（动物遗传育种与繁殖专业论文）脂肪酸诱导鹅肝细胞差异表达基因的筛选和鉴定.pdf

摘要 在动物肝细胞内，甘油三酯( t g ) 的异常沉积导致肝脂肪变性。将游离脂肪酸 ( f f a s ) 添加到肝细胞中可导致肝脂肪变性，但是关于f f a s 与t g 的异常沉积之间 联系和脂肪沉积相关基因的差异表达的机制目前还不清楚。本研究以四川白鹅( a n s e r c y g n o i d e s ) 为研究对象，利用抑制消减杂交技术构建了f f a s 诱导的肝脂肪变性细胞 和正常肝细胞差异e d n a 文库，对文库中序列进行了功能注释和分类，初步揭示了 f f a s 诱导后肝细胞差异表达基因的种类和数量，这为从分子水平探讨肥肝的机理奠 定了基础。本研究取得的主要结果如下： 1 采用添加l m m 游离脂肪酸混合物f f a s 到鹅原代肝细胞中培养3 6 h ，成功建立 肝细胞脂肪变性的细胞模型。 2 应用抑制性消减杂交技术成功构建了正常肝细胞与脂肪变性肝细胞正反向 s s h 文库。正向文库( s s h 一1 ) 扩增后获得1 3 4 4 个克隆，反向文库( s s h 2 ) 扩增后获 得11 5 2 个克隆。应用斑点杂交筛选阳性克隆测序，s s h 一1 文库有3 0 个测序成功，s s h 2 文库有2 3 个测序成功。 3 对去除载体序列和接头序列后的e s t 通过b l a s t n 进行在线d n a 序列同源性 比较分析得到：s s h 1 获得2 3 个已知基因，占克隆测序的7 6 7 ；已知e s t 有6 个 占2 0 ；全新e s t 有1 个占3 3 。其中s s h - 2 文库已知基因有1 8 个占克隆测序的 7 8 3 ；已知e s t 有1 个占4 3 ，全新e s t 有4 个占1 7 4 。 4 s s h 文库共获得已知基因4 1 个，对e s t 功能分类发现，细胞结构和运动占已 知基因的2 ，细胞信号和传导占1 2 ，翻译核糖体结构和功能占2 5 ，细胞转录占 5 ，细胞凋亡占2 ，物质转运占1 7 ，物质代谢占2 2 ，未知基因占1 5 。 5 a l d o b 、t g m 3 、r p l 家族( 即三刀、r p l 2 3 、剐呓3 9 、刷呓5 ) 、a p o r t 等这些 差异表达的e s t 序列与新基因片断在肝细胞的生长或脂肪代谢等过程中起了重要作 用，为进一步研究肝脂肪变性提供了线索。 关键词：抑制消减杂交；原代肝细胞；肝脂肪变性；差异表达基因 s c r e e n i n ga n d i d e n t i f i c a t i o no fd i f f e r e n t i a l ye x p r e s s e dg e n e si n g o o s eh e p a t o c y t ei n d u c e db yf r e ef a t t ya c i d z h o uz e - h u i ( a n i m a lg e n e t i c s ，b r e e d i n ga n dr e p r o d u c t i o n ) d i r e c t e d b yp r o f w a n gj i - w e n a b s t r a c t ：h e p a t i cs t e a t o s i sr e s u l t sf r o mt h ee x c e s s i v ea c c u m u l a t i o no ft r i g l y e r i d e s ( t g ) i nt h ea n i m a ll i v e r f f a sc u l t u r e dw i t hh e p a t o c y t e sc o u l di n d u c eh e p a t o c y t e ss t e a t o s i s ， b u ti th a sb e e nn o tc l e a ra b o u tt h er e l a t i o nb e t w e e nf f a sa n dt ga b n o r m a ld e p o s i t i o n ，a n d t h em e c h a n i s mo fd i f f e r e n t i a l ye x p r e s s e dg e n e si n f a td e p o s i t i o n i nt h i ss t u d y ，u s i n gt h e s i c h u a nw h i t eg e e s ea sm a t e r i a l ，w ec o n s t r u c tt w of o r w a r da n dr e v e r s es s hc d n a l i b r a r i e sb e t w e e nt h en o r m a lh e p a t o c y t e sa n dt h es t e a t o s i sh e p a t o c y t e s b yh o m o l o g y a l i g n m e n ta n df u n c t i o na n n o t a t i o n ，w ed i s c o v e r dt h es o r t s a n dq u a n t i t yo fd i f f e r e n t i a l y e x p r e s s e dg e n e si nf f a si n d u c e dh e p a t o c y t e s ，w h i c hw o u l dp r o v i d ea b i a sf o re l u c i d a t i n g t h em e c h a n i s mo ff a t t yl i v e ri nt h em o l e c u l a rl e v e l t h er e s u l t sw e r es h o w na sf o l l o w s ： 1 t h e h e p a t o c y t e s t e a t o s i sm o d e l sw e r ee s t a b l i s h e ds u c c e s s f u l l yi n d u c e db y l m m o l m lf f a sf o r3 6 d 2 d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e d c d n a l i b r a r y w e r ec o n s t r u c t e du s i n gs u p p r e s s i o n s u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n 13 4 4p o s i t i v ec l o n e sw e r eo b t a i n e di ns s h 一1 ，1 15 2p o s i t i v e c l o n e sw e r eo b t a i n e di n s s h 2 s s h 1l i b r a r yh a d3 0s u c c e s s f u ls e q u e n c e s ，a n ds s h 一2 l i b r a r yh a s2 3s u c c e s s f u ls e q u e n c e s 3 as e a r c hf o rs e q u e n c eh o m o l o g yi nt h eg e n b a n ka n de s td a t a b a s eb yb l a s t n r e v e a l e dt h a tt h ed i s t r i b u t i o no fs s h - 1e s tc l u s t e r sf o rh i 曲h o m o l o g yg e n e s t h eh i 曲 h o m o l o g yg e n e s ，h i g hh o m o l o g ye s t sa n dn o v e le s t sw e r e 2 3 ，6a n di , a n d t h ep r o p o r t i o n w e r e7 6 7 ，2 0 a n d3 3 i ns s h - 2 ，t h eh i g hh o m o l o g yg e n e sa n dn o v e le s t sw e r e 19 ，la n d4 ，a n dt h ep r o p o r t i o nw e r e7 8 3 ，4 3 a n d17 4 4 t h ep r o p o r t i o n so ft h eh i g hh o m o l o g yg e n e sw a s41 i ns s hl i b r a r y c a t e g o r i e so f f u n c t i o n se s t s ：也ep r o p o r t i o n so fe e l ls t r u c t u r e m o v e m e n tw a s2 ，l ec e l ls i g n a fc o n d u c t i o n w a s12 ，s l a t i o n e x p r e s s i o nr e g u l a t i o nw a s2 5 ，t r a n s p o r t e r sw a s5 c e l la p o p t o s i sw a s2 ， m a t e r i a lc o n v e y i n gw a s 17 ，m e t a b o l i s m da n du n k n o wg e n ew e r e2 2 a n d15 o fc o u r s e ， t h eg e n e si n v o l v e di nm e t a b o l i s ma n dt r a n s p o r t e r sw e r er i c he x p r e s s e d 5 r o l e so fd i f f e r e n tc h a r a c t e rf e a t u r eo fp a r t i a ld i f e r e n t i a l l ye x p r e e s e dg e n e si nt w o g e e s eb r e e d s w e r ep r e s u m e db a s e do nr e f e r e n c e sa n do u rr e s e a r c hr e s u l t s r p ( r p l 2 2 ，r p l 2 3 ，r p l 3 9 , r p l 5 ) ，t g m 3 , f a b p , t h b s l ，a n da p o hw e r ec o n s i d e r e dp l a y i n g a ni m p o r t a n tr o l ei nd i f f e r e n tc h a r a c t e rf e a t u r ei nd i f f e r e n tg e e s e t h e ya r et h eb i o l o g i c a l f u n c t i o no fp r o v i d i n gt h em a t e r i a la n dt h e yp r o v i d eac l u ei ns e a r c h i n gt h ei m p o r t a n tg e n e s r e l a t e dt ot h eh e p a t i cs t e a t o s i sa n dt h ef o i eg r a s k e y w o r d s ：s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ( s s h ) ，p r i m a r yg o o s eh e p a t o c y t e ， h e p a t o c y t es t e a t o s i s ，d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dg e n e 主要英文缩略词语 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机 构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：f 日；幸毛 关于论文使用授权的声明 加g 年占月a 7 日 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意i 四j i i 农业大学可以用不 同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名：i 毯泽是 导师签名：耽0 俐年 珈3 年 ， d 月df 日 6 月7 7 日 l 刖吾 肝脏脂代谢平衡的破坏会导致大量的甘油三酯( t r i a c y l g l y c e r o l ，t g ) 沉积在肝 脏，从而产生肝脂肪变性【1 1 。人类的肝脂肪变性是2 l 世纪医学发展的最普遍和最有挑 战性的问题，然而与人类不同的是家禽有代谢适应性，他们的肝脏在肝脂肪变性和复 性的过程中不会硬化和坏死【2 1 。在水禽生产中就是利用这种特殊的生理功能，通过人 工对鸭或鹅填饲大量以玉米为主的碳水化合物饲料，致使其肝脂肪变性而生产肥肝。 但目前对肝脂肪变性的研究绝大多数集中在人、小鼠等哺乳动物中，并且对肝脂肪变 性的具体机制仍不清楚。因此，筛选与肝细胞脂肪变性相关的差异表达c d n a 片段， 对深入研究脂肪酸在肥肝形成过程中的分子水平机制及其代谢途径等具有十分重要 的理论意义。 1 文献综述 1 1 脂肪的合成与分解 机体内脂肪即甘油三酯或称之为三酰甘油( t g ) ，它是由1 分子甘油与3 分子脂 肪酸通过酯键相结合而成。各种组织中的脂肪都不断的进行更新，一方面外源性的脂 肪通过血浆转运，以游离脂肪酸( f r e ef a t t y a c i d ，f f a ) 形式进入脂肪细胞，再合成 脂肪储存，而体内的内源性脂肪主要在肝脏中合成，也通过血浆转运而进入脂肪细胞 储存；另一方面储存的脂肪不断降解，以f f a 形式进入各组织被氧化利用，使脂肪 代谢处于动态平衡中。因此，f f a 在脂肪代谢中起到枢纽作用。 1 1 1 脂肪合成代谢 机体摄入糖、脂肪等食物均可合成脂肪在脂肪组织储存，以供禁食或饥饿时的需 要。t g 是机体储存能量的形式，t g 水平决定家禽的脂肪组织发育、脂肪沉积及蛋 黄的形成【3 j 。肝、脂肪组织及小肠是合成t g 的主要场所，以肝的合成能力最强；合 成t g 所需要的甘油及脂肪酸主要由葡萄糖代谢提供，机体在摄入碳水化合物等食物 后，在消化道以葡萄糖的形式吸收，经过磷酸戊糖途径【4 1 以及糖酵解途径生成乙酰辅 酶a ，在脂肪酸合成酶( f a t t y a c i ds y n t h a s e ，f a s ) 的作用下在肝细胞内大量合成脂 肪酸，通过3 氧化降解或与a 磷酸甘油反应生成t g 。 血浆中的脂肪酸一部分进入肝，在肝中酯化生成t g 暂时贮存。p i c a r d 等研究发 现，肝生成的极低密度脂蛋白( v e r yl o wd e n s i t yl i p o p r o t e i n s ，v l d l ) 颗粒中的t g 绝大多数来自于脂肪组织所释放的脂肪酸，这些脂肪酸进入肝中，经酯化生成t g ， l 并暂时贮存于脂滴中f 5 1 。y a l s u h a r a 等认为肝脏贮存t g 的能力虽然十分大，但也是有 限的【2 1 。血浆游离脂肪酸( n o n e s t e r i f i e df a t t ya c i d ，n e f a ) 浓度需要严格控制，因 为脂肪组织释放进血浆的脂肪酸量，比需能组织所氧化的脂肪酸的量多得多。从血浆 中吸收的外源性脂肪酸与通过从头合成方式生成的内源性脂肪酸，或被氧化，或经甘 油二酯酰基转移酶( d i a c y l g y c e r o la c y l t r a n s f e r a s e ，d g a t l ) 的催化而合成t g 旧。 1 1 2 脂肪分解代谢 储存在脂肪组织的脂肪被脂肪酶( 1 i p a s e ) 逐步水解为f f a 和甘油，并释放入血 液供其它组织氧化利用的过程称为脂肪的分解代谢，也叫脂肪的动员。脂肪组织释放 进血浆的脂肪酸，不仅是激素敏感性脂酶( h o r m o n es e n s i t i v el i p a s e ，h s l ) 对贮于 脂肪组织内t g 作用的结果，而且也来自脂蛋白脂酶( l i p o p r o t e i nl i p a s e ，l p l ) 所 介导的乳糜微粒和v l d l t g 的脂解，因为脂解产生的脂肪酸并非全部都能进入脂肪 组织被再度酯化【7 】。脂肪动员产生的甘油溶于水，直接由血液运送至肝、肾和肠等组 织，在甘油激酶的作用下，转化为3 磷酸甘油，循糖代谢途径分解或转化为糖。生成 的f f a 不溶于水，与血浆清蛋白结合后，运送到机体各个组织，主要被心、肝和骨 骼肌摄取利用，经过p 氧化，分解为c 0 2 和h 2 0 ，释放出大量能量【8 】。 1 2 肝脂肪变性研究 1 2 1 肝脏脂肪酸的生成 如图l 所示，葡萄糖或胰岛素引起肝中t g 积聚时，会出现一系列的分子和生理 性调节。对肝t g 积聚的传统解释是肥胖和胰岛素抵抗，导致脂肪细胞中f f a 的释放 增加。通过提高h s l 的活性来增加脂肪细胞团和t g 的水解，从而导致血浆游离脂 肪酸( f f a ) 水平的上升 9 1 。肝中f f a 的吸收速率上升与血浆f f a 浓度相适应2 1 。肝 脏吸收的f f a 通过两条途径代谢：氧化产生a t p 或酯化产生t g ，t g 或者被组装成 v l d l 微粒输出，或者储存在肝内，这两条途径破坏其任一条都将导致肝脂肪变性。 到达肝的脂肪酸流量的增加，会促进t g 的生成而诱发肝脂肪变性。当增加外源 性脂质如进食高脂食物，肝t g 含量升高 10 1 。在小鼠中，饲喂高脂食物1 0 天内肝 t g 含量增加。整晚禁食后，因外周氧化需求而引起血浆f f a 的可利用量升高，血浆 中过多的脂肪酸是以t g 形式所容纳，经循环而进入肝组织，使到达肝的脂肪酸流量 增加，诱发肝脂肪变性【1 1 1 。某些营养因子也能促使脂肪组织分泌一些激素如瘦素 ( 1 e p t i n ) 、脂联素( a d i p o n e c t i n ) 、抵抗素( r e s i s t i n ) ，这些激素通过改变到达肝的脂 2 肪酸流量而调节肝中t g 含量【”】。实验证明，由于不同器官间t g f f a 分配的打乱而 引起运输到肝的脂肪酸的量增加，从而导致肝脂肪变性i ”阍。 囤l 肝脏中脂肪酸的生成 f i 9 1 t h ep r o d u c t i o no f l i v e r f a t t ya c i d 肝内葡萄藉代谢的改变会促进肝脂肪生成而诱发肝脂肪变性 1 ，进食高能碳水化 合物，使到达r j 静脉的葡萄糖浓度大大升高这样就增加肝组织脂肪酸的合成，进而 促进脂肪酸的酯化而生成更多的t g 。当肝脏中葡萄糖超载时，就会发展成具有高糖 元含量的肝脂肪变性m i 。m o d e v i t t 4 1 等和g a u t h i e r t 等利用高蔗糖饲喂鼠引发肝脂肪 变性是通过增加脂肪从头合成所致。b a n d s m a t ”1 等研究发现，$ 4 0 4 8 对葡萄糖6 磷 酸酶的抑制引起肝对葡萄糖的吸收增强，而促进脂肪生成，结果几小时后，肝就发生 强烈的脂肪变性。h e r m i e r 【2 0 3 “、f o u m i e l 2 2 1 与d a v a i l 1 等对鸭和鹅进行填饲高能碳水 化合物，研究肥肝易感性的品种差异，结粜发现从头合成方式的肝脂肪生成也极显著 地增加。 1 2 2 肝脂肪变性发生的分子机制 肝脏作为能量代谢的中枢器官，在脂类代谢中起着十分重要的作用。肝细胞内的 脂质总是处于动态平衡状态。肝脏脂质代谢稳态的变化是构成各种形式脂肪肝的基 础，而肝脏脂质代谢又受许多相关蛋白的调控和影响。 12 21 固酵调节元件结合蛋白一l c ( s r e b p 1 c ) 肝脏内脂肪酸的从头合成受到胰岛素和葡萄糖独立调控，几种转录因子和激酶可 能介导胰岛素和葡萄糖对脂肪生成酶的转录和活性的调节。膜结合转录因子固醇调节 元件结合蛋白1 c ( s r e b p i c ) 在转录水平介导胰岛素对脂肪酸生成的调节【2 4 】。 s r e b p i c 是s r e b p 三种异构体中的一种，属于b h l h z i p 家族的转录因子。在细胞核 3 中，s r e b p 1 c 可激活脂肪合成所需的所有基因的转录【2 5 1 ，过度表达会使脂肪合成相 关的酶基因转录明显加强，造成肝脏脂质积聚，引起脂肪变性。转基因小鼠的肝脏中， 由于s r e b p 1 c 的过度表达致使脂肪合成增加，从而导致典型脂肪肝的产生。研究人 员还发现，在患有胰岛素抵抗、糖尿病和肥胖病的啮齿动物模型中，脂肪酸合成速度 的增加导致了脂肪肝的发生。通过图1 可以看出，胰岛素也可以通过调控s r e b p 1 c 的 转录来调节大部分涉及脂肪酸合成的酶的表达。 s r e b p 1 c 也能激活乙酰辅酶a 羧化酶2 ( a c c 2 ) 2 5 】，a c c 2 是a c c 的同分异 构体，可以在线粒体膜产生苹果酸辅酶a ，苹果酸辅酶a 的增加是由于肉毒碱棕榈 酰基转移酶1 ( c p t - 1 ) 的抑制作用降低了脂肪酸的氧化，c p t 可将脂肪酸转运到线 粒体。在肝的脂肪酸的代谢中，a c c 2 具有重要的作用。a c c 2 敲除小鼠能抵抗肥胖 病，这是由于c p t - 1 活性的增加，导致脂肪酸氧化速率的增加【2 6 1 。 1 2 2 2 碳水化合物反应元件结合蛋白( c h r e b p ) 碳水化合物( 葡萄糖) 对脂肪生成的诱导在转录水平上被另一个转录因子碳水化 合物反应元件结合蛋白( c h r e b p ) 所介导【2 7 1 。葡萄糖可促进c h r e b p 从胞质进入细 胞核并与d n a 结合，并能独立诱导所有脂肪生成所需酶。葡萄糖激活c h r e b p 与肝脏 型丙酮酸盐激酶( l p k ) 启动子的e 盒结合，从而激活l p k 。最近敲除小鼠c h r e b p 的实验证明：l p k 的表达在肝脏中降 f 氐9 0 ，并且出人意料的发现，所有脂肪酸合成 酶的m r n a 水平也降了约5 0 e 2 引，这表明c h r e b p 可以单独激活所有生脂酶基因的转 录。因此，l p k 的激活可以刺激糖酵解和脂肪生成，从而在能量过剩情况下有利于葡 萄糖到脂肪酸的转化。 1 2 2 3 过氧化物酶体增殖物激活受体y ( p p a ry ) 在啮齿动物中，第三个参与肝脂肪变性的转录因子是过氧化物酶体增殖物激活受 体y ( p p a ry ) ，它是正常脂肪细胞分化所需的核激素受体超家族成员【2 9 】。通常p p a r y 在肝脏中的表达非常低，然而，在脂肪肝动物模型中其表达显著上调。以前的研究 表明s r e b p 1 c 可以在转录水平激活p p a ry ，并且s r e b p 1 c 是通过刺激受体的活 化配体的产生来对p p a rg 进行活化。脂肪肝中p p a r 表达的重要性已经在两种不同 的胰岛素抵抗小鼠模型p p a ry 的剪切过程得到阐述，这两种小鼠分别是o b o b 小鼠 和脂类营养不足的转基因小鼠( 称为a z i p f 1 ) ，这种a z i p f 1 小鼠由于白色脂肪组 织的不足和瘦素的缺乏而导致胰岛素抵抗。在o b o b 3 0 】或a z i p f 1 【3 1 】小鼠的肝脏中， 肝脂肪p p a ry 基因的剪切显著地减少了肝脂肪变性的发生，而与胰岛素过多症和胰 4 高血糖症无关。但是关于p p a ry 精确的分子调节机制是否促进了肝脏中三酰甘油的 沉积还未完全研究清楚。 1 2 2 4a m p 激活蛋白激酶( a m p k ) a m p 激活蛋白激酶( a m p k ) 是具有细胞能量感受器功能的异三聚体蛋白【3 2 1 ， a m p k 被细胞内浓度升高的a m p 所激活，这是细胞内能量存储下降的标志。激活的 a m p k 通过直接磷酸化调节蛋白或间接通过影响这些途径的基因表达水平，从而刺 激a t p 产生的代谢途径( 如脂肪酸的鼻一氧化) ，并抑制a t p 消耗的途径( 如脂肪生 成) 【3 2 1 。 肝的脂肪酸结构也可以通过改变a m p k 活性影响积聚的t g 含量。s c d 1 的遗 传缺失，使抵抗小鼠中脂肪肝和胰岛素抵抗的发展。s c d 1 缺失时，a m p k 被激活【3 3 】， 导致磷酸化作用并抑制a c c 3 4 1 和c h r e b p 3 5 】及s r e b p 1 c 3 司表达水平的下降。治疗 糖尿病的药物二甲双胍可以激活肝中a m p k ，并减少o b 0 b 小鼠模型肝脂肪变性3 7 1 。 总之，这些研究表明肝中脂肪生成的增加是一个重要的代谢异常，隐含了胰岛素抵抗 的肝脏中脂肪变性的发病机理。脂肪生成的增加可以积聚引起代谢双改变，那将会导 致肝中t g 浓度的增加。第一个改变是直接的通过t g 合成的增加，第二个是间接的 通过苹果酸辅酶a 产物的增加，这会抑制c p t - 1 和脂肪酸进入线粒体从而降低伊氧 化，提高脂肪酸和t g 的积聚。还要必须指出的是，内源脂肪酸合成能显著导致脂肪 变性的结论是基于在小鼠上的研究。在人体上进行的稳定同位素研究表明脂肪酸的从 头合成对肝脏中甘油三酯的合成影响不大。 1 2 3 水禽肝脂质代谢相关基因的研究进展 脂质代谢在整个机体的生命活动中起着十分重要的作用，并受内外环境共同作用 的调控，这种调控是通过调节其代谢途径中蛋白质活性或相关基因表达而实现的。因 而，参与脂质代谢的基因，在不同的环境下表现出表达差异。而脂质代谢相关基因的 表达差异研究又包括脂质合成、氧化与分泌代谢的相关基因表达差异研究。针对脂质 合成、氧化代谢相关基因的表达差异，我们总结了本实验室及其他学者所做的一些研 究。 1 2 3 1 脂质合成相关基因 m o u r o t 等研究肝脂肪生成在鹅肥肝易感性中的作用时，分析比较了生酯基因m e ( 苹果酸酶) 、g 6 p d h ( 6 磷酸甘油酸脱氢酶) 、a c x ( 乙酞辅酶a 羧化酶) 和f a s ( 脂肪酸合成酶) 在填饲后的朗德鹅与波兰鹅间的表达差异，测定了这些酶的活性及 s 用n o r t h e r n 印迹分析( n o r t h e mb l o ta n a l y s i s ) 法量化了m e 的m r n a 表达丰度【1 7 1 ， 研究得到朗德鹅肝组织中m e ( 苹果酸酶) 活性比波兰鹅高出2 倍多，且与血浆v l d l 浓度呈正相关。刘祥友( 2 0 0 5 ) 在对朗德鹅与溆浦鹅在填饲期间的肝脂代谢差异研究 发现，v l d l 、m e 可能是这两个品种鹅肥肝形成过程中差异的主要原因，进行肥肝 鹅的选育时可视为主要的遗传因子【3 引。 1 2 3 2v l d l t g 合成与分泌相关基因 d a v a i l 等在研究鸭脂质代谢的填饲效应时，对肝外l p l 活性在填饲前后及不同 基因型鸭中的差异进行了分析【3 9 】。结果表明北京鸭较番鸭和骡鸭肥肝易感性弱，但肝 外肌肉组织与脂肪组织的生长强度较大。原因是填饲后高胰岛素水平使北京鸭l p l 活性维持在一定的水平，而番鸭与骡鸭填饲后l p l 活性显著降低。许恒勇 4 0 】( 2 0 0 5 ) 研究了l p l 活性在朗德鹅与四川白鹅两个品种间的表达差异。证明了l p l 活性低时 朗德鹅肝脏脂肪沉积多，而l p l 活性高时四川白鹅肝外脂肪组织一皮下脂肪和腹脂中 脂肪沉积多。他们还同时比较了同一品种预填和添饲后、不同脂肪组织的三彪表达 差异得出腹脂中三凡的表达增量高于皮脂中的增量。 叶建强【4 l 】( 2 0 0 5 ) 在研究m 冲的表达特性、不同生长时期肝脏与小肠中m 冲 的表达规律；对比填饲组与对照组m t p 表达水平。研究发现，填饲引起鹅m t p 基因 在肝组织中表达水平降低，而在小肠组织中表达水平升高；表明在肝脏与小肠中，填 饲效应对m t p 表达的影响不同。 蒋立 4 2 】( 2 0 0 5 ) 研究d g a t 2 在品种间的表达差异，得出d g a t 2 在朗德鹅中肝 的表达显著抑制肝t g 含量的增加，在四川白鹅中显著促进血浆t g 浓度上升。兰英 【4 3 】( 2 0 0 6 ) 研究表明肝中d g a t 2 酶活性及m r n a 丰度对朗德鹅的下调节效应大于四 川白鹅，这可能与胰岛素的抑制作用有关：在肝脏t g 合成上，d g a t 2 对朗德鹅上 调效应大于四川白鹅，这可能是导致四川白鹅肝脏脂肪沉积能力低于朗德鹅的原因。 蒋立【4 2 】( 2 0 0 5 ) 对填饲与对照研究鹅血浆v l d l 、t g 浓度差异表达发现：填饲 组中血浆v l d l 、t g 浓度显著高于对照组：四川白鹅的血浆v l d l 水平显著高于朗 德鹅，且与肝重率显著正相关。这表明四川白鹅血浆中y l d l 水平是肝中脂质合成与 外周组织脂质的吸收利用之间一个较好的平衡因素。朗德鹅较低的肝d g a t 2 酶比活 性和较低的肝外l p l 活性，使得肝v l d l t g 分泌部分受阻与血浆中v l d l t g 利用 减少，从而引起更多地返回肝脏并贮存，最终导致肝中t g 含量急剧上升而形成极度 脂肪变性的“肥肝”。 6 1 3 表达序列标签( e s t ) 技术及其应用 1 3 1e s t 概念及原理 表达序列标签( e x p r e s s e ds e q u e n c et g s ，e s t ) 是c d n a 的部分序列，长度一般 为1 5 0 5 0 0 b p ，由大规模c d n a 克隆一次性测序得到。由于c d n a 的5 端或3 端 的有限序列可特异性地代表一个基因，故被称为“表达序列标签”阻】。e s t 技术是 将m r n a 反转录成c d n a 并克隆到载体构建成c d n a 文库之后，大规模随即挑选 c d n a 克隆进行测序，对其5 端或3 端进行一步法测序，所获序列与基因数据库已知 序列作比较，从而获得对生物体生长发育、繁殖分化、遗传变异、衰老死亡等一系列 生命过程认识的技术。 e s t 是e d n a 上对应于m r n a 的一个片段，其技术原理就是基于中心法则和 c d n a 的特性。基因表达遵从中心法则，在此过程中遗传信息的流向为d n a r n a 一蛋白质，即遗传信息由d n a 序列经转录、剪接后流向m r n a ，再经翻译，产生有 功能的蛋白质。典型的真核生物的基因在转录后形成前体m r n a 分子，再经过剪接、 加帽、加p o l y a 尾和编辑等过程，才能成为成熟的m r n a 分子。绝大多数真核生物 成熟m r n a 分子由57 端转录非翻译区( 5 u n t r a n s l a t e dr e g i o n ，5 u t r ) 、开放阅读框架 ( o p e nr e a d i n gf r a m e ，o r f ) 、3 端转录非翻译区( 3 u n t r a n s l a t e dr e g i o n ，3 u t r ) 3 部 分组成，其c d n a 也具有对应的结构。绝大多数c d n a 的5 u t r 和3 u t r 都是特定 的，即每条c d n a 的5 端或3 端的有限序列即可特异性代表生物体某种组织某个时期 的一个表达基因。只要获得一段e s t ，就能够以之为基础研究基因的表达情况、追溯 m r n a 和d n a 序列、克隆全长c d n a 序列和预测蛋白质的结构和功能等等。 1 3 2e s t 的应用现状 1 3 2 1 分离和鉴定新基因 发现新基因是当前国际上基因组研究的热点，使用生物信息学方法预测新基因是 后基因组时代必不可少的方法，而基因预测所使用的数据主要来自e s t s 序列数据库 和基因组数据库。利用对某一特异组织或某一生长发育阶段的c d n a 文库，进行随 机部分测序所得的e s t s ，作为查询项在d b e s t 中进行同源查找，同时将由e s t s 序 列按密码子推出的氨基酸序列作为查询项在蛋白质信息资源数据库( p 瓜) 中进行同 源查找，如果该e s t s 序列及其所代表氨基酸序列在以上数据库中存在同源序列，可 对该e s t s 所代表基因的功能进行分析及鉴定，如果不存在同源序列，则该e s t 所 7 代表的基因有可能是新基因，有必要对其进一步研究。v a nd el o o 4 5 】等第一次成功应 用e s t 方法分离到蓖麻油酸( 1 2 羟基油酸) 生物合成的关键酶基因。b u a r m e 4 6 j 等利 用人类和小鼠的d n a 序列有较高的同源性的特性，他们利用小鼠发育相关基因p c 4 的序列搜寻人的e s t 数据库，发现了一个人的p c 4 同源基因，命名为干扰素相关发 育调节因子l ( ，f 尺d ，) ，而且通过同源性比较确定了一个己知基因s k m c l 5 也是属于 i f r d 基因家族的成员，由此获得了一个新的发育相关基因家族。 1 3 2 2 基因差异表达的研究 一般认为某一时期的基因表达数量通常占全部基因的1 0 0 o , - - 1 5 ，细胞的分化由 基因特异性的时空表达决定。对c d n a 文库随机挑选克隆进行大规模测序，可直接回 答特定组织细胞在某一时期哪些基因表达了、丰度如何等问题，从而能在基因整体水 平研究相关的功能及代谢。如果e s t 来源于不同的e d n a 文库，而每一个文库来自 于一种细胞或器官，那么在不同文库中某一e s t 存在与否反映了细胞或器官表达基 因的特异性，而且e s t 的丰度可以看作是该基因表达量的近似值。 e s t 数据在一定程度上可以作为很好的研究基因表达水平数据资源。但是在对基 因水平研究的时候必须考虑文库的处理过程，特别是单一文库。有些文库经过了均一 化或者差减杂交的处理，这两种处理都改变了文库中特定c d n a 的相对含量。均一化 处理导致的是降低了原始文库中丰度很高的c d n a 的含量，从而在e s t 测序时更容 易获得原始文库中丰度较低的e d n a ；差减杂交处理的目的在于去除另一文库所具有 的所有c d n a ，从而获得那些差异表达基因的c d n a ；故e s t 数量的差异只能粗略 的反映特定细胞或组织相应基因表达量的差异。目前基因差异表达研究是畜禽e s t 研究的主流，如品种差异、肿瘤细胞与正常细胞、同一组织不同时期基因表达产物或 产量的差异等等方面的研究。 1 3 2 3 构建遗传学图谱 遗传图谱、物理图谱和转录图谱是基因组计划要获得的三张遗传学图谱。遗传图 谱的构建依赖于各种遗传标记。以往作为d n a 分子遗传标记的多为限制性长度多态 ( i 强l p ) 标记、扩增片段长度的多态性( a f l p ) 标记、随即扩增多态性d n a ( r a p d ) 标记和重复序列标记等。如今由于e s t 片段多态性高也可以作为分子标记，用来建 立遗传连锁图谱 4 7 , 4 8 】。构建染色体物理图谱需要大量的单拷贝短序列( s e q u e n c e t g g e ds i t es t s ) 作为界标，由于大多数基因是单拷贝的，所以e s t 可以用来充当 s t s t 4 引。转录图谱为染色体d n a 的某一区段内，所有可转录序列的分布图，e s t 为 转录基因的产物，可直接用来构建该图，它可以与基因组文库序列比较，提供内含子 结构、可选择的剪切方式、转录起始与终止位点等信息 5 0 1 。 综合分析已有的遗传图谱、物理图谱和基因图谱，可将基因在染色体上准确定位。 先参考遗传图谱与物理图谱，根据孟德尔遗传特征，将相关基因定位在更狭小范围的 染色体基因组区段，再通过查询以e s t s 为基础的基因图谱，即可获得这一目的基因。 另外，直接用e s t 或其对应的全长e d n a 序列对d b s t s 进行检索，若得到高度同源 的序列标签位点( s t s ) 片段，用其登录号搜索u n i g e n e 数据库，根据其提供的信息 也可将基因定位在特定的染色体区域。 1 3 2 4 用于制各d n a 芯片 d n a 芯片技术是近年来发展起来的研究功能基因组学的新方法，e s t 是用于制 备d n a 芯片很好的基因资源，而芯片技术同样也是目前高通量筛选e s t 的有效方法。 随着更多基因组计划的开展和更多己知基因的累积，将来无需测序只通过d n a 芯片 技术就可研究基因功能。e s t 计划的实施，不仅获得了关于表达基因的信息资源，同 时也获得了大量已鉴定了的e d n a 克隆资源，而这些资源都是功能基因组学研究不可 缺少的。 1 3 3e s t s 研究现状 目前，世界上几个经济大国的几十个著名实验室先后开展了大规模的e s t s 测序， 各个e s t s 测序中心将所获得的成千上万条e d n a 序列进行系统处理；去除r r n a 、 t r n a 和线粒体、叶绿体等非核m r n a 序列，去除重复测定序列、长度小于1 0 0 个核 普酸的序列及碱基不确定率大于5 的质量较差序列，将筛选后得到的约占总量7 0 的e d n a 序列输入e s t s 数据库。表1 统计了登录到n c b id b e s t 中前1 5 种生物e s t s 的数目。 随着人类基因组计划的完成及各种模式生物基因组计划的开展，人们越来越重视 对e s t 的研究。从表1 中可知，排在前1 5 位的哺乳动物有：人、小鼠、牛、猪、褐 鼠和鸡。其中鸡的e s t s 数目排在第1 4 位，而从整个d b e s t 排序中还未找到鹅的e s t s 数目。近年来，d b e s t 文库中e s t s 序列的数目急剧增长，猪和牛的e s t 研究都取得 了较大的发展：但是对鹅的e s t 的研究极少，在d b e s t 文库中还是空白，那么对鹅 的e s t 的研究就具有重要的意义( h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v d b e s t ) 。 9 表1n c b id b e s t 中前1 5 种生物的e s t s 数目( 截止至2 0 0 8 年5 月2 日) t a b l e1t h ee s tn u m b e r so f t h es p e c i e si nd b e s to f n c b i ( u n t i lm a y2 ，2 0 0 8 ) 1 4 本研究的目的和意义 1 0 在过去的几年里，在鉴定导致肝脂肪变性的分子机制和生理学机制方面，人们主 要在哺乳动物上做了大量的研究；而水禽的肝脂肪变性是一种不同于其他动物的生理 现象，到目前为止，关于水禽的肝脂肪变性机制的研究还比较少。本研究用脂肪酸诱 导的脂肪变性肝细胞和正常肝细胞为材料，采用抑制消减杂交( s s h ) 技术构建了正 反向消减c d n a 文库，筛选与肝细胞变性有关的差异表达c d n a 片段。然后综合运 用生物信息学方法对相关基因表达序列片段进行较为全面的分析和研究，初步鉴定了 参与鹅肥肝形成的差异表达基因，为深入研究脂肪酸在肥肝形成过程中的分子水平机 制奠定基础。 2 材料与方法 2 1 试验材料 本实验所用的4 只四川白鹅公鹅( 1 5 日龄) 来自于i 四) l l 农业大学家禽育种试验 场。 2 2 仪器和试剂 2 2 1 主要仪器设备 超低温冰箱：8 0 ，h a r r i s ，i n c 低温冰箱：- 2 0 ，s a n y o ，i n c 低速离心机：m i n i s p i n ，e p p e n d o r f , i n c 高速冷冻离心机：c e n t r i f u g e5 4 1 5 r ，e p p e n d o r f ，i n c c e n t r i f u g e5 8 0 4 r ，e p p e n d o r f , i n c p c r 扩增仪：p t c - 1 0 0 t mp r o g r a m a b l et h e r m a lc o n t r o l l e r ，m jr e s e a r c h ，i n c p c re x p r e s s ，t h e r m oh y