h es m a l l e s te u c l i d e a nd i s t a n c ea n d f i r s t l yp a i r e du p ，t h e nc l u s t e r e dw i t ha 3 ，f i n a l l yg r o u p e dw i t ha 4t o g e t h e r t h i sr e s u l ti sc o n g r u e n tw i t hm o r p h o l o g i cc l u s t e ra n a l y s i sb u td i s t i n c t i v e w i t ha f l p t h ea u t h o rp r e s u m e st h a tt h ed i f f e r e n te n v i r o n m e n t sa n d g e o g r a p h i c a li s o l a t i o n a l et h ep r i m a r yr e a s o n sf o rt h er e s u l t t h et w o s a m p l e sh a v eg e n e t i cd i f f e r e n t i a t i o n sw h i c hm a i n l ye x i s ti no t h e ri n d e x o u t s i d em o r p h o l o g y k e yw o r d s ：a r t h r o s p i r a ，a f l p , m o r p h o l o g i c a ld i f f e r e n t i a t i o n ，g e n e t i c d i v e r s i t y , g e n e t i cr e l a t i o n s h i p 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研 究工作及取得的研究成果，尽我所知，除了文中特别加以标注和 致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包含本人为获得内蒙古师范大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示感谢。 签名：筮盐日期： 20 0 8 年4 月15 日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解内蒙古师范大学有关保留、使用学 位论文的规定：内蒙古师范大学有权保留并向国家有关部门或机 构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子 文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：李赫 钠张孳撖氓 日期： 2 00 8 年4 月15 日 前言 前言 ( p r e f a c e p r e f a c e )刖吾() 节旋藻是一类光合自养的原核生物，属于蓝藻门( c y a n o p y t a ) 、颤藻科 ( o s c i l l a t o r i a c e a e ) 、节旋藻属( a r t h r o s p i r a ) 或螺旋藻属( s p i r u l i n a ) 【啦】。节旋藻是 最早进行光合作用的生物之一，广泛分布于土壤、沼泽、温泉、湖泊及海洋中i 引。在 大规模商业开发中所谓的“螺旋藻”实际上几乎都是节旋藻，但在产品和商业性用语上 仍习惯称作“螺旋藻嚏。大多数节旋藻喜高温( 2 8 3 5 ) 、高碱( p h8 5 1 0 5 ) 和高盐 环境，在一些不适合其它生物生存的极端环境，节旋藻都能良好生长 4 1 。节旋藻能利 用光能将c 0 2 转化为有机物，且光能转化率高达1 8 ，具有巨大的生产潜力【5 1 。其体 内含有极丰富的营养成分和生理活性物质，具有提高机体免疫功能、抗衰老等作用 6 1 。 近年来，节旋藻( 螺旋藻) 已成为许多国家开发利用的一种新型的微藻，被世界卫生 组织和联合国粮农组织称为“2 l 世纪人类最佳保健品和最理想的食品 【7 】，具有较好 的开发利用前景。 1 9 4 0 年法国药物学家c r e a c h 在c h a d 湖发现了钝顶节旋藻，此后有关节旋藻的 基础研究和应用逐渐引起各国科学家们的广泛关注，从分类、形态解剖、生理、生态、 营养成分、培养条件及分子生物学等方面展开了一系列的研究。1 8 9 2 年，g o m o n t 将 节旋藻独立成为一属【2 1 ；1 9 6 6 年，巴斯德研究所的c z a r r o u k 有关螺旋藻( 节旋藻) 培养研究的博士论文发表【8 】，节旋藻在实验室培养获得成功，为工厂化生产奠定了基 础，他提供的z 氏培养液配方至今仍在被广泛应用；1 9 7 0 年，o g a w a 等对螺旋藻( 节 旋藻) 的生长进行了研究【9 】；1 9 7 9 年，m e l a c k 等对其光合作用进行了研刭旧】；1 9 8 1 年，r i c c a r d i 等对编码钝顶螺旋藻( 节旋藻) 的1 ，5 二磷酸核酮糖羧化酶( r u b p c a s e ) 大、小亚基的基因成功分离，并在ec o b 中得以表达【1 ；2 0 0 1 年，茅云翔等人测定 了节旋藻属3 个品系和螺旋藻属1 个品系的1 6 sr r n a 基因及1 6 s 2 3 sr r n a 转录单 位内问隔区( i t s ) 序列，这些序列与g e n b a n k 中已收录的节旋藻和螺旋藻的相关序 列一起被用于系统学研刭1 2 】等等。随着基础研究的深入，节旋藻的应用领域也从营养 食品【1 引、医药保健品扩大到系列化妆品【15 1 、饲料与饵料添加剂【6 1 、精细化工产品 f 1 7 】、环境治理和新能源开发【i s j g 等方面，在世界范围内形成了相当规模的节旋藻产业。 到目前为止，国内、外己发现的节旋藻属和螺旋藻属至少有3 8 个种。它们大都 生长在淡水或盐碱湖中，仅有少数的几种生长在海洋中【2 0 】。当今国内外研究与商业化 丌发最多的2 个种是钝顶节旋藻( 彳p l a t e n s i s ) 和极大节旋藻( 月m a x i m a ) 1 2 1j ，它们 内蒙古师范大学硕士学位论文 的原产地分别为非洲c h a d 湖和中美洲墨西哥t e x c o c o 湖，均在北纬十几度，两 者都属于喜高温的物种。 1 9 9 6 年内蒙古农业大学的乔辰和李博生教授在鄂尔多斯高原毛乌素沙地碱湖发 现了3 种节旋藻和1 种螺旋藻种质资源，经南京大学曾昭琪教授鉴定，其中2 个新种 分别是鄂尔多斯节旋藻( 彳e r d o s e n s i s ) 和巴彦淖尔螺旋藻( & b a y a n n u r e n s i s ) ；2 个 新记录种分别是钝顶节旋藻( 彳p l a m n a i s ) 和方胞节旋藻( 彳j e n n e r i ) 田】。这不仅丰 富了我国节旋藻的种质资源，填补了我国和内蒙古节旋藻和螺旋藻种质资源的空白， 而且鄂尔多斯高原也是目前在世界上发现有能够作为产业化藻种钝顶节旋藻分 布的第二个地区。近几年对鄂尔多斯高原碱湖节旋藻的研究已有很多报道，主要集中 在对该地区节旋藻的发现、形态解剖结构及生理生化特性方面的研究。2 0 0 1 年，乔 辰等报道了鄂尔多斯沙区碱湖与螺旋藻资源【2 2 12 0 0 3 ，刘华等进行了鄂尔多斯高原碱 湖的螺旋藻与引进种光合生理和光合色素的比较研列2 3 2 4 1 ，2 0 0 2 年和2 0 0 5 年，栗淑 媛等研究了螺旋藻过氧化氢酶动力学【2 5 】和低温对脱氢酶活性和游离氨基酸外渗的影 响【2 6 】；2 0 0 6 年，田秀英等研究了钝项节旋藻的解剖结构【2 7 】等等。但是有关鄂尔多斯 高原碱湖节旋藻遗传多样性、进化地位和亲缘关系的研究报道较少，仅见2 0 0 6 年杨 茜等对4 个节旋藻样品5 种酶的同工酶和可溶性蛋白谱带数目分析【2 8 】及2 0 0 8 年邰丽 华等对不同生境下的钝顶节旋藻的r a p d 分析【2 9 1 。 遗传多样性是指生物体内决定性状的遗传因子及其组合的多样性，是物种多样性 和生态系统多样性的基石出【3 0 】。遗传多样性是物种繁衍生命、抵抗疾病和适应环境条件 变化的必然结果，是遗传信息在传递过程中受到内、外环境因素的影响，d n a 发生 突变，而产生不同程度的变异所致。遗传多样性可以从形态学水平、染色体水平、等 位酶水平和d n a 水平四个方面进行研究。近年来，随着生物技术发展，采用分子生 物学的方法在d n a 水平上研究生物多样性更为多见。目前已有十几种分子标记技术， 如随机扩增多念性d n a ( r a n d o m l ya m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ，r a p d ) 、微卫星 d n a ( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，s s r ) 、限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n t l e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 【3 i 】等应用于生物多样性和亲缘关系的研究。a f l p 是 1 9 9 3 年由荷兰科学家z a b e a u 等公布并迅速应用的新方法，是继r f l p 、r a p d 之后 近年束发展最快的d n a 分子标记技术。它综合了r f l p 和p c r 技术的优点，与其它 分子标记相比，检测到的位点数目多，重复性和稳定性好，适用于区分、研究样品间 的遗传多样性及亲缘关烈3 2 】。1 9 9 7 年，p a u l 等利用a f l p 技术检测了不同地理生念 前言 区的3 2 个茶树品种的遗传多样性f 3 3 】；1 9 9 8 年，d o n a l d s o nsl 进行了有关红藻遗传多 样性的a f l p 研究【3 4 1 ；2 0 0 5 年，王淑霞等用这一方法对灰背栎进行了遗传多样性研 究【3 5 1 。使用扩增片段长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，a f l p ) 方法分析节旋藻样品间的遗传多样性及亲缘关系的研究未见报道。 自然界存在许多极端环境，如高盐、高碱、高温、低温、干旱等，为一般生物生 存的极限环境，；但却能生长着适应这些极端环境的生物。极端环境生物作为地球上边 缘生命现象，对认识生命起源及进化意义重大。地球上的生物约有2 0 0 万种，但在陆 地地表和水体盐碱环境的生物仅有几千种。在盐碱湖中生长、繁衍的生物经长期自然 选择具备了稳定的特殊结构、相应的生理特性和遗传基因，来应答极端的环境因子。 本文运用a f l p 分子标记技术和形态观察方法，试图从d n a 水平和形态水平上对鄂 尔多斯高原碱湖节旋藻的遗传多样性进行研究，并与国外引进的c h a d 湖的钝顶节旋 藻和t c x c o c o 湖的极大节旋藻作比较，目的是丰富和完善节旋藻种质资源的基础研究 内容，探讨它们的遗传多样性、进化地位及亲缘关系，这对于鄂尔多斯高原碱湖节旋 藻种质资源遗传多样性的保护和利用具有重要意义。 3 内蒙古师范大学硕士学位论文 一材料与方法( m a t e r iais m e t h o d s ) 1 实验材料 实验材料见表1 1 和图1 - 1 。 表1 - 1 实验材料 t a b l el 一1m a t e r i a l su s e di nt h ee x p e r i m e n t s 注：下文样品代i 以此表为准。 图1 一l4 个1 ，旋藻样t u l 的光镜照片 f i g 1 1l i g h tm i c r o g r a p h so f4s a m p l e so f a r t h r o s p i r ai nt h ee x p e r i m e n t a 钝顶1 ，旋滦a p l a t e n s i s aa l ：b 钝顶n 旋藻a p l a t e n s i sa 2 ； c 极人1 ，旋藻a m a x i m aa 1 ：d 办胞1 7 旋藻a j e n n e r ia 4 ： 4 纛糕 扩 材料和方法 2 主要实验仪器和药品 2 1 主要仪器 主要仪器及产地见表1 - 2 。 表1 2 主要仪器及产地 t a b l e1 - 2t h em a i ne q u i p m e n ta n dt h ep r o d u c i n ga r e a 2 2 主要药品和试剂 t a qd n a 聚合酶来源于大连宝生物公司；p c rm i x 、限制性内切酶( e c o ri 和 m s ei ) 、连接酶( t 4l i g a s e ) 、r n a 酶( r n a s e ) 、引物、剥离硅烷、结合硅烷、分析 纯尿素、l k bp l u sd n al a d d e r 、无毒核酸染料和琼脂糖均来源于上海s a n g o n 公司； e d t a 、c t a b 、t r i s 、氯仿、异戊醇、硼酸等均为国产分析纯试剂。 2 3 主要试剂的配制 ( 1 ) 2 x c t a b 抽提液：2 ( w v ) c t a b ，1 4 m o l l 的n a c i ，1 0 0 m m o l l 的t r i s h c i 缓冲液( p h8 o ) 。 ( 2 ) 3 m o l l 的n a a c 溶液：6 0 0 m l 的玻璃双蒸水( d dh 2 0 ) 中加入4 0 8 2 4 9 的 n a a c 3 h 2 0 ，溶解后用冰醋酸调p h 至5 2 ，加水定容至l l ，后灭菌，室温保存。 ( 3 ) 1 0 0 x t e 溶液：8 0 m l 的d dh 2 0 中加入1 2 1 1 4 9 的t r i s 碱，3 7 2 9 的 e d t a n a 2 2 h 2 0 ，用h c i 调p h 至8 0 ，然后定容至1 0 0 m l ，后灭菌。 ( 4 ) 1 0 x t b e ：称取5 4 9 的t r i s 碱，2 7 5 9 的硼酸，加入2 0 m l 的e d t a ( o 5 m o l l ) ， 5 内蒙古师范大学硕士学位论文 定容至5 0 0 m l ，室温保存。 ( 5 ) 琼脂糖电泳凝胶的制备：称取o 7 9 或1 o g 琼脂糖与1 0 0 m l 的0 5 x t b e 混合， 在微波炉中加热至完全溶解，冷却至5 0 - - - 6 0 ，加入溴化乙啶( e b ) 至终浓度为 o 1 l x g m l ，混匀后将胶倒入凝胶模框中，胶凝固后即可使用。o 7 的琼脂糖凝胶电泳 用于基因组d n a 纯度检测，1 o 的琼脂糖凝胶电泳用于p c r 反应产物的检测。 ( 6 ) 4 0 聚丙烯酰胺凝胶电泳( p a g e ) 母液：称取5 7 9 的丙烯酰胺，3 9 的甲叉双 丙烯酰胺，定容2 5 0 m l ，4 。c 避光保存。 ( 7 ) 6 聚丙烯酰胺胶：取4 0 的p a g e 母液3 7 5 m l ，加入尿素1 0 5 9 和1 0 x t b e 1 2 5 m l ，定容至2 5 0 m l ，4 。c 避光保存。 ( 8 ) 2 0 过硫酸铵( a p s ) ：称取过硫酸铵o 6 9 ，用d d h 2 0 定容到3 m l ，4 。c 保存。 此液最多保存一周。 ( 9 ) 载样缓冲液( l o a d i n gb u f f e r ) ：取1 0 0 的甲酰胺4 9 m l ，加入l m l 的e d t a ( o 5 m o l l 、p h8 0 ) ，o 1 2 5 9 的溴酚蓝和0 1 2 5 9 的二甲苯氰，室温保存。 ( 1 0 ) 1 0 的冰醋酸固定液：取1 0 m l 冰醋酸，加入1 5 0 0 m l 的d dh 2 0 和2 0 0 m l 的无水乙醇，此液现配现用，不重复使用。 ( 1 1 ) 染色液：称取3 9 的a g n 0 3 ，加入3 7 的甲醛3 m l ，用d dh 2 0 定容至2 0 0 0 m l ： 此液在使用前1 0 r a i n 配制，避光保存。 ( 1 2 ) 显色液：称取3 0 9 的n a o h ，溶解于2 0 0 0 m l 的d dh 2 0 中，使用前5 r a i n 加 入3 7 甲醛4 m l 。使用前5 h 配制。 3 实验方法 3 1 藻的培养 将分离纯化的节旋藻样品用z a r r o u k 培养液1 8 】在室温、自然光照下通气培养，在 对数生长期取材。 3 2a f l p 研究 3 2 1d n a 的提取 参照邰丽华的方法提取了节旋藻细胞的基凶组d n a ，本文采用溶菌酶法。具 体过程如下： ( 1 ) 捞取对数生长期的鲜藻，用d dh 2 0 冲洗干净，吸去表面水分。每个节旋藻样 品各称取0 0 3 9 置于2 m l 离心管中，加入l t e 液4 0 0 9 l 和2 0 m g m l 的溶菌酶 6 材料和方法 0 5 9 l ，3 7 恒温水浴中保温1 h 。 ( 2 ) 每个离心管中加4 9 l 的蛋白酶k ( 2 0 m g m l ) 和1 0 1 工l 的1 0 s d s ，6 5 c 恒 温水浴中保温1 h 。 ( 3 ) 自然降温后，加入等体积的4 。c 预冷的t r i s 平衡酚，混匀抽提5 m i n ，4 c 下 离心1 0 m i n ( r c f = 1 1 1 8 0 g ) 。 ( 4 ) 将上清液转移到另一离心管中，加入预冷的等体积的强s 平衡酚：氯仿：异戊 醇( 2 5 ：2 4 ：1 ，v n ) 液，混匀抽提1 0 r a i n 。4 c 下离心1 0 r a i n ( r c f ；l l l 8 0 x g ) 。 ( 5 ) 取上清液1 5 m l ，加入4 c 预冷的2 倍体积的无水乙醇和1 1 0 体积3 m o l l 的n a a e 溶液，混匀沉淀d n a 。置2 0 过夜。 ( 6 ) 4 。c 下离心1 0 m i n ( r c f = 1 1 1 8 0 x g ) ，弃上清液。用7 0 乙醇洗涤2 次( 离心， 弃上清) ，干燥。 ( 7 ) 沉淀d n a 加5 0 9 l 的1 x t e 液，置5 0 c 水浴中溶解1 5 m i n 。 ( 8 ) 用0 7 琼脂糖凝胶电泳( a g a r o s eg e le l e e t r o p h o r e s i s ，a g e ) 检测提取d n a 纯度。 3 2 2d n a 的纯化 ( 1 ) 将提取的d n a 样品5 0 9 l 置于离心管中，加入3 i l l 的r n a 酶( r n a s e ， l o m g m l ) ，3 7 恒温水浴保温l h 。 ( 2 ) 每个离心管中加入等体积的t r i s 平衡酚一氯仿混合液，充分混匀。5 m i n 后离 心7 m i n ( r c f = 1 6 0 9 0 x g ) 。 ( 3 ) 将上清液转移到另一离心管中，同时加入等体积的氯仿混匀，5 m i n 后离心 1 0 m i n ( r c f = 1 1 1 8 0 x g ) 。 ( 4 ) 将上清液再转移到另一离心管中，加入2 倍体积的无水乙醇( 内含1 1 0 体积 3 m o l l 的n a a e ) ，r c f1 6 0 9 0 x g 条件下离心1 5 m i n 。 ( 5 ) 弃上清液，在离心管中加入7 0 的乙醇沈盐1 次，r c f1 6 0 9 0 x g 条件下离心 1 0 m i n ，置通风橱内将乙醇充分挥发。根据所提取d n a 的量加入适当体积的1x t e 液， 置于5 0 水浴中助溶1 5 m i n 。 ( 6 ) 检测样品d n a 纯度，符合标准后继续下面的实验。 3 2 3d n a 纯度的检测 采取以下两种方法检测了4 个节旋藻样品基因组d n a 的纯度。 7 内蒙古师范大学硕士学位论文 ( 1 ) 凝胶电泳检测 采用o 7 的a g e 检测基因组d n a 的纯度，以l k bd n al a d d e r 为m a r k e r 。将5 9 l 基因组d n a 溶液与l g l 加样缓冲液混匀后上样。电泳条件：恒压8 0 v ，时间1 h 。电 泳结束后，在凝胶成像系统下观察电泳结果，样品前沿有弥散物出现，表明样品含有 r n a ；点样孔处较亮，表明样品中含有蛋白质；条带显示较强、无拖尾的d n a 样品 为合格的d n a 样品，根据下列公式计算出d n a 的浓度( c s ) - c s = ( m s c m v m ) ( m m v s ) 式中： c s d n a 的浓度； c m m a r k e r 的上样浓度； m s 样品d n a 片段的相对分子量； m m 酶切片段的总分子量； v s 样品d n a 的上样体积； v m m a r k e r 的上样体积。 ( 2 ) 紫外分光光度检测 使用紫外分光光度计测定d n a 样品在2 6 0 n m 与2 8 0 n m 的o d 值。以2 6 0 n m 与 2 8 0 n m 处o d 值的比值判断d n a 样品纯度，0 z ) 2 ( 0 0 0 2 值在1 8 左右时，为较纯的 d n a ；大于1 8 ，说明样品中r n a 未除干净；小于1 6 ，说明样品中有蛋白质。用2 6 0 n m 处的o d 值计算出d n a 样品的浓度，公式如下： d n a 样品浓度( 1 a g i _ t l ) = 0 1 ) 2 6 0 0 0 2 x l x 稀释倍数 式中： o 0 2 相当于1r t g m l 的d n a 钠盐的o d 值； l 比色杯的光径( c m ) 。 3 2 4d n a 的酶切和连接 本实验采取的酶切和连接反应分步进行。a f l p 分析酶切为双酶切，即采用稀有碱 基切点酶和常见碱基切点酶同时进行酶切。选用限制性内切酶e c o ri 和m s ei 对4 个提纯的节旋藻样品基因组d n a 进行双酶切。首先将限制性内切酶、接头、t 4d n a 连接酶等按说明书上的方法进行稀释，分装后2 0 保存。双酶切必须彻底，否则胶 材料和方法 板的上部会出现扩增带多而密，中下部扩增带稀少的现象。 双酶切的反应体系见表1 3 。各种试剂加好后，置于3 7 恒温水浴中1 2 h ，酶切 产物于6 5 灭活1 0 m i n ，4 c 下保存。 表1 34 个节旋藻样品的酶切反应体系 t a b l ei - 3t h eg t i z y m ed i g e s t i o nr e a c t i o ns y s t e mo f 4s a m p l e so f a r t h r o s p i r a 在酶切产物中加入5 此连接反应体系的混合液，3 7 ( 2 恒温过夜。连接反应结束 后，在6 5 灭活l o m i n ，4 保存。 连接反应体系见表l - 4 。接头( a d a p t e r ) 序列如下： e c o ria d a p t e r5 一c t c g t a g a c t g c g t a c c 3 3 一c t g a c g c a t g g t i aa 5 m s e1a d a p t e r5 i _ g a c g a t g a g t c c t g a g 3 3 t a c t c a g g a c t c 气t 5 表1 - 44 个肖旋藻样品的连接反应体系 t a b l e1 - 4t h el i g a t i o nr e a c t i o ns y s t e mo f 4s a m p l e so f a r t h r o s p i r a 9 内蒙古师范大学硕：t 学位论文 取5 p l 双酶切和连接产物，用0 7 的a g e 检测酶切连接的结果，电泳条件：恒 压8 0 v ，时间1 h 。电泳结束后在凝胶成像系统中检测样品d n a 的m s ei e c o ri 的双 酶切和连接效果。 3 2 5 预扩增反应 将酶切连接的反应液作为预扩增的模板。预扩增引物包括三个部分：5 端与接头 互补的核心序列，限制性酶切位点的序列，3 端1 个选择性碱基。 核心序列 酶切位点 选择性碱基 e 0 0 e c o ri5 l g a c t g c g t a c ca a q q ca 3 m 0 0m s ei5 l g a t g a g t c c ：t g a g t a a c 3 在预扩增反应过程中，作者摸索对比了自己配制的t a q 酶反应体系与市售的 p c r m i x 不同反应体系