（植物学专业论文）姜花愈伤组织诱导及其分化的研究.pdf

姜花愈伤组织诱导及其分化的研究 专业：植物学 率清入：李洪涛 导师：黄学林教授 摘要 零文戳姜藐( h e d y c h i u mc o r o n a r i u m ) 瓣镛嫩盱片、花豹各种器富驭觳无菌 苗的假蒸薄片为外槌体，在以m s 绒b 5 为基本熔养基附加不同种类和浓魔的生 长素( 2 4 - d 、n a a ) 和细胞分裂素( 6 b a ) 的焙养基上，进行了愈伤缀织携诱 导及鼓藏丝辑诱导豹愈伤组织分健不定芽斡秘步研究，戳麓为藩花酌快速繁殖以 及为开展姜花生物技术的遗传改良奠定基础。 本研究表明，对裢丝、花药、予房、花瓣、穗托和苗端所发育出的越来展开 豹第一片幼嫩卧笄鹣簸佳清毒方法筵先臻7 0 滔糖漩毒3 0 s ，褥用0 1 的辩汞灭 菌5 m i n ，其外植体存活率分别为9 0 0 ，7 6 2 7 0 o ，1 0 0 、1 0 0 和7 5 o ： 两对由壤茎发育出的菌的硬芽则攫先用7 0 灏糖消毒3 0 s 屡要采取我们称先 “0 。1 辩汞不连续酒毒豹方法”溺毒，弹蘧o 拜汞先清篝7m i n ，两器麓无菌 水冲洗2 3 次，再用0 1 升汞消毒8m i n ，才袅较有效，并可使外植体存涌率达 8 0 o 。 上述豹姜蓬辞片、花丝、藐药、予房和由檄蒸发育出静蘩靛项芽培养所形成 无菌苗的薄片外植体通过诱导均能脱分化形成愈伤组织，其中，薄片外植体最易 脱分化，花丝、花药、叶片次之，予赛较难脱分化，两花瓣与我捂则不能臌分化。 薄箨辨穗体的最佳愈伤组织诱替臻养基为b s 十o 1 7 5m e j li a a + 2 。2 1m g l d i c a m b a ，其诱导率w 达到8 8 3 ；叶片的最佳愈伤组织诱导培养基为m s + 0 5 m g l 6 - b a + 2 5 m g l 2 , 4 - d ，其诱鼯率为8 2 5 ；花丝、花翡鞫予房鲍最傣愈伤 组织诱搏培养基为m s + 1 0 删l6 - b a + 4 0 m g l 2 , 4 - d + 4 0 m g l n a a ，其诱 导率分别为8 6 3 ，7 0 o 和4 6 3 。另外，花丝外植体程光、孵两种培养条件 下均戆产生黎伤组缀，毽骧培养豹效暴魄巍壤莽翦好，荬诱导率分裂是8 6 。3 秘 7 7 5 。 对花丝所诱导愈伤组织分化不定芽的培养条件的研究表明，在m s 麓本培养 基土辫麴6 - b a 、z t 窝k t 三耱绸貔分裂素均能诱嚣该愈佟缝织分仡不定芽，英 中以6 - b a 的效果最好，谯所试的浓度范围( 2 0 , - 4 。0m g l ) 内，以3 0m g l 的 效果最佳，艇愈伤组织芽诱导率可达副7 0 o 。 关键词：姜花；愈伤组织；不定芽 m s t u d i e so ni n d u c t i o no f c a l l u sa n di t s d i f f e r e n t i a t i o no f h e d y c h i u mc o r o n a r i u m s p e c i a l t y ：p l a n ts c i e n c e s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rh u a n g , x u e l i n t oe s t a b l i s has u i t a b l ep l a n tr e g e n e r a t i o ns y s t e mf o rg e n e t i ci m p r o v e m e n to f h e d y c h i u mc o r o n a r i u mb yb i o t e c l l i 瓣1 0 9 y ，t h i sp a p e rp r e l i m i n a r i l ys t u d i e do nc a l l u s i n d u c t i o nf r o ms e v e r a le x p l a n t sa n da d v e n t i t i o u ss h o o ti n d u c t i o no f t h ec a l l u si n d u c e d f i ：o m f i l a m e m e x p l a n t o n m s o r b 5 m e d i as u p p l e m e n t w i t h a u x i n s ( 2 4 _ d 、n a a ) o r c y t o k i n i n s ( 6 一b a ) a td i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s t h ee x p l a n t si n c l u d e dy o u n gl e a v e s , f l o w e ro r g a n sa n dm i c r o - c r o s ss e c t i o n so f c o r mf r o m a s e p t i cp l a u t l e tc u l t u r e di n i t i a l l y f r o mt h es h o o t - t i po f t h ec o r mw h i c h d e v e l o p e df r o mt h er h i z o m e as t e r i l i z a t i o np r o c e d u r ef o rc l e a n i n gt h ee x p l a n t sw a sd e v e l o p e di nt h i ss t u d y r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ee x p l a n t si n c l u d i n gy o u n gl e a v e s , f i l a m e n t ，a n t h e r , o v a r y , p e t a la n dr e c e p t a c l ec o u l db es u c c e s s f u l l ys t e r i l i z e db y7 0 0 aa l c o h o lf o r3 0 sa n d f o l l o w i n gb yo 1 h g c hf o r5 m i n , a n dt h es u r v i v a lr a t ef o rt h e s ee x p l a n t sw a s7 5 。o 9 0 。泓，7 6 2 ，7 氇鹳龟1 0 0 a n d1 0 0 r e s p e c t i v e l y h o w e v e r , a f t e r7 0 a l c o h o lf o r 3 0 s ，t h es t e r i l i z a t i o nf o rt h es h o o t - t i pc u tf i o mt h ec o r mb yu s i n go 1 n g c h n e e da s oc a l l e d d i s c o n n e c t e ds t e r i l i z a t i o no fo 。1 h g c l 2 t h a ti s , a r e rs t e r i l i z a t i o no f7 0 0 a l c o h o lf o r3 0 s , 毡1 h g c hs t e r i l i z a t i o nf o r7 m i nf o l l o w e dr i n s i n gw i t hs t e r i l i z e d w a t e ra n dt h e no 1 h g c hs t e r i l i z a t i o nf o r8 m i na g a i n a n dt h es u r v i v a lr a t eo ft h i s e x p l a mc o u l dr e a c ht o8 0 。0 b ys u c h 弱s t e r i l i z a t i o np r o t o e a l c a p a b i l i t yo f t h ee x p l a n t st oi n d u c et of o r mc a l l u sw a sd e p e n d e n to nt h ee x p l a n t l v s o u r c ea n di n d u c t i o nm e d i u m t h ef r e q u e n c yo fc a l l u sf o r m a t i o nf r o mt h e m i c r o - c r o s ss e c t i o n so f t h ec o r m , l e a f , f i l a m e n t ，a n t h e ra n do v a r yw a s8 8 3 ，8 2 5 ， 8 6 。3 ，7 0 。鹞a n d4 6 。3 ，r e s p e c t i v e l y h o w e v e rb o t ho fp e t a la n dr e c e p t a c l ew e r e v e r yd i f f i c u l tt oi n d u c et of o r mc a l l u s 确oo p t i m a lm e d i u mf o rc a l l u si n d u c t i o nf r o m t h em i c r o c r o s ss e c t i o n sw a sb 5 b a s i cm e d i u mw i t ho 1 7 5m e f li a aa n d2 2 1m g l d i c a m b a ，t h eo p t i m a lm e d i u mf o rc a l l u si n d u c t i o no ft h el a v e se x p l a n tc o n t a i n e d m sm e d i u mw i t h0 , 5m # l6 - b aa n d2 , 5m g l2 , 4 - d ：a n dt h em e d i u mf o rc a l l u s i n d u c t i o nf r o mt h ef i l a m e n t ，t h ea n t h e ra n dt h eo v a r yw a st h es a m em e d i u mw h i c h c o n t m n e dm sm e d i u mw i t h1 0 啦6 - b a ，4 0 峨2 , 4 一da n d4 0m g ln a a i n a d d i t i o n , c a l l u si n d u c t i o nw i t h8 6 。3 f r e q u e n c yf r o mf i l a m e n tu n d e rd a r kc o n d i t i o n w a sh i g h e rt h a nt h a tw i t hf r e q u e n c y7 7 5 u n d e r l i g h tc o n d i t i o no nt h es a l l e m e d i u m o p t i m a lp r o t o c o lf o ra d v e n t i t i o u ss h o o ti n d u c t i o no f t h ec a l l u sf r o mt h ef i l a m e n t e x p l a n ta l s oc a r r i e do nt h i ss t u d y , a l t h o u g ht h es h o o t sc o u l di n d u c e df r o mt h ec a l l u s o nm sm e d i u ms u p p l e m e n tw i t h6 - b ao rz to rk ta tc o n c e n t r a t i o nf r o m2 0t o4 0 m g m ，h o w e v e r , m a x i m u me f f e c to np r o m o t i n gt h es h o o ti n d u c t i o nw a so nt h e m e d i u mw i t h3 0m 啦6 - b aa n dt h ef r e q u e n c yo ft h es h o o tf o r m a t i o nc o u l db e r e a c h e dt o7 0 0 k e y w o r d ：h e d y c h i u mc o r o n a r i u m ；c a l l u s ；a d v e n t i t i o u sb u d v a c c 6 b a 2 4 d p i c a m b e r e t h l a a k t n a a z t 缩略词表 1 - a m i n o c y c l o p r o p a n e - 1 - c a r - 1 - 氨基环丙烷一1 一羧酸 b o c y l i ca c i d & b e n z y t a m i n o p u r i n e 6 - 苄氨基骧呤 2 , 4 d i c h l o r p h e n o x ya c e t i ca c i d2 ，4 - = 氯苯氧乙酸 3 , 6 d i c h l o r o - o - a n i s i ca c i d3 ，& 二氯甲氧蘩蘸香酸，又称 3 ，6 _ 二氯2 甲氧基苯甲酸 e t h y l e n e乙烯 i n d o l e - 3 a c e t i ca c i d 孵| 噤乙酸 k i n e t i n 激动素 n a p h t h y l e n ea c e t i ca c i d萘乙酸 z e a t i n 玉米紊 李浃涛 姜花愈荡缮臻诱导盈其势证静骈装 串出走学疆士学拉论文2 0 0 5 第1 章前畜 1 1 姜筏的分类憋链及生活溺牲 姜= 沌( h e d y c h i u mc o r o n a r i u m ) 是姜科姜花属的多年生革本植物，株高可达 l 1 5 米，成株丛状黛。地下有肥大的根茎，时长匿形、披针形或长圆状披针形， 长3 5 5 0c m ，先端嚣尖，茎帮澎窄，两瑟有徽绒撼，无旗或其辍柄，静舌长2 。扣3 ，5 c m 。一般在夏秋季开花，花序穗状圆柱形、顶缴，长2 0 - - 3 0c m ，花序轴披梁毛； 苞片卵圆形、绿色，长4 5 c m ，披疏柔毛，每筏片内有小猿2 3 朵，小花囱色、 清香；筏茎管较花苞嚣短；芘茎餐长扯5 。5g m ，袋净缄形，妖3 5 4c m ；镧生退 化雄蕊长圆形，长约3 5c m ；唇瓣圆形，宽约3c m ，先端2 裂，茎部收缩足瓣 橱：花熊长3 5 - - 4c m ，花药长约1 2c m ，蒴果辩状长圆形，长约2c m ( 倦囊国 等t 9 9 9 ) 。 姜花生性喜欢温暖、湿润的气候和稍阴的环境，一般产襁我国广西、贵州、 四川、云南及强藏，嫩于海拔2 0 乱9 0 0 m 林内或灌丛中。此辨，东南亚嚣家如越 南氇霄分 南。 1 2 姜花的秘用现状 1 2 1 观赏花型 姜花花型美丽，熙有沁人的清香，晶莹遴亮的花苞，薄如蝉翼的花瓣，玲珑 裂透翡雅蕤，薅媾多姿戆辞子，熬殍瓣窕麴一嚣纷飞戆蠲蝶，藏又名瘴臻藐、蝴 蝶姜，怒种良好的切花、插花材料，在内地和番港市场上十分畅销。我阑广州 天河区在2 0 0 2 年跫有近百荫连片种植的罄花，年产鲜花8 8 万多枝 ( h t t p ：w w w g z a g r i g o v c n ) t 1 2 2 提取次生代谢产物 姜花不仅习耀予切花观赏、纛颡绿化蕊赏，褥且鼠花瓣巾提取静天然菊档香 李泱涛 姜张愈伤组织诱导及萁分化的研究中山大学硬士学位论文2 0 0 5 精，可广泛用于食品和化妆品加工，目前只有少数国家小批量生产( 陈薇等 2 0 0 2 ) 。姜花被中药大辞典收载，怒一种煎要的中草药，入药的根鍪又名土 姜滔，其有豫菇驱寒、释滚发汗、法菇止咳、治头痛、雷黢瘸、溅湿、麓骨痛殿 跌打损伤等菰效。此外，姜兹还可作为褥料植物，提取姜花浸鹰，用于调氍香精。 姜花的这些特点都与其体内具有多种次生代谢产物有关，产物中主要的生理活性 成分麓二菇纯台穆，j 毙舞，还含有漉香簿、1 , 8 棱漆簿、异法程醇、颓式译基髯 丁子赘酚、金合欢烯、桧烯和十八烷基吗啉等成分( 范燕萍等2 0 0 3 ) 。 目前，国内外学者对荽花体肉二帖化合物的种类、结构及其生理特性都进行 了较为深入静研究。国舞褡获姜筏垂摄取爨8 稀二萜，其中褡个其有细稳毒活健 ( s h a r m a 等1 9 7 5 ，s h a r m a 等t 9 7 6 ，s h a r m a 蒋1 9 8 3 ，i t o k a w a 等1 9 8 8 ，s h a g h 等1 9 9 1 ) 。国内也有科研单位从姜花分离到6 个半e l 花烷型二萜。还有科研学者 及溃姜花戆裰茎牢分离羁两个其獍耱瘤活桎静二萜裁分滇娄花素c 及演姜花素 a ( 赵庆等1 9 9 9 ) ，前者为新化会物。 从姜花体内已分离到的二萜成分来看，均属于半日花环型( 1 a b d a n e ) 双环 二萜。a 、b 环( 1 - 5 号碳覆予帮l o 号碳琢予擒残a 环，5 1 0 号碳原予构成b 环) 为反式稠合，1 8 位甲基为a 构型，c 9 位侧键为b 奄型。这一构塑已由m o e s y 谱给出( i t o k a w a 等1 9 8 8 ) ，并由x - r a y 单晶衍射所证实( s i n g h 等1 9 9 1 ) 。姜张 二菇纯合耱的一觳绩梅鲡下( 赵获等1 9 9 5 ，赵痰等1 9 9 8 ) ： r i h 程1 0 嚣 i 。二旗化舍物鲍一般结擒 姜花二萜的a 环一般无取代，而b 环上的c 9 位侧链上的取代方式较多， 造菇结构的多样往。常觅静有：l 、c 1 3 1 6 构成唳蝻结构( i i ) ，其有这种结构 的二旗可能怒形成其他二旗成分购剪体他会貔；2 、c - 1 3 1 6 撬藏内醺臻，其蠢 该结构的成分较多。3 、侧链为开环链状结构绒降二旗结构( i i i ) 。4 、侧链为过 2 李洪涛姜花鑫伤缀甄诱导爱其分纯豹骈究 串出走学硕士学位论文2 0 0 5 氧键结构。此外，从嫠花植物中述得到一些结构特异的二萜，如c 一1 5 的羟基与 球冀簿彩或了萤键( w ) 。又懿，麸簧藐孛还分褰戮一令罕冕鹣二聚二蕤袋分( v ) 和一个降解二萜成分。 o蠡 影起 i i 呋喃结构i i l i 降= 萜结构i v 形成苻键 过氧化物结构 总的来说，姜花撩物，特别是其二萜成分的化学结构、活性筛选、结构转换、 伍学分类鞋及资源分农等方自戆磷究，跨麦我嚣嫠花资源豹会理开发穰建掇供秘 学依据( 赵庆等1 9 9 8 ) 。 李洪涛姜花愈伤组织诱导及其分化的研究 中山大学硕士学位论文2 0 0 5 1 3 姜花组织培养与植株再生的研究 1 3 1 植物组织培养及植株再生途径 植株再生的途径有两种：体细胞胚胎发生途径和器官发生途径。无论是哪种 途径都建立在植物细胞的全能性( t o t i p o t a n c y ) 基础上。植物细胞的全能性是指植 物的每个细胞都具有该植物的全部遗传信息和离体细胞在一定培养条件下具有 发育成完整植株的潜在能力。根据细胞理论，细胞是生物有机体的基本单位。在 植物的生长发育中，从一个受精卵分裂到产生具有完整形态和结构机能的植株， 这是该受精卵具有该物种全部遗传信息的表现。同样，植物的体细胞也是从合子 的有丝分裂产生的，也具有全能性。在一个完整的植株上，某器官的体细胞只表 现出一定的形态，执行特定的功能，这是由于它受具体器官或组织所在环境的约 束，但它的潜在的全能性并没有消失。当它脱离原来的组织或器官后，在一定的 脱分化培养条件下，就有可能表现出全能性，进而发育成完整的植株。植物的体 细胞胚胎发生( s o m a t i ce m b r y o g e n e s i s ) 是指双倍体或单倍体的体细胞在特定条件 下，未经性细胞融合而通过与合子胚胎发生类似的途径发育出新个体的形态发生 过程。经体胚发生形成类似合子胚的结构称为胚状体或体细胞胚。有些植物从体 胚的细胞中又可以产生体胚，这一过程称为重复体胚发生，所形成的体胚称为次 生胚。体胚发生首先是由r e i n e r t 和s t e w a i d 等人各自于1 9 5 8 年发现的。r e i n e r t 是在固体培养基上从胡萝卜愈伤组织上获得体胚。而s t e w a i d 则是从胡萝h 悬浮 培养细胞体系中获得体胚。器官发生( o r g a n o g e n e s i s ) 则是指离体植物组织( 外植 体) 或细胞( 悬浮培养的细胞和原生质体) 在组织培养的条件下形成无根苗、根 和花芽等器官的过程。器官发生又可以分为直接发生途径和间接发生途径两种。 直接发生途径是指由茎尖、腋芽、原球茎、球茎、块茎、鳞茎等外植体直接分化 成器官的途径。而间接发生途径是指外植体先脱分化形成愈伤组织再分化形成器 官的途径。这两种器官发生途径，其器官原基的形成是十分重要的。它从细胞分 裂的启动开始，经过分裂形成拟分生组织或分生组织中心，随后形成器官原基( 黄 学林和李筱菊1 9 9 5 ) 。 器官发生是离体植株再生的主要途径，其中不定芽的诱导是关键步骤之一。 不定芽、苗的诱导可从腋生分生组织、不定分生组织或顶端分生组织如茎尖中诱 导。大多数植物的叶腋均有腋生分生组织即腋芽，在特定的条件下( 如去掉顶芽) 4 李浃涛 姜藐鑫伤缢缀诱导及其势纯的骈究 中南大学硕士学位论文2 0 0 5 它们都能代替顶芽发商成主干。腋嫩分生组织常常被顶端优势所抑制，其被抑制 戆程度鞭檀携静静类及势技多少舔定。这穆疆端健势夔壤剿燕然跑较复杂，毽蠡 破顶端优势激发腋生分生组织与细胞分裂素( c k ) 的供给密切相关。如有些植 物施用c k 后可产生密切的丛生芽。 羁溺茎尖或矮端分玺缝绞接券不毽是芽、蘩诱等豹一耱鬻露戆途径，憨显还 可以获得无病毒植株。另外，也可从不定分生组织中诱导，包括直接从外檬体诱 导、从愈伤组织中诱爵、从悬浮细胞中诱导及从原生质体中诱导四种方法，目前 毒关这方嚣荻骚究炎瓣援少。 1 3 2 婺花属植物组织培养与槭株再生的研究进展 嚣旃，国内癸辩菠花缝织涪养麓植撩霉生静研究缀乡，淄内仅寿一些关予嗣 属( 姜花属) 的其它种的相关报道，如陈薇等( 2 0 0 2 ) 做了关于圆瓣姜花熬尖组 织培养方面的研究；潘学峰，杨海菊等( 2 0 0 2 ) 做了关于火炬蛰叶片培券殿植株 霉生匏磷究；褥书赞镣( 2 0 0 3 ) 骰了关予火难姜瀚组织培养和快速繁殖方甏豹研 究。因而，深入开展滋方面的研究附于利用生物技术进行姜花的遗传改良鼹有重 要的意义。 1 4 姜花切花保鲜与基因工稳研究 1 4 。1 锈藐衰老橇理 搬据切花的衰老机理( 陈丹生镰2 0 0 4 ) ，姜花切花的衰老一般是由以下几个 原因引越：l 、水分代谢。在瓶插过程中，水分代谢对切花衰老有重要影响。其 瘩分乎鬻麦要取决予蹶本薹窝蒸耱疑羲穆对大小。泰分乎鸳好，有羁予延长其韬 花期。税瓣衰老后期的典型表现悬幽予水分丧失而导致的鲜熬下降、干枯和皱缩。 切花吸水薰的减少是由多因素引越的，如微生物堵塞微管束。引起堵塞的鼹体原 嚣莠： ，5 m i n 时，污染章和存活率之秘并不等于1 0 0 ， 这是因为滥消毒时间， 5 m i n 时，除了被污染的和存瀵的外檀体外，还商由于灭 菌而造成死亡的外植物。 2 。2 。20 1 的升汞溶渡对花器富溃毒时阌懿选择 实验结采裘翳舞整体雳为潘耪消毒3 0 s 后，用0 1 匏辩汞溶液灭菌不同 的薅阀是有效瓣灭藩方法。 小花消毒对澜选取5m i l l ，1 0m i n 两个辩闻淼，然磊分剐培养7 d 霜，巍察 并统诗花药、花丝、花瓣、子房、花耗等花器官静污染率( 表2 - 2 ) 及存活率( 表 2 - 3 ) ，结暴魏下：溺消毒辩溺为5m i n 或1 0m i n 时，对不翮花器官静污染率及存 活率影响不太，焉显帮没膏发生密予消毒时闯避长雨外植俸死亡的现象。鲍矫， 当消毒霉雩阉秀5m i l l 辩，愈伤缀织蹴现瓣对阀及诱导率硝显高于消毒时间为1 0 r a i n 懿努棱体。因貌，花器官最适的消毒对闻为5m i n 。 1 2 李溪涛姜花盎伤维缀诱导及其分纯静磷爨 串由夫学磺士学位论文2 0 0 5 表2 - 2 溃毒怼阉鼹不弱蓬器窘污染率瓣影睫 1 h b 2 2e f f e c t so f d i f f e r e n ts t e r i t i z a t i o nt i m eo n d i f f e r e n tf l o w e ro r g a n sc o n t a m i n a t i o nr a t e 表2 3 消毒时间对不同花器官存活率的影响 m m 2 - 3e f f e c t so f d i f f e r e n ts t e r i l i z a t i o nt i m eo n d i f f e r e n tf l o w e ro r g a n ss u r v i v a lr a t e 灭菌时间辨植体数托药花熊子房花瓣花托 s t e r i l i z a t i o nt i m e ( r a i n ) n m n b c ro f e x p l a n t sa n t h e r ( * * ) f i l 跏嘲域) o v a r y ( ) p e t a l ( ) r e c e p t a c l e ( ) 58 07 6 。29 0 07 0 01 0 0 01 0 0 。0 l 鼬85+01 0 0 08 2 。51 0 0 。0t 0 0 。0 2 2 3o 1 的升汞溶液对芽消毒时间的选择 实羧结果表饔势榱箨强7 0 孵蘸猿滇毒3 0 s 嚣，惩0 。1 豹爵汞溶渡灭蔼不目 的时间怒有效的灭菌方法。 从蒸花地下根蒸经过催芽而褥到的芽，由于其在室步 培养而得到，因此需要 迸孬严格戆港毒。努游毒雾孝霾遥双7m i n ，1 5m i n 秘7r a i n + 8m i n ( 走港毒7r a i n ， 而后用无菌水冲洗2 3 次，再消毒8m i n ) 等3 个不同时间，然后分别培养7 d 后，观察并统计其污鞠! 率和存活举，结果见表2 - 4 。随着消瓣时间的延长，芽污 染率下繇，存话率主辩。当溪毒鞋溺为7m i l l + 8m i n 辞，帮滚毒总瓣翔为1 5m i n ， 中间用凭菌水冲洗鼽3 次，会大大提高存活的外植体数，提高其存活率。因此， 芽最适的消毒时间为7m i n + 8r a i n 。 1 3 李洪涛 姜税愈伤组织诱导及其分化的研究 巾山大学烦士皇够建塞兰壁箜 表2 4 不同消毒时问对芽污染率及存活率的影响 t a b 2 4e f f e c t so f d i f f e r e n ts t e n l i z a t i o nt i m eo n b u de o n t a m i n a t i o nr a t ea n ds u r v i v a lr a t e 灭诗时间外植体数 污染察存活率 洼：7 + 8 ：先滇毒7m i n ，两后用无菌水冲洗2 3 次，再消毒8r n i n 2 3 讨论 2 3 1 消毒方法对外植体的影响 姜芘畸拷蘧覆被毒徽绒毛，棼癸嚣氛畜苞冀，弱予难游毒懿楗瓣，熬既，凌 o 1 的升汞消毒之前，先在7 0 灏精中浸泡3 0 s ，可能有利于发挥消毒剂的作用。 在用0 + 1 的辩汞消毒灭菌之后，要用纛菌水艇复冲洗5 6 次，洗净残留的汞， 秀则秀汞含鸯豹重金属珏9 2 + 会对终蓬钵产生毒害终鼷。 2 3 2o 1 的升泶消毒时间对外植体的影响 在本研究串，对于姜纯时片来说，髓着消毒时间韵延长，污染率逐渐下降， 存活攀先上势后下黪。本寰验孛，当污染率为3 0 左农时，瀵毒效：爨较好，这瓣 存活的外植体没有受到消毒剂的严重损伤，利于愈伤组织的诱导。当消毒时间超 过l or a i n 时，污染率为0 ，僵存满的叶片不能产生愈伤组织，这可能是由于升汞 照会襄的重垒羼珏9 2 + 对峙片蛉缨瞧缝据造成了攫痿。丽对予姜花芯器害来说， 因为消毒是用尚未开放的处于花觜期的小花整体进行消毒的，而且花药、花丝、 子虏等花器宙被包农花瓣爨面，一般不会受到外界微难物的污染，因此，在对不 同芯嚣害数嚣綮率及毒活率影晚不大黪壤漫下，采爆较短静溃毒露阗。本磷究采 用5m i n 。对f 芽消海时间来说，由于通过以芽繁芽得到无菌苗的外植体一芽采 裔大醋，所携带的微生物较多，翻此，消毒处瑷的时间相对较长，但过长时间的 处理叉使存滔率大大减少，毽此，本实验采取苓连续消毒，在嚣次0 。1 磐汞溃 l 毒 李洪涛姜花愈伤组织诱导及其分化的研究中山大学硕士学位论文2 0 0 5 毒之间，用无菌水冲洗2 3 次，即先消毒7m i n ，而后用无菌水冲洗2 3 次，再 消毒8r a i n 。这种消毒方法可避免升汞在连续消毒中给外植体造成过度伤害，又 可进一步发挥消毒剂持续消毒的作用。 李洪涛姜诧愈伤组织诱导及其分化的研究 中山大学硕士学位论文2 0 0 5 第3 章愈伤组织的诱导 零磅究邋过鲻攘器富发玺途径建立扶姜筏愈镌缀缓载宠整毯撩戆甏叛秀生 体系，因此，在确寇了叶片、花器官等外植体的合适的消毒时问后，就要选用培 养基、植物生长调节物质组合及藏浓度对这些外植体进行愈伤组织的诱导。 3 1 材料与方法 3 1 。l 材料 选用的外植体为姜花顶端第一片刚抽生的尚未展开的幼嫩叶片，花丝、花药、 予痨、花瓣、花手乏簿花器露，潋芽繁芽褥虱静无菌苗生长3 个薅瑟的假羹薄片， 经消毒灭菌詹，切成合适大小。具体无麓楗料制备与第2 枣2 。1 3 ，l 楗犀。 d i c a m b a 试剂购自s i g m a - a l d r i c h 公司，其余试剂均购自广州威佳公司。 3 1 2 方法 3 1 2 1 培养基的选择 本实验参照潘学峰等( 2 0 0 2 ) 进行级荽花叶片培养及植株再生的研究以及李 佳( 2 0 0 4 ) 进行香蕉( m u s as p p ) 薄片外稳体植株再生的研究采用m s ( m u r a s h i g e 和s k o o g1 9 6 2 ) 积b s ( o k o l c 秘s c h u 魏1 9 9 6 ) 嚣静蒸本壤葵萎，分别滚热苓溺 种类和不同浓度的生长素( 2 ，4 - d ，n a a ) 和细胞分裂索( b 氏k t ) ，按常规方法 配制( 李浚明1 9 9 2 ) 分装厢，即分别分装3 0r n l 的培养基于2 5 0 m l 的培养瓶中， 经1 2 1 ( 1 1k g c m s ) , 灭蓥2 0m i n 焘各愆。在灭过蓉熬e p 答中，耀二串基耍戳 ( d m s o ) 将d i c a m b a 配制为8 8 4r a g m e 的母液。需添加d m a m b a 的培养基 在灭菌后，培养基濑度降至5 0 c 时加入，混匀后分装。 为了磅究单独馕题缨溅分裂索、生长素黟使薅誉秘懿橇勃生长调节物矮缝 合，包括种类和浓度，对诱导叶片产生愈伤组织的影响，必使用以下1 9 芹申培养 蘩。以m s 纂本盐和维生索，分别附加下列的艇长调节物质： 1 5 ( 1 ) 6 - b af o + 5m g l ) ( 蛰2 ，4 - df 0 + 5r a g l ) ( 3 ) 2 , 4 - i ) ( 1 0m e l ) ( 4 ) 2 , 4 - d ( 1 5r a g l ) ( 辩n a af 。5n a g l ) ( 6 ) n a a f l 0 m g l ) ( 7 ) n a a f l 5m e l ) 秘6 - b a ( 0 5m g l ) + 2 , 4 - df o ，5m g l ) ( 9 ) 6 - b a ( 0 5n a g l ) + 2 , 4 一d ( 1 0r a g l ) 0 0 ) 6 - b a ( o 5m e l ) + 2 , 4 * d ( 1 5m e l ) 秘6 - b a 圆5m e l ) + n a a 国5m e l ) 6 - b a ( 0 5m g l ) + n a a ( 1 0m g l ) 0 3 ) 6 - b a ( 0 5r a g l ) + n a a ( 1 5 m g l ) 秘6 - b af 0 。5r a g l ) + 2 ，拳d 2 。0m g l ) 6 - b a ( o 5m e l ) + 2 ，4 - i ) ( 2 5m g l ) 6 - b a ( 0 5m g l ) + 2 , 4 - d ( 5 0m g l ) 妫6 - b a ( 1 0 醐2 ，z l 。8r a g l ) 6 - b a ( 1 0 m e l ) + 2 ，4 - d ( o 1m e l ) 6 - b a ( 1 0 m e l ) + 2 , 4 一d ( o 2 m e l ) 为了研究使用不同的生长调节物质组合，靓括种类和浓度，对诱导花器官产 生愈伤组织的影响，以m s 基本盐和维生素，分别附加下列的生长调节物质： 6 - b a ( 1 0 删2 , 4 - d ( 2 0 m e l ) 6 - b a ( 1 0m e l ) + 2 , 4 - d ( 4 0m g l ) 6 - b a 0 0 m g l ) + 2 , 4 - d ( 4 0 m g l ) + n a a ( 4 0 r a g l ) 参照李娃( 2 0 0 4 ) 送行香蕉( m u s as p p 。) 薄片终禳俸糠拣再生熬磷究，设 计诱导熬尖产生愈伤组织培养基一薄片培养培养基为： b 5 + i a a 0 1 7 5 r a g l + d i e a m b a 2 2 1r a g l 氇+ i a a 0 。1 7 5 m g l + 2 , 4 - d 6 0 嬲汪 1 7 李洪涛 姜花愈伤组织诱导及其分化的研究 中啦盔堂堡主兰垡笙苎! 竺! 在切取薄片之前进行3 个月的预培养。预培养分为两个阶段：首先是以芽繁 芽得到从生芽，然后是通过小芽长成无菌苗。以m s 为基本培养基，配制了3 组 预培养培养基：6 - b a 3 0m g l + n a a 0 2 m g l 6 - b a 0 5r n l ；n a a 0 2 m g m 。 3 1 2 2 培养条件 培养室温度为2 84 - 1 ，在诱导愈伤组织阶段采用暗培养，但用花器官为外 植体时采用光培养、暗培养两组对照处理。光培养是用日光灯为光源，光照周期 1 6 h ( 光照) 8 h ( 黑暗) ，光照强度为4 5 l a m o l p h o t o n s m - 2s 1 进行培养，暗培养 是用黑布遮光进行培养。每3 0 天更换一次培养基。 3 1 2 3 愈伤组织诱导率的计算 各种外植体诱导愈伤组织一定时间后( 如叶片诱导7 5 d 后) 继代，并计算愈 伤组织诱导率，愈伤组织诱导率= 诱导出愈伤组织的外植体数目总的外植体数 目1 0 0 。 3 2 结果与分析 3 2 1 叶片愈伤组织的诱导 3 2 1 1 植物生长调节物质对愈伤组织诱导的影响 为了确定诱导姜花叶片产生愈伤组织的合适的植物生长调节物质组合，以 m s 为基本培养基，配制了一组含有细胞分裂素( 6 - b a ) 和生长素( 2 ，4 d 或n a a ) 的培养基。6 - b a 设两个浓度梯度：0 和0 5m g l ，而生长素设4 个浓度梯度：0 、 o 5 、1 0 和1 5m e t , 共1 3 个处理。每个处理接种8 0 片叶片外植体，每瓶接0 8 片，接l 啦1 2 瓶。接种l o 天后叶片变皱弯曲；6 - b a 和2 , 4 d 配合的处理3 5 天 后开始出现愈伤组织，6 - b a 和n a a 配比的组合4 5 天后才产生愈伤组织。接种 7 5 天后，调查愈伤组织的诱导情况，结果见表3 - 1 。 李洪涛姜花愈伤组织诱导及其分化的研究 中山大学硕士学位论文2 0 0 5 表3 1 不同植物生长调节物质组合对诱导叶片愈伤组织的影响 t a b 3 - le f f e c t so f d i f f e r e n tg r o w t hr e g u l a t o r o nl e a v e sc a l l u si n d u c t i o n 从表3 1 可看出，单独使用生长素或细胞分裂素都不能使姜花叶片产生愈伤 组织，叶片愈伤组织的产生需要生长素和细胞分裂素两者的同时存在。从所试的 两种生长素与6 - b a 的组合中发现，2 , 4 d 的诱导效果较好，n a a 的效果较差。 在相同浓度，相同配比的情况下，1 5m g l2 , 4 - d 与0 5m g l6 - b a 配合，叶片愈 伤组织诱导率最高可达3 0 o ，而1 5m g l n a a 与o 5m g l6 - b a 配合，叶片愈 伤组织诱导率只有2 2 5 。同一生长素，不同浓度的效果也不相同，在所试的浓 度范围内，愈伤组织诱导率与生长素的浓度成正比。因此，下一步应用6 - b a 与 2 , 4 d 组合来寻找合适的植物生长调节物质配比。 3 2 1 2 选择合适的植物生长调节物质配比 为了确定诱导姜花叶片产生愈伤组织的合适的植物生长调节物质配比，以 m s 为基本培养基，配制了一组含有6 - b a 与2 , 4 d 的不同浓度比例的培养基。 6 - b a 浓度为o 5m g l ，而生长素设6 个浓度梯度：o 5 、1 0 、1 5 、2 0 、2 5 和 5 0m g l 。每个处理接种8 0 片叶片外植体，每瓶接8 片，接1 0 1 2 瓶。接种 1 9 李灌涛 姜花愈痿缝缓诱导及其势亿静科究 囊生查兰堡圭兰壁鎏壅塑箜 1 0 天后叶片变皱弯曲，3 5 天后开始出现愈伤组织。接种7 5 天后，调查愈伤组织 夔诱导戆凌，续票冤表3 - 2 。 袭3 - 2 不同植物生长调节物质组合对叶片愈伤组织诱弹率的影响 t a b 。3 2e f f t so f c o m b i n a t i o n so f 6 - b a a n d2 , 4 - 1 9 o nc a l l u si n d u c t i o nr a t eo f l e a v e s 艇表3 2 可看出，当6 - b a 浓壤为0 5 氆l ，6 - b a 与2 , 4 一d 的浓疫毙铡明显 影响着愈伤组织的诱搏率。随着2 ，4 d 浓度比例的递增，最大的愈伤组织诱导率 出现在两者浓度比例为l ：5 时，此时愈伤组织的诱导率达到8 2 5 。 爨越诱导时片形成塞伤维织，诱导率最裹黪缨藏分裂豢与生长素缝合楚0 5 m g l6 - b a + 2 5h l g l2 , 4 - d ，诱导豢达到8 2 5 。 a b c 图3 1 叶片外植体在m s 培养基中诱导出的各种类型愈伤组织的形态特征 f i g 3 - lt h em o r p h o l o g yo f c a l l u si n d u c e df r o mt h el e a v e so nm sm e d i u m a ：i 型愈伤组织：白色盐末状，生长鬣较少，难以继代培养； b ：i i 型愈伤组织：黄自德、颗粒状、致密、含水量少，能继代培养； c ：掰黧躲爨跬织；淡黄魏、致密、颓靛凌、糖经、含永量鞍多，麓壤伐塔养；爨愈伤 组织：疏松、半透明、水激状，在继代培养时褐化死掉，这类愈伤容易长出不定根，难成苗。 2 0 李洪涛姜花愈伤组织诱导及其分化的研究 中山大学硕士学位论文2 0 0 5 在观察中发现，所产生的愈伤组织有四种类型( 图3 - 1a 、b 、c ) 。其中i 型 愈伤组织是在2 , 4 d 诱导下，在叶片中央产生；i i 型愈伤组织是在n a a 诱导下， 从叶片周围产生；i i i 型和i v 型愈伤组织是在2 , 4 d 诱导下，从叶片周围产生。 3 2 1 3 愈伤组织的继代 图3 - 2 叶片i i 、i i i 、i v 型愈伤组织在诱导培养基上继代培养时的形态特征 f i g 3 - 2t h em o r p h o l o g yo ft h et y p e so fi i 、i i i 、i vc a l l u so fl e a v e so ni n d u c e d m e d i u mw h e nf u r t h e rc u r u r e d a i 、a 2 ：i v