（植物学专业论文）洋桔梗高频再生系统的建立及几丁质酶基因的转化.pdf

摘要 摘要 本研究以洋桔梗( e u s t o m ag r a n d i f l o r u m ) “d o u b l em a r i a c h ip i n k ”品种为试 材，建立了该品种的离体培养高频再生体系；构建了菜豆几丁质酶基因的植物表 达载体，并对“d o u b l em a r i a c h ip i n k ”进行了转化。卡那霉素( k i n ) 抗性筛选 和p c r 检测结果表明，菜豆几丁质酶基因已转入该品种，为进一步培育抗真菌 性病害的洋桔梗新品种奠定了重要基础。 在本研究中，首先以洋桔梗的叶片为外植体，研究了不同的切割方式、培养 基中6 - b a ( 眠o 1 、0 5 和1 0 m g l ) 与n a a ( 0 、0 0 1 、0 0 5 和0 1 m g l ) 的不 同配比对不定芽分化的影响；并测定了不定芽分化对k m 的敏感性。研究结果表 明，“五刀切”与“三刀切”对不定芽分化数量的影响无显著性差异，“三刀 切，中间不切断”与“三刀切”和“五刀切”相比，不定芽分化数少： m s + 6 - b a l 0 m g l 为叶片不定芽分化的最适培养基：在此培养基上，不定芽分化 率达1 0 0 ，1 0 e n l x i o e m 大小的叶块上不定芽分化数平均达2 5 4 ；将获得的不 定芽在m s + 6 一b a o 1 m g l + n a a 0 0 5 m g l 培养基中增殖，芽苗在i 2 m s + n a a 0 1 m g ，l 培养基中生根，从而建立了“d o u b l em a r i a c h ip i n k ”的高频再生 体系。另外，2 5 m g l 的k m 为抑制洋桔梗叶片不定芽分化的最低浓度。 然后，根据菜豆i 类几丁质酶基因序列( m 1 3 9 6 8 - - - - - - g e n b a n k 登录号) ， 设计了一对特异弓i 物( p 1 ：5 - t a et o ta g aa t ga a g a a ga a ta g ga t g a t g3 ；p 2 ：5 e g cg a a t c e t e a c t ga g a g 昏g a ca a g a a g 一3 ) ，进行p c r 扩增；回收扩增产物，进行t a 克 隆、测序鉴定表明已分离、克隆了菜豆几丁质酶基因；将该基因与p b l l 2 1 相连， 成功构建了菜豆几丁质酶基因植物表达载体( p b l l 2 1 c h i ) ：通过电转化法，将 p b l l 2 1 - c h i 导入根癌农杆菌l b a 4 4 0 4 中。 最后，将洋桔梗叶片与含p b l l 2 1 c h i 的l b a 4 4 0 4 共培养，经过除菌、k m 抗 性筛选和再生诱导，获得了2 0 个抗性株系；根据菜豆几丁质酶基因序列和p b l l 2 1 序列( a f 4 8 5 7 8 3 ) 设计p c r 弓i 物( p 3 ：5 一a c a g a a c t cg e cg t aa a g 一3 ；p 4 ：5 - a t ga a g g e a t e g t a g g t g t a g a a g c 一3 ) ，从1 1 个抗性株系中扩增到了与目的片段长度( 8 3 2 b p ) 吻合的的特异性条带，表明菜豆几丁质酶基因已整合到洋桔梗基因组中。 此外，本研究还观察到g a 3 可促进洋桔梗种苗节间伸长，有效地缩短了育 摘要 苗期、防止簇生。 关键词：洋桔梗；高频再生系统；菜豆几丁质酶基因；基因转化 i l a b ，妇n e s t a b l i s h m e n to f h i g hf r e q u e n c y r e g e n e r a t i o ns y s t e ma n dt r a n s f o r m a t i o no f e u s t o m a g r a n d i f l o r u mw i t hc h i t i n a s cg e n e a b s t r a c t i nt h er e s e a r c h al i s i a n t h u s ( e u s t o m ag r a n d i f l o r u m ) c u l t i v a r “d o u b l em a r i a c h i p i n k w a su s e d t h er e s e a r c hi n c l u d e de s t a b l i s h m e n to fr e g e n e r a t i o ns y s t e mo f l i s i a n t h n s ，c o n s t r u c t i o no f e h i t i r m s eg e n ei np l a n te x p r e s s i o nv e c t o ra n dt r a n s f o r m a t i o n o fl i s i a n t h u sw i t hc h i t i n a s eg e n e t h er e s u l to fk ms e l e c t i o na n dp c r a n a l y s i s s h o w e dt h ee h i t i r m s eg e n ew i t st r a n s f o r m e di n t o “d o u b l em a r i a c h ip i n k f i r s t , l e a v e so fl i s i a n t h u sw e r eu s e dt or e s e a r c ht h ei r d l u e n c eo f d i f f e r e n tm o d e so f i n c i s i o n a n dc o m b i n a t i o n s o f 6 一b 0 、0 i 、0 5a n d1 0 m g l ) a n d n a a ( 0 、0 o i 、o 0 5 a n do 1 i n g l ) t oa d v e n t i t i o u sb u df o r m a t i o n ，a n dt ot e s tt h es e n s i t i v i t yo f a d v e n t i t i o u s b a df o r m a t i o nw i t hk a n a m y c i n t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h el e a v e sw h i c hh a d4 i n c i s i o n sw e r en o tp r o m i n e n t l yd i f f e r e n tf r o mt h o s ew h i c hh a d2i n c i s i o n si nt h e n u m b e ro fa d v e n t i t i o u sb u d s t h eo p t i m a lb u d sd i f f e r e n t i a t i o nm e d i t t mw a s m s + 6 一b a i 0 m g 兄，i aw h i c ht h ef r e q u e n c yo fd i f f e r e n t i a t i o n 、张s1 0 0 , a n dt h e n u m b e ro fa d v e n t i t i o u sb u d sw a s2 5 4i na v e r a g e a d v e n t i t i o u sb u d sp r o l i f e r a t e do n m s + 6 一b ao 1 i n g l + n a a 0 0 5 m 矿l h a a t l e t sr t e do n1 2 m s + n a a 0 1 m g l h i g h f r e q u e n c yr e g e n e r a t i o ns y s t e mo f d o u b l em a r i a c h ip i n k w a se s t a b l i s h e d a n dt h e l o w e s tl e v e lo fk a n a m y c i nw h i e l lc o u l dr e s t r a i nt h ef o r m a t i o no fa d v e n t i t i o u sb u d s w a s2 5 m g l s e c o n d ，a p a i r o f d i f f e r e n t i a lp r i m e r s ( p 1 ：5 - t a c t o ta g a a t ga a g a a g a n ta g ga t ga t g3 ； p 2 ：5 c g cg u nt c c t c ac t ga g ag g tg a ea a ga n g 一3 ) w i i , sd e s i g n e da c c o r d i n gt o t h e s e q u e n c eo f p v u l g a r i t y p eic h i t i l m s eg e n e ( m t 3 9 6 8 、，耵忙c h i t i n a s eg e n ew n s s e p a r a t e da n dc l o n e di n t op l a n te x p r e s s i o nv e c t o rp b i l 2 1a n dn a m e dp b l l 2 1 一c h i t h ep b l l 2 1 - c h iw b $ c o n f i r m e db yr e s t r i c t i o ne n z y m ea n dp c r a n a l y s i s 1 1 1 er e s u l t a i n 些型一一一 s h o w e dt h a tt h er e c o m b i n a n tp h s m i dw a sc o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y p b | 1 2 1 - c h iw a s t r a n s f o r m e di n t oa g r o b a c t e r i u mt u r n e f a c 把nl b a 4 4 0 4 a tl a s t 1 e a v e sw c t cc 0 o d o r e dw i t hl b a 4 4 0 4w h i c hc o n t a i n e dp b l l 2 1 c h it o t r a n s f o r mc h i t i n a s eg e n ei n t ot h el b i a n t h s o m ea d v e n t i t i o u sb u d sr e g e n e r a t e df r o m i e a v e si nm e d i u mw i t i lk a n a m y c i mt h o s ew e r es u b c u l t o r e dt os e l e c tt h et r a n s g i ：n i e p l a n t l e t si 1 1m e d i u m w i t hk a n a n l y c i n 2 0l i n e sc o u l dg r o wi nm e d i u mw i t hk a n a m y e i n a p a i r o f d i f f e r e n t i a lp r i m e r s ( p 3 ：5 - a c 3g a n c t cg e e g t a a a g - 3 ；p 4 ：5 - a i ga a gg c a t e g t a gg 馆t a gn a gc - 3 ) w a sd e s i g n e da c c o r d i n gt o t h e s e q u e l i c eo fe h i t i n a s e g e n e ( m 1 3 9 6 8 ) a n dp b i l 2 l ( a f 4 8 5 7 8 3 ) ad i f f e r e n t i a l b a n dw a so b t a i n e db yp c r m e t h o du s i n gn a n dp 4i n1 1t i n e s t h ec h i f i n a s eg e n ew a nt r a n s f o r m e di n t o d o u b l e m a r i a c h ip i n k i nt h er e s e a l c h ，t h ee f f e c to f d i f f e r e n tl e v e l so f g a 3 ( 0 、2 5 、2 0 0a n d5 0 0r a g l ) t o l i s i a n t h u sp l a n t l e mw a st e s t e dt h er e s u l ts h o w e dt h a tg a 3c o u l dp r o m o t et h eg r o w t h o f l i s i a n t h u sa n dp r e v e n tf r o mf a s c i a t i o n k e yw o r d s ：l i s i a u t h t t h i 曲f r e q u e n c yo f t h er e g e n e r a t i o ns y s t e m ；t h ee h i t i n a s eg e n e ； g e n et r a r 矗f o r m a t i o n i v 学位论文独创性声明 本人郑重声明： 1 、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。 2 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究 成果。 3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。 4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构 已经发表或撰写过的研究成果。 5 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示 了谢意。 作者签名：至圣壅堕 日瓤迹丝 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 作者签名：缝壶 日期：磁：墨! 兰 1 上 j 刖百 一洋桔梗及其病害 1 洋桔梗 洋桔梗( e u s t o m ag r a n d i f l o r u m ) ，又名草原龙胆或土耳其龙胆，是龙胆科龙 胆属的一、二年生草本观赏植物。洋桔梗花姿优美，花色丰富，是国际上十分流 行的切花和盆花种类之一。目前洋桔梗列切花第七位，是切花生产中上升最快的 种类。 洋桔梗原产于美国中部内布拉斯加州( n e b r a s k a ) 至得克萨斯州( t e x a s ) 一 带。日本1 9 3 5 年引进洋桔梗，并开始少量栽培“1 。1 9 7 5 年以后，洋桔梗的育种研 究得到了快速的发展。1 。主要在日本进行。1 9 8 2 年，日本坂田公司推出重瓣共鸣 ( e c h o ) 系列和单瓣凯迪( h e i d i ) 系列以后，洋桔梗在市场上的销售量剧增。 欧美国家对洋桔梗的育种研究稍迟，大约在1 9 8 0 年以后。1 9 6 8 年我国台湾从日本 引进在洋桔梗，从零星试栽到大量种植、育种，积累了丰富的经验。雨我国大陆 引种较晚，很多地区还处于试验种植阶段。 长期以来，我国对花卉品种“重引轻育”，花卉市场中的绝大多数品种是国 外培育的，而世界范围内对花卉品种的保护越来越重视，所以品种问题已成为限 制我国花卉业进一步发展的“瓶颈”“。洋桔梗的情况也是如此，其种源主要 依赖外国进口的f 1 代杂交品种，价格昂贵，加之种子细小、种子萌发缓慢以及幼 苗有4 “个月的停滞期等，限秘了洋桔梗在我国的发展。种源问题尤其是重要的 制约因素，因此培育出具有我国自主知识产权的洋桔梗新品种至关重要。 2 洋桔梗的病害 洋桔梗的病害按照病原可分为真菌性病害、细菌性病害和病毒性病害等。 2 1 真菌性病害 关于洋桔梗真菌病害主要有以下几个方面； ( 1 ) p e r o n o s p o r ac h t o r a e 侵染洋桔梗，弓l 发露菌病，染病的植株叶片表面 呈现污斑，逐渐扩大呈黄褐色病斑，使叶片卷曲，最后变褐死亡唧： ( 2 ) f u s a r i u ms o l a n i 侵染洋桔梗，引发立枯病，染病的植株生长缓慢，根 本学位论文相关研究为国家自然基金项目( 批准号；3 0 3 7 1 0 1 0 7 ) 的一部分 1 前宦 和茎腐烂“； ( 3 ) f u s a r i u ma v e n a c e u m 可通过真菌蚊( f u n g u sg n a t s ) 等昆虫传播病菌， 侵染洋桔梗，使其顶芽、茎腐烂9 ”1 ； ( 4 ) 齐整小核菌( s c l e r o t i u mr o l f s i i ) 侵染洋桔梗，引起其茎枯萎”1 ； ( 5 ) 拟茎点霉( p h o m o p s 妇s p ) 侵染洋桔梗，引起其茎和叶的枯萎。”； ( 6 ) m i t o s p o r i co i d i u m p s e u d o i d i u m 侵染洋桔梗，引发其白粉病，染病的植 株叶片出现白色的小粉斑，逐渐扩大为圆形或不规刚形的白粉斑“”： ( 7 ) p h y t o p h t h o r a p a l m i v o r a 侵染洋桔梗，引发其疫病，使其根和茎腐烂“”。 2 2 细菌性病害 ( 1 ) 炭疽病菌( c o l l e t o t r i c h u ma c u t a t u m ) 侵染洋桔梗，引发其炭疽病“； ( 2 ) 石竹伯克氏菌( b u r k h o l d e r i ac a r y o p h y l l i ) 侵染洋桔梗，引发其细菌萎 蔫病，使植株萎蔫变黄“”。 2 3 病毒性病害 ( 1 ) 番茄斑萎病毒( t o m a t os p o t e dw i l tv i r u s ，t s w v ) 侵染洋桔梗，引发其斑 萎病“6 ”1 ； ( 2 ) 番茄黄叶卷曲病毒( t o m a t oy e l l o wl e a f c u r lv i r u s ) 侵染洋桔梗，引发 其黄叶卷曲病，使其茎尖扭曲，叶片杯形，下部的叶片膨大开花减少“”： ( 3 ) 鸢尾黄斑病毒( i r i sy e l l o ws p o tv i r u s ，i y s v ) 侵染洋桔梗，使其叶片坏 死嘲。 二几丁质酶基因在植物抗真菌性病害中的应用 在农业生产中，由真菌引起的病害占植物总病害的8 0 以上。传统的植物病 害的防治主要是依靠化学农药和通过传统育种培育抗性品种，但传统育种周期 长、费时费力，而化学农药的商残留、易对环境造成污染，危害人畜健康。分子 育种新技术植物基因工程可将外源抗病基因导入宿主植物，定向、高效地培 育出抗性品种。在目前的植物抗真菌病基因工程研究中，几丁质酶基因是最受关 注的基因之一。 1 几丁质酶及其基因 1 1 几丁质酶及其分类 几丁质是大多数真菌细胞壁的主要成分之一。几丁质酶是一种糖苷酶，可水 2 解真菌细胞壁中的几丁质，从而抑制真菌的生长。几丁质酶存在于很多动物、植 物及微生物中，特别是普遍存在于高等植物中啪1 。几丁质酶在高等植物中主要分 布于茎、叶、种子及愈伤组织中，正常情况下，植物体内的几丁质酶只是低水平 表达，其活性一般低于可检测水平“1 。当植物受病原菌侵染、诱导物处理及各 种伤害后，几丁质酶的活性迅速提高，从而提高植物抗病能力。因此，普遍认为 几丁质酶是重要的病程相关蛋白。多种生物因素和非生物因素，如真菌、细菌、 病毒、乙烯、水杨酸、重金属等可诱导植物几丁质酶，其中病原真菌3 1 种( 含交 种和变化型) 、菌根真菌6 种。”及水解的几丁质酶碎片。另外，几丁质酶对线虫和 昆虫也有一定的抗性。在昆虫中，几丁质酶主要存在于蜕皮液、肠道中。而在一 些昆虫的毒液中( 如蜜蜂等) 也存在几丁质酶。 根据水解切口位置的不同可将几丁质酶分为内切几丁质酶和外切几丁质酶。 研究较多的植物几丁质酶是内切几丁质酶。另外，根据几丁质酶蛋白氨基酸序列 的结构特征可将植物几丁质酶分为四类：i 类是碱性酶，常具有三个区域，包 括前导肽，n 端富含半胱氨酸的几丁质结合区，c 端高度保守的催化功能区，中 间由可变铰链区连接而成；类是酸性酶，与i 类相比，只有前导肽与催化功能 区；l 类是酸性酶，有前导肽和催化功能区，但其功能区与i 、i i 类的无相似性； 类与i 类相似，但其功能区较小，保守序列中有4 处缺失。 1 2 几丁质酶基因的结构特点 最早对植物几丁质酶基因进行研究的是b r o 醇i e 。他以菜豆m r n a 为模板，通 过逆转录构建了菜豆c d n a 文库，再经分子杂交获得了菜豆几丁质酶基因。z h u 等以蚕豆几丁质酶基因为探针，从水稻基因组文库分离到几丁质酶r c h l 0 基因， 编码由3 3 6 个氨基酸组成的多肽陬“。至今已从菜豆、豇豆、水稻、烟草、油菜、 马铃薯、小麦、玉米和甜菜等多种植物中克隆到几丁质酶基因，对其基因组结构 进行分析，结果显示，不同类型几丁质酶基因组具有不同的特点，但普遍是由小 的多基因家族组成，且在同一组染色体中，含有一个或多个几丁质酶基因。植 物几丁质酶基因一般含有z 个位于馑化区的内含子，虽然它们大小不同，但在基 因中的位置却很保守，内含子i 一般位于成熟蛋白中的第1 3 6 位氨基酸残基处( 一 般是g l y ) ，内含子一般位于第1 9 l 位的氨基酸残基处。这些内含子中富含a + t ， 与外显子交界也遵循g t - a g 规则啪1 。也有很多几丁质酶基因含有一个内含子， 如拟南芥c h i a l 和c h i a 4 基因、大豆c h i b i 基因；还有些植物的几丁质酶的基因甚 至不含内含子，例如，豇豆几丁质酶成熟蛋白基因。1 、水稻几丁质酶基因、蚕豆 c h 5 b 基因、马铃薯r u 8 7 1 3 基因等。 2几丁质酶基因在植物抗真菌性病害中的应用 b r o g l i e 等首次将组成型表达的菜豆i 类碱性几丁质酶基因导入烟草，获得的 转基因植株对立枯丝核菌俾h i z o c t o n i a s d 砌0 具有较强抗性。”。s i m i 等证明导入含 有c h i a 基因的转座子p u x - b f 5 后，荧光假单胞菌( p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s ) a 7 2 7 9 高效表达后，分泌的几丁质酶可有效降低立桔丝核菌( r h i z o c t o n i as o l a n o 对棉花幼苗的危害嘲。g r i s o n 等将组成型表达的几丁质酶基因导入甘蓝型油菜中 结果发现转基因植株对病原菌：柱孢霉菌( c y l i n d r o s p o r i u mc o n c e n t r i c u m ) 、茎点 霉菌( p h o m a l i n g a m ) 、菌核菌( s l e r o t i n i as c l e r o t i o r u m ) 的田阊耐瘸性比未转基 因的亲本明显增强汹1 。t o y o d a 等用外源几丁质酶处理离体的大麦胚芽鞘以观察对 于小麦自粉菌( e r y s i p h e g r a m i n i s f 妒h o r d e d 的影响，结果发现在2 h 内，病菌细 胞被完全消解，并抑制了病原菌次生菌体的形成。t a b e i 将水稻凡丁质酶e d n a ( r c c 2 ) 导入黄瓜中，经灰葡萄孢( b o t r y t i sc i n e r e a ) 接种实验表明，转基因植 株中有7 5 的幼苗较对照的抗性增强，完全抑制了c r 2 9 、c r 3 2 和c r 3 3 菌株病斑 的扩展。王果萍等将外源几丁质酶基因导入s 3 1 5 等3 个西瓜株系中，经自然发 病和室内人工接种抗病性鉴定，其抗枯萎病菌的能力较原材料( 对照) 的确有较 大提高“1 。m a r c h a n t 等将水稻i 类碱性几丁质酶基因导入感染蔷薇黑斑病的栽 培玫瑰g l a dt i d i n g 品种中，从两增强了对黑斑病菌( d i p l o c a r p o nr o s a e ) 的抗性， 使斑病的严重度降低了1 3 0 一4 3 ”1 。n i s h i z a w a 等将水稻几丁质酶基因c h i - 2 或 c h i - 3 转入粳稻，转基因植株对2 个稻瘟病病原菌( m a g n a p o r t h eg r i s e a ) 0 0 7 0 和 3 3 3 号小种表现高抗往。而且这种抗性还能稳定遗传给下一代。b o l a r 氍j - 编码木 霉( t r i c h o d e r m ah a r i a n u m ) 的几丁质酶基因导入苹果，所得的1 5 个转基因苹果品 系对苹果黑心病的抵抗性显著提高。孟亮等把来自于菜豆的几丁质酶基因 ( c h 5 b ) 导入g l 黑杨中，以期获得抗真菌病害的杨树。 尽管目前几丁质酶基因的研究和利用取得了较大的进展，但仍存在不少问 题。p u n j a 等“”指出，尽管转几丁质酶基因可以增强植物的抗病性，但这与物种、 基因来源、类型、导入目标植株后在染色体上的定位及病原菌的种类等均有关系， 4 前言 上述种种不确定性使得利用导入外源抗病基因来增强植物对真菌性病害抵抗能 力的策略更加复杂。 几丁质酶基因对于植物真菌病害的防治具有十分重要的利用价值。利用此基 因获得的转基因抗瘸植物，是防治植物真菌病害的有效途径之一。随着对植物抗 病机制和病原物致病机制的进步研究，以及几丁质酶作用机制的深入了解，可 以选择出抑菌活性强的几丁质酶；随着基因工程技术的不断完善与成熟，可对几 丁质酶基因进行必要的修饰和改造，利用转基因技术有效地将揶菌活性强的凡 丁质酶基因导入植物体，用以提高植物的抗病性。同时，可利用其他酶与几丁质 酶的协同作用，实行多基因共转以及发掘植物自身的抗性基因资源，以获得更 强、更广泛的抑菌效果，从而培育出抗病性更强、更稳定的转基因植株。从长远 看。通过植物基因工程手段培育出对真菌病害的高抗植物，将对农业生产产生 极大的推动作用，同时又对保护环境、维持生态平衡有积极的促进作用。另外， 由于转基因难度较大，得到的转基因植物较少，且一般还处于实验室研究阶段， 因此，在扩大转几丁质酶基因植物群体的同时，大力推进转基因植物的商品化和 实用化也是今后发展的一个主要方向，这也是转基因植物具有巨大应用前景和 市场潜力的原因所在。 三洋桔梗的基因工程 近年来，关于洋桔梗的基因工程方面已有不少报道，本文对洋桔梗离体培养 中品种和外植体的选择、不定芽的分化、芽苗增殖、生根以及基因转化过程中转 化的受体材料和方法、转化的目的基因和存在的问题等方面进行了综述，为洋桔 梗基因工程的进一步研究提供参考资料。 l 洋桔梗的离体培养 1 1 品种 洋桔梗品种繁多，离体培养的最佳条件可能会因品种的不同而不同。目前关 于洋桔梗的离体培养方面也已有一些报道，但只有少数文章中对其品种有详细的 标注，如：“d w a r f p u r p l e ”、“b i c o l o r p u r p l e ” 4 3 1 、“l i s a b l u e ”、“d e e p b l u e ” h 5 “1 、台湾引种的a i 、a i i 及a - h i “”、“f r e s hw h i t e ”删、“h a k u s e n ” 4 t 1 、 “m i s sl i l a c “嘲、“f r e s hp u r p l e ”啪1 和“d o r e m iw i n er e d 川删等：还有一些文 章中对其花型、花色进行了简单的描述，如：重瓣复色、盆栽白花、红色切 5 花“”等。 1 2 外植体的种类 在洋桔梗的离体培养中，可选用不同的外植体，例如：选用叶片诱导不定芽 的分化 “删或体细胞胚的形成。”；选用茎段池“剃、顶芽m “1 和根删 诱导不定芽的分化；分离原生质体进行离体再生植株m “6 ”等。其中以选用叶片 诱导不定芽的分化应用较为广泛。 1 3 不定芽和体细胞胚的诱导 1 3 1 影响不定芽分化的主要因素 1 3 1 1 植物激素对不定芽分化的影响 细胞分裂素6 - b a 对洋桔梗具有诱导分化和产生玻璃化的双重作用。在一 定浓度范围内，随着6 - b a 浓度的升高，不定芽的分化率和分化个数都有增高的 趋势咖“；但高浓度的6 - b a 易造成不定芽的玻璃化，且不定芽矮小，节间短， 叶片紧密，成苗率低州“：当6 - b a 浓度 1 0 m g l 时，愈伤组织和不定芽玻 璃化严重”，成苗率低；当6 - b a 浓度降为0 5 m g l 或更低时，叶片舒展，茎粗 壮，节间较长，成苗率高“7 “”“6 ”。所以应采用适当的低浓度6 - b a 诱导洋 桔梗不定芽的分化，既能保证一定的分化率和分化个数，又可获得较高的成苗率。 除了6 b a ，常使用的细胞分裂索还有k t 和z t ，它们和6 b a 一样，当浓度较 高时，易造成洋桔梗愈伤组织和不定芽的玻璃化噼“。z t 与6 b a 相比，诱导出 的不定芽颜色鲜绿，长势良好，未见不能分化的芽点。 生长素n a a 可促进愈伤组织的生长。在一定的浓度范围内，随着n a a 浓 度的升高，愈伤组织也随之增多，但不定芽的分化能力呈下降的趋势；当n a a 浓度较低时( o 1 加5 r a g l ) 。愈伤组织呈淡绿色、颗粒状“、分化能力强； 当n a a 浓度较高时( o 5 m g l l ) ，切口处愈伤组织发达，但较松散，分化能力下 降”1 。据以上推测：高浓度的n a a 可能使不易分化的愈伤组织增多，从而降低 了不定芽的分化能力。为了提高不定芽的分化能力，培养基中适宜附加较低浓度 的n a a 。 除了n a a ，常用的生长素还有n a 、i b a 和2 ，4 d 。有研究指出：附 j i i i b a 的 培养基上形成的愈伤组织比在n a a 上出现得早，适合分化；2 , 4 - d 对洋桔梗不 定芽的分化具有抑制作用，且2 , 4 d 浓度越高抑制作用越强嘲1 。 6 细胞分裂素和生长素常搭配使用来获得最佳的不定芽分化效果。细胞分裂素 和生长素之间的最佳组合可能会因洋桔梗品种或外植体的不同而有差异。 赤霉素在低浓度6 b a 中添) j 【i g a 3 时，生成的愈伤组织增多”；在6 b a 和i b a 存在的情况下，添加适量的g a 3 ，可提高不定芽的分化个数和芽长嘟1 。 1 3 1 2 其他因素对不定芽分化的影响 光照强度洋桔梗不定芽的分化需要足够的光照强度，当光照为1 0 0 0 1 x 时， 不定芽叶片颜色较浅，苗较细弱。 p h 值在诱导不定芽分化的培养基中，p h 值不宜太低，一般保持在6 0 左右 ”“1 ；低d h 值易造成不定芽的玻璃化。 活性炭活性炭对不定芽的形成有抑制作用呻1 。 1 3 2 体细胞胚的诱导 、 在体细胞胚的诱导中，2 , 4 - 1 3 对于胚性愈伤组织的生长是必不可少的。 1 a 芽苗的增殖 当获得转基因植株后，可通过芽苗的增殖，使其在短期内获得大量扩增。 在洋桔梗芽苗增殖中得到的芽，一方面是由顶芽和腋芽萌发生长而来，另一 方面是从茎段基部分化的不定芽。为了保持植株的种质特性，应尽量减少变异， 即增殖的芽应来自于顶芽和腋芽萌发，而不是分化的不定芽。 洋桔梗增殖培养时，高浓度的6 b a 有利于愈伤组织的再分化和不定芽的增 生，并且明显抑制芽的伸长呻s t 当n a a 从0 0 5 m g l 增加到0 1 m g l 时，芽苗的 高度并没有显著性增高，说明在此浓度范围内，n a a 对芽苗的高度没有显著的 促进作用咖1 ；g a 3 可使芽苗的高度增加，在低于0 8 m g l 的浓度范围内，g a 3 浓度 越高，芽苗越高；而当g a 3 浓度高于0 8 m g l 时。芽苗的高度又里下降的趋势1 ： 在6 一b a 存在的情况下，添) i n 0 2 5 或l m g l g a 3 f l , 增加腋芽数，在0 或0 1m g l 6 一b a 情况下，添j n g a 3 可提高芽苗的高度啪1 ；2 ，4 。d 的存在不利于洋桔梗苗的生长，也 不利于其增殖。根据以上研究结果，可以推论；在洋桔梗芽苗增殖中，应使用低 浓度的6 b a ，降低不定芽的分化，减少对芽长的抑制，同时，添加适量的g a 3 来增加腋芽数和提高芽苗高度。 1 5 再生根的诱导 洋桔梗生根较为容易，在未添加激素的1 2 m s 培养基中就能生根，但生根率 7 前言 和生根数都较低“。 1 5 1 植物激素对洋桔梗生根的影响 在洋桔梗生根培养中，添加的激素主要有n a a 、i b a 和i a a 。 低浓度的n a a 有n 于生根，而高浓度n a a 抑制生根，当n a a 的浓度 o 5 m g l 时，芽基部形成大量愈伤组织，从愈伤组织上产生大量的不定根删， 着生于愈伤组织上的不定根容易随愈伤组织一起从茎段基部脱落，并且密被根毛 的不定根黏附较多的琼脂，移栽时不易清洗“。苗移栽成活率低：当n a a 的浓 度 o 5 m g l ，特别是在0 1 o 3 m g l 之间时，生根率高，且芽的基部切口处无明 显愈伤组织，根短而粗壮，即根的维管束同苗的地上部分的维管束是相通的，利 于炼苗成功“：另外还发现：在一定浓度范围内，随着n a a 浓度的增加， 根粗和根毛数量也有增加的趋势唧1 。 当i b a 浓度 l m g l 时，芽的基部形成的愈伤组织较少，根直接生于芽的基 部。绿色、较粗壮“：在一定浓度范围内，芽苗生根率随i b a 浓度的提高而增 加，根长度、根粗、根毛数量1 随i b a 浓度的提高有下降的趋势。 当i a a 浓度为0 5 m g l 时，生根率较高呻1 ，根直接着生于芽的基部，利于炼 苗。 根据以上研究结果，可知：低浓度的生长索利于生根，且生出的根健壮、根 毛较少。苗移栽成活率高。 1 5 2 其他因素对洋桔梗生根的影响 活性炭活性炭不利于洋桔梗的生根“6 州。 糖浓度糖浓度对洋桔梗生根影响显著，5 0 9 l 阼t 有利于生根“。 无机盐浓度盐浓度较低时，如1 4 m s ，有利于生根。 琼脂琼脂有利于苗的生长，无琼脂的培养基中小苗的长势弱“”。 1 6原生质体的离体再生植株 洋桔梗的原生质体培养主要采用液体培养法和固液结合培养法( 如：念珠 培养法) m 1 。 在洋桔梗的原生质体培养中，结冷胶( g e l l a ng u m ) 中添加1 ( w v ) 的活性 炭有利于原生质体团的形成m 1 。原生质体的稳定性和后续的生长对钙离子浓度 和生长调节物有依赖性“；常用甘露醇作为原生质体培养的渗透压稳定剂1 ；在 8 前言 等渗或渗透压稍大的液体中培养原生质体“”；除此之外，在再生植株性状的稳定 性方面也有一些报道，例如：“b i e o l o r p u r p l e ”的再生植株中双色花的频率比种 苗的要低”：k u n i t a k e 等通过原生质体再生的8 个品种中，有一种的形态学结构、 生长习性和繁殖力等与种苗没有差异鲫1 。 洋桔梗的离体培养的研究为其高效的基因转化奠定了重要基础。 2 基因转化 2 1 转化的受体材料和方法 在洋桔梗的基因转化中，很多材料都可以作为转化受体，如：叶片、茎、根、 悬浮细胞等。根据受体材料的不同，可选用合适的转化方法。迄今至少有农杆菌 介导法和基因枪法两种方法在洋桔梗基因转化研究中得到了应用。农杆菌介导法 与其他方法相比，具有转化效率高、转基因拷贝数低、可转化大片段d n a 、操 作简便、费用低廉等优点呻1 ，因而成为洋桔梗基因转化的首选方法。在洋桔梗的 基因转化的研究中，以叶片为受体材料利用根癌农杆菌“”1 或发根农杆菌”7 ”介 导的基因转化最为常见。基因枪介导的基因转化是一种物理过程，不受受体基因 型的限制，且受体范围广泛，几乎包括所有具潜在分化能力的组织或细胞“”。目 前用基因枪介导转化洋桔梗的悬浮细胞1 、茎和根m 1 已获得成功。 2 2 转化的目的基因及转基因植株的性状 在洋桔梗转基因的研究中，一部分是以建立其遗传转化体系为目的，另一部 分是为了改变洋桔梗花色、开花时间等性状，来筛选优良的转基因品种的。 在以建立其遗传转化体系为目的的研究中，所转的外源基因主要局限于选择 标记基因n p t l l ( 新霉素磷酸转移酶基因) 帆”“、b a r “”( 草丁膦乙酰转移酶 基因) 以及报告基n g u s ( 3 - 葡糖醛酸酶基因) 缸“。“1 。 在以改变性状为目的的研究中，除以上选择标记基因和报告基因外，主要的 目的基因有：反义c h s ( 查尔酮合成酶) e d n a 、u f g t ( 类黄酮一3 - o - 葡萄糖 基转移酶) e d n a 、l f y ( 花分生组织特征基因) e d n a 、r o l 基因和t s w v ( 番茄斑萎病毒) 基因等。 反义c h se d n a 和u f g te d n a 是与花色有关的基因d e r o l e s 等将c h s e d n a 导入洋桔梗中，研究发现，从紫花系获得的转基因植株占总转基因植株的 5 0 以上，其花色差异较大，在紫花自条纹和全自问渐变。检测结果表明：花色 9 前言 的改变是由于反义c h se d n a 的插入造成了c h s 基因的转录水平降低以及相应 的酶活性降低；大多数转基因株系自交后，性状不稳定，在后代中发生改变或丢 失。s e h w i n n 等将u f g te d n a 导入洋桔梗中，在获得的四个转基因株系中。 有一株系可产生高水平的u f g t ，u f g t 可促使3 一o 一葡糖基花青昔和3 o 一葡糖 基黄酮醇的形成，从而影响洋桔梗的花色嗍。 z a c 七a i 等将调控花分生组织启动的l f y 类基因导入洋桔梗中，获得转基因 植株的f 1 代比对照早两个星期开花”1 。h a n d a 等将携带r o l 基因的t i - d n a 导 入洋桔梗中，获得的转基因植株矮化、叶片卷皱、花冠杯型，其后代也出现了植 株矮化，一些植株还出现种子减少的现象。s c m e d a 等将t s w v 基因转入洋桔 梗中，在转基因植株中检测到病毒核蛋白的表达。 2 3 洋桔梗基因工程中的问题和发展方向 在离体培养洋桔梗叶片时，不定芽的分化主要集中在与主脉垂直的两端切 口，与主脉平行的切口处很少分化；面在基因转化中，叶片与农杼菌共培养后， 再置于具有选择压的培养基上筛选转化体时，不定芽的分化主要集中于与圭脉平 行的两边或者叶片的四角处呻1 。从以上研究可知：洋桔梗叶片易于转化的部位和 易于分化不定芽的部位不一致。这可能是农杆菌介导转化洋桔梗时转化频率不高 的原因之一。所以在基因转化中，如何对洋桔梗叶片进行切割，来提高转化频 率，值得进一步研究。 洋桔梗与牵牛花和菊花相比，农杆菌介导的转基因转化频率较低且“潜逃” 的个体( 非转化个体) 较多删。如何优化培养条件和转化条件等来提高转化频率 并减少“潜逃”个体，是洋桔梗转基因的研究方向之一。 洋桔梗转基因方面虽然有了些报道，但获得的可市场化的转基因洋桔梗并 不多，可能与很多转基因植株性状不稳定，在遗传给下一代时容易改变或丢失有 关，所以筛选性状稳定性高的转基因植株至关重要。 目前洋桔梗的基因转化主要集中在改变花色上。以市场为导向，获得更奇美、 香溢、抗病性强的转基因植株必然成为未来洋桔梗转基因育种的发展方向。 四论文的研究目的、内容和创新性 洋桔梗是目前国际上较流行的切花之一。在洋桔梗生产过程中，洋桔梗病害 引起的减产是不可忽略的，特别是真菌性病害。分子育种新技术一植物基因工 1 0 程可将外源抗病基因( 如，几丁质酶基因) 导入宿主植物，定向、高效地培育出 抗病种质，为洋桔梗真菌病害的防治提供了一条有效途径。 本论文的完成，在查阅和参考大量相关文献的基础上，以设计科学合理的实 验为前提，选用目前市场上较流行的洋桔梗“d o u b l e m a r i a c h i p i n k ”品种为试材， 建立了其高频离体再生系统；构建了菜豆几丁质酶基因植物表达载体，并用菜豆 几丁质酶基因转化洋桔梗，筛选出了抗k m 苗，并对其进行了p c r 检测，为进 一步培育抗真菌病害的洋桔梗新品种奠定了重要基础。 第一章赤霉素对洋桔梗幼苗生长的影响 第一章赤霉素对洋桔梗幼苗生长的影响 切花洋桔梗( e u s t o m a g r a n d i f l o